KR20170082484A - 락토바실러스 플란타룸 ｆｇｌ０００１ 및 이를 이용한 어류의 면역 증진 방법 - Google Patents

락토바실러스 플란타룸 ｆｇｌ０００１ 및 이를 이용한 어류의 면역 증진 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20170082484A
KR20170082484A KR1020170084420A KR20170084420A KR20170082484A KR 20170082484 A KR20170082484 A KR 20170082484A KR 1020170084420 A KR1020170084420 A KR 1020170084420A KR 20170084420 A KR20170084420 A KR 20170084420A KR 20170082484 A KR20170082484 A KR 20170082484A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
fgl0001
lactobacillus plantarum
fish
feed
medium
Prior art date
Application number
KR1020170084420A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102054780B1 (ko
Inventor
백보람
김다니엘
송성규
도형기
Original Assignee
주식회사 이뮤너스
한동대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 이뮤너스, 한동대학교 산학협력단 filed Critical 주식회사 이뮤너스
Priority to KR1020170084420A priority Critical patent/KR102054780B1/ko
Publication of KR20170082484A publication Critical patent/KR20170082484A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102054780B1 publication Critical patent/KR102054780B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
    • A23K10/16—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
    • A23K50/80—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for aquatic animals, e.g. fish, crustaceans or molluscs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A61K35/747—Lactobacilli, e.g. L. acidophilus or L. brevis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • C12R1/25—
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus
    • C12R2001/25—Lactobacillus plantarum

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Fodder In General (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 아라비노스(arabinose) 및 리보스(ribose)의 분해능이 있으며, 에스쿨린(Esculine) 및 자일로스(xylose)의 분해능이 없고, 기탁번호 KCTC 12704BP로 기탁된, 락토바실러스 플란타룸 FGL0001에 대한 것이다. 또한 본 발명은 상기 락토바실러스 플란타룸 FGL0001를 이용한 어류의 면역 증진 방법에 대한 것이다.

Description

락토바실러스 플란타룸 ＦＧＬ０００１ 및 이를 이용한 어류의 면역 증진 방법{LACTOBACILLUS PLANTARUM FGL0001 AND METHOD FOR ENHANCING IMMUNITY OF FISH USING IT}
본 발명은 락토바실러스 플란타룸 FGL0001 및 이를 이용한 어류의 면역 증진 방법에 대한 것이다.
최근 양식 기술의 발전에 힘입어, 어류 양식이 널리 이루어지고 있다. 이러한 어류 양식은 대규모의 어류를 한번에 양식장에서 키우게 되는데, 이 때, 어병이 한 번 발생하면 집단폐사로 이어지는 경우가 많다. 그러므로 현재 어병 예방을 위한 백신, 항생제, 사료 첨가제 등이 연구, 개발되고 있다(한국공개특허 10-2013-0013965호 등).
본 발명자들은 유산균을 이용하여 양식 어류의 면역력을 높이고 항어병 효과를 증진시키는 방안을 연구하던 중 신규 균주인 락토바실러스 플란타룸를 확인하고, 이를 이용 시 양식 어류의 면역을 증진시킬 수 있는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 신규한 유산균 및 이를 이용한 어류의 면역 증진 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 기탁번호 KCTC 12704BP로 기탁된, 락토바실러스 플란타룸 FGL0001 및 이를 이용한 어류의 면역 증진 방법을 제공한다.
본 발명의 기탁번호 KCTC 12704BP로 기탁된, 락토바실러스 플란타룸 FGL0001을 이용 시, 어류의 면역능이 증진되고, 어병균에 대한 저항성이 커지게 된다.
도 1은 락토바실러스 플란타룸 FGL0001의 16S rRNA 염기서열의 확인 결과를 나타낸다.
도 2는 락토바실러스 플란타룸 FGL0001의 위장 통과 모방 실험 결과를 나타낸다.
도 3은 유산균 식이에 의한 각 선천면역 지표들의 상승 결과를 나타낸다(A: 리소자임 B: 대식세포 대식능 C: NBT 환원능).
도 4는 유산균 식이군들에서 IL-6, IL-8, TNFα의 발현량을 측정한 결과이다(A: IL-6 B: IL-8 C: TNFα).
도 5는 락토바실러스 플란타룸 FGL0001 식이군에서 TGF-β의 증가를 보여준다.
도 6은 유산균 식이군의 증체률을 나타낸다.
도 7은 스트렙토코커스 이니애 공격 감염 시 유산균 식이군의 생존률을 나타낸다.
본 발명은 락토바실러스 플란타룸 FGL0001에 대한 것이다.
본 발명은 락토바실러스 플란타룸 FGL0001을 준비하는 단계;
상기 락토바실러스 플란타룸 FGL0001를 어류에 처리하는 단계를 포함하는, 어류의 면역 증진 방법에 대한 것이다.
본 발명은 락토바실러스 플란타룸 FGL0001을 포함하는 면역 증진용 사료 첨가제에 대한 것이다.
본 발명은 락토바실러스 플란타룸 FGL0001을 포함하는 면역 증진용 사료에 대한 것이다.
본 발명은 락토바실러스 플란타룸 FGL0001을 포함하는 어류 양식용 면역 증진제에 대한 것이다.
이하, 본 발명을 자세히 설명한다.
어류
본 발명의 어류는 양식이 가능한 어류이다. 바람직하게는 본 발명의 어류는 스트랩토코커스 이니애에 감염 시 폐사율, 즉 치사율이 감염되지 않을 때의 폐사율보다 유의하게 증가하는 종류의 어류이며, 바람직하게는 넙치이다.
락토바실러스 플란타룸 FGL0001
본 발명은 기탁번호 KCTC 12704BP로 기탁된, 락토바실러스 플란타룸 FGL0001에 대한 것이다.
상기 락토바실러스 플란타룸 FGL0001은 아라비노스(arabinose) 및 리보스(ribose)의 분해능이 있다. 바람직하게는 상기 락토바실러스 플란타룸 FGL0001은 L-아라비노스(arabinose), 리보스(ribose), 갈락토스(galactose), 글루코스(glucose), 프럭토스(fructose), 만노스(mannose), 만니톨(mannitol), 소르비톨(sorbitol), 메틸-알파-D-만노피라노사이드(Methyl-αD-Mannopyranoside), 아세틸글루코사민(Acetylglucosamine), 아미그달린(Amygdaline), 알부틴(Arbutine), 살리신(Salicine), 셀로비오스(Cellobiose), 말토스(Maltose), 락토스(Lactose), 멜리보스(Melibose), 수크로스(Sucrose), 트레할로스(Trehalose), 인슐린(insulin), 멜레지토스(Melezitose), 라피노스(Raffinose), 게니토비오스(Gentiobiose), 투라노스(Turanose), 포타슘 글루코네이트(Potassium Gluconate)의 분해능이 있다.
상기 락토바실러스 플란타룸 FGL0001은 에스쿨린(Esculine) 및 자일로스(xylose)의 분해능이 없다. 바람직하게는 상기 락토바실러스 플란타룸 FGL0001은 글리세롤(Glycerol), 에리스리톨(Erythritol), D-아라비노스(Arabinose), 자일로스(xylose), 아도니톨(Adonitol), 메틸-베타-D-자일로피라노사이드(Methyl-βD-Xylopyranoside), 소르보스(Sorbose), 둘시톨(Dulcitol), 이노시톨(Inositol), 메틸-알파-D-글루코피라노사이드(Methyl-αD-Glucopyranoside), 에스쿨린(Esculine)(Ferric citrate), 전분(Starch), 글리코겐(Glycogen), 자일리톨(Xylitol), 릭소오스(Lyxose), 타가토스(Tagatose), 푸코스(Fucose), L-아라비톨(Arabitol), 포타슘-2-케토글루코네이트(Potassium 2-Ketogluconate), 포타슘-5-케토글루코네이트(Potassium 5-Ketogluconate) 분해능이 없다.
또한 락토바실러스 플란타룸 FGL0001은 L-람노스(Rhamnose) 및 D-아라비톨(Arabitol)에 대하여는 약한 분해능을 갖는다.
본 발명의 락토바실러스 플란타룸 FGL0001은 0 이상 6 %(W/V) 이하의 염분을 갖는 배지에 접종 시 내염성을 가지며, 성장이 가능하다. 그러나 락토바실러스 플란타룸 FGL0001은 7 %(W/V) 이상의 염분을 갖는 배지에 접종 시 성장이 저해되어 성장하지 못한다.
또한 락토바실러스 플란타룸 FGL0001은 어병균에 대한 항균성을 갖는다. 예컨대, 락토바실러스 플란타룸 FGL0001은 스트렙토코커스 이니애 및 스트렙토코커스 파라우베리스에 강한 항균성을 가지며, 락토코커스 가비애에 대해서도 유의한 항균성을 갖는다. 한편, 락토바실러스 플란타룸 FGL0001은 MRS 배지에 도말한 에드바드시엘라 타르다(Edwardsiella tarda)에 대하여는 항균성을 갖지 않는다. 그러나 락토바실러스 플란타룸 FGL0001은 BHI (Brain Heart Infusion) 배지에 MnCl2, MgCl2를 첨가한 배지, 또는 MRS (de Man Rogosa Sharpe) 배지와 BHI 배지를 혼합한 배지에 도말한 에드바드시엘라 타르다(Edwardsiella tarda)에 대하여는 항균성을 갖는다.
락토바실러스 플란타룸 FGL0001은 티로신, 히스티딘, 오르니틴 및 라이신으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 생체 아민에 대하여 생성능이 없다. 또한 락토바실러스 플란타룸 FGL0001은 pH3에서 생존능을 가지며, 생균 수의 변화가 없다.
락토바실러스 플란타룸 FGL0001의 처리
본 발명의 어류에 락토바실러스 플란타룸 FGL0001를 처리하는 단계는 락토바실러스 플란타룸 FGL00010를 어류 양식 수조에 첨가하여 수행되거나, 상기 락토바실러스 플란타룸 FGL0001를 포함하는 사료를 어류에 공급하여 수행될 수 있다. 이 때, 상기 사료는 락토바실러스 플란타룸 FGL0001을 1x106 CFU/g를 초과하는 농도로 포함하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 5x106 CFU/g 이상의 농도로 포함한다.
락토바실러스 플란타룸 FGL0001의 처리에 의하여 어류의 피부 점액의 라이소자임 분비량이 증가하게 된다. 또한 락토바실러스 플란타룸 FGL0001의 처리에 의하여 어류의 대식세포의 대식능이 증가하게 된다. 또한 락토바실러스 플란타룸 FGL0001의 처리에 의하여 어류의 인터루킨 6, 인터루킨 8 또는 TNF알파의 발현량이 증가하게 되며, 어류의 TGF-베타의 발현량이 증가하게 된다. 또한 락토바실러스 플란타룸 FGL0001의 처리에 의하여 스트렙토코커스 이니애의 감염 시 어류의 생존률이 증가하게 된다.
또한 어류에 락토바실러스 플란타룸 FGL0001를 처리함으로써, 어류의 면역능, 사료 효율 및 성장율이 증가하게 된다.
어류에 락토바실러스 플란타룸 FGL0001를 처리하는 단계는 락토바실러스 플란타룸 FGL0001을 락토코커스 락티스 BFE920과 함께 어류에 첨가하여 수행될 수 있다. 이 때, 락토코커스 락티스 BFE920는 락토바실러스 플란타룸 FGL000과 함께 락토바실러스 플란타룸 FGL000와 동일한 방법으로 어류에 첨가될 수 있다. 락토바실러스 플란타룸 FGL0001가 락토코커스 락티스 BFE920과 함께 첨가 시 양 유산균들은 1:0.3 내지 1.5의 비율(기준: CFU/g)로 혼합하여 첨가될 수 있으며, 바람직하게는 동량(즉 예컨대, 107 CFU/g )으로 혼합되어 첨가될 수 있다.
면역 증진
본 발명은 어류에 락토바실러스 플란타룸 FGL0001를 처리함으로써, 어류의 면역을 증진시키게 된다. 그러므로 상기 락토바실러스 플란타룸 FGL0001 처리에 의하여 어류 양식 시, 어류의 폐사율이 낮아질 뿐 아니라, 스트랩토코커스 이니애에 감염이 되더라도 어류의 치사율이 낮아지게 된다.
사료, 사료 첨가제, 면역 증진제
본 발명은 락토바실러스 플란타룸 FGL0001를 포함하는 사료, 사료 첨가제, 면역 증진제 등에 대한 것이다. 상기 사료, 사료 첨가제, 면역 증진제 등은 어류 양식용 사료, 사료 첨가제, 면역 증진제 등이 바람직하다.
상기 사료, 사료 첨가제, 면역 증진제은 각각 락토바실러스 플란타룸 FGL0001 외 락토코커스 락티스 BFE920를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
<실험예 1> 락토바실러스 플란타룸 FGL0001의 분리 및 확인
<1-1>
2011년 11월에 800 g 중량의 넙치를 경상북도 사료연구센터에서 제공받았다. 상기 넙치의 장을 적출하여 생리식염수에 10배율 단계 희석을 하여 MRS agar (Difco사) 에 각 농도 별로 도말하였다. 그 후 30 ℃에서 하루 동안 배양 후 나타나는 콜로니들을 3% 과산화수소수에 반응하여 Catalase 음성인 균들 중 당분해능 및 16S rRNA 염기서열을 통해 락토바실러스 플란타룸 FGL0001을 골라내었다.
<1-2>
상기 <1-1>에서 분리한 균을 16S rRNA 시퀀싱(sequencing)을 하였다. 그 결과 Lactobacillus plantarum isolate 8 (Genebank number: HF677504) 과 99%로 높은 상동성을 보여, 락토바실러스 플란타룸인 것을 확인하였다. 하지만 락토바실러스 플란타룸 FGL0001의 16S rRNA(서열번호 1)은 HF677504과는 달리, 1개의 염기서열이 삭제되어 있는 것으로 나타났다(도 1). 도 1은 16S rRNA 염기서열의 차이점을 나타내는 NCBI의 BLAST의 결과를 캡쳐한 도면이다. 상기 차이점 부분들은 빨간색 및 검은 밑줄로 표시하였다.
<실험예 2> 락토바실러스 플란타룸 FGL0001의 특성
<2-1> 당 분해능
락토바실러스 플란타룸 FGL0001의 당 분해능 실험은 하기의 방법으로 수행되었다. 이는 API® 50CHL Kit (Biomerieux사)을 이용하여 제공된 매뉴얼대로 실험을 진행하였다. 간략하게 제공되는 용액에 L. platnarum FGL0001을 현탁하고, 종류별로 당이 제공되는 채널에 적정량을 넣고 30 ℃에서 하루 동안 배양하였다.
그 결과는 표 1과 같다. 이를 보면, 락토바실러스 플란타룸 FGL0001은 L-아라비노스(arabinose), 리보스(ribose), 갈락토스(galactose), 글루코스(glucose), 프럭토스(fructose), 만노스(mannose), 만니톨(mannitol), 소르비톨(sorbitol), 메틸-알파-D-만노피라노사이드(Methyl-αD-Mannopyranoside), 아세틸글루코사민(Acetylglucosamine), 아미그달린(Amygdaline), 알부틴(Arbutine), 살리신(Salicine), 셀로비오스(Cellobiose), 말토스(Maltose), 락토스(Lactose), 멜리보스(Melibose), 수크로스(Sucrose), 트레할로스(Trehalose), 인슐린(insulin), 멜레지토스(Melezitose), 라피노스(Raffinose), 게니토비오스(Gentiobiose), 투라노스(Turanose), 포타슘 글루코네이트(Potassium Gluconate)의 분해능이 있는 것으로 확인되었다.
그러나 락토바실러스 플란타룸 FGL0001은 글리세롤(Glycerol), 에리스리톨(Erythritol), D-아라비노스(Arabinose), 자일로스(xylose), 아도니톨(Adonitol), 메틸-베타-D-자일로피라노사이드(Methyl-βD-Xylopyranoside), 소르보스(Sorbose), 둘시톨(Dulcitol), 이노시톨(Inositol), 메틸-알파-D-글루코피라노사이드(Methyl-αD-Glucopyranoside), 에스쿨린(Esculine)(Ferric citrate), 전분(Starch), 글리코겐(Glycogen), 자일리톨(Xylitol), 릭소오스(Lyxose), 타가토스(Tagatose), 푸코스(Fucose), L-아라비톨(Arabitol), 포타슘-2-케토글루코네이트(Potassium 2-Ketogluconate), 포타슘-5-케토글루코네이트(Potassium 5-Ketogluconate) 분해능은 없는 것으로 확인되었다.
또한 락토바실러스 플란타룸 FGL0001은 L-람노스(Rhamnose) 및 D-아라비톨(Arabitol)에 대하여는 약한 분해능을 보였다.
이러한 락토바실러스 플란타룸 FGL0001의 당 분해능은 기존의 락토바실러스 플란타룸들과는 다른 특성으로 판단되었다. 예컨대, Hammes, W.P., Hertel, C., 2006. The genera Lactobacillus and Carnobacterium, in: Dworkin, M., Falkow, S., Rosenberg, E., Schleifer, K., Stackebrandt, E. (Eds.), The Prokaryotes: a handbook on the biology of bacteria: Firmicutes, Cyanobacteria, Volume 4, Third edition. Springer-Verlag, New York, pp. 320-403.에는 락토바실러스 플란타룸이 에스쿨린(Esculine) 및 자일로스(xylose)의 분해능을 갖는 것으로 기재되어 있는데, 락토바실러스 플란타룸 FGL0001은 에스쿨린(Esculine) 및 자일로스(xylose)를 분해하지 못한다.
Figure pat00001
<2-2> 내염성
락토바실러스 플란타룸 FGL0001의 내염성을 평가하였다. 구체적인 내염성 평가 방법은 하기와 같다. MRS agar 배지에 NaCl을 농도별로 1 내지 10% (w/v) 로 1 %(W/V) 단위로 첨가하여 배지를 준비하였다. 락토바실러스 플란타룸 FGL0001을 해당 NaCl 농도별 배지에 각각 루프(백금이)로 접종하여 하루 동안 30℃에 배양하여 Colony가 나타나는지 여부를 확인하였다.
그 결과, 락토바실러스 플란타룸 FGL0001은 0 내지 6 %(W/V)까지의 염분 내성을 가지고 있는 것으로 나타났다. 그러나 락토바실러스 플란타룸 FGL0001은 7% 농도의 염분부터는 자라지 못했다.
<2-3> 항균성 평가
박테리오신(Bacteriocin) 분석을 통하여 항균성을 평가하였다. 구체적인 평가 방법은 하기와 같다. 4종의 어류 질병균 (스트렙토코커스 이니애(Streptococcus iniae) FP5228(국립수산과학원으로부터 제공 받음), 스트렙토코커스 파라우베리스(S. parauberis) PLAB0001(방어 장으로부터 직접 분리), 락토코커스 가비애(Lactococcus garveiae) PLAB0003(조피볼락 장으로부터 직접 분리), 에드바드시엘라 타르다(Edwardsiella tarda) FP5060(국립수산과학원으로부터 제공 받음),)을 하루 동안 완전히 배양한 배양액을 100 μL씩 BHI agar (Brain heart infusion, Difco)에 도말하였다. 병원균이 도말된 배지위에 8mm 지름의 원형 filter paper (Advantec)을 올린 후, 하루동안 배양한 락토바실러스 플란타룸 FGL0001을 filter paper에 50 μL씩 각각의 배지에 접종하였다. 하루 동안 30℃에서 배양한 뒤 filter paper 주변으로 투명한 halo가 나타나는지를 확인하였다.
그 결과, 락토바실러스 플란타룸 FGL0001은 어병균에 대한 항균성을 갖는 것으로 확인되었다. 특히, 락토바실러스 플란타룸 FGL0001은 스트렙토코커스 이니애 및 스트렙토코커스 파라우베리스에 가장 강한 항균성 (억제 구역 지름 20 - 25 mm)을 나타냈다. 락토코커스 가비애에 대해서는 상대적으로 낮은 항균력 (억제 구역 지름 약 14 mm)을 보였다. 한편, 에드바드시엘라 타르다에 대해서는 조건부로 항균성을 나타내었다. 즉, 락토바실러스 플란타룸 FGL0001의 에드바드시엘라 타르다에 대한 항균성은 MnCl2, MgCl2를 BHI배지에 보충을 해주거나, MRS와 BHI를 혼합한 배지에서 나타났다.
Figure pat00002
<2-3> 생체 아민 생성능 평가
락토바실러스 플란타룸 FGL0001이 생체 아민(Biogenic amine)을 생산하는지 여부를 평가하였다. 본 생체 아민 생성능 평가는 Bover-Cid, Sara., WH Holzapfel. (1999) Improved screening procedure for biogenic amine production by lactic acid bacteria. Int. Jour. of Food Microbiol. 53:33-41에 기재된 방법을 이용하여 수행하였다. 즉, 티로신(tyrosine), 히스티딘(histidine), 오르니틴(ornithine) 및 라이신(lysine)이 첨가된 배지에 락토바실러스 플란타룸 FGL0001를 접종하였다. 그리고 하루 동안 30 ℃에 배양하여 콜로니 주변으로 검은색이 나타나는지 여부를 확인하였다.
그 결과, 락토바실러스 플란타룸 FGL0001은 생체 아민(Biogenic amine)을 생성하지 않는 것으로 나타났다. 생체 아민들 중 히스타민(histamine)과 같은 경우 알러지를 유발 할 수 있기에 이를 생성하지 않는 균주일수록 식품첨가물로써 안전하다.
<2-4> 위장 및 십이지장 통과 시험(SSDP)
락토바실러스 플란타룸 FGL0001에 대하여 위장 및 십이지장 통과 시험(SSDP)을 수행하였다. 이는 Charteris, WP., PM Kelly, L. Morelli and JK Collins. (1998) Development and application of an in vitro methodology to determine the transit tolerance of potentially probiotic Lactobacillus and Bifidobacterium species in the upper human gastrointestinal tract. Jour. of Appl. Microbiol. 84:759-768에 기재된 방법을 이용하여 수행하였다. 즉, 위장과 십이지장을 통과할 때와 유사한 액상환경에서 균을 배양하고, 그 생존율을 평가하였다.
구체적인 시험 방법은 하기와 같다. 하기 표 3의 조성을 갖는 시약 A 내지 C를 준비하고, 이를 이용하여 하기 1) 내지 5)의 방법으로 락토바실러스 플란타룸 FGL0001를 액상 환경에서 배양하였다.
Figure pat00003
1) 시약 A 10 ml에 최종 균의 농도가 2 x 107 CFU/ml 되도록 접종한 뒤 한 시간 동안 37℃에서 배양한다.
2) 1)의 배양액 1 ml을 취하여 CFU를 계수하기 위하여 MRS agar에 도말을 한다.
3) 4 ml의 시약 C를 넣고 직후에 17 ml의 시약 B를 첨가하여 1시간 배양한다.
4) 3)의 배양액 1 ml을 취하여 CFU를 계수하기 위한 MRS agar에 도말을 한다.
5) 1시간 추가 배양 후 다시 배양액 1 ml을 취하여 MRS agar에 도말을 한다.
그 결과, 위장(즉, 시약 A)을 통과할 때에는 생균 수의 변화가 없었으나, 담즙과 만나는 십이지장에서 초기에 생균수가 Log 2.0가량 (약 100배) 줄어들었다가 점차 회복되는 양상을 보였다. 이는 락토바실러스 플란타룸 FGL0001이 유용균으로써 장을 살아있는 채로 통과하고 정착될 수 있는 가능성을 시사한다(도 2).
<2-5> 기탁
상기 <2-1> 내지 <2-4>의 평가를 마친 락토바실러스 플란타룸 FGL0001를 미생물자원센터에 2014년 11월 7일 기탁하였다(기탁번호 KCTC 12704BP).
<실험예 3> 어류의 선천면역력 증가능 평가
<재료 및 방법>
실험 동물
그룹별 30마리씩의 넙치 유어들을 대조군, 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) BFE920(KCCM 11383P), 락토바실러스 플란타룸 FGL0001 식이군으로 준비하였다. 상기 총 60마리의 넙치 유어 (평균 37.5 ± 1.26 g)를 폐쇄순환식 (Closed-circulating) 250 L 수조에 넣고 실험하였다. 실험에 앞서 일주일간 18-19 ℃ 의 해수에서 안정화를 거쳤다.
유산균 급여 시험 및 장기 적출
넙치들은 10:00와 18:00에 일 2회 만복 급여를 한달 간 하였으며, 대조군은 일반 사료 (천하제일사료; 대전)를 식이하였다. 각 유산균 급여군의 사료는 109 CFU/ml으로 배양한 균액을 1% v/w 비율로 혼합하여 최종 사료 중량 g 당 107 CFU (107 CFU/g)을 흡착하였다. 혼합 유산균(이하 Mix) 는 락토코커스 락티스 BFE920(이하, "LL"이라 함)과 락토바실러스 플란타룸 FGL0001 (이하, "LP"라 함)을 동일한 생균 량으로 혼합한 후, 상기와 같이 사료에 흡착하여 준비하였다. 급여 30일째에, 각 그룹에서 3마리씩 얻어 혈액, 전신, 비장, 장을 적출해 내었다.
대식세포 대식능 측정
넙치의 전신 조직을 70 μm nylon mesh 로 분쇄하여 RPMI medium에 균질화하였다. 적혈구는 RBC lysis buffer (G-DEXTM II genomic DNA extraction kit, iNtRON Biotechnology, Korea) 로 2분간 처리함으로 제거하고, 순수 전신 세포들만 1,000g 에서 10분간 원심분리 및 회수하여 1 x 105 개의 세포를 96-well 배양판에 seeding하였다. CytoSelectTM 96-Well Phagocytosis Assay (Zymosan) kit (CELL BIOLAB, INC., USA) 을 이용하여 제공되는 매뉴얼에 따라 실험을 진행하였다. 단, 이때 반응 온도는 20 ℃ 변형하였다. 색변화의 정도를 SPECTROstar Nano microplate reader (BMG LABTECH, Germany) 를 이용하여 흡광도 405 nm 파장으로 측정하였다.
Nitro blue tetrazolium ( NBT ) 환원능 실험
헤파린을 처리한 혈액 50 μL과 50 μL (0.2 % w/v) NBT 용액 (SIGMA-ALDRICH; St. Louis, Mo, USA)을 함께 실온에서 30분간 반응시켰다. 그리고 400 μL of N, N-dimethylformamide (SIGMA-ALDRICH, St. Louis, Mo, USA) 를 넣어 세포를 분쇄하고 13,000 rpm에서 10분간 원심분리 후 흡광도를 620 nm에서 측정하였다.
피부 점액의 라이소자임 ( lysozyme ) 활성 평가
넙치를 물에서 건진 후 중력을 이용하여 잔여 해수를 제거하고 1 mL 피펫팁의 옆 면을 이용하여 부드럽게 점액을 긁어 모았다. EnzChek® Lysozyme Assay Kit (Life Technology, USA) 를 이용하여 점액에 존재하는 라이소자임(lysozyme)의 활성도를 측정하였다. 제공되는 매뉴얼에 따라 실험하였으며, 점액 50 μL 부터 원액의 2배 희석을 샘플로 하여 실험하였고 달걀 흰자의 lysozyme (0 Units/mL 에서 250 Units/mL)을 표준치로 하여 측정하였다.
상대적 사이토카인 발현량 평가
상대적 사이토카인 발현량은 quantitative real time polymerase chain reaction (qRT-PCR) 을 이용하여 측정하였다. 총 RNA를 각 조직을 얻어내어 1 mL TRIzol® Reagent (Invitrogen, USA) 를 이용하여 추출하였으며, 첫번째 가닥 cDNA를 SuperScript® III reverse transcriptase (Invitrogen, USA) 로 합성하였다. PCR 반응은 StepOnePlusTM PCR System (Invitrogen, USA) 으로 94 ℃에서 2분 반응 후, 94 ℃에서 30초; 60 ℃에서 40초; 72 ℃에서 40초 반응의 40회 반복하여 진행하였다. 이때 사용한 프라이머들은 하기 표 4와 같다.
Figure pat00004
증체률 평가
실험 시작 전에 최초 무게를 기록하고 급여 30일째에 각 실험군의 임의의 5마리를 측정하였다. 측정은 6번 반복함으로써 통계처리를 하였다. 증체률은 하기 <식 1>에 따라 계산하였다.
<식 1>
증체률 = {(최종 중량 - 최초 중량)/(최초 중량)}X 100
공격감염 시험
급여 실험 30일째에 장내 잔류하는 물질에 의한 차이를 없애기 위해 하루 급여를 중단한 뒤, 각 실험군들 중 20마리 씩 106 CFU S. iniae FP5228 를 (Fish Pathology Division, National Fisheries Research & Development Institute, Busan, Korea) 복강으로 주사하였다. 하루 10:00와 22:00에 사망하는 개체를 확인하였다. 생존 그래프는 Graph Pad Prism 5를 이용하여 생성하였다. 본 실험은 2번 반복되었다.
통계 분석
The unpaired two-tailed Student’s t-test 를 이용하여 인 비트로 실험들을 통계 처리하였다. 생존률은 log-rank and Gehan-Breslow-Wilcoxon tests를 이용하여 통계 분석 하였다. 유의미성은 다음과 같다: *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001.
<결과>
유산균 식이에 의한 선천면역 지표들의 상승
유산균 식이에 의하여 선천면역 지표가 상승한 것이 확인되었다. LL, LP 그리고 Mix 사료를 한달 간 일반 사료와 함께 식이함으로써 피부 점액 라이소자임(lysozyme)의 증가가 확인되었다. (도 3A). 또한, 대식 세포의 대식능도 증가하였으며(도 3B), NBT의 환원 수치도 대조군에 비하여 높았다(도 3C). 특히, 라이소자임, 대식세포의 대식능은 LP, 즉 락토바실러스 플란타룸 FGL0001 식이군이 LL, 즉 락토코커스 락티스 BFE920 식이군보다 높았으며, 이 둘을 혼합 처리할 때, 그 효과가 더욱 증대된 것으로 나타났다.
NBT 환원 정도와 대식능의 증가는 수지상세포, 대식세포 그리고 호중구의 세포들이 활성화 되었음을 의미한다. 또한 점액 라이소자임의 역할은 면역기전에 있어 가장 첫 번째 방벽으로 어류 면역에 있어 매우 중요한 지표 중 하나이다. 어류의 라이소자임은 그람양성과 그람음성의 세균들에게 분해활성이 있고 보체를 활성화 시키는 것으로 알려져 있다. 그러므로 이러한 선천면역의 지표 증가가 유산균 식이군의 S. iniae 공격감염에 대한 생존률에 기여할 것으로 판단되었다.
장내 사이토카인의 상대적 발현량
IL-6, IL-8, TNFα의 발현량이 일반 사료를 식이한 대조군(Ctrl)에 비해 유산균을 식이한 실험군이 더 높게 측정 되었다. 특히, LP, 즉 락토바실러스 플란타룸 FGL0001 식이군이 LL, 즉 락토코커스 락티스 BFE920 식이군보다 IL-6, IL-8, TNFα 의 발현량들이 모두 높았다. 또한 이 둘을 혼합 처리할 때(Mix), 좀 더 사이토카인의 발현량이 높게 측정되는 경향성을 나타냈으나, 통계적으로 유의한 정도는 아니었다(도 4).
한편, LP, 즉 락토바실러스 플란타룸 FGL0001 식이군의 경우 IL-6, IL-8, TNFα 외 TGF-β의 발현량 역시 높아진 것으로 나타났다(도 5).
T세포와 대식세포에 의해 분비 된 IL-6는 염증과 항염증 효과를 동시에 나타내고, 호중구를 급성 염증단계에서 조절하는 것으로 알려져 있다. IL-8은 주로 대식세포, 상피세포, 내피세포에서 생성이 되는데 이는 호중구의 주화를 감염된 지역으로 유도하는 역할을 한다. 또한 TNF-α는 주로 활성화 된 대식세포에서 발현이 되며, 이는 호중구를 포함하여 선천면역에 매우 중요한 자극을 준다. TGF-β는 면역기전 조절에 있어 다양한 종류의 세포에서 발현되는 사이토카인이다. 따라서 이러한 사이토카인들의 변화는 앞서 밝힌 선천면역지표의 결과들을 뒷바침하며, 이 역시 대조구에 비해 높은 생존율을 유산균 식이군이 나타낸 것에 대한 분자생물학적 증거라고 할 수 있다.
증체률
한달 간 일반 사료를 식이한 대조군(Ctrl)의 증체률은 27.4 ± 2.5% 였으며 LL 식이군은 38.5 ± 2.4%, LP 식이군은 34.0 ± 4.2%, Mix 식이군은 38.1 ± 2.8%의 증체률을 나타내었다(도 6). 모든 유산균 식이군은 대조군에 비해 높은 증체률을 나타내었다.
그러므로 유산균 식이가 넙치의 성장률을 증진시키는 것으로 판단되었다. 이는 양식어류의 상품성과 직결되는 부분으로 빠른 성장은 곧 양식장의 회전률이 높아진다는 것을 의미한다.
스트렙토코커스 이니애 공격 감염에 대한 생존률
스트렙토코커스 이니애(S. iniae) 공격감염시 유산균 식이군들의 생존률을 평가하였다. 그 결과, Mix 식이군은 55%, LL 식이군은 45%, LP 식이군은 35%의 생존률을 보여, 모두 대조군(생존률 20%)보다 높은 생존률을 보였다(도 7).
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC12704BP
수탁일자 : 20141107
기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)
수탁번호 : KCCM11383P
수탁일자 : 20130221
<110> IMMUNUS INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION OF HANDONG UNIVERSITY <120> LACTOBACILLUS PLANTARUM FGL0001 AND METHOD FOR ENHANCING IMMUNITY <130> DP20170123KR <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 179 <212> DNA <213> Lactobacillus plantarum <400> 1 gcagtcgaac gaactctggt attgattggt gcttgcatca tgatttacat ttgagtgagt 60 ggcgaactgg tgagtaacac gtgggaaacc tgcccagaag cgggggataa cacctggaaa 120 cagatgctaa taccgcataa caacttggac cgcaggtccg agtttgaaag atggcttcg 179

Claims (10)

  1. 락토바실러스 플란타룸 FGL0001 (기탁번호 KCTC 12704BP) 를 포함하는, 어류의 면역 증진제.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 락토바실러스 플란타룸 FGL0001 은 6 %(W/V) 이하의 염분을 갖는 배지에 접종 시 내염성을 갖는 것인, 어류의 면역 증진제.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 락토바실러스 플란타룸 FGL0001 은 7 %(W/V) 이상의 염분을 갖는 배지에 접종 시 성장이 저해되는 것인, 어류의 면역 증진제.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 락토바실러스 플란타룸 FGL0001 은 MRS 배지에 도말한 에드바드시엘라 타르다(Edwardsiella tarda)에 대하여 항균성이 없는 것인, 어류의 면역 증진제.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 락토바실러스 플란타룸 FGL0001 은 티로신, 히스티딘, 오르니틴 및 라이신으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 이용하여 생체 아민을 생성하지 않는 것인, 어류의 면역 증진제.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 락토바실러스 플란타룸 FGL0001 은 pH3에서 생존능을 갖는 것인, 어류의 면역 증진제.
  7. 제 1항에 있어서,
    락토코커스 락티스 BFE920 (기탁번호 KCCM 11383P) 를 더 포함하는, 어류의 면역 증진제.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 어류의 면역 증진제를 준비하는 단계;
    상기 어류의 면역 증진제를 어류에 처리하는 단계를 포함하는, 어류의 면역 증진 방법.
  9. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 어류의 면역 증진제를 포함하는, 어류의 면역 증진용 사료 첨가제.
  10. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 어류의 면역 증진제를 포함하는, 어류의 면역 증진용 사료.
KR1020170084420A 2017-07-03 2017-07-03 락토바실러스 플란타룸 ｆｇｌ０００１ 및 이를 이용한 어류의 면역 증진 방법 KR102054780B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170084420A KR102054780B1 (ko) 2017-07-03 2017-07-03 락토바실러스 플란타룸 ｆｇｌ０００１ 및 이를 이용한 어류의 면역 증진 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170084420A KR102054780B1 (ko) 2017-07-03 2017-07-03 락토바실러스 플란타룸 ｆｇｌ０００１ 및 이를 이용한 어류의 면역 증진 방법

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020150034565A Division KR20160110789A (ko) 2015-03-12 2015-03-12 락토바실러스 플란타룸 ｆｇｌ０００１ 및 이를 이용한 어류의 면역 증진 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20170082484A true KR20170082484A (ko) 2017-07-14
KR102054780B1 KR102054780B1 (ko) 2019-12-12

Family

ID=59358570

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020170084420A KR102054780B1 (ko) 2017-07-03 2017-07-03 락토바실러스 플란타룸 ｆｇｌ０００１ 및 이를 이용한 어류의 면역 증진 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102054780B1 (ko)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108185352A (zh) * 2017-12-20 2018-06-22 四川东坡中国泡菜产业技术研究院 一种低生物胺发酵泡菜的制作方法
CN108354090A (zh) * 2018-04-09 2018-08-03 苏州市承恩水产科技有限公司 一种水产养殖用复合益生素组合物的使用方法
CN108497218A (zh) * 2018-04-09 2018-09-07 苏州市承恩水产科技有限公司 一种水产养殖用复合益生素组合物
CN110499271A (zh) * 2019-09-02 2019-11-26 千禾味业食品股份有限公司 一种植物乳杆菌qr19及其应用
CN115381005A (zh) * 2022-08-25 2022-11-25 中国农业科学院饲料研究所 植物乳杆菌cicc 6240在消减水产品体内抗生素残留中的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20120111608A (ko) * 2011-04-01 2012-10-10 주식회사한국야쿠르트 면역증강 및 항산화 활성을 가지는 신규한 락토바실러스 플란타룸 에이취와이 7712 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품
KR20140102888A (ko) * 2013-02-15 2014-08-25 한동대학교 산학협력단 유산균 배양 배지 및 산업적 규모의 유산균 배양 및 보관 방법
KR20150019934A (ko) * 2013-08-16 2015-02-25 한동대학교 산학협력단 락토코커스 락티스를 이용한 어류의 면역 증진 방법

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20120111608A (ko) * 2011-04-01 2012-10-10 주식회사한국야쿠르트 면역증강 및 항산화 활성을 가지는 신규한 락토바실러스 플란타룸 에이취와이 7712 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품
KR20140102888A (ko) * 2013-02-15 2014-08-25 한동대학교 산학협력단 유산균 배양 배지 및 산업적 규모의 유산균 배양 및 보관 방법
KR20150019934A (ko) * 2013-08-16 2015-02-25 한동대학교 산학협력단 락토코커스 락티스를 이용한 어류의 면역 증진 방법

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108185352A (zh) * 2017-12-20 2018-06-22 四川东坡中国泡菜产业技术研究院 一种低生物胺发酵泡菜的制作方法
CN108185352B (zh) * 2017-12-20 2021-04-23 四川东坡中国泡菜产业技术研究院 一种低生物胺发酵泡菜的制作方法
CN108354090A (zh) * 2018-04-09 2018-08-03 苏州市承恩水产科技有限公司 一种水产养殖用复合益生素组合物的使用方法
CN108497218A (zh) * 2018-04-09 2018-09-07 苏州市承恩水产科技有限公司 一种水产养殖用复合益生素组合物
CN110499271A (zh) * 2019-09-02 2019-11-26 千禾味业食品股份有限公司 一种植物乳杆菌qr19及其应用
CN115381005A (zh) * 2022-08-25 2022-11-25 中国农业科学院饲料研究所 植物乳杆菌cicc 6240在消减水产品体内抗生素残留中的应用
CN115381005B (zh) * 2022-08-25 2023-09-19 中国农业科学院饲料研究所 植物乳杆菌cicc 6240在消减水产品体内抗生素残留中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
KR102054780B1 (ko) 2019-12-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102054780B1 (ko) 락토바실러스 플란타룸 ｆｇｌ０００１ 및 이를 이용한 어류의 면역 증진 방법
Nguyen et al. Improved growth rate and disease resistance in olive flounder, Paralichthys olivaceus, by probiotic Lactococcus lactis WFLU12 isolated from wild marine fish
Chen et al. Functional probiotics of lactic acid bacteria from Hu sheep milk
Wu et al. Enhancement of the immune response and protection against Vibrio parahaemolyticus by indigenous probiotic Bacillus strains in mud crab (Scylla paramamosain)
Panigrahi et al. Immune responses in rainbow trout Oncorhynchus mykiss induced by a potential probiotic bacteria Lactobacillus rhamnosus JCM 1136
Argañaraz-Martínez et al. Physiological and functional characteristics of Propionibacterium strains of the poultry microbiota and relevance for the development of probiotic products
AU2015334989B2 (en) Probiotic and prebiotic compositions
CN111534447B (zh) 约氏乳杆菌及其应用
CN110452829A (zh) 长双歧杆菌菌株及其应用
JP2009159955A (ja) クルマエビ腸内から分離したプロバイオティクス乳酸菌
Starke et al. Effects of the probiotic Enterococcus faecium NCIMB 10415 on selected lactic acid bacteria and enterobacteria in co-culture
CN113040390A (zh) 一株益生、耐盐约氏乳杆菌及其在畜禽水产养殖中防治病原菌的应用
JP5082048B2 (ja) 免疫賦活作用及び／又はアレルギー抑制作用を有し、且つ胃液耐性を有する新規乳酸菌
Feliatra et al. Phylogenetic analysis to compare populations of acid tolerant bacteria isolated from the gastrointestinal tract of two different prawn species Macrobrachium rosenbergii and Penaeus monodon
CN108660097A (zh) 一株鱼源屎肠球菌r8的筛选及应用
Purivirojkul Application of probiotic bacteria for controlling pathogenic bacteria in fairy shrimp Branchinella thailandensis culture
Rajyalakshmi et al. Identification and screening of probiotics as a biocontrol agent against pathogenic vibriosis in shrimp aquaculture
Xu et al. Lactobacillus casei JY300-8 generated by 12C6+ beams mutagenesis inhibits tumor progression by modulating the gut microbiota in mice
KR101005747B1 (ko) 김치로부터 분리된 유산균 및 그의 용도
CN113528367B (zh) 一株具有预防腹泻和降解胆固醇功能的凝结芽孢杆菌
CN105062922B (zh) 一种抑制禽源致病性大肠杆菌的乳酸杆菌及其应用
CN113604387B (zh) 一株耐盐、耐高温罗伊氏乳杆菌及其在畜禽水产养殖中防治病原菌的应用
Mirbakhsh et al. Screening and evaluation of indigenous bacteria from the Persian Gulf as a probiotic and biocontrol agent against Vibrio harveyi in Litopenaeus vannamei post larvae
Lavanya et al. Isolation and characterization of probiotic bacteria from the soil samples of the coastal areas of (Gudur division, Nellore Dt.) for utilization in Shrimp farming
EP3168292B1 (en) New lactobacillus plantarum strain amt14 and composition containing the strain of lactobacillus plantarum amt14

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application
J301 Trial decision

Free format text: TRIAL NUMBER: 2018101001883; TRIAL DECISION FOR APPEAL AGAINST DECISION TO DECLINE REFUSAL REQUESTED 20180430

Effective date: 20190823

S901 Examination by remand of revocation
GRNO Decision to grant (after opposition)