RO130353B1 - Procedeu de cultivare mixotrofă a algelor unicelulare - Google Patents

Procedeu de cultivare mixotrofă a algelor unicelulare Download PDF

Info

Publication number
RO130353B1
RO130353B1 ROA201300896A RO201300896A RO130353B1 RO 130353 B1 RO130353 B1 RO 130353B1 RO A201300896 A ROA201300896 A RO A201300896A RO 201300896 A RO201300896 A RO 201300896A RO 130353 B1 RO130353 B1 RO 130353B1
Authority
RO
Romania
Prior art keywords
algal
algae
biomass
parts
mixture
Prior art date
Application number
ROA201300896A
Other languages
English (en)
Other versions
RO130353A2 (ro
Inventor
Florin Oancea
Sanda Velea
Emil Stepan
Lucia Ilie
Original Assignee
Institutul Naţional De Cercetare-Dezvoltare Pentru Chimie Şi Petrochimie - Icechim
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institutul Naţional De Cercetare-Dezvoltare Pentru Chimie Şi Petrochimie - Icechim filed Critical Institutul Naţional De Cercetare-Dezvoltare Pentru Chimie Şi Petrochimie - Icechim
Priority to ROA201300896A priority Critical patent/RO130353B1/ro
Priority to PCT/RO2013/000025 priority patent/WO2015076689A1/en
Publication of RO130353A2 publication Critical patent/RO130353A2/ro
Publication of RO130353B1 publication Critical patent/RO130353B1/ro

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/04—Oxygen as only ring hetero atoms containing a five-membered hetero ring, e.g. griseofulvin, vitamin C
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/649—Biodiesel, i.e. fatty acid alkyl esters
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Description

Prezenta invenție se referă la un procedeu de cultivare mixotrofă a algelor unicelulare, pe un mediu mineral suplimentat cu glicerol, și hidrolizate de proteine și acizi nucleici, destinat obținerii de biomasă algală utilizabilă pentru producerea de biocombustibili, inclusiv biocombustibil pentru aviație.
Se cunosc diferite procedee mixotrofe de cultivare a algelor unicelulare, care implică suplimentarea mediilor de cultură minerale cu diferiți compuși organici.
RU 2460771 (C1) se referă la o metodă de extracție a substanțelor bioactive din biomasa algelor unicelulare din genul Chlorella, care cuprinde extracția lipidelor-pigment cu un solvent organic, benzină sau etanol, la temperatura camerei, timp de 3...5 h, filtrarea extractului, evaporarea solventului din porțiunea solubilă și formarea unui complex lipid-pigment uscat, amestecarea părții insolubile a extractului cu preparatele enzimatice de tipul celor celulazice și proteazice, urmată de hidroliza enzimatică timp de 4...8 h, la pH 4..6, la o temperatură cuprinsă între 5O...65°C, centrifugarea hidrolizatului și uscarea părților solubile și insolubile, cu obținerea de produse uscate.
WO 2010/123848 (A2) dezvăluie un procedeu care implică formarea unei culturi algale, prin combinarea unor populații de alge care au capacitatea de a supraviețui și prolifera pe ape industriale uzate, pe un mediu cu ape industriale uzate suplimentat, opțional, cu o sursă de carbon reprezentată de glucoză, zaharoză, fructoză, glicerol, metanol, acetat sau hidrolizat lignocelulozic, ca și de orice altă combinație a acestora. Lipidele extrase din algele astfel cultivate se pot converti în biodiesel sau alte produse organice.
US 2013/0217084 (A1) descrie un procedeu de cultivare mixotrofă a algelor pe medii suplimentate cu 30 g/l glicerină brută de la fabricarea biodieselului și 10 g/l extract de drojdie, prin care se obține biomasă de alge unicelulare cu un conținut ridicat de acizi grași omega-3.
WO 2012/035262 (A1) descrie un procedeu mixotrof de cultivare a algelor în prezența unei surse de lumină discontinue, sub formă de flash-uri. Mediul de creștere este suplimentat cu diferite surse de carbon: 5 mM acetat, 5 g/l glucoză, 10 g/l lactoză, 10 g/l zaharoză și 5 g/l glicerol. Flash-urile de lumină, care sunt între 20 și 30/h, au amplitudine egală sau superioară la 10 pEm2s1, și o durată cuprinsă între 20 s și 10 min, de preferat între 10 s și 2 min, și mai exact între 20 s și 1 min. Prin acest procedeu se acumulează cantități de biomasă cuprinse între 100 și 150 g/l, cu un conținut de lipide cu peste 30% mai ridicat decât cel din celulele acelorași alge cultivate autotrof, iar timpul de cultivare se reduce la mai puțin de 40 h.
Un dezavantaj comun al procedeelor descrise până în prezent este faptul că suplimentarea mediului de cultură mineral autotrof se realizează prin adăugarea de compuși care provin din fotosintetizatul organismelor terestre, în condițiile în care această suplimentare s-ar putea realiza prin reutilizarea unor compuși proveniți din prelucrarea biomasei algale, recoltată inclusiv din medii mixotrofe suplimentate cu surse de carbon, azot și fosfor provenite din biomasă de alge unicelulare.
Un alt dezavantaj este dat de faptul că suplimentarea se realizează predominant cu surse de carbon, în condițiile în care deficitul principal în producerea comercială de biocombustibili din micro-alge este cel al surselor de carbon și fosfor - a se vedea, de exemplu, review-ul Chisti, 2013, J. Biotech., 167: 2012-214.
Problema tehnică pe care urmărește să o rezolve invenția este utilizarea compușilor proveniți din prelucrarea biomasei algale, respectiv a glicerolului brut, rezultat de la transesterificarea lipidelor algale, ca sursă de carbon, precum și a hidrolizatelor de proteine și acizi nucleici din biomasa de alge unicelulare, ca sursă de azot și fosfor, pentru suplimentarea mediului de cultură mixotrof.
RO 130353 Β1
Obiectul invenției se referă la un procedeu prin care se obțin hidrolizatele de proteine 1 și acizi nucleici din biomasa de alge unicelulare, folosite pentru suplimentarea mediului autotrof. 3
Procedeul conform invenției este alcătuit din următoarele etape:
- recoltarea biomasei de alge cultivate pe mediu mixotrof și ruperea celulelor de alge 5 unicelulare prin omogenizare la înaltă presiune;
- extragerea lipidelor din omogenizatul algal, folosind amestec de solvenți, urmată de 7 recuperarea prin distilare a solvenților și separarea lipidelor;
- transesterificarea lipidelor prin procedee cunoscute, cu recuperarea glicerolului brut 9 care este utilizat, după aducere la pH neutru cu acid fosforic, ca sursă de carbon pentru suplimentarea mediului de cultivare a algelor, în concentrații cuprinse între 2 și 5 g/l; 11
- hidroliza enzimatică a biomasei lipidice cu un amestec de hidrolaze, fosfataze, nucleaze, proteaze și celulaze, urmată de separarea prin centrifugare a materialului algal 13 rezistent la hidroliza enzimatică, constituit predominant din (ligno)celuloză recalcitrantă, și de prelucrarea ulterioară a acestui material la furani și acid levulinic utilizabili pentru obține- 15 rea de biocombustibili;
- normalizarea hidrolizatului de proteine și acizi nucleici prin ultrafiltrare tangențială 17 pe o membrană cu limita de excludere de 5 kDa, până la 5% azot total și 1,5% fosfor total, și utilizarea ca sursă de azot și fosfor pentru suplimentarea mediului de cultivare a algelor, 19 în concentrație de 12,5 g/l;
- cultivarea algelor unicelulare pe mediu mineral suplimentat 16 g/l NaHCO3, glicerină 21 brută în concentrație cuprinsă între 2 și 5 g/l și 12,5 g/l hidrolizat de proteine și acizi nucleici, cu 5% N și 1,5% P, pe un mediu aerat cu 1 ...101 de amestec gazos cu 7% C02/min/100 I de 23 mediu, la temperatura de 28°C și la intensități ale iluminării cuprinse între 250 și 1000 pEm2s1, timp de 2...5 zile, până la atingerea concentrației de 100 g/l biomasă algală, urmată de recol- 25 tarea biomasei algale.
Procedeul conform invenției prezintă următoarele avantaje: 27
- creșterea cantității de biomasă de alge unicelulare și de lipide în biomasa de alge, datorită suplimentării mediului de cultivare cu surse organice de carbon, azot și fosfor; 29
- stimularea creșterii algelor datorită acumulării de fitohormoni algali și de aminoacizi precursori ai fitohormonilor algali în hidrolizatele enzimatice de biomasă algală delipidizată; 31
- adaptarea la condiții de mediu adverse, reprezentate de intensități ridicate ale iluminării și de concentrații ridicate de CO2 în gazele de aerare a mediului de cultură, datorită acu- 33 mulării de compuși osmoprotectanți, în special pralină, în hidrolizatele enzimatice de biomasă algală delipidizată; 35
- utilizarea prin reciclare în cadrul procedeului de cultivare mixotrof a glicerolului brut și a fracțiilor de proteine și acizi nucleici din biomasa algală, a produselor secundare de la 37 procesarea lipidelor și carbohidraților din biomasa algală în biocombustibili.
Aspectele preferate ale procedeului descris mai sus sunt: 39
- recoltarea prin centrifugare la minimum 8000 x g, și ruperea celulelor de alge unicelulare prin trecere pe un omogenizator cu piston, prevăzut cu valvă tip muchie de cuțit, 41 3 cicluri la 150 MPa;
- extragerea lipidelor din omogenatul de alge unicelulare cu un amestec de 43 cloforrmmetanol 2:1, în raport de 5 părți amestec solvenți la 1 parte omogenat;
- hidroliza proteinelor și a acizilor nucleici din biomasa algală delipidizată cu un 45 amestec de hidrolaze, inițial cu un amestec format din 0,25 părți proteină activitate specifică endonucleazică de 1 x 10® unități endonuclează/mg proteină, și 0,25 părți proteină cu activi- 47 tate specifică de 300 unități fosfatază/mg proteină, la 1000 părți biomasă algală delipidizată, exprimată ca substanță uscată, timp de 12 h la 45°C și pH 6,5, urmat de tratamentul cu 49
RO 130353 Β1
0,1 părți proteine având activitatea specifică proteazică de 2,4 unități Anson (AU) per g și 0,1 g părți proteine cu o activitate specifică aminopeptidazică de 500 LAPU/g la 1000 părți biomasă algală delipidizată, exprimată ca substanță uscată, la pH 6,5 și temperatura de 60°C, timp de 16 h.
în continuare, se prezintă exemple de realizare care ilustrează invenția fără să o limiteze.
Exemplul 1
Se recoltează biomasa algală după cultivare într-un fotobioreactor Biostat PBR 2S (Sartorius Stedim Biotech, Goettingen, Germania), prin centrifugare pe o centrifugă continuă de laborator Westfalia Laboratory Separator, model SA 1-02-175 (GEA Westfalia Separator Group, Oelde, Germania), care este operată la o viteză a discurilor de centrifugare de 10000 rpm, echivalent a 8500 x g; la o rată de alimentare de 0,3 l/min, cu separarea continuă a mediului de cultură clarificat și discontinuă a unui concentrat de alge, ajuns la o densitate de 1100 kg/m3. Concentratul de biomasă algală se omogenizează într-un omogenizator cu piston, GEA Niro Soavi Arriete NS2006 (GEA Niro Soavi, Parma, Italia), prevăzut cu o valvă tip „muchie de cuțit, două cicluri la 150 MPa, câte 0,3 l/min. Omogenizarea la înaltă presiune determină ruperea celulelor algale prin liză indusă de variațiile de presiune, și trecerea prin valva tip „muchie de cuțit, cu exprimarea conținutului celular și expunerea pereților celulari.
Din omogenizatul algal se extrag lipidele cu un amestec de cloforrmmetanol 2:1, în raport de 5 părți amestec solvenți la 1 parte omogenat. Lipidele se transesterifică prin folosirea unui catalizator bazic, alcoxid de potasiu. 100 părți de ulei algal reacționează în autoclavă, sub atmosferă protectoare de azot, și la 40°C, timp de 8 h, cu o soluție obținută din 0,8 g hidroxid de sodiu 99,1% și 11,3 g metanol 99,9%, cu recuperarea glicerolului brut care este adus la pH neutru prin neutralizare cu acid fosforic, și utilizarea acestuia ca sursă de carbon pentru suplimentarea mediului de cultivare a algelor.
Transesterificarea se poate realiza prin orice alt procedeu cunoscut, cu recuperarea glicerolului brut care este adus la pH neutru prin neutralizare cu acid fosforic și/sau hidroxid de potasiu, și utilizarea acestuia ca sursă de carbon pentru suplimentarea mediului de cultivare a algelor.
Acizii nucleici și proteinele din biomasa algală delipidizată se hidrolizează cu un amestec de hidrolaze. Inițial se tratează 1000 părți biomasă algală delipidizată, care are o umiditate reziduală de peste 80%, cu un amestec format din 0,25 părți proteină cu activitate specifică endonucleazică de 1 x 10® unități endonuclează/mg proteină (circa 0,28 părți de Benzonase, purity grade II > 90%, Merck Millipore, Darmstad, Germania, amestec de endonucleaze din Serratia marcensens obținut prin exprimarea genelor specifice în E. coli) și 0,25 părți proteină cu activitate specifică de 300 unități fosfatază/mg proteină (circa 0,5 părți din fosfataza alcalină purificată din cultură de Bacillus licheniformis MTCC 1483, conform procedeului descris de Pandey și Banik, 2011, Biores. Technol., 102: 4226-4231), timp de 12 h, la 45°C și pH 6,5. O unitate de Benzonase este definită ca fiind acea cantitate de enzimă care determină, în condiții standard, o creștere a absorbantei A260 cu 1,0 în 30 min, corespunzând la o digestie completă de 37 pg ADN. Condițiile standard de reacție sunt 1 mg/ml substrat sonicat ADN, respectiv spermă de somon, în tampon 50 mM Tris-HCI, pH 8,0, 0,1 mg/ml BSA, 1 mM MgCI2, incubare la 37°C. O unitate defosfatază alcalină este definită ca fiind acea cantitate de enzimă care determină, în condiții standard, eliberarea a 1 pmol p-nitrofenol per min. Condițiile standard sunt: 0,1 ml probă enzimatică adăugat peste 1,9 ml soluție p-nitro-fenil fosfat, sare disodică (2 mg/ml în tampon 1 M Tris-HCI, pH 10,0) și incubarea amestecului la 50°C. Orice tip de combinație de endonucleaze și fosfatază alcalină poate fi folosită, cu condiția de a asigura o activitate enzimatică similară în amestec.
RO 130353 Β1
După hidroliza enzimatică a acizilor nucleici, cu amestec de endonucleaze și 1 fosfatază alcalină, se hidrolizează proteinele din biomasa algală delipidizată. Se tratează 1000 părți algală delipidizată, care are o umiditate reziduală de peste 80%, cu un amestec 3 format din 0,1 părți proteine având activitatea specifică proteazică de 2,4 unități Anson (AU) per g (0,1 părți Alcalase AF 2.4 L, Novozyme, Novozyme A/S, Bagvaerd, Danemarca, endo- 5 peptidază bacteriană din Bacillus licheniformis, cu subtilizină/serin endo-peptidază ca principal component enzimatic, având activitatea specifică de 2,4 unități Anson (AU) per g) 7 și 0,5 g părți proteine cu o activitate specifică aminopeptidazică de 500 LAPU/g (Flavourzyme 500 MG, Novozyme, un complex de amidopeptidaze/exopeptidaze și endo- 9 proteaze, obținut din Aspergillus oryzae, cu o activitate de 500 LAPU/g), la pH 6,5 și temperatura de 60°C, timp de 16 h. O unitate Anson este definită ca fiind acea cantitate de enzimă 11 care, în condiții standard, la pH 7,5, 25°C și 10 min timp de reacție, digeră hemoglobina denaturată, cu o viteză inițială care produce într-un minut o cantitate de compuși solubili în 13 acid tricloracetic care dau aceeași culoare cu reactivul Folin-Ciocâlteu ca și 1 miliechivalent de tirozină. O unitate LAPU, unitate leucină aminopeptidazică, este cantitatea de enzimă 15 care hidrolizează 1 pmol de leucin-p-nitroanilid/min, în condiții standard, 26 mM of L-leucin-pnitroanilid ca substrat, tampon 0,1 M Tris - HCI, pH 8,0, 40°C). Orice tip de combinație de 17 endoproteaze și amidopeptidaze/exo-proteaze poate fi folosită, cu condiția de a asigura o activitate enzimatică similară în amestec. 19
Materialul algal rezistent la hidroliză enzimatică, constituit predominant din (ligno)celuloză recalcitrantă, se separă prin centrifugare, la 8000 x g, și se prelucrează 21 ulterior la furani și acid levulinic utilizabili pentru obținerea de biocombustibili.
Supernatantul se reia și este ultrafiltrat tangențial pe un sistem de uitrafiltrare 23 tangențială Prostak (Merck Millipore, Billerica, MA, SUA) prevăzut cu o membrană Ultracel PLAC (Merck Millipore) din celuloză regenerată, cu limită de excludere de 5 KDa. 25 Concentrarea proteinelor hidrolizate, aminoacizi și/sau peptide în permeat este continuată până la atingerea unei concentrații de 5% azot total și 1,5% fosfor total în permeat, controlată 27 prin dozarea azotului total și a fosforului. Din permeat se prelevează probe în care se analizează periodic pentru conținutul azot total folosind metoda Kjedahl (EN 13342-2001) 29 și după extragere în apă regală (EN 13346-2000).
Cultivarea algelor unicelulare se realizează pe mediu mineral Z, Zarouk, suplimentat 31 cu 16 g/l NaHCOg, și mediu Zarouk mixotrof, suplimentat cu 16 g/l NaHCO3, glicerină brută în concentrație cuprinsă între 2 și 5 g/l și 12,5 g/l hidrolizat de proteine și acizi nucleici, cu 33 5% N și 1,5% P, ale căror formule sunt prezentate în tabelul 1 de mai jos.
Tabelul 1
Compoziția mediului nutritiv Zarouk și a mediului Zarouk suplimentat cu glicerină și 37 hidrolizat din proteine algale (Zarouk mixotrof)
Componenți mediu Zarouk Zarouk mixotrof
NaHCOg 16,80 g/l 16,80 g/l
K2HPO4 0,50 g/l 0,50 g/l
NaNO3 1,875 g/l 1,875 g/l
Hidrolizat cu conținut 5% azot și 1,5% fosfor - 12,5
Glicerină - 42770
RO 130353 Β1
Tabelul 1 (continuare)
Componenți mediu Zarouk Zarouk mixotrof
K2SO4 1,00 g/l 1,00 g/l
NaCI 1,00 g/l 1,00 g/l
MgSO4 · 7H2O 0,20 g/l 0,20 g/l
CaCI2 · 2H2O 0,04 g/l 0,04 g/l
Soluție de microelemente* 1 ml 1 ml
Soluție de Fe chelatat** 5 ml 5 ml
‘Micronutrienți soluție stoc (g/l): H3BO3, 2,860; MnSO4 · 4H2O, 2,030; ZnSO4 · 7H2O 0,222; MoO3 (85%) 0,018; Cu SO4 · 5H2O 0,079; Co(NO3)2 · 6H2O 0,494.
** Pentru prepararea soluției stoc de Fe chelatat, s-au dizovat în 80 ml de apă distilată 0,69 g de FeSO4 · 7H2O și 0,93 g Na2 EDTA. După fierbere pentru o scurtă durată de timp și răcire la temperatura camerei, soluția finală se aduce la un volum de 100 ml.
într-un fotobioreactor Biostat PBR 2S (Sartorius Stedim Biotech), se introduc 2,7 I de mediu nutritiv Zarouk sau, respectiv, mediul Zarouk suplimentat cu 2 g glicerină și 12,5 g/l hidrolizat din proteine și acizi nucleici din alge (Zarouk mixotrof).
Condițiile de creștere în fotobioreactor sunt volumul de mediu: 3 I; temperatura de lucru: 28°C; iluminare 250 pEm2s1, cu ofotoperioadă/alternanță ciclu iluminare: întuneric de 12:12 h; administrare de amestec sintetic de gaze cu compoziția: 7% CO2, 14% O2 și 79% N2, la un debit de 30 ml/min, corespunzând la o aerare cu 1 I de amestec gazos cu 7% C02/min/100 I de mediu; viteza pompei de recirculare a pompei peristaltice 70%, respectiv un debit de recirculare de 3500 ml/min; se programează din softul bioreactorului măsurarea automată a parametrilor de lucru, respectiv pH, turbiditate (OD), temperatură, lumină, viteza de recirculare, debit de CO2/aerare cu amestec sintetic de gaze.
Mediul de creștere se inoculează cu 300 ml de inocul din cultură de tulpinii Nannochloris sp 424-1, minimum 109 ufc/ml. Se cultivă timp de 5 zile, până la atingerea concentrației de 100 g/l biomasă algală, urmată de recoltarea biomasei algale. Rezultatele medii care se obțin sunt prezentate în tabelul 2 de mai jos.
Tabelul 2
Creșterea autotrofă și mixotrofă a tulpinii Nannochloris sp 424-1 pe fotobioreactor Biostat PBR 2S, la iluminare 250 pErrris1, cu o fotoperioadă 12 h
Parametrii de creștere Cultură autotrofă Cultură mixotrofă
Rata exponențială creștere, Rexp, zile1 284 655
Timp de dublare, TD, zile 244 106
Conținut lipide în biomasă uscată, % (g/100 g) 214 208
Exemplul 2
Se procedează ca în exemplul 1, cu diferența că se utilizează pentru cultivare un sistem integratfotosintetizator original, descris pe larg în brevetul RO 0123480. în esență, acest sistem fotosintetizator original este compus dintr-un corp central sub formă de cuvă deschisă la partea superioară, în care sunt amplasate un număr variabil de celule de fotosinteză, legate în paralel prin conducte de alimentare cu soluții nutritive (sau soluții nutritive + masă algală sau masă algală adusă la stadiul de creștere exponențială), respectiv prin conducte
RO 130353 Β1 de alimentare cu gaze având conținut variabil de dioxid de carbon. Deasupra cuvei 1 fotobioreactorului se află amplasat sistemul de iluminare. Sistemul fotobioreactor integrat îmbină avantajele sistemului deschis de tip iaz, cu cele ale sistemului cu plăci plane, putând 3 fi încadrat în clasa fotobioreactoarelor hibride. Pentru testarea creșterii tulpinii s-au încărcat celulele de fotosinteză cu mediu de cultură Zarouk cu 16,8 g/l NaHCO3, sau cu mediu Zarouk 5 suplimentat cu 5 g/l glicerină și 12,5 hidrolizat din acizi nucleici și proteine din alge (mediu mixotrof), și inoculul proaspăt preparat, în raport volumetric 9:1. încărcarea s-a făcut până 7 la umplerea celulelor de fotosinteză, astfel încât fluidul alimentat să deverseze în fotobioreactor, peste deversoarele de prea-plin. S-a cuplat sistemul de iluminare și apoi s-a 9 introdus prin conducta de alimentare amestecul de gaze cu dioxid de carbon, vehiculat de suflanta S8, cu un debit prestabilit, care să permită barbotarea și să mențină o bună agitare 11 a suspensiei în celulele de fotosinteză.
Experimentele se realizează în condiții de seră, la 22 ± 2°C în timpul zilei și 17 ± 2°C 13 în timpul nopții, cu o fotoperioadă de 12 h. în condiții de laborator, iluminarea s-a realizat cu lămpi de halogen, la 250 μΕ m2s1. în condiții de seră, se utilizează lumina solară, cu inten- 15 sități care ating 1100 μΕ m2s1 în timpul amiezii, suplimentată cu lumină cu intensitatea de 160 μΕ m 2s1, provenită din lămpi cu halogen, atunci când intensitatea luminoasă scade sub 17 500 μΕ m 2s1. Se efectuează determinări ale ratei exponențiale de creștere și ale timpului de dublare (Wood et al., 2005. Algal culturing techniques, 269-285), ale conținutului de 19 lipide (Bligh și Dyer, 1959, Can. J. Biochem. Physiol. 37: 911-917) și de carotenoizi (Wrightși Jeffrey, 1997, în JeffreySW, MantouraRFC, WrightSW(eds), Phytoplankton 21 Pigments in Oceanography, Unesco Publishing, Paris, pp. 327-341). Rezultatele medii care se obțin sunt prezentate în tabelul 3 de mai jos. 23
Tabelul 3 25
Creșterea autotrofă și mixotrofă a tulpinii Nannochloris sp 424-1 pe sistem integrat fotosintetizator, la iluminare 500-1101 pErrris1, cu o fotoperioadă de 12 h 27
Parametri de creștere Cultură autotrofă Cultură mixotrofă
Rata exponențială creștere, Rexp, zile1 655 723
Timp de dublare, TD, zile 106 72
Conținut lipide în biomasă uscată, % (g/100 g) 208 246
Aceste rezultate care sunt obținute susțin eficiența procedeului de cultivare mixotrofă 33 propus, pentru creșterea randamentelor de cultivare a algelor unicelulare, cu reciclarea azotului și fosforului din proteinele și acizii nucleici din biomasa algală, neutilizați pentru bio- 35 combustibili.

Claims (4)

Revendicări
1. Procedeu conform invenției, caracterizat prin aceea că este alcătuit din următoarele etape: recoltarea biomasei de alge cultivate pe mediu mixotrof, ruperea celulelor de alge unicelulare prin omogenizare la înaltă presiune, extragerea lipidelor din omogenizatul algal, prin folosire de amestec de solvenți, recuperarea prin distilare a solvenților și separarea lipidelor, transesterificarea lipidelor prin procedee cunoscute, cu recuperarea glicerolului brut care este utilizat, după aducere la pH neutru cu acid fosforic, ca sursă de carbon pentru suplimentarea mediului de cultivare a algelor, în concentrații cuprinse între 2 și 5 g/l, hidroliza enzimatică a biomasei lipidice cu un amestec de hidrolaze, fosfataze, nucleaze, proteaze și celulaze, separarea prin centrifugare a materialului algal rezistent la hidroliza enzimatică, constituit predominant din (ligno)celuloză recalcitrantă, și prelucrarea ulterioară a acestui material la furani și acid levulinic, utilizabili pentru obținerea de bio-combustibili, normalizarea hidrolizatului de proteine și acizi nucleici prin ultrafiltrare tangențială pe o membrană cu limita de excludere de 5 kDa, până la 5% azot total și 1,5% fosfortotal, și utilizarea ca sursă de azot și fosfor pentru suplimentarea mediului de cultivare a algelor, în concentrație de 12,5 g/l, cultivarea algelor unicelulare pe mediu mineral suplimentat cu 16 g/l NaHCO3, glicerina brută în concentrație cuprinsă între 2 și 5 g/l și 12,5 g/l hidrolizat de proteine și acizi nucleici, cu 5% N și 1,5% P, pe un mediu aerat cu 1... 10 Ide amestec gazos cu 7% C02/min/100l de mediu, la temperatura de 28°C și la intensități ale iluminării cuprinse între 250 și 1000 pEm2s1, timp de 2...5 zile, până la atingerea concentrației de 100 g/l biomasă algală, urmată de recoltarea biomasei algale.
2. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că recoltarea biomasei de alge se realizează prin centrifugare la minimum 8000 x g, iar ruperea celulelor de alge unicelulare se realizează prin trecere pe un omogenizator cu piston prevăzut cu valvă tip muchie de cuțit, 3 cicluri la 150 MPa.
3. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că extragerea lipidelor din omogenatul de alge unicelulare se face cu un amestec de cloroform: metanol 2:1, în raport de 5 părți amestec solvenți la 1 parte omogenat.
4. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că hidroliza proteinelor și a acizilor nucleici din biomasa algală delipidizată se face cu un amestec de hidrolaze, inițial cu un amestec format din 0,25 părți proteină activitate specifică endonucleazică de 1x10® unități endonuclează/mg proteină, și 0,25 părți proteină cu activitate specifică de 300 unități fosfatază/mg proteină, la 1000 părți biomasă algală delipidizată, exprimată ca substanță uscată, timp de 12 h la 45°C și pH 6,5, urmat de tratamentul cu 0,1 părți proteine având activitatea specifică proteazică de 2,4 unități Anson (AU) perg și 0,1 g părți proteine cu o activitate specifică aminopeptidazică de 500 LAPU/g la 1000 părți biomasă algală delipidizată, exprimată ca substanță uscată, la pH 6,5 și temperatura de 60°C, timp de 16 h.
ROA201300896A 2013-11-25 2013-11-25 Procedeu de cultivare mixotrofă a algelor unicelulare RO130353B1 (ro)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ROA201300896A RO130353B1 (ro) 2013-11-25 2013-11-25 Procedeu de cultivare mixotrofă a algelor unicelulare
PCT/RO2013/000025 WO2015076689A1 (en) 2013-11-25 2013-11-27 Process for mixtrophic cultivation of algae

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ROA201300896A RO130353B1 (ro) 2013-11-25 2013-11-25 Procedeu de cultivare mixotrofă a algelor unicelulare

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RO130353A2 RO130353A2 (ro) 2015-06-30
RO130353B1 true RO130353B1 (ro) 2017-12-29

Family

ID=53179857

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ROA201300896A RO130353B1 (ro) 2013-11-25 2013-11-25 Procedeu de cultivare mixotrofă a algelor unicelulare

Country Status (2)

Country Link
RO (1) RO130353B1 (ro)
WO (1) WO2015076689A1 (ro)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6896804B2 (en) * 2002-05-07 2005-05-24 Agsmart, Inc. System and method for remediation of waste
WO2009094440A1 (en) * 2008-01-25 2009-07-30 Aquatic Energy Llc Algal culture production, harvesting, and processing
WO2010042842A2 (en) * 2008-10-09 2010-04-15 Eudes De Crecy A method of producing fatty acids for biofuel, biodiesel, and other valuable chemicals

Also Published As

Publication number Publication date
RO130353A2 (ro) 2015-06-30
WO2015076689A1 (en) 2015-05-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Soto-Sierra et al. Extraction and fractionation of microalgae-based protein products
Kose et al. Properties of microalgal enzymatic protein hydrolysates: Biochemical composition, protein distribution and FTIR characteristics
DK2616536T3 (en) PROCEDURE FOR CULTIVATING MIXOTROPIC SINGLE-CELL ALGES IN THE PRESENT OF A DISCONTINUOUS PROVISION OF LIGHT IN THE FORM OF FLASHES
Zhou et al. Microalgae cultivation and photobioreactor design
CN109198167B (zh) 饲用酵母水解物及其制备方法和应用
Dhillon et al. Proteolytic enzymes
Callejo-López et al. Versatile method to obtain protein-and/or amino acid-enriched extracts from fresh biomass of recalcitrant microalgae without mechanical pretreatment
FR3044679A1 (fr) Procede de culture d'algues, particulierement d'algues rouges unicellulaires (arus), avec du lactose
Chiong et al. Microalgal-based protein by-products: Extraction, purification, and applications
CN108203729B (zh) 一种巨藻抗氧化肽的制备方法
Enebo Single-cell protein
CN104894034A (zh) 一种海洋来源小单孢菌scsio 01819、酶制剂溶液及其制备方法和应用
Falanghe et al. Production of fungal mycelial protein in submerged culture of soybean whey
RO130353B1 (ro) Procedeu de cultivare mixotrofă a algelor unicelulare
KR102481241B1 (ko) 유글레나 그라실리스 균주를 이용한 고부가가치 물질의 생산방법
Lakshmikandan et al. Efficient bioflocculation and biodiesel production of microalgae Asterococcus limneticus on streptomyces two-stage co-cultivation strategy
ES2784253T3 (es) Procedimiento de producción de un cóctel enzimático a partir de mosto de hongo
RU2397247C1 (ru) Способ биосинтеза липазы
CN101440390B (zh) 混菌固态发酵制备菜籽活性肽的方法
KR20100040589A (ko) 글루타치온의 대량 생산방법
CN101654696B (zh) 一种微生物液态发酵制备菜籽肽的方法
Jankiewicz et al. Identification and properties of a keratinase from Stenotrophomonas maltophilia N4 with potential application in biotechnology
CN104388404A (zh) 脂肪酶的微生物发酵及提取分离方法
Markou et al. Microalgae as a source of alternative protein
RO130238B1 (ro) Procedeu de cultivare continuă a microalgelor, în ciclu autotrof - mixotrof, cu reciclarea apei şi a nutrienţilor