RO122836B1 - Unguent farmaceutic şi procedeu de obţinere pe bază de flori de gălbenele crescute pe soluri îmbogăţite cu zinc - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă la un unguent farmaceutic pe bază de flori uscate de Calendula Officinallis, crescute pe soluri îmbogăţite cu zinc, ce constă în aceea că acesta conţine 3...4 părţi extract uscat şi purificat de Calendula officinalis, împreună cu o formulă pe bază de unguent, alcătuită din 5...6 părţi alcool cetilic, 5...6 părţi unt de cacao, 1...2 părţi lauril sulfat de sodiu, 25...30 părţi vaselină, 1...2 părţi cetaceu şi 50...60 părţi soluţie conservată, părţile fiind exprimate în greutate, şi la un procedeu de obţinere a unguentului, ce constă în aceea că o cantitate de 25,00 părţi flori uscate de Calendula officinallis mărunţită prin măcinare mecanică se supune extracţiei, într-un amestec de solvenţi organici selectaţi dintre cloroform, metanol, diclormetan, în raport de 1:1:1, în cantitate de 500 ml, cu ajutorul unui aparat Soxhlet şi a băii cu ultrasunete, într-un raport amestec de solvenţi:material vegetal de 10:3, iar extracţia se efectuează până la epuizarea drogului vegetal, timp de 40 min...2 h, după care soluţia se evaporă cu ajutorul unui rotavapor, la temperatura de 40...50°C şi la presiunea corespunzătoare solvenţilor, până la obţinerea unui extract uscat, apoi 3...4 părţi extract uscat purificat se înglobează într-o bază de unguent.

Description

Invenția se referă la un unguent farmaceutic pe bază de flori uscate de Calendula officinalis, crescute pe soluri îmbogățite cu zinc, și la procedeul de obținere al acestuia, cu utilizare în industria farmaceutică.

Datele generale referitoare la Calendula officinallis L. (Stănescu U., Hăncianu M., Miron A., Aprotosoaie C.-Plantele medicinale de la A la Z, vol.l, Ed.”Gr. T. Popa, lași, 2004) subliniază faptul că această plantă numită și filimică, face parte din familia Asteraceae și se folosește pentru florile sale. Sunt de remarcat uleiul volatil și sescviterpenele sale. Acțiunea terapeutică se referă la efecte diaforetice, diuretice, spasmolitice și antihelmintice. Totodată, prezintă acțiune coleretică, antiinflamatoare, cicatrizantă, antibacteriană și antifungică; pentru efectul antispastic se mai folosesc în dismenoree, ca emenagoge.

Extern, planta se folosește pentru răni, arsuri, ulcer varicos, erupții cutanate etc., condiționată sub formă de unguente în care se introduce și acid ascorbic ca antioxidant, pentru protejarea carotenoidelor.

Gălbenelele intră în compoziția multor preparate farmaceutice. Plantele de Calendula officinalis L. se pot adapta la concentrații mai ridicate, de zinc în țesuturi, concentrații care pot depăși până la de douăzeci de ori nivelul normal fără ca plantele să fie afectate. Această toleranță a gălbenelelor la excesul de zinc se poate explica prin capacitatea acestora de a inactiva zincul la nivel celular sau prin capacitatea redusă a plantelor de a absorbi zincul.

Compușii zincului de tipul oxidului de zinc și sulfat de zinc se folosesc ca, antimicotice, în produse de tipul soluție Alibour sau Aqua Zinci Cuprica (Farmacopeea Română, Ed. Medicală, Ed. a X-a, București, 2000), în care alături de sulfatul de zinc se asociază și sulfatul de cupru.

Excesul seboreic se tratează cu compuși ai zincului în diverse combinații, în produse ca: Jecozinc, Cutaden (Agenda Medicală 2000, Ed. Medicală, București, 2000) dar și în preparate magistrale cu oxid de zinc.

Terapiile naturiste cu produși vegetali sunt în mare vogă de cele mai multe ori datorită reacțiilor adverse reduse sau acțiunii lor blânde, și mai ușor acceptate. Biotehnologiile cu încorporarea de metale sunt un trend al viitorului, prin posibilitatea oferirii atât a unor compuși activi cât și a unor elemente minerale esențiale.

RO 94 010 se referă la un procedeu de preparare a unui extract cu acțiune calmantă și cicatrizantă pe bază de plante, ce constă în aceea că un amestec de produse vegetale uscate și pulverizate, constând din flores Millefolii, flores Calendulae, herba Meliloti, luate în raport de 2: 1: 1, se percolează, cu alcool etilic de 70', conținând 10% propilenglicol, și soluția hidroalcoolică obținută se aduce la un conținut de minimum 40% alcool și minimum 0,25% substanțe flavonoidice, exprimate în rutozid.

RO 83 135 descrie o compoziție de un unguent antiacneic, ce constă în aceea că este constituit din 1% camfor, 10% oxid de zinc, 6% romazulan, încorporate într-o bază de unguent hidrofilă, formată din 78% metilceluloză 4000-2,5%, 10% pectină-gel 5% și 12% stearat de trietanolamină;

R0115 690 (Bl) prezintă un unguent antiacneic și antiseboreic, constituit din 1 ...3% hidrolizatde colagen cu greutatea moleculară 3000...5000,0,2...2% acid salicilic, 1 ...4% sulf precipitat, 0,2...2% hidrocortizon, 1...5% oxid de zinc, 0,1...0,3% vitamina A acetat, 1...4% vitamina F, 65...70% vaselină, 10...12% lanolină anhidră, 2...4% ceară de albine, 0,1...0,3% nipagin, 0,05...0,1% nipasol, cu sau fără 0,5...1% rezorcină, precum și apă distilată până la obținerea a 100% procente în greutate.

Problema tehnică propusă spre rezolvare de prezenta cerere constă în tratarea unor afecțiuni dermatologice de tipul: arsuri, degerături, dermatoze, micoze.

Soluția constă în faptul că, în preparatele farmaceutice se folosesc gălbenele crescute pe sol îmbogățit cu zinc.

RO 122836 Β1

Unguentul farmaceutic pe bază de flori uscate de Calendula officinalis crescute pe 1 soluri îmbogățite cu zinc, conform invenției, constă în aceea că, conține 3...4 părți extract uscat și purificat de Calendula officinalis împreună cu o formulă pe bază de unguent, 3 alcătuită din 5...6 părți alcool cetilic, 5...6 părți unt de cacao, 1 ...2 părți laurii sulfat de sodiu,

25...30 părți vaselină, 1...2 părți cetaceu și 50...60 părți soluție conservantă, părțile fiind 5 exprimate în greutate, iar procedeul de obținere a unguentului, constă în aceea că o cantitate de 25,00 părți flori uscate de Calendula officinalis mărunțită prin măcinare mecanică se 7 supune extracției, într-un amestec de solvenți organici selectați dintre cloroform, metanol, diclormetan, în raport de 1:1:1, în cantitate de 500 ml, cu ajutorul unui aparat Soxhlet și a băii 9 cu ultrasunete, într-un raport amestec de solvenți: material vegetal de 10: 3, iar extracția se efectuează până la epuizarea drogului vegetal, timp de 40 min...2 h, după care soluția se 11 evaporă cu ajutorul unui rotavapor, la temperatura de 40...50°C și la presiunea corespunzătoare solvenților, până la obținerea unui extract uscat, apoi 3...4 părți extract uscat purificat 13 se înglobează într-o bază de unguent alcătuită din 5...6 părți alcool cetilic, 5...6 părți unt de cacao, 1...2 părți laurii sulfat de sodiu, 25-30 părți vaselină, 1...2 părți cetaceu și 50-60 15 părți soluție conservantă, părțile fiind exprimate în greutate.

Prin aplicarea unguentului farmaceutic pe bază de gălbenele crescute pe soluri 17 îmbogățite cu zinc, conform invenției, se obțin următoarele avantaje:

- prezintă acțiune antiacneică și antipruriginoasă dovedită în testarea pe animale de 19 experiență;

- este capabil să declanșeze procesul de refacere și vindecare a cicatricilor, prin 21 reducerea infiltrației inflamatorii și a edemului, cât și stimularea regenerării dermului și epidermului prin proliferarea fibroblastilor și angiogeneză; 23

- are efecte antitumorale evidențiate prin scăderea numărului total de celule tumorale.

Se dau în continuare exemple în legătură și cu figura care reprezintă spectrul de 25 masă al extractului obținut din gălbenele (Calendula off.) crescute pe soluri îmbogățite cu zinc. 27

Invenția este prezentată pe larg în continuare.

Procedeul de obținere a extractului din flori de gălbenele crescute pe soluri 29 îmbogățite cu zinc, constă în extracția florilor uscate, mărunțite prin măcinare mecanică, în solvenți organici de tipul: cloroform, metanol, diclormetan luați în diferite proporții sau în mod 31 singular, cu ajutorul unui aparat Soxhlet sau a băii cu ultrasunete. Raportul amestec de solvenți: material vegetal este de minimum 10:1, extracția efectuându-se până la epuizarea 33 drogului vegetal (minim 40 de min, 2 h timp optim), apoi soluția obținută se evaporă cu ajutorul unui rotavapor, la temperatura de 40-50”C și la presiunea corespunzătoare conform 35 solvenților.

Extractul obținut adus la sec se va folosi ca atare, ingerat sau injectat în formule 37 speciale sau se încorporează într-o formulă semisolidă de tip unguent sau bază emulsie. Unguentul conține între 1 % și 10% produs vegetal extras luat ca substanță uscată. Extractul 39 uscat se încorporează în formula semisolidă prin dispersie sau prin procedee tipice de solubilizare a principiului activ. Prepararea formulei semisolide se face conform Farmacopeei 41

Române ed. a X-a, prin topirea componentelor grase, eventual solubilizarea tensioactivului în soluția conservantă la cald și dispersarea fazei grase în faza apoasă, aflată la aceeași 43 temperatură.

Se prezintă în continuare 2 exemple de realizare a invenției. 45

Exemplul 1. Se macină 25 g flori uscate de gălbenele, crescute pe soluri îmbogățite în diverse forme cu zinc, de preferat oxid de zinc, care este supus extracției cu un amestec 47 în raport de 1:1:1 de cloroform: metanol: diclormetan, în cantitate de 500 ml cu ajutorul unui

RO 122836 Β1 aparat Soxhlet. După epuizarea drogului, amestecul de solvenți este îndepărtat cu ajutorul unui rotavapor, la temperatura de 4O...5O°C și la o presiune redusă și vid, condițiile blânde protejând substanța extrasă de oxidări. Extracția are un randament de minimum 10%. Extractul uscat este încorporat prin dispersare mecanică într-un unguent, preparat conform Farmacopeei Române, Ed. a X-a, pagina 954-955Unguentum emulsificansas\gurând o concentrație de extract în unguent de minimum 1% și maximum 5%.

Exemplul 2. Se macină 25 g plante uscate de gălbenele, crescute pe un sol îmbogățit prin diverse procedee cu zinc, care este supus extracției cu un amestec în raport de 1:1:1 de cloroform: metanol: diclormetan, în cantitate de 500 ml, cu ajutorul unei băi cu ultrasunete, timp de 1 ...4 h. După epuizarea drogului, amestecul de solvenți este îndepărtat cu ajutorul unui rotavapor, la temperatura de 4O...5O°C și la o presiune redusă și vid, condițiile blânde protejând substanța extrasă de oxidări. Extracția are un randament de minimum 10%. Extractul uscat este încorporat prin dispersare mecanică sau solubilizare în faza apoasă cu ajutorul tensioactivilor într-o bază de unguent de tip emulsie U/A, preparată conform Farmacopeei Române ed. a X-a, asigurând o concentrație de extract în unguent de minimum 1% și maximum 5%.

Exemplul de formulă de bază de unguent:

- alcool cetilic 6 g;

-unt de cacao 6g;

- laurii sulfat de sodiu...................................... 1g;

-vaselină .............................................. 30g;

- cetaceu................................................ 2g;

- soluție conservantă ..................................... 65g.

Testări farmacologice

Unguentul farmaceutic, obținut conform exemplelor invenției, a fost testat în vitro pe anumite tipuri de celule canceroase tumorale de piele (metastatic melanoma) de șobolan. Analizele au fost efectuate prin CSS, HPLC, GS cuplată cu MS.

Pentru testatrea citotoxicității și citogenității s-au utilizat extractele vegetale obținute sub diferite forme, în asociere adecvată scopului propus, pentru acțiune internă sau pentru acțiune externă (topică). Fiecare extract a fost evaluat calitativ și cantitativ, pentru stabilirea potențialului biosintetic al compușilor cu acțiune imunomodulatoare, adaptogenă, antiinflamatoare și antimicrobiană.

Rezultatele și concluziile acestor testein vitrope diverse tipuri de celule canceroase tumorale de piele A 431 și A 2058 au fost aplicate pe modelul de șobolan cu iritație cutanată.

Acțiunea antiacneică și antipruriginoasă se manifestă datorită unei cooperări sinergice între saponozide, flavonozide, dioxidul de siliciu și uleiul volatil. Acțiunea este antiinflamatoare prin triterpene și cicatrizantă prin carotenoide și uleiul gras. Acțiunea antioxidantă se manifestă prin vitaminele C, E și P.

Extractul a fost utilizat în diferite leziuni ale pielii, ale mucoaselor și ale semimucoaselor datorită uleiului volatil și sescviterpenelor sale. Extractul din flori de gălbenele sub formă de unguent favorizează vindecarea leziunilor cutanate de tipul: arsuri, degerături, dermatoze, micoze și, de asemenea, consolidează țesutul conjunctiv prin creșterea sintezei de colagen (sub acțiunea saponozidelor) și prin aportul de săruri minerale.

Extractul obținut din florile de gălbenele Calendula officinalis L., crescute pe soluri îmbogățite cu zinc, acționează prin alchilări (deoarece are loc înlocuirea H compușilor organici cu radical alchil), efectul citotoxic este dat de alchilarea acizilor nucleici ai ADN-ului din celula tumorală conducând la rupturi ale moleculei de ADN și legături încrucișate (punți)

RO 122836 Β1 între cele 2 catene ale helixului astfel că se împiedică replicarea ADN-ului și transcripția 1 acestuia în ARN, acționează în toate fazele ciclului celular. Mecanism de acțiune: agenți antitumorali care determină alterări ale ADN-ului prin: intercalarea în molecula de ADN, 3 blochează sinteza de ADN, ARN și proteine din celulele tumorale cu creștere rapidă, generare de radicali liberi și prin inhibarea topoizomerazei II, care are ca rezultat ruptura 5 dublă catenară în celula malignă.

Extractul obținut din florile de gălbenele Calendula officinalis L., conține substanțe 7 citotoxice care prin legarea de proteinele microtubulare ale celulelor tumorale; se leagă puternic de tubulinâ (pe un situs specific), astfel împiedică formarea fusului mitotic blocând 9 mitoza în metafază; acționează în faza M a ciclului celular, dar și în faza S de sinteză. Acțiunea farmacodinamică este citostatică și antineoplazică. 11

Testarea microbiologică

Fiecare extract a fost evaluat calitativ și cantitativ pentru stabilirea potențialului 13 biosintetic al compușilor cu acțiune antiinflamatoare și antimicrobiană.

Activitatea extractul obținut din flori de Calendula officinalis L., a fost testat „in vitro” 15 prin determinarea concentrației minime inhibitoare asupra unor tulpini de enterobacterii de tipul: Pseudomonas aeruginoasa, Actinobacter, Haemophilus influenzae, Staphylococccus 17 aureus, Klebsiella pneumoniae.

Valorile care demonstrează activitatea antimicrobiană eficientă a extractului de 19 Calendula officinalis sunt prezentate în tabelul 1.

Tabelul 1

Valorile care demonstrează o activitate eficientă antimicrobiană 23 a extractului de Calendula officinalis

Compus	Tulpini microbiene
E. coli	Sa/monella sp.	Pseudomonas aeruginosa	Listeria monocytogenes	S. aureus	Bacillus sp.	Candida sp.
seria 1 (pg/mL) (micrograme/ml)
1.1	256	256	256	256	256	256	256
1.2	256	256	256	256	256	256	256
1.3	512	>1024	256	1024	512	>1024	1024
1.4	512	>1024	>1024	>1024	>1024	>1024	>1024
1.5	1024	>1024	>1024	>1024	>1024	>1024	>1024
1.6	1024	1024	1024	>1024	1024	256	>1024
1.7	1024	1024	1024	>1024	1024	256	512
1.8	>1024	>1024	>1024	>1024	>1024	256	>1024

RO 122836 Β1

Tabelul 1 (continuare)

Compus	Tulpini microbiene
E. coli	Salmonella sp.	Pseudomonas aeruginosa	Listeria monocytogenes	S. aureus	Bacillus sp.	Candida sp.
seria 2 (micrograme / ml)
1.9	256	256	32	>1024	32	>1024	64
1.10	128	256	32	>1024	>1024	>1024	128
1.11	1024	256	32	>1024	32	>1024	512
1.12	512	512	32	1024	32	>1024	1024
1.13	>1024	>1024	256	>1024	>1024	>1024	256
1.14	>1024	>1024	256	>1024	>1024	>1024	256
1.15	>1024	256	256	256	>1024	256	128
1.16	>1024	256	256	256	>1024	128	64
1.17	>1024	256	256	256	>1024	128	64
1.18	>1024	>1024	256	128	>1024	>1024	128
1.19	>1024	>1024	>1024	>1024	>1024	>1024	256

Model experimental pe animale de laborator, studiile au fost efectuate pe un număr de 70 șoareci Swiss masculi, în greutate de 20±2 g, care au fost inoculați în ziua 0 a experimentului cu 1x10⁶ celule canceroase tumorale de piele A 431 și A 2058 (metastatic melanom).

Animalele au fost împărțite în 7 loturi: lot I, martor netratat; lot II tratat cu PREPARATUL A, lot III tratat cu vitamina C, lot IV tratat cu extract de Calendula officinalis, lot V tratat cu doxorubicină și vitamina C, lot VI tratat cu doxorubicină și extract de Calendula officinalis și lot VII tratat cu vehicul (carboximetilceluloză).

Dezvoltarea tumorii a fost apreciată prin evaluarea volumului tumoral absolut și prin numărarea celulelor carcinomatoase. Pentru evaluarea prezenței stresului oxidativ au fost urmăriți produșii de oxidare ai constituenților unguentului de Calendula officinalis.

Din analiza rezultatelor obținute se constată că doza administrată din PREPARATUL A are efecte antitumorale evidențiate prin scăderea numărului total de celule tumorale. Tratamentul cu PREPARATUL A produce stres oxidativ evidențiat prin creșterea nivelului de peroxizi lipidici în plasma șoarecilor purtători de carcinom. O altă constatare a fost aceea că, vitamina C în doza aleasă nu influențează dezvoltarea tumorii la animale însă, asocierea vitaminei C la PREPARATUL A duce la scăderea semnificativă a nivelului plasmatic al peroxizilor lipidici. Nu în ultimul rând, s-a stabilit că extractul de Calendula officinalis în doza administrată influențează dezvoltarea celulelortumorale la șoareci, împiedicând dezvoltarea lor cu până la 40%, iar un tratament asociat cu PREPARATUL A-extract de Calendula officinalis reduce semnificativ peroxidarea lipidică. în concluzie, doza din PREPARATUL A produce stres oxidativ, iar doza de vitamina C are efect antioxidant.

în urma urma testării farmaco-toxicologice fost stabilită DL_S0 a extractului de Calendula officinalis la șoareci Swiss în administrare i. p.; extractul este netoxic.

Testări biochimice

Analizele biochimice (fig. 1) au evidențiat conținutul în pigmenți asimilatori, determinarea saponinelor și dozarea spectrofotometrică (fig. 2) a flavonoidelor exprimate în rutozidă. Saponina obținută are culoare alb-murdar-gălbui, dizolvat în apă, cu pH = 4,5-5, iar la agitare formează o spumă foarte abundentă, care se menține peste 2 h.

RO 122836 Β1

Cromatograma (fig. 3) de identificare a flavonoidelor specifice prin cromatografie pe 1 strat subțire (CSS) demonstrează că benzile de compuși separați sunt similare în cele 3 probe (solvenții folosiți la extracție). Benzile sunt mai intense în proba a) și puțin mai slabe 3 în proba b) (fig. 4). Se observă benzi specifice saponinelor în jurul nivelului escinei. Comparând valorile de referință ale etaloanelor de acid galic și escină, cu valorile obținute 5 din componentele separate din probe, constatăm aceleași valori, ceea ce demonstrează prezența saponinelor. Cromatogramele pentru identificarea flavonoidelor specifice, înainte și 7 după pulverizare cu NTS, prezintă benzi de compușii separați similare în probe. Se observă benzi în dreptul rutinului și în dreptul acidului clorogenic. în urma analizei comparative a 9 probelor în raport cu etaloanele de rutin și acid clorogenic, s-a confirmat prezența în probe a acidului clorogenic și a rutinului. Această confirmare se bazează pe compararea valorilor 11 Rf (fig. 5) a etalonului cu a compusului separat din probe, respectiv pe compararea aspectului benzii etalonului cu cea a compusului separat din probe. 13

Benzile galben-brun corespund flavonoidelor, iar benzile albastre corespund derivaților polifenolcarboxilici. în urma dozării spectrofotometrice (tabelul 2) a flavonoidelor 15 exprimate în rutozidă s-a obținut o valoare de 0,60 ± 0,03%, față de extractul sec.

Tabelul2

Pic	Compus	Aria%a	Ki	Ki*
1	a-copaen	0,9	1365	1376
2	a-ionon	1,5	1421	1426
3	a-humulen	1,2	1444	1454
4	geranilaceton	1,6	1452	1453
5	γ-muurolen	2,3	1472	1477
6	β-ίοηοη	3,2	1484	1485
7	Leden	2,3	1488	1493
8	a-muurolen	5,6	1497	1499
9	γ-cadinen	8,9	1511	1513
10	δ-cadinen	22,5	1522	1524
11	a-cadinen	0,9	1533	1538
12	a-calacoren	2,3	1539	1542
13	cariofllene oxid	0,5	1547	1581
14	copaen-4-a-ol	0,6	1566	1584
15	β-oplopenon	1,7	1568	1606
16	viridiflorol	2,2	1585	1590
17	ledol	1,3	1595	1565
18	1,10-di-epi-cubenol	0,9	1608	1614

RO 122836 Β1

Tabelul 2 (continuare,

Pic	Compus	Aria%a	Ki	Ki*
19	1-epi-cubenol	1,6	1621	1627
20	epi-a-muurolol	12,9	1639	1641
21	a-cadinol	20,4	1654	1653
22	cadalen	0,8	1671	1674

“-procentele relative a compușilor

Ki-a fost calculat de la cromatogramele GC-MS, Ki*-calculat cu ajutorul datelor Adams.

Testarea microscopică pentru stabilitatea unguentelor

Examinarea microscopică. Consistența preparatelor semisolide, în special geluri depinde de fracția solidă, dependentă de structura și fracția lichidă. Diferențele de concentrație și felurile agenților de geluri rezultă din schimbările petrecute în consistența structurii. Aspectul microscopic al emulsiilor apă/ulei studiat la un microscop optic a dovedit ca emulsiile și formele sferice ale picăturilor dispersate au un diametru de 33,4 pm.

Examinarea fiziologică. Preparatele semisolide și formulele acestora au fost analizate vizual în funcție de culoare, omogenitate și fazele de separare. Valoarea pH-ului la soluția apoasă 1% a preparatelor obținute au fost determinate potențiometric cu ajutorul unui pHmetru (Jenway 3030) la temperatura camerei (25’C).

Analiza microscopică. S-a realizat pentru a vizualiza dimensiunile particulelor din emulsie. Aceasta analiză s-a desfășurat folosind un microscop optic cu cameră digitală, conectată la un computer, pentru a obține imagini din care să rezulte mărimea particulelor. Examinarea microscopică a fost făcută la 24 h după prepararea emulsiei.

Analiza reologică a produselor finite

Examinarea fiziologică. Toate trei preparatele au fost vâscoase, omogene. Preparatele hidrofile au prezentat o culoare gălbuie în timp ce cremele hidrofile au avut culoare albă. S-au întins ușor pe piele, având proprietăți de aderare la aceasta. Valoarea pHului la preparatele semisolide obținute a fost între 5,3-5,5, corespunzând unei toleranțe crescute după aplicarea pe piele.

Determinarea viscozității. S-a observat că toate preparatele au un comportament pseudoplastic fără tixotropie, deoarece conexiunea structurală formată este extrem de stabilă și foarte greu de rupt prin agitare. Hidrogelul carbopol 940 a prezentat valori ale viscozității mult mai mari decât hidrogelul metilceluloza sau crema hidrofilă. Forma reogramei indică faptul că, carbopolul 940 cu 1% hidrogel este mai ușor aplicabil pe piele decât alte hidrogeluri sau creme hidrofile. Aliniamentul curbelor de viscozitate indică o relație lineară între viscozitatea structurală a preparatelor studiate și rata de împărțire.

Această relație este descrisă prin următoarea ecuație: log η = log q⁺-m log γ, unde η = viscozitatea structurală (Pa.s), rf = viscozitatea extrapolată, η = tangenta de regresie, γ = rata de împărțire (s^-1). Rezultatele sunt prezentate în Tabelul 3.

Tabelul 3

Ecuația de regresie lineară și corelarea acesteia cu curbele coeficientului de viscozitate corespunzătoare preparatelor semisolide

Preparatele semisolide	Ecuația lineară	Coef. de corelație (r)
Hydrophilic cream	y= 1,5436-0,6276x	0,9985
Carbopol 940 1% hydiogel	y = 2,3758-0,7894x	0,9983
Methylcellulose 5% hydrogel	y = 1,2804-0,344x	0,9987

RO 122836 Β1

Studii de stabilitate. Toate formulele semisolide care conțin 1 % extract uscat de flori de Calendula offcinalis au fost stabile din punct de vedere chimic după o depozitare de trei luni, neobservându-se schimbări fiziologice sau de pH. Preparatele semisolide au fost depozitate departe de lumină, în sticle de polietilenă la 25°C și 4’C timp de 3 luni. După depozitare, probele au fost testate pentru comportamentul fiziologic și reologic.

Analiza calităților senzoriale

Această analiză s-a efectuat pe un grup de 27 voluntare, de sex feminin, în cadrul unui cabinet de înfrumusețare, prezentând următorul tablou preliminar:

-17 cazuri prezentau ten uscat și vârste cuprinse între 25-35 ani (subgrup 1);

-10 cazuri prezentau un ten îmbătrânit și vârste între 35-45 ani (subgrup 2);

Cremele au fost aplicate pe partea interioară a antebrațului, conform cu cerințele actuale referitoare la testarea unui produs cosmetic nou pe om. Pentru fiecare dintre subiecți a fost determinat gradul de hidratare inițial, înainte de experiment. Această parte a studiului a urmărit aceleași evaluări senzoriale ca și în prezentările anterioare, și anume:

- gradul hidratării- la 7,14, 21 și 60 de zile, s-a efectuat prin determinări cu ajutorul Skin-tester-ului, fabricat de Pinter-Cosmetic, Ungaria;

- evaluarea senzorială (Testul consumatorului) a cuprins întrebări adresate consumatorului (metoda So-Yeon), obligatorii pentru un produs cosmetic nou.

Descrierea skintester-ului și a evaluărilor efectuate cu acesta

Skintester-ul se bazează pe faptul că există o mare diferență între constanta dielectrică a apei (80) și cea a substanțelor organice din constituția învelișului cutanat (toate sub 7). Astfel, o mică creștere în conținutul de apă al pielii determină o mărire evidentă a mediei constantei dielectrice a pielii, motiv pentru care metoda este sensibilă și acceptată pentru evaluarea hidratării cutanate. Aparatul afișează 8 trepte de intensitate a hidratării cutanate, prin semnale luminoase, după cum urmează:

- primele 2 trepte semnifică pielea deshidratată; trecerea în regimul următor de trepte se realizează prin emiterea de către aparat a unui semnal sonor, semnificând trecerea în domeniul fiziologic de hidratare (treapta joasă J);

- următoarele 3 trepte semnifică hidratare bună, ideale pentru vârstele medii și înaintate (treapta medie M);

- ultimele 3 trepte semnifică hidratare foarte bună, ideale pentru vârstele tinere (treapta înaltă I);

Tabelul 4

Evaluarea senzorială (testul consumatorului)

Aspect urmărit	Semnificație
Luciu	Cantitatea de lumină reflectată de piele după aplicarea produsului
Finețe	Textura produsului
Coeziunea emulsiei cu pielea	Forța necesară îndepărtării degetului de pe produs
Senzația de piele lipicioasă	Cantitatea de produs separată la o prelevare de pe piele
Alunecare	Senzația de alunecare a produsului la întinderea într-o singură direcție
Capacitate de întindere	Ușurința cu care produsul se întinde pe piele

RO 122836 Β1

Tabelul 4 (continuare)

Aspect urmărit	Semnificație
Densitate	Cantitatea de produs între deget și piele
Umiditate	Cantitatea de apă percepută în timpul aplicării
Catifelare	Senzația de catifelare
Cantitate reziduală (parametru invers proporțional cu calitatea produsului)	Cantitatea de produs rezidual după ce produsul nu mai este percept ca fiind hidratant

Pentru fiecare aspect al acestei evaluări fiecare subiect a fost notat satisfăcător sau nesatisfăcător. Ca rezultat global, un aspect este satisfăcător dacă este notata fi satisfăcător în cel puțin 90% din cazuri (din eșantionul chestionat), iar produsul este considerat bun dacă are acest gen de accept pentru toți parametrii senzoriali urmăriți.

Analiza gradului de spălare al produsului. Toate produsele cosmetice propuse au un grad de spălare corespunzător, respectiv se spală ușor fără săpun.

Analiza pH-ului produselor semisolide propuse. Acest tip de analiză s-a efectuat cu ajutorul hârtiei indicatoare de pH menționate și rezultatele pH-ul cremelor s-a încadrat între 6,5 și 7.

Analiza tipului de bază-emulsie. Prin testul diluției s-a constatat că formulele propuse se diluează foarte bine cu apă și nu cu ulei, ceea ce indică o bază-emulsie de tip U/A.

Analiza stabilității. Studiul produselor a fost efectuat pe o lamă de microscop, după întinderea produsului semisolid de analizat cu ajutorul unei lamele.

Discuții. Din analiza proprietăților fizice ale cremelor s-a observat că acestea au o putere de spălare corespunzătoare, ceea ce corespunde cu cerințele actuale cu privire la produsele cosmetice, aspect explicat atât prin tipul bazei de emulsie alese, cât și prin proporția echilibrată de fază grasă. Tipul bazei, respectiv U/A, s-a realizat cu ajutorul emulgatorului anionic, laurii sulfatul de sodiu.

Din analiza pH-ului, s-a observat că, deși pentru crema hidratantă pH-ul este ușor bazic, el este foarte apropiat de limitele optime pentru produsele cosmetice.

Rezultatul stabilității arată faptul că produsele în studiu sunt stabile în termenele limită pentru această analiză.

în conformitate cu directivele Comunității Europene 76/768 din 1993, reluate în 1995, un produs cosmetic poate fi definit ca: „Orice substanță sau preparat ce se intenționează a fi pus în contact cu diferite părți externe ale trupului uman (epidermă, păr, unghii, buze, organele genitale externe) sau cu dinții ori membranele mucoase ale cavității orale, cu scopul exclusiv sau principal de a le curăța, parfuma, modifica aspectul, corecta mirosul corporal sau de a le proteja și menține în stare bună.

Evaluarea potențialului iritativ cu lautilsulfat de sodiu (SLS)

Laurilsulfatul de sodiu (SLS) este un bine cunoscut agent tensioactiv care este utilizat ca model de iritare (Tabelul 5), ce determină efecte toxice importante pe piele, în funcție de relația doză-efect. Efectele sale primare sunt nocive, de eritem și edem. Concentrațiile de peste 10% sunt foarte dăunătoare pentru piele, în special atunci când se aplică ca unic compus.

RO 122836 Β1

Tabelul 51

Evaluarea macroscopică a potențialului de scădere a iritării cu laurilsulfat de sodiu

Preparat	Eritem	Descuamare	Edemu	Subiecți cu efectele %	Observații
Unguent de bază cu extract vegetal obținut din gălbenele Calendula officinalis L	0	0		75%	(25%) dintre subiecți a prezentau roșeață, care a dispărut într-o oră după, aplicarea preparatului
Produs A	0,5	0		80%	20% din subiecții testate prezentau edem sau înroșire difuză, sau simptome care au dispărut după câteva ore după aplicarea preparatului
Produs B	1	0		25%	80% din subiecții testați prezentau edem, produs în mod evident, suprafață irită a pielii, eritem a persistat timp de 24
martor	0	0	-	100%	-

Tabelul 623

Evaluare macroscopică: aspect după aplicarea preparatului, timp de aplicare

Preparat	după 30 min	după 1 h	după 3 h	după 5h	Observații
Unguent de Calendula officinalis	+ 60%	+ 50%	+ 47%	+ 7,4%	Integritatea stratului hidric a fost îmbunătățită imediat după aplicarea produsului, efect care persistă mai mult de 3 h
Produs A	3,75	+10%	+3%	Nu variază	Acest preparat schimbă în mod semnificativ funcția de barieră hidrică a pielii
Produs B	- 35%	- 70%	-1,5%	Nu variază	Este observată o degradare hidrică, corelată cu o tot mai mare evaporare a apei, în prima oră după aplicarea produsului

Testul decisiv. Aplicare locală.39

Ziua 20-22. Grupurile control și de tratament. Coastele animalelor din grupurile control și de tratament sunt curățate de păr. O compresă îmbibată cu substanța test este 41 aplicată pe o singură coastă a animalelor, și o altă compresă, îmbibată numai în vehicul, poate fi de asemenea aplicată pe cealaltă coastă. Compresele suntținute în contact printr-un 43 pansament ocluziv timp de 24 h.

Observații. Grupurile control și de tratament. 45

- aproximativ 21 h, după îndepărtarea compresei, zona testată este curățată și tunsă cu atenție și/sau depilată dacă este necesar; 47

RO 122836 Β1

- aproximativ 3 h mai târziu (aproximativ 48 h de la începerea aplicării) reacția cutanată este înregistrată și observată conform gradelor arătate mai jos;

- aproximativ 24 h după această observație, este realizată o a doua observație (la 72 h) și încă o dată înregistrată.

Sunt recomandate citirile în alb atât pe loturile control cât și de tratament.

Scara gradată Magnusson și Kligman pentru evaluarea reacțiilor la aplicarea compresei:

= nici o schimbare vizibilă;

= eritem discret sau neregulat;

= eritem moderat și confluent (aderent);

= eritem intens și umflat.

S-a aplicat unguentul pe modelul de șobolan cu iritație cutanată și s-a observat evoluția zonei iritate în timp.

După câteva aplicări a apărut o ameliorare vizibilă.

Tabelul 7

Procentele de inhibare edemului inflamator pentru substanțele studiate

Nr	Preparat	Doza mg/kg greutate corporală	inhibare edem după 2 h%	inhibare edem, după 4 h%	inhibare edem, după 24 h%
1	apă distilată	-	-	-	-
2	Produs A	1,4	28,57	48,71	34,41
3	extractul obținut din gălbenele Calendula officinalis L	1,4	31,42	18,20	11,18
4	Produs B	1,4	24,28	24,35	21,42

Tabele comparative (tabelul 8 și tabelul 9) prezintă tratamentul cu unguentul de gălbenele și alte produse farmaceutice care conțin compuși ai zincului (de tipul oxidului de zinc și sulfat de zinc) folosiți ca antimicotice.

Tabelul 8

Formarea de eriteme și escare	Nr. de zile
	Eritem moderat spre grav	Eritem ușor	Edem ușor	Eritem foarte ușor	Fără eritem
Produsul folosit	ziua	ziua	ziua	ziua	ziua	ziua
Cutaden	0	3	4	6	6	9
Jecozinc	0	5	5	6	6	9
unguent cu Calendula officinalis	0	3	3	5	5	6
REZULTATE
	Aqua Zinci Cuprică	2
	Soluția ALIBOUR	2
	unguent cu Calendula officinalis	0

RO 122836 Β1

Tabelul 9

Formarea de edeme	Nr. de zile
	Edem grav	Edem moderat	Edem ușor	Edem foarte ușor	Fără edem
Produsul folosit	ziua	ziua	ziua	ziua	ziua	ziua
Cutaden	0	3	5	6	7	10
Jecozinc	0	4	5	5	7	8
unguent cu Calendula officinalis	0	2	3	4	5	7
REZULTATE
	Aqua Zinci Cuprica	2-3
	Soluția ALIBOUR	2
	unguent cu Calendula officinalis	0

Rezultatul reacțiilor cutanate pentru formarea de eriteme și escare este 0, iar pentru 15 formarea de edeme, rezultatul este de asemenea 0.

Concluzii17

Nu au fost observate fenomene iritante. Pentru clarificarea reacțiilor echivoce s-a procedat la examen histopatologic.19

Strategia de testare și evaluare a iritației /coroziunii dermice pentru unguentul pe bază de extract de gălbenele îmbogățit cu zinc demonstrează o acțiune antiacneică și 21 antipruriginoasă.

Produsul are acțiune antitumorală; distrugerea celulelor tumorale fiind de peste 40%23 procent măsurat ca inhibiție a proliferării celulare.

în urma aplicării produsului pe modelul de șobolan cu iritație cutanată se observă 25 evoluția zonei iritate în timp. După câteva aplicări apare o ameliorare vizibilă.

Testări clinice27

Acțiunea extractelor sub formă de unguent a fost administrată la pacienți internați în Spitalul Clinic Municipal de Urgență, Timișoara. Studiul a fost reprezentat de un lot de 20 de 29 pacienți cu acnee, selectați după criterii eligibile de includere și excludere în studiu în baza unui protocol de cercetare și cu o fișă tip de urmărire a bolnavilor, care a cuprins patru 31 evaluări: inițială, la 4 zile, 10 zile și o lună.

A fost condus un studiu de tip prospectiv. Loturile de studiu au fost structurate pe 33 două grupe, un prim lot tratat cu terapie farmacologică (lot martor), dar în același timp și de studiu comparativ de analiză a beneficiului terapiei farmacologice cu diferiți agenți 35 farmacologici) și al doilea lot (lotul de studiu), cu preparatul cu extract de Calendula officinalis din soluri îmbogățite cu zinc, având acțiune antiacneică și antipruriginoasă. 37

Rezultate

Rezultatele au fost surprinzătoare comparativ cu celelalte produse folosite; cazurile 39 tratate au fost vindecate în proporție de 90%, fără a produce efecte adverse, spre deosebire de pacienții din lotul martor unde vindecarea a fost în proporție de 30%, lăsând urme, care 41 după o lună mai erau perfect vizibile.

Concluzii 43

Extractul de Calendula officinalis în urma testării pe animale de experiență a fost încadrat drept produs nesensibilizant, fiind capabil să declanșeze procesul de refacere și 45 vindecare a cicatricilor, cu reducerea infiltrației inflamatorii și edemului, prin stimularea regenerării dermului și epidermului, cu proliferarea fibroblastilor și angiogeneză. 47

RO 122836 Β1 în testările pe subiecți umani unguentul din de extract de flori de Calendula officinalis de pe soluri îmbogățite cu zinc, prezintă acțiune antiacneică și antipruriginoasă evidentă.

	Activitate	Observații	Concluzii
1	Date existente privind efectele asupra oamenilor/animalelor care indică efecte asupra pielii și membranelor mucoaselor	Corozivă	Punct final apical; substanță considerată corozivă. Nu sunt necesare teste.
	NU ESTE CAZUL. NU AU FOST OBSERVATE ACESTE EFECTE
Iritantă	Punct final apical; substanță considerată iritantă. Nu sunt necesare teste.
	NU ESTE CAZUL. NU AU FOST OBSERVATE ACESTE EFECTE
Necorozivă/ neiritanta	Punct final apical; substanță considerată necorozivă și neiritantă. Nu sunt necesare teste.
	i		PRODUSUL POATE FI CONSIDERAT NECOROZIV Șl NEIRITANT
	Nu sunt disponibile informații sau informațiile disponibile nu sunt concludente
2	Se face evaluarea RSA pentru coroziune/iritație dermică	Se prevăd leziuni grave ale pielii	Substanță considerata corozivă. Nu sunt necesare teste.
	NU ESTE CAZUL. NU AU FOST OBSERVATE ACESTE EFECTE
Se prevede iritația pielii	Substanță considerata iritantă. Nu sunt necesare teste.
	1		NU ESTE CAZUL. NU AU FOST OBSERVATE ACESTE EFECTE
3	Se măsoară pH-ul (se ia în considerare capacitatea de tamponare, dacă este relevantă)	pH < 2 sau >11,5 (cu capacitate de tamponare ridicată, dacă este relevantă)	Se presupune un potențial coroziv. Nu sunt necesare teste.
	1
	2 <pH <11,5 sau pH < 2,0 sau > 1 7,5 cu o capacitate de tamponare redusă, dacă este relevantă
	1

RO 122836 Β1

Tabel (continuare)

	Activitate	Observații	Concluzii
4	Se evaluează datele privind toxicitatea sistemică pe cale dermică	Foarte toxic	Nu sunt necesare teste suplimentare.
	NU ESTE CAZUL. NU AU FOST OBSERVATE ACESTE EFECTE
Substanță necorozivă și neiritantă la testarea la o doză limită de 2000 mg/kg greutate corporala sau mai mare, pe iepuri	Se presupune că substanța este necorozivă și neiritantă. Nu sunt necesare teste suplimentare.
	l		PRODUSUL ESTE NECOROZIV Șl NEIRITANT LA TESTAREA PE IEPURI
	Nu sunt disponibile astfel de informații sau informațiile disponibile sunt neconcludente.
5	Se efectuează un test in vitro sau ex vivo pentru coroziune dermică validat și acceptat.	Reacție corozivă	Se presupune coroziune in vivo. Nu sunt necesare teste suplimentare.
	1		NU ESTE CAZUL. NU AU FOST OBSERVATE ACESTE EFECTE
	Substanța este necorozivă.
	i
6	Se efectuează un test in vitro sau in vivo pentru iritație dermică validat și acceptat.	Reacție iritantă	Se presupune iritație in vivo. Nu sunt necesare teste suplimentare.
			NU ESTE CAZUL. NU AU FOST OBSERVATE ACESTE EFECTE
	1 se poate lua în considerare înaintea etapelor 2 și 3.
	Nu sunt încă disponibile metode validate de testare in vitiv sau ex vivo pentru iritație dermică sau substanța nu este iritantă
	1

RO 122836 Β1

Tabel (continuare)

	Activitate	Observații	Concluzii
7	Se efectuează testul inițial in vivo pe un animal	Leziuni cutanate grave	Substanță considerată corozivă. Nu sunt necesare teste suplimentare.
	l		NU ESTE CAZUL. NU AU FOST OBSERVATE ACESTE EFECTE
	Fără leziuni grave
8	Se efectuează testul de confirmare cu unul sau două animale suplimentare	Substanță corozivă sau iritantă	Substanța considerată corozivă sau iritantă. Nu sunt necesare teste suplimentare.
	NU ESTE CAZUL. NU AU FOST OBSERVATE ACESTE EFECTE
Substanță necorozivă și neiritantă	Substanță considerată necorozivă și neiritantă. Nu sunt necesare teste suplimentare.
			PRODUSUL ESTE NECOROZIV Șl NEIRITANT LA TESTAREA PE UN ANIMAL

Claims (2)

1. Unguent farmaceutic pe bază de flori uscate de Calendula officinalis crescute pe 3 soluri îmbogățite cu zinc, caracterizat prin aceea că, conține 3...4 părți extract uscat și purificat de Calendula officinalis împreună cu o formulă de bază de unguent alcătuită din 5

5...6 părți alcool cetilic, 5...6 părți unt de cacao, 1 ...2 părți laurii sulfat de sodiu, 25...30 părți vaselină, 1...2 părți cetaceu și 50...60 părți soluție conservantă, părțile fiind exprimate în 7 greutate.

2. Procedeu de obținere a unguentului definit în revendicarea 1, caracterizat prin 9 aceea că o cantitate de 25,00 părți flori uscate de Calendula officinalis mărunțită prin măcinare mecanică, se supune extracției, într-un amestec de solvenți organici selectați dintre 11 cloroform, metanol, diclormetan, în raport de 1:1:1, în cantitate de 500 ml, cu ajutorul unui aparat Soxhlet și a băii cu ultrasunete, într-un raport amestec de solvenți: material vegetal 13 de 10: 3, iar extracția se efectuează până la epuizarea drogului vegetal, timp de 40 min...2 h, după care soluția se evaporă cu ajutorul unui rotavapor, la temperatura de 4O...5O°C și la 15 presiunea corespunzătoare solvenților, până la obținerea unui extract uscat, apoi 3...4 părți extract uscat purificat se înglobează într-o bază de unguent alcătuită din 5...6 părți alcool 17 cetilic, 5...6 părți unt de cacao, 1...2 părți laurii sulfat de sodiu, 25...30 părți vaselină, 1...2 părți cetaceu și 50...60 părți soluție conservantă, părțile fiind exprimate în greutate. 19