RO128689A2

RO128689A2 - Procedeu de biosecurizare a sistemelor recirculante de acvacultură intensivă prin stimularea răspunsului imun la peşti, prin utilizarea probioticelor

Info

Publication number: RO128689A2
Application number: ROA201101390A
Authority: RO
Inventors: Victor Cristea; Iulia Rodica Grecu; Lorena Dediu; Angelica Ionelia Docan; Elena Bocioc; Marilena Talpeş; Petru Niculiţa; Mona Popa; Mioara Costache; Cecilia Bucur
Original assignee: Universitatea "Dunărea De Jos" Din Galaţi
Priority date: 2011-12-12
Filing date: 2011-12-12
Publication date: 2013-08-30

Abstract

Prezenta invenţie se referă la un procedeu tehnologic de tratare a biomasei de cultură ciprinicole cu probiotic, în vederea obţinerii unei producţii superioare şi a biosecurizării sistemului recirculant de creştere prin stimularea sistemului imun al peştilor, prin folosirea unui produs probiotic pentru uz zootehnic, aditivat furajului într-o concentraţie de 3,2...3,84*10UFC/kg furaj. Procedeul conform invenţiei constă în aceea că se asigură exprimarea potenţialului bioproductiv al speciei, în vârstă de un an, prin creşterea sporului mediu zilnic cu 5...40% faţă de martor, concomitent cu stimularea răspunsului imun al gazdei, prin creşterea semnificativă a limfocitelor şi scăderea numărului de neutrofile la nivelul tabloului leucocitar, respectiv, prin creşterea cantităţii de hemoglobină şi a numărului de eritrocite.

Description

PROCEDEU DE BIOSECURIZARE A SISTEMELOR RECIRCULANTE DE ACVACULTURA INTENSIVĂ PRIN STIMULAREA RĂSPUNSULUI IMUN LA

PEȘTI PRIN UTILIZAREA PROBIOT1CELC4!

In sistemele de producție intensivă din acvacultura, ași. cum ;ste cazul sistemelor recirculante, organismele acvatice sunt expuse unor condiții slresarte de viata ce conduc deseori la declanșarea unor boli, mai ales de natură infecțioasă, si de deteriorarea rapida a condițiilor de viata ce se traduc in pierderi economice serioase. La momentul actual, prevenirea și controlul stărilor patologice au condus la o excalaoaie în utilizarea unor substanțe chimice în producția zootehnică care fie se acumulează în carnea si ficatul peștilor, fie conduce la apariția unor forme de rezistență la bacterii determinând o incidență crescută a îmbolnăvirilor.

O serie de studii experimentale au demonstrat faptul că acești agenți patogeni pot fi eliminați sau reduși prin procese de biocontrol exercitate de o seric de microorganisme considerate probiotice. Aceste probiotice, de cele mai multe ori bacterii benefice, au fost și sunt studiate și utilizate în nutriția umană și a animalelor terestre de n ai mult timp (Fuller, 1989; Bengmark, 1998) însă introducerea si aplicarea lor pentru preveni'ea și. eventual, controlul stării sanitare a populațiilor de organisme acvatice (pești, credeți) este de dată mai recentă (Balcazar, 2006; Gatesoupe, 1999; Gomez-Gil și al., 2000; Ve'schuere și al., 2000: Irianto și Austin, 2002) asigurând, simultan, atât reducerea probleme or de sănătate de la nivelul populațiilor acvatice de cultură, cât și îmbunătățirea supraviețuiri’ și ratei de creștere, în literatura de specialitate non-brevet s-au descris o serie de meca îisme de acțiune ale probioticelor: activitate antimicrobiană, furnizarea de nutrienți esențiali și asigurarea unor enzime digestive pentru stimularea nutriției și digestiei, îmbunătățirea calități: apei în unitățile de creștere și, nu în ultimul rând, stimularea răspunsului imun al gazdei. Sub aspectul exercitării unei acțiuni inhibante asupra proliferării unor bacterii patogene sau condiționat patogene care apar în sistemele de producție din acvacultura, micioorganismele de tip probiotic sunt apreciate, din ce in ce mai mult, ca o alternativă ecologică la tratamentul cu antibiotice.

Autoritatea Europeană pentru Siguranța Alimentelor (EFSA) a aprobat o serie de preparate probiotice ca aditivi alimentari cu uz zootehnic. Unul dintre aceste produse este aditivul BioPlus 2B de la firma Chr. Hansen A/S și care conține 2 tulpini de Bacillus·. Bacillus licheniformis DSM 5749 și Bacillus subtilis DSM 5750 în proporție 1:1 într-o concentrație de min. 3.2xl0⁹ UFC/g (1.6x10⁹ /tip bacterie) cu aplicabilitate demonstrată pentru păsări (pui, curcani) dar și pentru porci, iepuri (conform literaturii).

în general, conceptul de probiotic a fost dezvoltat la organismele terestre iar extinderea aplicației acestor bioproduse în acvacultură obligă la o analiză profundă în ceea ce privește efectul lor asupra unor organisme atât de diferite din punct de vedere al mediului de viață. în acvacultură, practica tehnologică a demonstrat faptul că vechiul dietei după care este cu mult mai ușor să previi decât să tratezi o boală este de importanță majoră în patologia animalelor acvatice, lupta împotriva îmbolnăvirilor prin profilaxie, având o importanță chiar mai mare decât în cazul vertebratelor terestre, date fiind caracteristicile mediului acvatic care îngreunează diagnosticul timpuriu al diferitelor boli, condiție esențială pentru împiedicarea la timp a extinderii acestora

Acțiunea probiotică a tulpinilor de Bacillus sp este cunoscută ca fiind legată de inhibarea proliferării unor bacterii patogene pentru organismul gazda prin fenomene de excludere competitivă (concurenta vitală și antagonism bacterian) prin producerea de bacitracină. Siguranța manipulării acestor bacterii se datorează caracteristicilor fizice și

Ο 1 1 - Ο 1 3 9 Ο - - ¢) ί 2 -12- 2011 biologice ale sporilor, preparatele microbiale fiind rezistente la condițiile de mediu (temperatură, pH, presiune osmotică, oxigen etc.) și cu o perioadă mai lungă de viață.

în literatura de specialitate au fost întâlnite doua studii restrâse de aplicabilitate a acestui produs în acvacultură: la larve de păstrăv (Naseri, S și al., 2008) și tilapia (Shelby R.A. și al., 2006).

Procedeul nostru urmărește aplicația acestui produs la o altă specie - crapul considerat o specie importantă din punct de vedere al acvaculturii din România în condițiile utilizării lui în cadrul unui sistem recirculant în scopul asigurării unor măsuri de prevenire și control al îmbolnăvirilor prin stimularea sistemului imunitaral peștilor.

Procedeul tehnologic conform invenției constă în aditivarea tulpinilor de bacterii Bacillus licheniformis DSM 5749 și Bacillus subtilis DSM 5750 într-o concentrație de 3,2 -3.84* 10⁹UFC per kg furaj administrat la creșterea crapului de 1 an pentru obținerea unui spor mediu zilnic cuprins între 5 19 % fata de materialul biologic netratat, în condiții de stres termic (valori suboptimale de 13.5-17 °C), respectiv între 26-40 % in condiții de optim de temperatură (22-27 °C)

Procedeul tehnologic presupune parcurgerea următorilor pași:

Analiza și caracterizarea microbiotei indigene a crapului sănătos de cultură

Selecția tulpinilor bacteriene cu potențial probiotic (comerciale și/sau indigene)

Testarea in vitro a modului de acțiune a bacteriilor selecționate, cu potențial rol probiotic, împotriva bacteriilor patogene din sistem

Testarea in vivo a modului de acțiune a bacteriilor selecționate, cu potențial rol probiotic Expunerea experiementală a unor loturi de pești la îmbolnăviri după tratarea in vivo cu bacteriile selecționate, cu potențial rol probiotic

- Testarea la scară a soluției tehnologice de asigurare a biosecurității sistemului recirculant de acavacultură pentru o perioada de timp semnificativa

Se dau în continuare, 2 exemple concrete de realizare a invenției și care sunt în corelație cu etapele descrise anterior si figurile:

Fig. 1 Aeromonas hydrophila, placa cu Agar nutritiv și galerie AP1 20NE

Fig. 2 Dinamica ritmului de creștere a biomasei de cultură

Fig.3. Variația coeficientului de conversie a hranei (FCR) și a ratei creșterii specifice (SGR)

Fig. 4. Evoluția hemoglobinei

Fig. 5. Evoluția hematocritului

Fig. 6. Evoluția numărului de eritrocite

Fig.7 Leucograma în varianta de control

Fig. 8. Leucograma în varianta cu BioPlus

Exemplul 1. Experiment in vitro privind evaluarea calitativă a sensibilității bacteriei patogene/condiționat patogene Aeromonas hydrophila la acțiunea tulpinilor probiotice din bioaditivul cu uz zootehnic BioPlus® 2B. Chiar dacă Aeromonadele sunt bacterii frecvente în mediul înconjurător, specia Aeromonas hydrophila din familia Vibrionaceae este considerată factorul primar determinant al septicemiei hemoragice bacteriene la pești, boală cu extensivitate mare în fermele piscicole. Este o bacterie Gram-negativă, sub formă de bastonaș, drept cu dimensiuni de 0,3 - 1,0 x 1,0 - 3,5 pm, mobilă. Este un microorganism puțin pretențios fiind izolat din rinichiul sau sângele peștelui afectat și crescut pe un mediu nutritiv uzual, cum este agarul nutritiv, pe care dezvoltă după 24 h, la 22 - 28 °C , colonii rotunde, cremoase, albe, netede, convexe, cu diametru până la 5 mm. Tulbură bulionul cu sau fără

Ο 1 1 - 0 1 3 9 0 -ί 2 -12- 2011 producere de pigment, este oxidazo-pozitivă și fermentează glucoza, maltoza, lactoza fiind ulterior confirmată cu testul API 20 NE.

Testarea s-a realizat prin metoda difuziei pe agar nutritiv (Piddock. 1990) în plăci Petri, cu o adâncime de 4 mm, suprafața mediului fiind inoculată cu câte 100 pl suspensie bacteriană pură de Aeromonas hydrophila izolată de la un exemplar bolnav de crap. Au fost testate 3 concentrații succesive din inolulul bacterian: 0,5; 1; 2; Mc Farland ce corespunde următoarelor concentrații:

0,5 Mc Farland echivalent cu 1,5 x 10⁷germeni / ml;

Mc Farland echivalent cu 3 x IO⁸ germeni / ml,

Mc Farland echivalent cu 6 xlO⁸germeni / ml

Pe plăci au fost testate 4 concentrații succesive din produsul probiotic: 1,28*IO⁹ UFC/g, l,28*10⁸/g, 1,28* IO⁷ UFC/g și 1,28* IO⁶ UFC/g pregătite în prealabil prin dispunerea, în condiții aseptice, a 20 μΙ suspensie probiotic pe discuri de hârtie de filtru sterile (d=6 mm). Discurile au fost ulterior repartizate pe suprafața mediului de cultură. în continuare plăcile Petri au fost incubate în condiții optime pentru creșterea bacteriei testate pentru o perioadă de 24 de ore. După incubare, plăcile Petri au fost examinate în vederea determinării zonelor de inhibiție în care bacteria nu a crescut, zone care se prezintă sub formă de halouri în jurul discurilor de hârtie. Exprimarea rezultatelor privind rezistența microorganismului testat s-a făcut în funcție de zona de inhibiție măsurată în milimetri. în general, microorganismul testat este considerat foarte sensibil dacă zona de inhibiție este > 30 - 35 mm în diametru, sensibil dacă zona de inhibiție este între 20 și 30 mm în diametru sau rezistent dacă zona de inhibiție este <15-20 mm.

Rezultatele experimentale sunt prezentate în tabelul 1 și au demonstrat faptul că tulpinile de Bacillus licheniformis (DSM 5749) și Bacillus subtilis (DSM 5750) prezintă activitate antimicrobiană față de tulpina de A. hydrophila, fapt evidențiat prin haloul dezvoltat în jurul discurilor de hârtie.

Combinațiile testate conform exemplu	ui 1 și rezultatele o	aținute:
Tulpina Aeromonas hydrophila (AH) utilizată	Concentrația produsului probiotic 1,28* IO⁹UFC/ml	Concentrația produsului probiotic 1,28* I0⁸UFC/ml	Concentrația produsului probiotic 1,28* IO⁷UFC/ml	Concentrația produsului probiotic 1,28* IO⁶UFC/ml
Inundare placă Agar cu 100 μΙ AH, concentrația de 0,5 Mc Farland	Sensibil	Sensibil	Sensibil	Rezistent
Inundare placă Agar cu 100 μΙ AH, concentrația de 1 Mc Farland	Sensibil	Sensibil	Sensibil	Rezistent
Inundare placă Agar cu 100 μΙ AH, concentrația de 2Mc Farland	Rezistent	Rezistent	Rezistent	Rezistent

Exemplul 2. Experiment in vivo privind efectul de stimulare a răspunsului imun al gazdei.

υ - 2 Ο 1 1 - 01 3 9 Ο - 1 2 -12' 2011

Experimentul a urmărit testarea efectului acestui probiotic asupra puietului de crap sub aspectul performanței de creștere și stării fiziologice. Alături de probioticul BioPlus® 2B au mai fost testate încă alte 2 probiotice, fiecare variantă experimentală fiind organizată pe trei replici iar probioticul comercial fiind adiționat în furajul granulat în aceeași concentrație, astfel:

variantă experimentală - VI - lot martor, hrănit cu furaj granulat tratat doar cu liantul de fixare a probioticului (însă fără probiotic)

A Il-a variantă experimentală - V2 - lot tratat cu probioticul BioPlus® 2B (uz veterinar), adiționat într-o concentrație de 3,2 * 10⁹CFU/kg furaj;

A 111-a variantă experimentală - V3 - lot tratat cu probioticul PI (uz veterinar), adiționat într-o concentrație de 3,2 χ IO⁹ CFU/kg furaj;

o A IV-a variantă experimentală - V4 - lot tratat cu probioticul P2 (uz uman), adiționat într-o concentrație de 3,2 χ IO⁹ CFU/kg furaj;

Experimentul s-a derulat pe o perioadă de 35 de zile, rația zilnică de furaj administrată a fost 3,5 % din greutatea totală a biomasei piscicole.

Rezultatele au arătat faptul că în cele trei tratamente experimentale cu probiotice s-au obținut sporuri de creștere semnificative (fig. 1), în condițiile unei supraviețuiri de 100% în toate subvariantele.

Sporul de creștere al biomasei de cultură a înregistrat valori mai mari la variantele tratate cu aditivi probiotici, sporul de creștere cel mai mic a fost în varianta martor (subvarianta sv2), iar cel mai mare spor de creștere a fost obținut în varianta cu probiotic BioPlus® 2B. De asemenea, cei doi indicatori tehnologici - rata creșterii specifice (SGR) și coeficientul de conversie a hranei (FCR) - arată cele mai mari valori pentru varianta tratamentului cu probioticul BioPlus® 2B (fig. 3)

Pentru evidențierea stimulării răspunsului imun, a fost analizat tabloul sanguin deoarece deoarece prin caracterizarea profilelor eritrocitar si leucocitar, mai precis prin stabilirea formulei leucocitare, putem obține rapid o serie de date privind modificările cantitative ale unor elemente celulare cu rol în apărarea nespecifică a organismului: granulocitele, fagocitele mononucleare si mastocitele. Aceste celule au un rol imunitar însemnat datorită activității fagocitare și a colaborării cu celule limfocitare care execută recunoașterea specifică a antigenului reprezentat de substanțele străine (virusuri, bacterii, toxine, ecto și endoparaziți etc.). Activitatea lor este deosebit de importantă deoarece sunt răspândite, practic, în tot organismul și sunt ușor de mobilizat, iar foarte multe dintre ele au acțiune fagocitară și elaborează enzime digestive puternice.

Astfel, in fig 4, 5 și 6 sunt indicate variațiile parametrilor hematologici; hemoglobina, hematocrit și număr de eritrocite.

In ceea ce privește evoluția tabloului leucocitar, putem aprecia ca stimularea răspunsului imun s-a realizat prin stimularea numărului de limfocite (limfocitoză), însoțită de o ușoară scădere a granulocitelor neutrofile (neutropenie), conform fig. 7 si 8.

Procedeul conform invenției conduce la următoarele avantaje:

permite obținerea unor sporuri de creștere superioare a biomasei de cultură stimulează sistemul imunitar al peștilor are avizul utilizării la animalele terestre in Comunitatea Europeana, speciile de BaciIlus fiin apreciate ca specii probiotice rezistente la diferite condiții de mediu simplitate tehnologica și preț de cost scăzut

^-2011-01390-1 2 -12- 2011

BIBLIOGRAFIE

Balcăzar, J.L., de Blas, 1., Ruiz-Zarzuela, 1., Cunningham, D., Vendrell, D., Mhzquiz, J.L., 2006. The role of probiotics in aquaculture. Vet. Microbiol. 114: 173-186.

Bengmark, S., 1998. Ecological control of the gastrointestinal tract. The role of probiotic flora. Gut 42, 2-7.

Fuller, R., 1989. Probiotics in man and animals. J. Appl. Bacteriol. 66, 365-378.

Gatesoupe, F.J., 1999. The use of probiotics in aquaculture, Aquaculture 180, 147-165.

Naseri Samira*,Nezami Balouchi Shaaban Ali,Khara Hossein,Farzanfar A., Lashtou Aghaei Gh.R.,Shakouri Matin. 2008. The study of growth performance of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) larvae with different levels of probiotic and iron in use of supplemented in diet. Journal of Fisheries Fall 2008; 2(3): 15-20.

Piddock, L.J.V., 1990. A review. Techniques used for the determination of antibacterial resistance and sensitive in bacteria. J. Appl. Bacteriol., 68: 307-18

Shelby RA, Lim CE, Aksoy M, Klesius PH. 2006. Effect of probiotic diet supplements on disease resistance and immune response of young Nile tilapia, Oreochromis mloticus. J Appl Aquac 18: 23-34.

Welker T.L., C. Lim. 2011. Use of Probiotics in Diets of Tilapia. Aquac Res Development 2011, S1, http://dx.d0i.0rg/l0.4172/2155-9546.S 1 -014

Claims

t 2 -12- 2011

REVENDICARE

Procedeu tehnologic de tratarea a biomasei de cultură ciprinicole cu un produs probiotic de uz zootehnic aditivat furajului administrat într-o concentrație de 3,2-3,84* IO⁹ UFC/kg furaj probiotice și care permite obținerea unei producții superioare (creșterea sporului mediu zilnic cu 5-40 % față de martor) și biosecurizarea sistemului recirculant de creștere prin stimularea sistemului imun al peștilor.