RO128694B1 - Procedeu de obţinere a microtuberculilor de cartof in vitro, mai mari de 10 mm şi mai mari de 1 g - Google Patents

Description

Invenția se referă la un procedeu de obținere a microtuberculilorde cartof in vitro, mai mari de 10 mm și mai mari de 1 g.

în producerea cartofului pentru sămânță, există o problemă destul de dificilă din cauza presiunii mari de infecție, problemă ce poate fi depășită prin utilizarea înmulțirii in vitro. Rezolvarea constă în obținerea unui material inițial corespunzător din punct de vedere fitosanitar, în menținerea libere de virusuri a noilor genotipuri create, precum și în micropropagarea rapidă a celor mai valoroase creații.

Soiul, ca resursă biologică, constituie unul dintre cei mai importanți factori în realizarea unor producții mari, constante și economice, dar, ca orice material biologic, se menține în producție un timp limitat. Degenerarea biologică, uzura morală, apariția și evoluția agenților patogeni, modificarea condițiilor tehnice și economice, cerințele pieții, toate constituie elemente principale în menținerea în producție un timp mai lung sau mai scurt.

La cartof, calitatea materialului de plantare este factorul esențial care determină calitatea și cantitatea recoltelor obținute, fiind cunoscut faptul că producția de cartof este determinată în valoare de peste 50% de calitatea materialului de plantare. Producerea cartofului pentru sămânță reprezintă o activitate științifică complexă, laborioasă, care necesită o preocupare mai mare decât producerea materialului semincer la culturile cu înmulțire prin sămânță adevărată, datorită în principal următoarelor cauze:

- diminuarea progresivă a producției, determinată de degenerarea virotică și fiziologică;

- coeficientul de înmulțire foarte mic (1:4... 1:10);

- conținutul ridicat de apă și sensibilitatea la vătămare a tuberculilor impune condiții speciale pentru păstrare;

- costurile aferente materialului pentru plantat sunt mari datorită normei de plantare ridicate.

Prin dezvoltarea culturii in vitro de producere de microtuberculi, se mărește eficiența procesului de producere de sămânță atât sub aspect economic, cât și ca durată, această tehnică determinând o reducere cu 4...5 ani a timpului necesar, și, în același timp, se elimină o serie de lucrări adiacente, create de necesitatea menținerii unui stoc de material biologic reproductiv sănătos, și care se utilizează în mod obișnuit în sistemul clasic.

La ora actuală, pe plan mondial, există tehnici clasice de producere a cartofului pentru sămânță, prin utilizarea microtuberculilor produși in vitro. Aceste tehnici clasice nu rezolvă problema obținerii unor microtuberculi cu dimensiuni și greutăți mari și, din acest motiv, microtuberculii mai mici de 10 mm și mai mici de 1 g prezintă un risc real în procesul de multiplicare, prin faptul că raportul de multiplicare nu depășește valoarea de 2:1, respectiv, 3:1 [Angel M. Mingo-Castel și colab., “Effect of Carbon Dioxide and Ethylene on Tuberization of IsolatedPotato Stolons Culturedin Vitro”, Plant Physiol. (1974) 53, pp. 798-801; A. A. R. Yousef și colab., “In Vitro Culture and Microtuberization of “Spunta” Potato (Solanum tuberosum L.)”, Di rasat, Agricultural Sciences, Voi. 24, No. 2,1997; Evgenij V. Mokshin și colab., “Induction of Microtuberization forOne-bud Potato Cuttings in Vitro”, Fruit, Vegetable and Cereai Science and Biotechnology 2, 2008 Global Science Books, pp. 118-124].

Producerea de microtuberculi in vitro

Procedeul clasic

1. Obținerea materialului inițial liber de virusuri, utilizând culturile de meristeme Pentru inițierea culturii de meristeme, tuberculii de cartof luați în studiu (câte 10 tuberculi pentru fiecare soi) sunt puși la încolțit, în condiții de laborator, la temperatura de 18°C, la lumină. După aproximativ 3 săptămâni, colții au lungimea de circa 2...3 cm, sunt detașați, dezinfectați și utilizați pentru obținerea inoculilor meristematici, prin îndepărtarea micilor

RO 128694 Β1 foliole ce înconjoară vârful de creștere, până ce se observă domul meristematic, cu primele 1 primordiile foliare Excizarea meristemelor se face la lupa binoculară, în hota cu flux de aer steril, pe o suprafață ce a fostîn prealabil dezinfectată cu alcool 70°. După prelevare, explan- 3 tul meristematic este introdus într-un mediu de cultură de dezvoltare, folosit la cartof, Murashige-Skoog (MS 1962), cu diverse variante hormonale. Culturile odată înființate, sunt 5 transferate în camera de creștere, fiind expuse unui regim de lumină de 4000 lucși, cu o fotoperioadă de 16 h lumină, 8 h întuneric, la o temperatură de22°C ±2°Cziua, și 18...20°C 7 ± 2°C noaptea. în cazul meristemelor viabile, după un timp, inoculii meristematici încep să crească și dezvoltă mici muguri care se transformă în plantule (în funcție de soi, 6...8 luni). 9

2. Multiplicarea in vitro a cartofului

Plantulele de cartof regenerate din meristeme sunt microbutășite, fiecare minibutaș 11 conținând un nod cu frunzulița aferentă. Fiecare minibutaș este inoculat apoi într-un mediu nutritiv de cultură, Murashighe-Skoog (MS 1962), cu un adaos de acid alfanaftilacetic (ANA) 13 în concentrație de 0,5 mg/l, pentru stimularea creșterii și înrădăcinării. Mediul a fost solidificat cu 0,7% Agar-Agar, iar pH-ul a fost ajustat la 5,8 cu KOH înainte de autoclavare. Sterilizarea 15 recipientelor cu mediu a fost făcută la 120°C, timp de 25 min. După inocularea minibutașilor, operație efectuată in incinta hotei cu flux laminar steril, eprubetele sunt plasate în camera 17 de creștere în aceleași condiții de temperatură și lumină ca la faza de inițiere a culturii din meristeme. După aproximativ 3...4 săptămâni (în funcție de genotip), fiecare genotip s-a 19 dezvoltat și a generat o nouă plantulă de circa 5...7 cm, acestea au fost secționate din nou, nod per nod în minibutași. Fenomenul se repetă ori de câte ori este nevoie. Mediul de cultură 21 utilizat a facilitat de fiecare dată regenerarea din mugurele prezent la nivelul nodului, respectiv, la axila fiecărei frunzulițe (meristeme axilare) o plantulă completă, cu o tulpiniță 23 bine conformată și cu multe rădăcinuțe. Coeficientul de multiplicare este în jur de 4...5 la fiecare 3...4 săptămâni. 25

3. Identificarea infecției virale prin testul ELI SA

Prima testare a plantulelor, în vederea depistării prezenței infecției virale în 27 vitroplantele regenerate din meristeme cu ajutorul testului ELISA, s-a făcut în faza în care plantulele erau dezvoltate, având frunzulițe și rădăcinuțe. 29

Materialul biologic este reprezentat de 90 de clone de cartof (din soiurile analizate), și fiecare clonă este testată pentru fiecare dintre virusurile PVX, PVY, PVM, PVS, PVA și 31 virusul răsucirii frunzelor (PLRV). Pentru testare, se recoltează 5...6 plantule din in vitro de la fiecare clonă de cartof din soiurile supuse devirozării, și se extrage sucul prin presare la 33 presa automată.

4. înființarea culturii in vitro pentru obținerea de microtuberculi in vitro 35

Punctul de plecare în producerea microtuberculilor sunt plantulele produse în ultima fază de multiplicare, adică minibutașii care sunt inoculați în mediul de creștere și înrădăci- 37 nare MS. După 3...4 săptămâni, se adaugă mediul de microtuberizare care este un mediu lichid, de conține aceleași substanțe ca și mediul MS de creștere și înrădăcinare, dar 39 cantitatea de soluție stoc este redusă la jumătate, fiind completat cu kinetină, cumarină și zaharoză în concentrație de 80...90 g/l. 41

Mediul de microtuberizare nu conține agar sau alți agenți gelifianți. în fiecare cutie de plastic ce conține câte 20 de minibutași, se toarnă 40 ml de mediu de microtuberizare sterili- 43 zat și răcit. Microtuberizarea are loc la întuneric, timp de 6...8 săptămâni, temperatura fiind de 20 ± 2°C. 45

5. Recoltarea microtuberculilor

Recoltarea se face separat, în funcție de soi, clonă, iar microtu bercul ii din fiecare 47 cutie sunt calibrați cu ajutorul sitelor cu orificii de diferite dimensiuni.

RO 128694 Β1

Caracteristicile tehnice ale microtuberculilor obținuți prin procedeul clasic·.

- tuberculi mici (3...5...9 mm);

- greutate 0,05...0,2...0,5 g;

- timp de obținere a microtuberculilor pornind de la meristem: aproximativ 16... 18 luni;

- repaus vegetativ 6...8 luni, în funcție de soi;

- deshidratare puternică pe timpul perioadei de vegetație, din cauza greutății foarte mici, deci pierderi destul de mari pe timpul păstrării (30%).

WO 2010/076954 A2 se referă la un procedeu pentru producerea materialului săditor liber de virusuri, prin propagarea masivă a microtuberculilor de cartofi, prin dezvoltare sterilă într-un bioreactor de cultură care conține mediu de cultură lichid MS într-o cantitate redusă de la 1/2 la 1/4 din valoarea acestuia, creșterea în mediul MS de cultură lichid folosit, realizându-se de 1...2 ori, și într-un loc întunecos. între 7 și 20 de microtuberculi de cartofi cu tulpinile cu o lungime de 3...5 cm, fără germeni de cultură tisulară, sunt crescuți la 2...5 cm semănați pe 10 cm³ pe un pat germinativ umplut cu sol la o adâncime de 3...6 cm. Cartofii de 5 g sau mai mari sunt folosiți ca material săditor pentru ferme, și cartofii mai mici de 5 g sunt semănați pe patul de însămânțare, pentru a produce cartofi de sămânță. Cartofii de sămânță obținuți prin prezenta invenție sunt capabili de depozitare convenabilă, și au avantajul de a fi liberi de virusuri.

US 7906703 B2 prezintă un procedeu de producere în masă a răsadurilor de cartofi, care cuprinde colectarea punctelor de creștere de cartofi de sămânță, și cultivarea punctelor de creștere într-un mediu lichid sau solid, introducerea plantulelor obținute din cultura punctelor de creștere în in cultură solidă in vitro, și eliminarea plantulelor din cultura solidă in vitro și plantare prin tăierea tulpinilor și climatizarea plantulelor in vitro în cultură în flux, în care soluția nutritivă se recirculă. Atunci când plantulele cultivate in vitro sunt plantate în DSCAC, prin tăierea tulpinilor, iar mugurele terminal și mugurii laterali ai plantulelor sunt căliți prin creștere gradată a nivelului de lumină de la întuneric, până când plantulele au frunze de un verde închis sănătos și o acumulare mare de carbohidrați, se obțin astfel răsaduri de cartofi cu tulpini lungi, la care apar noduri robuste, dar nu prea mari, elastice și scurte. La plantarea în instalațiile hidroponice, aceste răsaduri de cartofi au mare adaptabilitate la mediul extern și, astfel, rapid și uniform pot genera rădăcini într-un timp scurt. Ancorarea rapidă a rădăcinii previne răsadurile de ofilire, ceea ce duce la moarte, creșterea slabă și altele asemenea. Plantarea directă a plantulelor in vitro, prin tăierea tulpinilor, fără un proces de aclimatizare separat, scurtează perioada totală de producție de material săditor de cartofi, prin omiterea procesului de aclimatizare.

Problema tehnică pe care urmărește să o rezolve invenția constă în reducerea timpului de producere a microtuberculilor de cartof in vitro, cât și obținerea de microtuberculi mai mari atât ca dimensiune, cât și ca greutate.

Procedeul de obținere a microtuberculilor de cartof in vitro, mai mari de 10 mm și mai mari de 1 g, conform invenției, constă în aceea că din colți de cartof sănătoși, inoculați pe mediu nutritiv de creștere și înrădăcinare, MS 1962, în camera de creștere, se obțin, după

3...4 săptămâni, plantule de 5...6 cm, care se supun microbutășirii; fiecare microbutaș este apoi inoculat în mediu MS 1962, aditivat cu acid alfanaftil acetic și solidificat cu agar-agar; după 3...4 săptămâni, din microbutași se formează o plantulă nouă, de 5...7 cm, care se secționează în minibutași, operația repetându-se de câte ori este nevoie, cu un coeficient de multiplicare, la fiecare 3...4 săptămâni, de 4...5 ori; minibutașii rezultați se utilizează pentru producerea de microtuberculi, prin cultivarea acestora pe un mediu de bază solid MS1962,

RO 128694 Β1 specific fazei de creștere și înrădăcinare; plantulelede4...5cm rezultate se inoculează apoi 1 orizontal, câte 4...5/cutie, în același mediu; după 3...4 săptămâni, noilor plantule dezvoltate din fiecare internod li se adaugă mediu de tuberizare, ce conține kinetină, cumarină și 3 zaharoză.în concentrație de 80...90 g/l și, după 6...8 săptămâni, se recoltează microtuberculi mai mari de 10 mm și mai mari de 1 g. 5

Avantajele producerii de microtuberculi >10mm și >1 g prin procedeul conform invenției sunt următoarele caracteristici tehnice: 7

- tuberculi mari (10...15...20 mm);

- greutate 0,5...2,6; 9

- timp de obținere a microtuberculilor pornind de la colț de carof sănătos: 6...8 luni;

- repaus vegetativ 6...8 luni, în funcție de soi; 11

- pierderile pe timpul repausului sunt mult mai mici (2%);

- plantați în tunel, produc tuberculi normali. 13

Se dă, în continuare, un exemplu de realizare a invenției, în legătură și cu fig. 1...3, ce reprezintă: 15

- fig. 1, microtuberculi recoltați și sortați, obținuți prin procedeul clasic;

- fig. 2, microtuberculi recoltați mai mari de 10 mm, obținuți prin procedeul conform 17 invenției;

- fig. 3, microtubercul recoltat mai mare de 1 g, obținut prin procedeul conform 19 invenției;

- fig. 4, schema de obținere a microtuberculilor de cartof in vitro, mai mari de 10 mm 21 și mai mari de 1 g, conform invenției.

Procedeul de obținere a microtuberculilor de cartof in vitro, mai mari de 10 mm și mai mari de 1 g, conform invenției 25

Claims (4)

1 2. înființarea culturii in vitro pentru obținerea de microtuberculi in vitro

Punctul de plecare în producerea microtuberculilor sunt plantulele crescute in vitro

1. Obținerea materialului inițial liber de virusuri, utilizând colții de cartof în noul procedeu de producere de microtuberculi in vitro, punctul de plecare îl 27 constituie colțul de cartof obținut din tuberculi testați inițial prin testul DAS ELISA (Doble Antibody Sandwich ELISA), care sunt detașați, dezinfectați și introduși în mediul de cultură 29 de creștere și înrădăcinare, utilizat la cartof, Murashige-Skoog (MS 1962). Culturile sunt apoi transferate în camera de creștere, fiind expuse unui regim de lumină de 4000 lucși, cu o 31 fotoperioadă de 16 h lumină, 8 h întuneric, la o temperatură de 22°C ±

2°C ziua, și 18...20°C ± 2°C noaptea. După aproximativ 3...4 săptămâni, colții formează plantule bine dezvoltate, 33 de 5...6 cm, care sunt supuse microbutășirii.

Fiecare minibutaș este inoculat apoi într-un mediu nutritiv de cultură, Murashighe-Skoog 35 (MS 1962), cu un adaos de acid alfanaftilacetic (ANA) în concentrație de 0,5 mg/l, pentru stimularea creșterii și înrădăcinării. Mediul a fost solidificat cu 0,7% Agar-Agar, iar pH-ul a 37 fost ajustat la 5,8 cu KOH înainte de autoclavare. Sterilizarea recipientelor cu mediu a fost făcută la 120°C, timp de 25 min. După inocularea minibutașilor, operație efectuată in incinta 39 hotei cu flux laminar steril, eprubetele sunt plasate în camera de creștere în aceleași condiții de temperatură și lumină ca la faza de creștere a culturii. După aproximativ 3...4 săptămâni, 41 s-a dezvoltat și a generat o nouă plantulă de circa 5...7 cm, care a fost secționată din nou, nod per nod, în minibutași. Fenomenul se repetă ori de câte ori este nevoie. Mediul de cultură 43 utilizat a facilitat, de fiecare dată, regenerarea din mugurele prezent la nivelul nodului, respectiv, la axila fiecărei frunzulițe (meristeme axilare), o plantulă completă, cu o tulpiniță bine conformată 45 și cu multe rădăcinuțe. Coeficientul de multiplicare esteîn jur de 4...5 la fiecare 3...4 săptămâni.

RO 128694 Β1

3 din segmente uninodale (microbutași) de cartof, ce sunt cultivate într-un mediu de bază solid M&S (Murashige-Skoog, 1962), specific fazei de creștere și înrădăcinare. Aceste plantule

5 dezvoltate, de 4...5 cm înălțime, se inoculează apoi orizontal, câte 4...5/cutie, în același mediul MS de creștere și înrădăcinare. După 3...4 săptămâni, din fiecare internod se vor

7 dezvolta noi plantule, peste care se adaugă 40 ml mediu de microtuberizare lichid, ce conține aceleași substanțe ca și mediul MS de creștere și înrădăcinare, dar cantitatea de soluție stoc

9 este redusă la jumătate, fiind completată cu kinetină, cumarină și zaharoză în concentrație de 80...90 g/l. Microtuberizarea are loc la întuneric, temperatura fiind de 20 ± 2°C.

11 3. Recoltarea microtuberculilor

După aproximativ 6.. .8 săptămâni, în funcție de genotip, se recoltează microtu bercul ii

13 și se calibrează (>10; 7,1; 5 mm) și se cântăresc. Noua metodă produce cea mai mare cantitate de microtuberculi >10 mm (fig. 2) și >1 g (fig. 3).

RO 128694 Β1

Revendicare 1

Procedeu de obținere a microtuberculilor de cartof in vitro, mai mari de 10 mm și mai 3 mari de 1 g, caracterizat prin aceea că din colți de cartofi sănătoși, inoculați pe mediu nutritiv de creștere și înrădăcinare, MS 1962, în camera de creștere, se obțin, după 3...4 săptămâni, 5 plantule de 5...6 cm, care se supun microbutășirii; fiecare microbutaș este apoi inoculat în mediu MS 1962, aditivatcu acid alfanaftil acetic și solidificat cu agar-agar; după 3...4 săptă- 7 mâni, din microbutași se formează o plantulă nouă, de 5...7 cm, care se secționează în minibutași, operația repetându-se de câte ori este nevoie, cu un coeficient de multiplicare, la 9 fiecare 3...4 săptămâni, de 4...5 ori; minibutașii rezultați se utilizează pentru producerea de microtuberculi, prin cultivarea acestora pe un mediu de bază solid MS1962, specific fazei de 11 creștere și înrădăcinare; plantulele de 4...5 cm rezultate se inoculează apoi orizontal, câte

4...5/cutie, în același mediu; după 3...4 săptămâni, noilor plantule dezvoltate din fiecare 13 internod li se adaugă mediu de tuberizare, ce conține kinetină, cumarină și zaharoză, în concentrație de 80...90 g/l, și, după 6...8 săptămâni, se recoltează microtuberculi mai mari 15 de 10 mm și mai mari de 1 g.