RO122298B1 - Secvenţă adn a enzimei fosfolipază a1 din tetrahymena termophila şi utilizarea acesteia - Google Patents
Secvenţă adn a enzimei fosfolipază a1 din tetrahymena termophila şi utilizarea acesteia Download PDFInfo
- Publication number
- RO122298B1 RO122298B1 ROA200300631A RO200300631A RO122298B1 RO 122298 B1 RO122298 B1 RO 122298B1 RO A200300631 A ROA200300631 A RO A200300631A RO 200300631 A RO200300631 A RO 200300631A RO 122298 B1 RO122298 B1 RO 122298B1
- Authority
- RO
- Romania
- Prior art keywords
- seq
- nucleic acid
- proteins
- thr
- homologous
- Prior art date
Links
- 108010013563 Lipoprotein Lipase Proteins 0.000 title abstract description 4
- 102100022119 Lipoprotein lipase Human genes 0.000 title abstract description 4
- 241000223892 Tetrahymena Species 0.000 title description 24
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 title description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 79
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 60
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 35
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 29
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 13
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims abstract description 11
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 241000248384 Tetrahymena thermophila Species 0.000 claims abstract description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 19
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 claims description 12
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 claims description 12
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 10
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 10
- ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trimethyl-N-[3-(trifluoromethyl)phenyl]benzenesulfonamide Chemical compound CC1=CC(C)=CC(C)=C1S(=O)(=O)NC1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 9
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 6
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 5
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 5
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 claims description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 4
- 210000004081 cilia Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims description 4
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims description 4
- 241000203069 Archaea Species 0.000 claims description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 abstract description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 43
- 241000282320 Panthera leo Species 0.000 description 28
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 28
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 18
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 17
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 11
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 10
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 8
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 6
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 5
- ALBODLTZUXKBGZ-JUUVMNCLSA-N (2s)-2-amino-3-phenylpropanoic acid;(2s)-2,6-diaminohexanoic acid Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 ALBODLTZUXKBGZ-JUUVMNCLSA-N 0.000 description 4
- FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N L-Phenylalanyl-L-lysin Natural products NCCCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- BECPPKYKPSRKCP-ZDLURKLDSA-N Thr-Glu Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O BECPPKYKPSRKCP-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 4
- 102000007478 beta-N-Acetylhexosaminidases Human genes 0.000 description 4
- 108010085377 beta-N-Acetylhexosaminidases Proteins 0.000 description 4
- 108010016616 cysteinylglycine Proteins 0.000 description 4
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 4
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- SNFUTDLOCQQRQD-ZKWXMUAHSA-N Glu-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O SNFUTDLOCQQRQD-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 3
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 108010003700 lysyl aspartic acid Proteins 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- PKOHVHWNGUHYRE-ZFWWWQNUSA-N (2s)-1-[2-[[(2s)-2-amino-3-(1h-indol-3-yl)propanoyl]amino]acetyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound O=C([C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)N)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O PKOHVHWNGUHYRE-ZFWWWQNUSA-N 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-1,3,5-triazine-2,4-diamine Chemical compound NC1=NC(N)=NC(Cl)=N1 FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 2
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 2
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 2
- JWKDQOORUCYUIW-ZPFDUUQYSA-N Asn-Lys-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O JWKDQOORUCYUIW-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 2
- VBKIFHUVGLOJKT-FKZODXBYSA-N Asn-Thr Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)O VBKIFHUVGLOJKT-FKZODXBYSA-N 0.000 description 2
- DXHINQUXBZNUCF-MELADBBJSA-N Asn-Tyr-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)C(=O)O DXHINQUXBZNUCF-MELADBBJSA-N 0.000 description 2
- FKBFDTRILNZGAI-IMJSIDKUSA-N Asp-Cys Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O FKBFDTRILNZGAI-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- RVMXMLSYBTXCAV-VEVYYDQMSA-N Asp-Pro-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O RVMXMLSYBTXCAV-VEVYYDQMSA-N 0.000 description 2
- LEYKQPDPZJIRTA-AQZXSJQPSA-N Asp-Trp-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O LEYKQPDPZJIRTA-AQZXSJQPSA-N 0.000 description 2
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- AYKQJQVWUYEZNU-IMJSIDKUSA-N Cys-Asn Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O AYKQJQVWUYEZNU-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- SYELGNBERZZXAG-JQWIXIFHSA-N Cys-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CS)N)C(O)=O)=CNC2=C1 SYELGNBERZZXAG-JQWIXIFHSA-N 0.000 description 2
- ZWQVYZXPYSYPJD-RYUDHWBXSA-N Glu-Gly-Phe Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 ZWQVYZXPYSYPJD-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 2
- XMBSYZWANAQXEV-QWRGUYRKSA-N Glu-Phe Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XMBSYZWANAQXEV-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- FMNHBTKMRFVGRO-FOHZUACHSA-N Gly-Asn-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)CN FMNHBTKMRFVGRO-FOHZUACHSA-N 0.000 description 2
- SUDUYJOBLHQAMI-WHFBIAKZSA-N Gly-Asp-Cys Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O SUDUYJOBLHQAMI-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- UZZXGLOJRZKYEL-DJFWLOJKSA-N His-Asn-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O UZZXGLOJRZKYEL-DJFWLOJKSA-N 0.000 description 2
- JCOSMKPAOYDKRO-AVGNSLFASA-N His-Glu-Lys Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N JCOSMKPAOYDKRO-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 2
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- ZUKPVRWZDMRIEO-VKHMYHEASA-N L-cysteinylglycine Chemical compound SC[C@H]([NH3+])C(=O)NCC([O-])=O ZUKPVRWZDMRIEO-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 2
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 2
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 2
- JPNRPAJITHRXRH-BQBZGAKWSA-N Lys-Asn Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O JPNRPAJITHRXRH-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- NKKFVJRLCCUJNA-QWRGUYRKSA-N Lys-Gly-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN NKKFVJRLCCUJNA-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- QOJDBRUCOXQSSK-AJNGGQMLSA-N Lys-Ile-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O QOJDBRUCOXQSSK-AJNGGQMLSA-N 0.000 description 2
- GIKFNMZSGYAPEJ-HJGDQZAQSA-N Lys-Thr-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O GIKFNMZSGYAPEJ-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 2
- MYTOTTSMVMWVJN-STQMWFEESA-N Lys-Tyr Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 MYTOTTSMVMWVJN-STQMWFEESA-N 0.000 description 2
- XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N N-alpha-L-glutamyl-L-phenylalanine Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BFYHIHGIHGROAT-HTUGSXCWSA-N Phe-Glu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O BFYHIHGIHGROAT-HTUGSXCWSA-N 0.000 description 2
- GLUBLISJVJFHQS-VIFPVBQESA-N Phe-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 GLUBLISJVJFHQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- RVRRHFPCEOVRKQ-KKUMJFAQSA-N Phe-His-Asn Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N RVRRHFPCEOVRKQ-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- OAOLATANIHTNCZ-IHRRRGAJSA-N Phe-Met-Asp Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)N OAOLATANIHTNCZ-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- MHNBYYFXWDUGBW-RPTUDFQQSA-N Phe-Tyr-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)N)O MHNBYYFXWDUGBW-RPTUDFQQSA-N 0.000 description 2
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 2
- URPSJRMWHQTARR-MBLNEYKQSA-N Thr-Ile-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(O)=O URPSJRMWHQTARR-MBLNEYKQSA-N 0.000 description 2
- BIBYEFRASCNLAA-CDMKHQONSA-N Thr-Phe-Gly Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CC1=CC=CC=C1 BIBYEFRASCNLAA-CDMKHQONSA-N 0.000 description 2
- QOLYAJSZHIJCTO-VQVTYTSYSA-N Thr-Pro Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O QOLYAJSZHIJCTO-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 2
- DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N Thr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N 0.000 description 2
- NJGMALCNYAMYCB-JRQIVUDYSA-N Thr-Tyr-Asn Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O NJGMALCNYAMYCB-JRQIVUDYSA-N 0.000 description 2
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 2
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N cycloheximide Chemical compound C1[C@@H](C)C[C@H](C)C(=O)[C@@H]1[C@H](O)CC1CC(=O)NC(=O)C1 YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- -1 lac Proteins 0.000 description 2
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 2
- 108010054155 lysyllysine Proteins 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000000734 protein sequencing Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- CUVSTAMIHSSVKL-UWVGGRQHSA-N (4s)-4-[(2-aminoacetyl)amino]-5-[[(2s)-6-amino-1-(carboxymethylamino)-1-oxohexan-2-yl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound NCCCC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CN CUVSTAMIHSSVKL-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710149506 28 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 108010011619 6-Phytase Proteins 0.000 description 1
- SYMHUEFSSMBHJA-UHFFFAOYSA-N 6-methylpurine Chemical compound CC1=NC=NC2=C1NC=N2 SYMHUEFSSMBHJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 108010025188 Alcohol oxidase Proteins 0.000 description 1
- 229930183010 Amphotericin Natural products 0.000 description 1
- QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N Amphotericin A Natural products OC1C(N)C(O)C(C)OC1OC1C=CC=CC=CC=CCCC=CC=CC(C)C(O)C(C)C(C)OC(=O)CC(O)CC(O)CCC(O)C(O)CC(O)CC(O)(CC(O)C2C(O)=O)OC2C1 QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100437118 Arabidopsis thaliana AUG1 gene Proteins 0.000 description 1
- YQNBILXAUIAUCF-CIUDSAMLSA-N Asn-Cys-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N YQNBILXAUIAUCF-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- VXLBDJWTONZHJN-YUMQZZPRSA-N Asn-His-Gly Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)NCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N VXLBDJWTONZHJN-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- AYOAHKWVQLNPDM-HJGDQZAQSA-N Asn-Lys-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O AYOAHKWVQLNPDM-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 101000609456 Beet necrotic yellow vein virus (isolate Japan/S) Protein P26 Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 235000011299 Brassica oleracea var botrytis Nutrition 0.000 description 1
- 240000003259 Brassica oleracea var. botrytis Species 0.000 description 1
- 101100505161 Caenorhabditis elegans mel-32 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 241000223782 Ciliophora Species 0.000 description 1
- 101710137943 Complement control protein C3 Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- OIMUAKUQOUEPCZ-WHFBIAKZSA-N Cys-Asn-Gly Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O OIMUAKUQOUEPCZ-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 101100125027 Dictyostelium discoideum mhsp70 gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 1
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 108010072062 GEKG peptide Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- LSPKYLAFTPBWIL-BYPYZUCNSA-N Glu-Gly Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O LSPKYLAFTPBWIL-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- LYCDZGLXQBPNQU-WDSKDSINSA-N Glu-Gly-Cys Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O LYCDZGLXQBPNQU-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- GXMXPCXXKVWOSM-KQXIARHKSA-N Glu-Ile-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N GXMXPCXXKVWOSM-KQXIARHKSA-N 0.000 description 1
- IEFJWDNGDZAYNZ-BYPYZUCNSA-N Gly-Glu Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O IEFJWDNGDZAYNZ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- UPADCCSMVOQAGF-LBPRGKRZSA-N Gly-Gly-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)CNC(=O)CN)C(O)=O)=CNC2=C1 UPADCCSMVOQAGF-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- VLIJYPMATZSOLL-YUMQZZPRSA-N Gly-Lys-Cys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)CN VLIJYPMATZSOLL-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- SSFWXSNOKDZNHY-QXEWZRGKSA-N Gly-Pro-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)CN SSFWXSNOKDZNHY-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 1
- JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N H-Gly-Phe-OH Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150031823 HSP70 gene Proteins 0.000 description 1
- LYCVKHSJGDMDLM-LURJTMIESA-N His-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 LYCVKHSJGDMDLM-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- 101100083853 Homo sapiens POU2F3 gene Proteins 0.000 description 1
- HYXQKVOADYPQEA-CIUDSAMLSA-N Ile-Arg Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N HYXQKVOADYPQEA-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- PWDSHAAAFXISLE-SXTJYALSSA-N Ile-Ile-Asp Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O PWDSHAAAFXISLE-SXTJYALSSA-N 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- CIOWSLJGLSUOME-BQBZGAKWSA-N Lys-Asp Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O CIOWSLJGLSUOME-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- AAORVPFVUIHEAB-YUMQZZPRSA-N Lys-Asp-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O AAORVPFVUIHEAB-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- MWVUEPNEPWMFBD-SRVKXCTJSA-N Lys-Cys-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN MWVUEPNEPWMFBD-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- PBLLTSKBTAHDNA-KBPBESRZSA-N Lys-Gly-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O PBLLTSKBTAHDNA-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- NVGBPTNZLWRQSY-UWVGGRQHSA-N Lys-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN NVGBPTNZLWRQSY-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- QCZYYEFXOBKCNQ-STQMWFEESA-N Lys-Phe Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 QCZYYEFXOBKCNQ-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- ZOKVLMBYDSIDKG-CSMHCCOUSA-N Lys-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN ZOKVLMBYDSIDKG-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 1
- IMDJSVBFQKDDEQ-MGHWNKPDSA-N Lys-Tyr-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N IMDJSVBFQKDDEQ-MGHWNKPDSA-N 0.000 description 1
- 102100024295 Maltase-glucoamylase Human genes 0.000 description 1
- JMEWFDUAFKVAAT-WDSKDSINSA-N Met-Asn Chemical compound CSCC[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC(N)=O JMEWFDUAFKVAAT-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 241001430197 Mollicutes Species 0.000 description 1
- AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)CN)C(O)=O)=CNC2=C1 AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010002311 N-glycylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 101001120192 Naja sputatrix Acidic phospholipase A2 C Proteins 0.000 description 1
- 101001120189 Naja sputatrix Acidic phospholipase A2 D Proteins 0.000 description 1
- 241000320412 Ogataea angusta Species 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 101100058850 Oryza sativa subsp. japonica CYP78A11 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150059175 PLA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100026466 POU domain, class 2, transcription factor 3 Human genes 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- UOZODPSAJZTQNH-UHFFFAOYSA-N Paromomycin II Natural products NC1C(O)C(O)C(CN)OC1OC1C(O)C(OC2C(C(N)CC(N)C2O)OC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)N)OC1CO UOZODPSAJZTQNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- RMKGXGPQIPLTFC-KKUMJFAQSA-N Phe-Lys-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O RMKGXGPQIPLTFC-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- PEFJUUYFEGBXFA-BZSNNMDCSA-N Phe-Lys-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 PEFJUUYFEGBXFA-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- 102000000571 Phospholipases A Human genes 0.000 description 1
- 108010002176 Phospholipases A Proteins 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- OCYROESYHWUPBP-CIUDSAMLSA-N Pro-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]1CCC[NH2+]1 OCYROESYHWUPBP-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- WCNVGGZRTNHOOS-ULQDDVLXSA-N Pro-Lys-Tyr Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC2=CC=C(C=C2)O)C(=O)O WCNVGGZRTNHOOS-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 101100273253 Rhizopus niveus RNAP gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000710960 Sindbis virus Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 101710152003 Suppressor of silencing P0 Proteins 0.000 description 1
- 241000248418 Tetrahymena pyriformis Species 0.000 description 1
- UQTNIFUCMBFWEJ-IWGUZYHVSA-N Thr-Asn Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O UQTNIFUCMBFWEJ-IWGUZYHVSA-N 0.000 description 1
- JBHMLZSKIXMVFS-XVSYOHENSA-N Thr-Asn-Phe Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O JBHMLZSKIXMVFS-XVSYOHENSA-N 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 1
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 1
- DZIKVMCFXIIETR-JSGCOSHPSA-N Trp-Gly-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O DZIKVMCFXIIETR-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 1
- QZOSVNLXLSNHQK-UWVGGRQHSA-N Tyr-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 QZOSVNLXLSNHQK-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- VNYDHJARLHNEGA-RYUDHWBXSA-N Tyr-Pro Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 VNYDHJARLHNEGA-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- SOEGLGLDSUHWTI-STECZYCISA-N Tyr-Pro-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 SOEGLGLDSUHWTI-STECZYCISA-N 0.000 description 1
- MFEVVAXTBZELLL-GGVZMXCHSA-N Tyr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 MFEVVAXTBZELLL-GGVZMXCHSA-N 0.000 description 1
- 241000726445 Viroids Species 0.000 description 1
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 108010028144 alpha-Glucosidases Proteins 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229940009444 amphotericin Drugs 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 101150009206 aprE gene Proteins 0.000 description 1
- 238000013452 biotechnological production Methods 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000006196 deacetylation Effects 0.000 description 1
- 238000003381 deacetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 230000003292 diminished effect Effects 0.000 description 1
- 101150052825 dnaK gene Proteins 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 1
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010008671 glycyl-tryptophyl-methionine Proteins 0.000 description 1
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 1
- 108010084389 glycyltryptophan Proteins 0.000 description 1
- 108010036413 histidylglycine Proteins 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 125000002669 linoleoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])/C([H])=C([H])\C([H])([H])/C([H])=C([H])\C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 108010038320 lysylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 210000004898 n-terminal fragment Anatomy 0.000 description 1
- UOZODPSAJZTQNH-LSWIJEOBSA-N paromomycin Chemical compound N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](N)C[C@@H](N)[C@@H]2O)O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)N)O[C@@H]1CO UOZODPSAJZTQNH-LSWIJEOBSA-N 0.000 description 1
- 229960001914 paromomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 229940085127 phytase Drugs 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 1
- 108010015796 prolylisoleucine Proteins 0.000 description 1
- 230000018883 protein targeting Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000160 recombinant therapeutic protein Drugs 0.000 description 1
- 230000037425 regulation of transcription Effects 0.000 description 1
- 238000012340 reverse transcriptase PCR Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 238000000539 two dimensional gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 108010020532 tyrosyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
- C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
- C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
- C12Y301/01032—Phospholipase A1 (3.1.1.32)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Prezenta invenţie se referă la un acid nucleic care cuprinde regiunile de codificare şi necodificare a fosfolipazei A1 din Tetrahymena thermophila şi regiunile din amontele şi avalul acestei gene, la proteina de fosfolipază A1, acid utilizat într-o metodă de expresie omoloagă sau heterologă a proteinelor şi peptidelor din fosfolipaza A1.
Description
Invenția se referă la un acid nucleic care codifică pentru fosfolipaza A1 (PLAJ și la utilizarea acesteia pentru obținerea de sisteme bacteriene pentru producere de proteine bacteriene recombinante.
Este cunoscut faptul că, levurile, bacteriile și celulele de mamifere au o mare importanță pentru prepararea biotehnologicăși producerea substanțelor active recombinante prin expresia heterologă a proteinelor străine. Sistemele de expresie bacteriene pe bază de E.coli sau B. subtilis sunt utilizate la producția de proteine sau peptide recombinante, cum arfi insulina, interleukina-2, activatorul tisular al plasminogenului, proteaze și lipaze. La bacteriile gram negative, sistemele de expresie se bazează în principal pe folosirea elementelor genetice, cum arfi operonul lac sau operonul triptofan. Proteinele străine gazdei sunt produse fie în corpuri de incluziune în interiorul celulei, sau atunci când sunt utilizate sistemele de expresie pe baza genelor de β-lactamază, în spațiul periplasmatic. Producerea de proteine recombinante în mediul de fermentație înconjurător nu a fost stabilită. La bacteriile gram pozitive, până în prezent, sunt introduse în sistemele de expresie și exprimate aproape exclusiv proteine proprii celulelor.
Levurile, cum ar fi S. cerevisae, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces lactis sau Pichia pastoris sunt, de asemenea, utilizate pentru expresia heterologă a proteinelor recombinante, cum ar fi factorul uman XIIla, pro-chimozina bovină, fitaza sau antigenii de suprafață. Aici, sistemele de expresie se bazează pe vectori-shuttle (vectori având atât părți de levură cât și părți bacteriene) care se bazează (în funcție de speciile de levuri) pe elementele genetice ale galactokinaz-epimerazei, metanol oxidazei, fosfatazei acide sau alcool-dehidrogenazei. De regulă, proteina recombinantăeste produsăîn citoplasmă celulei. Atunci când sunt utilizate secvențe semnal proprii levurilor, cum arfi factorul alfa, proteinele exprimate pot fi secretate, de asemenea, în mediul de fermentație. Glicozilarea proteinelor secretate are loc conform sistemului high-mannose și frecvent există hiperglicozilări ale proteinei care pot avea ca rezultat formarea de anticorpi la pacient.
Celulele de mamifere, cum ar fi diferite tipuri de celule ale rozătoarelor (celule CHO, celule C127) sau ale maimuțelor (vero, CV-1 sau celule COS) sunt utilizate, de asemenea, pentru expresia heterologă a proteinelor recombinante. în acest caz, sistemele de expresie se bazează pe virusuri recombinanți (vector BPV) sau pe vectori shuttle. Pentru reglarea expresiei sunt utilizate sisteme virale amplificator/promotor SV40. Proteinele recombinante, cum ar fi eritropoietina, sunt secretate în mediul de fermentație, deoarece genele străine își aduc, de regulă, propriile secvențe semnal, care sunt percepute de sistemul de expresie și utilizate pentru țintire.
Mai mult, pentru producerea biotehnologică a enzimelorglicozilate extracelulare, sunt utilizate protozoare ale genului Tetrahymena. Tetrahymena va crește în medii de fermentație ieftine utilizând metode standard de fermentație. Pentru transformarea unor astfel de celule Tetrahymena, sunt disponibili vectori care se bazează pe elemente rADN ale Tetrahymena. Pentru expresia heterologă a proteinelor bacteriene în Tetrahymena, se utilizează proiecții de ADN realizate din gene de Tetrahymena. Atunci când sunt disponibile elemente genetice adecvate pentru reglarea transcrierii, țintirea și glicozilarea proteinelor străine, Tetrahymena este un sistem de expresie ideal pentru producerea ieftină de proteine recombinante terapeutice.
Sistemele de expresie bacteriene gram negative utilizate până acum, conduc, de regulă, la formarea de corpuri de incluziune în interiorul celulei, însoțite de denaturarea proteinelor. Pentru recuperarea proteinelor recombinante, celulele trebuie lizate și proteina inactivă denaturată trebuie să reposede funcția. Aceasta necesită etape de procedeu suplimentare costisitoare și reduc producerea de proteină dorită. Glicozilarea, care este importantă pentru
RO 122298 Β1 proteinele de eucariote, este eliminată complet. Atunci când sunt utilizate sisteme de 1 expresie bacteriene gram-pozitive, degradarea proteinei țintă datorită activităților proteolitice intense din bulionul de fermentație este o problemă suplimentară. 3
Atunci când sunt utilizate levuri pentru expresia heterologă, proteina țintă dorită este, de asemenea, produsă numai în celulă, de unde trebuie eliminată prin liza celulară. Ca și la 5 sistemele de expresie bacteriene, aceasta determină etape de procedeu suplimentare care necesită timp și bani. Atunci când sunt utilizate peptide semnal proprii levurilor, proteinele 7 străine nu sunt despărțite și glicozilate corect pentru secreție.
Dacă se vor utiliza în schimb sisteme celulare de mamifere pentru producerea de 9 proteine recombinate, proteinele dorite sunt găsite în mediul de fermentație într-o stare extracelulară, despărțite și glicozilate corect. Cu toate acestea, ceea ce este dezavantajos 11 aici, este pe de o parte rata de expresie scăzută datorită prelucrării defectuoase și transcrierea ineficientă a genelor care au fost introduse în genomul liniei celulare de pro- 13 ducție prin intermediul vectorilor virali. Pe de altă parte, mediile de fermentație cu conținut de ser pentru celulele de mamifere sunt extrem de costisitoare. în plus, tehnologia de 15 fermentație pentru liniile celulare sensibile la forfecare este complicată și în mod similar costisitoare datorită construcțiilor pentru aerarea fără bule. Probleme suplimentare provin din 17 riscul ridicat de infectare a liniilor celulare prin micoplasme și virusuri. în consecință, utilizarea celulelor de mamifer pentru prepararea biotehnologică a proteinelor recombinante are 19 ca rezultat costuri foarte ridicate, măsuri de siguranță sporită și producții scăzute.
La utilizarea ciliatelor, cum ar fi Tetrahymena, dezavantajele menționate mai sus la 21 producerea de proteine recombinantesunt eliminate. Astfel, de exemplu, anumite hidrolaze acide care sunt implicate în digerarea particulelor de hrană sunt exportate din celulă în 23 cantități ridicate și cu glicozilare complexă.
Alam și colab., descriu în J. Euk. Microbiol. 43(4), 1996, paginile 295-303 donarea 25 unei gene, care codifica pentru alfa-glucozidaza acida a Tetrahymena pyriformis. Cu toate acestea, doar o mică parte din proteină este eliminată din celulă. în plus, cererea internațio- 27 nala de brevet PCT/EP00/01853 descrie gena unei β-hexosaminidaze din Tetrahymena termophila, care este cunoscută, cu toate acestea, este exportată din celulă doar aproximativ 29 80%.
Cu toate acestea, până acum nu a fost posibilă determinarea expresiei proteinelor 31 glicozilate de eucariote în Tetrahymena, care să fie, de asemenea, secretate exclusiv în mediul de fermentație. Motivul este faptul ca secvențele de ADN ale proteinelor extracelulare 33 proprii Tetrahymena care sunt necesare pentru construcția vectorilor de expresie și care exportă exclusiv proteina străină în mediul de fermentație înconjurător au fost necunoscute 35 până acum. Cunoscute sunt secvențele de ADN ale unei proteine care codifică pentru β-hexosaminidaza de Tetrahymena thermophila. O astfel de secvență a fost înregistrată de 37 cerere de brevet DE 199 58 979.8, DE 199 09189.7 precum și PCT/EP00/01853. Dezavantajul acestor secvențe este totuși, ca pre/pro-peptidele care le conțin vor ținti o proteină 39 străină gazdei în mediul de fermentație înconjurător doar în proporție de aproximativ 80%.
Acest lucru se datorează faptului că enzima β-hexosaminidaza este prezentă în proporție de 41 aproximativ 20% în membrană în condiții naturale și doar în proporție de aproximativ 80% din enzima produsă în mod natural este exportată din celulă. Din acest motiv pre/pro- 43 peptidele β-hexosaminidazei, atunci când sunt poziționate în fața unei proteine străine gazdei prin metode de inginerie genetică, vor ținti doar aproximativ 20% din această proteină 45 străină gazdei în membrana citoplasmatică pe suprafața Tetrahymena thermophila. Aceasta este asociată cu un dezavantaj tehnologic considerabil la prelucrarea substanțelor active re- 47 combinante. Pe de o parte se diminuează producția deoarece o parte din proteina exprimată
RO 122298 Β1 rămâne în celula legată de membrană și atfel nu este posibilă purificarea în întregime a proteinei exprimate din bulionul de fermentație. Pe de altă parte, proteina străină gazdei din membrana celulară poate exercita efecte toxice asupra celulelor gazdă, încetinind astfel creșterea celulară.
Până astăzi nu sunt cunoscuți promotori constitutivi ai Tetrahymena care să determine o transcripție corespunzătoare sau continuă a proteinelor heterologe. Până acum sunt cunoscuți doar promotori ai genelor histona și tubulina (Bannon și colab., 1984, Gaertig și colab., 1993). Cu toate acestea, un dezavantaj critic al acestor promotori este faptul că activarea lor este dependentă de ciclul celular. Expresia genelor proteinelor heterologe care sunt legate de astfel de promotori dependenți de ciclul celular se determină numai în celule care cresc și se divid. Aceasta are dezavantaje tehnologice considerabile de prelucrare, deoarece proteina dorită este produsă astfel numai în faza logaritmică de creștere. în faza de creștere staționară, în care se atinge cea mai mare densitate celulară și astfel cea mai ridicată performanță a organismului de expresie (Tetrahymena), cu greu mai există celule crescute rămase și astfel are loc doar o expresie redusă a proteinei heterologe.
Problema pe care o rezolvă invenția este de a prezenta un acidul nucleic, secvența semnal N-terminală respectiv proteina fosfolipaza Ai din ciliate, metoda de expresie omoloagă sau heteroloagă a proteinelor și peptidelor prin intermediul vectorilor, plasmidelor, cosmidelor, cromozomilor sau minicromozomilor, transpozonilor, elementelor IS, rADN sau alte tipuri circulare sau liniare de ADN sau ARN.
Acidul nucleic conform invenției cuprinde regiuni de codificare și ne-codificare având SECV. ID. NR 4, în care respectiva regiune codifică fosfolipaza A! (PLA1) din Tetrahymena thermophila și respectivele regiuni de ne-codificare reprezintă regiunile în amontele și în avalul acestei gene.
Secvența semnal N-terminală aPLA., conform invenției are SECV. ID NR. 6.
Proteina de fosfolipază At (PLAJ conform invenției are secvența aminoacizi conform SECV. ID NR. 7.
Metoda pentru expresia omoloagă sau heterologă a proteinelor și peptidelor și pentru recombinarea omoloagă sau heterologă (knock-out, înlocuire genică) conform invenției, în care ciliatele sunt transfectate cu un acid nucleic sau părți ale acestora care sunt combinați cu amplificatori, promotori, operatori, origini, terminatori, gene de rezistență la antibiotice, uzuale pentru expresia omoloagă sau heterologă a proteinelor sau cu alți acizi nucleici sau fragmente de ADN sau alte tipuri de secvențe de viroizi, virusuri, bacterii, arheozoare, protozoare, fungi, plante, animale sau oameni.
Prin aplicarea invenției se obține avantajului că recuperarea proteinelor recombinante și a proteinei inactive denaturate care trebuie să reposede funcția nu are loc în etape de procedeu suplimentare costisitoare și nu se reduce producerea de proteină dorită.
Un obiect al invenției este asigurarea unui sistem care să permită producerea de proteine heteroloage într-un sistem de expresie, după transformarea în Tetrahymena, din celule în mediul de fermentație.
Obiectul este realizat printr-un sistem în care se utilizează un acid nucleic având secvența SECV. ID NR. 1 care codifică pentru o fosfolipază Al (SECV. ID NR. 7). în mod avantajos, produsul de expresie al acestui ADN este exportat în cantități mari din celulă în condiții de cultură. Proteina exprimată este exportată în cantități mari în mediul de cultură înconjurător și nu este conținută în membrană. Secvența de acid nucleic conform invenției conține un promotor care determină o transcripție constitutivă, adică independența de ciclul celular, a genelor din aval a proteinelor heterologe. O asemenea transcripție constitutivă are ca avantaj faptul că proteinele sunt exprimate continuu prin expresie heterologă în organismul
RO 122298 Β1 gazdă, nefiind afectate de ciclul celular. Astfel, poate fi efectuată transcripția genei străine 1 și expresia proteinei heterologe și în timpul fazei staționare de creștere, cu o creștere celulară redusă. 3
Secvența de ADN a fosfolipazei ΑΊ în conformitate cu invenția, include de preferință o regiune amonte a PLA! (SECV. ID NR. 2), care poartă elementele promotoare pentru iniție- 5 rea transcripției, o peptidă semnal și o pro-peptidă, elemente genetice suplimentare pentru țintirea proteinelor și în particular, o regiune aval a PL·^ (SECV. ID NR. 3) care conține 7 elemente genetice pentru terminarea transcripției. Utilizarea acestor acizi nucleici într-un vector permite expresia proteinelor exprimate heterolog independent de ciclul celular și 9 transportarea lor selectiv afară din celulă și în mediul de cultură înconjurător fără ca proteinele exprimate să devină încorporate în membrana citoplasmatică, prin aceasta, 11 putând fi izolate asemenea proteine din bulionul de fermentație fără liza celulară.
în particular, invenția se referă, de asemenea, la secvența semnal (SECV. ID NR. 6) 13 a proteinei conform invenției. De preferință, acestea sunt aminoacizii 1 - 110 ai proteinei conform invenției (SECV. ID NR. 5). Invenția se referă, de asemenea, la un acid nucleic care 15 codifică fragmentul N-terminal (SECV. ID NR. 3). Acesta este, de preferință, un fragment al acizilor nucleici conform invenției (SECV. ID NR. 4) având în special secvența acidului 17 nucleic 1 până la 155 conform Fig. 1.
Secvența acidului nucleic al regiunii netranslatate (regiunea amonte) 19 (SECV. ID NR. 2) în amonte de regiunea secvenței de codificare a ΡΙ_ΑΊ din Tetrahymena este poziționată între poziția -275 și poziția -1 (reprezentată prin litere mici). Regiunea 21 netranslatată stabilită cuprinde 275 baze. Ca elemente ale unui promotor, în pozițiile -49 până la -55 (tipărite cu litere îngroșate) se găsește o casetă TATA, iar între baza -133 23 și baza -136 (tipărite cu litere îngroșate) se găsește o casetă CAAT putativă. Domeniul secvenței de codificare a cADN este reprezentat cu majuscule. Numerotarea secvenței 25 începe cu codonul start ATG. Regiunile cunoscute din secvențarea proteică sunt încasetate iar codonul stop este subliniat. Proteina matură este codificată de la baza 331. Listarea 27 secvenței de la baza 1 la baza 330 reprezintă pre/pro-secvența (SECV. ID NR. 8) al PLA^
Listarea secvenței de la baza 331 până la baza 963 reprezintă secvența PLA! 29 (SECV. ID NR. 9) matură. La poziția 961 se găsește sfârșitul translației TGA, iar la poziția 1039, semnalul de poliadenilare AAT AAA. Secvența acidului nucleic din poziția 964 până 31 la poziția 1134, ce se găsește sub secvența de codificare a PLA! a Tetrahymena, reprezintă regiunea aval a PLA! (SECV. ID NR. 3) care nu este translatată (reprezentată de asemenea 33 cu litere mici). De la poziția 964 până la poziția 1101 se află regiunea cunoscută din secvențarea cADN-ului, care a fost de asemenea confirmată cu PCR inversă. După 35 transcripție, coada poli-A este atașată de ultimul codon al mARN (ttt, pozițiile 1098-1101).
Un alt aspect al invenției este utilizarea unei secvențe de acid nucleic din hidrolaze 37 acide conform invenției, sau părți din acestea pentru expresia omoloagă sau heterologă a peptidelor și proteinelor recombinante și pentru recombinarea omoloagă sau heterologă 39 (knock-out, înlocuire genică).
Invenția se referă, de asemenea, la o metodă pentru expresia heterologă sau 41 omoloagă a proteinelor și peptidelor și pentru recombinarea heterologă sau omoloagă (knock out, înlocuire genică) în care sunt transfectate ci liate cu un acid nucleic conform 43 invenției.
Acizii nucleici sau părțile lor pot fi combinați în special cu enhanceri, promotori 45 operatori, origini, terminatori, rezistente la anitibiotice uzuale pentru expresia omoloagă sau heterologă a proteinelor, sau cu alți acizi nucleici sau fragmente de ADN ale altor secvențe 47 de orice fel de viroizi, virusuri, bacterii, arheozoare, protozoare, fungi, plante, animale sau oameni. 49
RO 122298 Β1 în particular, acidul nucleic conform invenției este conținut într-un vector, o plasmidă, o cosmidă, un cromozom, un minicromozom, un transpozon, un element IS, un rADN sau oricare altă formă circulară sau liniară de ADN sau ARN.
Invenția se referă, de asemenea, la o metodă în care acidul nucleic conform invenției sau părți din acesta, care codifică fosfolipaza Αή sunt combinate cu amplificatori, în expresia omoloagă sau heterologă, cum ar fi regiunea NF-1 (un enhancercitomegalovirus) promotori, cum ar fi promotori lac, trc, tic sau tac, promotori din clasa II și III ai sistemului T7 RNAP, promotori bacteriofagi T7 și SP6, promotori aprE, amilază sau spac pentru sisteme de expresie cu Bacillus, promotori A0X1, AUG1 și 2 sau GAPp (Pichia) pentru sisteme de expresie cu levuri, promotor RSV (virus-SV40), promotor CMV (citomegalovirus), promotor AFP (adenovirusuri) sau promotori metalotionină pentru sisteme de expresie cu celule de mamifere, promotori virus Sindbis sau promotori virus de pădure Semlike pentru celule de insecte, promotori pentru sisteme de expresie cu celule de insecte, cum ar fi hsp70, DS47, actina 5C sau copia, promotori specifici plantelor cum ar fi promotor 35S (virusul mozaic al conopidei), promotori amilaza sau promotori patatina clasa I, operatori cum ar fi operator tet, peptide semnal cum ar fi secvențe semnal pre-pro a-MF (Saccharomyces), origini, terminatori, antibiotice și rezistente la medicamente, cum ar fi ampicilina, kanamicina, streptomicina, cloramfenicol, penicilina, amfotericina, cicloheximida, 6-metilpurina, paromomicina, higromicina, α-amanatina, markeri auxotrofi cum ar fi gena dihidrofolat reductazei sau alți acizi nucleici sau fragmente de ADN, sau orice fel de secvențe din viroizi, virusuri, bacterii, arheozoni, protozoare, fungi, plante, animale sau oameni.
în particular, acidul nucleic conform invenției sau părți ale acestuia sunt introduse întrun vector, o plasmidă, o cosmidă, un cromozom sau minicromozom, un transpozon, un element IS, un rADN, sau orice alt fel de ADN sau ARN circular sau liniar.
Persoana de specialitate va înțelege că acizii nucleici având omologie de cel puțin 40% cu acidul nucleic conform SECV. ID NR. 1. potfi utilizați, de asemenea, în conformitate cu invenția. Proteina conform SECV. ID NR. 2 poate fi modificată, de asemenea, fără să își piardă funcția. Astfel, pot fi realizate așa-numitele schimburi conservative de aminoacizi. Astfel, potfi interschimbați, de exemplu, aminoacizii hidrofobi.
în continuare, se prezintă un exemplu de realizare a invenției în care se descrie purificarea și izolarea fosfolipazei At din Tetrahymena și determinarea secvenței acesteia în legătură cu cele fig. 1 și 2, care reprezintă:
- fig. 1, un acid nucleic ce codifică regiunea în amonte (SECV. ID NR. 2), regiunea de codificare (SECV. ID NR. 1) și pentru regiunea aval (SECV. ID NR. 3) a fosfolipazei A! din ciliate;
- fig. 2, un produs de expresie corespunzător al acidului nucleic conform SECV. ID NR. 1. Invenția se referă, de asemenea, la proteina conform SECV. ID NR. 7.
Exemplul 1. Recuperarea PLA1
PLA, a fost obținută din supranatanți de cultură fără celule de la Tetrahymena thermophyia. Astfel, celulele au fost fermentate într-un fermentator de 2 litri (Biostat MD, Braun Diessel Biotech, Melsungen, Germania) care a fost controlat de o unitate digitală de control (DCU). Fermentatorul a funcționat mai întâi 24 de ore secvențial și apoi continuu. Recoltarea supranatantului de cultură fără celule a fost asigurată printr-un modul de perfuzie având dimensiunea porilor de aproximativ 0,3 pm (S6/2, Enka, Wuppertal).
Fermentarea a fost realizată după următorii parametri:
- volumul de lucru a fost 2 I;
- rata perfuziei a fost 2 l/zi;
- turația agitatorului a fost limitată la 800 rpm ;
RO 122298 Β1
- temperatura a fost constantă la 30°C; 1
- valoarea pH-ului a fost menținută constantă la pH 7;
- titrul de inoculare a fost de 50 000 celule/ml. 3
Pentru fermentație a fost utilizată tulpină SB 1868 VII. Aceasta este un tip de tulpină sălbatică a Tetrahymena thermophila. 5
Fermentația a fost realizată pe o perioadă de 264 de ore, iar recoltele au fost testate pentru activitate PLA,. 7
Purificarea PLA1
Pentru purificarea PLA, s-a utilizat 1 I de supranatant de cultură fără celule din 9 fermentație. Acesta a fost amestecat cu 140 g sulfat de amoniu și concentrat printr-o unitate de ultrafiltrare (Pellikon XL, dimensiunea de eliminare 3kDa, Millipore) până la un volum de 11 50 ml. Ulterior, eșantionul a fost purificat prin cromatografie cu interacțiune hidrofobă (20 x 1,6 Fractogel EMD Phenyl I 650, Merck, Darmstadt). Debitul a fost de 5 ml/min, iar 13 eluatul a fost colectat în fracțiuni de 5 ml. Activitatea enzimatică a fost măsurată după deacilarea unei fosfolipide radiomarcate (L-3-fosfatidilcolina, 1-palmitoil-2-[1-14C]linoleoil). 15 Fig. 3 arată profilul de eluare obținut, gradientul de acetat de sodiu și avtivitățile enzimatice în fracțiuni individuale. 17
Cele trei fracțiuni cu activitatea enzimatică cea mai ridicată au fost combinate și retamponate în soluția tampon de pornire (Bis-Tris 20mM, pH 6,5) pentru cromatografia cu 19 schimb de anioni (AEC). Ulterior, eșantionul a fost introdus într-o coloană (Q-SepharoseHiload-16/10, Pharmacia, Sweden) și PLA! a fost eluată cu un gradient liniar de NaCl (debitul 21 -3 ml/min) din coloană și colectat în fracțiuni de 5 ml. Fig. 4 arată profilul de eluare obținut, gradientul de NaCl și activitățile enzimatice ale fracțiunilor individuale. 23
Din fracțiunea cu cea mai mare activitate PLA.,, au fost eliminați 200 pl și separați prin cromatografie de excludere dimensională (SEC). în acest scop, a fost utilizată o coloană 25 Superdex HR 75 30/10 (Pharmacia, Sweden). Debitul în această cromatografie a fost 0,6 ml/min, eluatul a fost colectat în fracțiuni de 200 μΙ. Fig. 5 arată profilul eluatului obținut și 27 activitățile enzimatice ale fracțiunilor individuale.
Fracțiunile obținute au fost examinate pentru puritate utilizând electroforeză pe gel 29 unidimensională. Astfel, au fost stabilite două benzi la -26 și -28 kDa. Separarea acestor două benzi printr-o electroforeză pe gel bidimensională a avut ca rezultat separarea celor 31 două benzi în 2 și respectiv 3 pete, având puncte izoelectrice diferite.
Pentru proteinele de 26 kDa, acestea au fost la pH 6,3 și 5,7 iar pentru proteinele de 28 kDa 33 acestea au fost la pH 6,3, 5,7 și 5,3.0 examinare finală a acestor pete prin analiza de masă a amprentelor a arătat ca aceste pete au fost izoforme cu aceeași proteină. 35
Examinarea molecular-biologică a PLA1
După ce s-a demonstrat puritatea proteinei, au fost blotate eșantioane din proteină 37 pe o membrană PVDF și supuse secvențierii inițiale din capătul N. în plus, un eșantion suplimentar a fost digerat în triplicat și supus de asemenea secvențierii inițiale. Utilizând 39 secvențele de proteină obținute în felul acesta, au fost preparați primeri de oligonucleotidă, care au fost apoi utilizați în revers transcriptaza PCR (3' RACE, amplificarea rapidă a 41 capetelor cADN). Utilizând această tehnică de PCR, a fost amplificat cu succes cADN de fosfolipaza A, și secvențiat ulterior. Secvența obținută a avut o lungime de 633 baze și 43 respectiv 729 baze, iar greutatea moleculară a proteinei mature derivată din acestea este de aproximativ 22,4 kDa. în secvența derivată, au fost găsite din nou la 100% oligopeptide 45 de 22 aminoacizi (N-terminal) și 18 aminoacizi (în proteină) stabilite din secvențierea proteinei. în plus față de secvența proteinei mature, a pututfi de asemenea stabilită secvența 47 pre/pro peptidei prin intermediul 5' RACE (amplificarea rapidă a capetelor cADN) (fig. 2).
RO 122298 Β1
Aceasta este o peptidă având o lungime de 110 aminoacizi care poartă atât secvența semnal cât și prop peptida care inactivează enzimă și este cilvată doar în locul final al activității enzimei. Comparațiile secvențelor nu au produs homologii cu fosfolipazele A! cunoscute anterior, în afară de o secvență consens de 5 aminoacizi (GxSxG), care este găsită în toate lipazele și fosfolipazele și este discutată ca un situs de legare pentru lipide sau fosfolipide. Mai departe, secvențele amonte și aval ale PLA, au fost stabilite prin PCR invers (fig. 1).
Astfel, ADN-ul genomic a fost tăiat cu endonucleaze de restricție, ligat cu T4 ligaza și amplificat în final cu primeri inversi. Pentru amplificarea regiunii amonte a PLA1 prin PCR inversă, a fost utilizat ADN genomic tăiat cu endonucleaza de restricție Sspl. Astfel, a putut fi stabilită o regiune amonte de 275 baze și identificate elemente promotori. La poziția -136, există o casetă CAAT, care are o distanță similară față de startul translației ca și casetele CCAAT ale genelor histonei (-141 și -151) ale Tetrahymena găsite de Brunk și Sadler (1990).
A fost identificată la poziția -55 o casetă TATA, care stabilește punctul exact de pornire al transcripției în genele eucariote. Secvența acesteia corespunde secvențelor consens găsite la eucariote. Pentru amplificarea regiunii avală, care conține terminatorul pentru transcripția PLA! din Tetrahymena, prin PCR invers, s-a utilizat ADN genomic tăiat cu BamHI. Astfel, în plus față de regiunea aval cunoscută din 3'-RACE, au putut fi stabilite alte 222 baze (fig. 3).
RO 122298 Β1
LISTA SECVENȚELOR <I10> Cilian AG <120> SECVENȚA ADN A ENI2MEI FOSFOLIPAZA Αχ DE TETRAHYMENA CILIATE SI UTILIZAREA ACESTEIA <130> 020414wo MB/BM <140> PCT/EP02/00578 <141> 2002-01-22 <160> 9 <17O> Patentii» Ver. 2.1 <210> 1 <211> 963 <212> ADN <213> Tetrahymena therraophila <400> 1 atgaacaaga ctctcatctt agctttagtt gttgttttgg ctttaactgc caccaccttg 60 gttgctttcc acaaccactc tcacaacatc agagttgact aagaccccgc cactetcttc 120 aagcaattca agcaaactta caataagaag tatgctgatg ctactttcga aacctacaga 180 ttcggtgtct tcacccaaaa cttagaaatc gtcaagactg actctacttt cggtgtcacc 240 taattcatgg acttaactcc tgctgaattc gctcaacaat tcctcacttt acacgaaaag 300 gttaacagca ccgaagttta cagagcttaa ggtgaagcta ccgaagttga ctggactgcc 360 aagggtaagg tcacccctgt taagaactaa ggttcttgtg gttcctgctg ggctttctcc 420 accattggtg ccgttgaatc tgctctttgg attgctggtc aaggtgaata aaacactctt 480 aaccttgctg aataagaata agttgactgt gctaagtccc ccaagtacga ctctgaaggt 540 tgcaacggtg gttggatggt tgaaggtttc aagtacatca tcgacaacaa gatctcctaa 600 actgctaact atccctacac tgctaaggat ggtaagtgca aggacacctc ttccttcaag 660 aagttetcta tttctaagta cgctgaaatc ccctaaggtg actgcaactc cctcaâctct 720 gccttagaac aaggtcctat ctccgttgct gttgatgcca ccaacttcta attctacact 780 tctggtgtct ttaaaaactg caaggccaac ctcaaccacg gtgtcctctt agttgccaac 840 gttgactctt ctctcaagat caagaactcc tggggtcctt cttggggtga aaagggtttc 900 atcagattag ctgccggtaa cacttgcggt gtctgcaatg ctgcctctta ccctattgtt 960 tga 963 <210> 2 <211> 275 <212> ADN <213> Tetrahymena thermophila <400> 2 aatatttatc aatgctactt ataattcttt tagtatgaga tatgatatgc tctttctctg 60 ctagacttaa cttatgacat ttgaactttt aataaaagaa ttttttttat taaaaagcag 120 agatttttaa tagaagaatc aatgactcat gaatttaata aagattttca agtgttttct 180 aataccgact agctttataa attcacttat taatcaacga tataaaaatt atattaacaa 240 atcaataaat aaaaaaataa ataaaaacaa aacaa 275 <210> 3 <211> 171 <212> ADN <213> Tetrahymena thermophila
RO 122298 Β1 <212> ADN <213> Tetrahyroena thermophiia <400> 4 aatatttate aatgctactt ataattcttt tagtatgaga tatgatatgc tctttctctg ctagacttaa cttatgaeat ttgaactttt aataaaagaa ttttttttat taaaaagcag agatttttaa tagaagaatc aatgactcat gaatttaata aagattttca agtgttttct aataccgact agctttataa attcacttat taatcaacga tataaaaatt atattaacaa atcaataaat aaaaaaataa ataaaaacaa aacaaatgaa caagactctc atcttagctt tagttgttgt tttggcttta actgccacca ccttggttgc tttccacaac cactctcaca acatcagagt tgactaagac cccgccactc tcttcaagca attcaagcaa acttacaata agaagtatgc tgatgctact ttcgaaacct acagattcgg tgtcttcacc caaaacttag aaatcgtcaa gactgactct actttcggtg tcacctaatt catggactta actcctgctg aattcgctca acaattcctc actttcacga aaaggttaac agcaccgaag tttacagagc ttaaggtgaa gctaccgaag ttgactggac tgccaagggt aaggtcaccc ctgttaagaa ctaaggttct tgtggttcct gctgggcttt ctccaccatt ggtgccgttg aatctgctct ttggattgct ggtcaaggtg aataaaacac tcttaacctt gctgaataag aataagttga ctgtgctaag tcccccaagt acgactctga aggttgcaac ggtggttgga tggttgaagg tttcaagtac atcatcgaca acaagatctc ctaaactgct aactatccct acactgctaa ggatggtaag tgcaaggaca cctcttcctt caagaagttc tctatttcta agtacgctga aatcccctaa ggtgactgca actcectcaa ctctgcctta gaacaaggtc ctatctccgt tgctgttgat gccaccaact tctaattcta cacttctggt gtctttaaaa actgcaaggc caacctcaac cacggtgtcc tcttaqttgc caacgttgac tcttctctca agatcaagaa ctcctggggt ccttcttggg gtgaaaaggg tttcatcaga ttagctgccg gtaacacttg cggtgtctgc aatgctgcct cttaccctat tgtttgaaaa aacataatcc aaattaaaaa aaattactca aaactgataa tataaaaaat taattttcat aattttaatg taaataaata cctttatatt tgacgttttg tactcaaaat aaattaaagt taacaaacca tatttattta attctacttt tcaattttta aaaatata <210> 5 <211> 320 <212> PRT <213> Tetrahyroena thermophiia <400> 5
| Met 1 | Asn | Lys | Thr | Leu 5 | Ile | Leu | Ala | Leu | Val 10 | Gly | Val | Leu | Ala | Leu 15 | Thr |
| Ala | Thr | Thr | Leu 20 | Val | Ala | Phe | His | Asn 25 | His | Ser | His | Asn | Ile 30 | Arg | Val |
| Asp | Gin | Asp 35 | Pro | Ala | Thr | Leu | Phe 40 | Lys | Gin | Phe | Lys | Gin 45 | Thr | Tyr | Asn |
| Lys | Lys 50 | Tyr | Ala | Asp | Pro | Thr 55 | Phe | Glu | Thr | Tyr | Arg 60 | Phe | Gly | Val | Phe |
| Thr 65 | Gin | Asn | Leu | Glu | Ile 70 | Val | Lys | Thr | Asp | Ser 75 | Thr | Phe | Gly | Val | Thr 80 |
| Gin | Phe | Met | Asp | Leu 85 | Thr | Pro | Ala | Glu | Phe 90 | Ala | Gin | Gin | Phe | Leu 95 | Thr |
| Leu | His | Glu | Lys 100 | val | Asn | Ser | Thr | Glu 105 | Val | Tyr | Arg | Ala | Gin 110 | Gly | Glu |
| Ala | Thr | Glu 115 | Val | Asp | Trp | Thr | Ala 120 | Lys | Gly | Lys | Val | Thr 125 | Pro | Val | Lys |
| Asn | Gin 130 | Gly | Ser | Cys | Gly | Ser 135 | Cys | Trp | Ala | Phe | Ser 140 | Thr | Ile | Gly | Ala |
| Val 145 | Glu | Ser | Ala | Leu | Leu 150 | Ile | Ala | Gly | Gin | Gly 155 | Glu | Gin | Asn | Thr | Leu 160 |
| Asn | Leu | Ala | Glu | Gin | Glu | Leu | Val | Asp | Cys | Ala | Lys | Ser | Pro | Lys | Tyr |
RO 122298 Β1
| 165 | 170 | 175 | 1 | |||||||||||||
| Asp | Ser | Glu | Gly | Cys | Asn | Gly | Gly | Trp | Met | Val | Glu | Gly | Phe | Lys | Tyr | |
| 180 | 185 | 190 | 3 | |||||||||||||
| Ile | Ile | Asp | Asn | Lys | Ile | Ser | Gin | Thr | Ala | Asn | Tyr | Pro | Tyr | Thr | Ala | |
| 195 | 200 | 205 | 5 | |||||||||||||
| Lys | Asp | Gly | Lys | Cys | Lys | Asp | Thr | Ser | Ser | Phe | Lys | Lys | Phe | Ser | Ile | |
| 210 | 215 | 220 | 7 | |||||||||||||
| Ser | Lys | Tyr | Ala | Glu | Ile | Pro | Gin | Gly | Asp | Cys | Asn | Ser | Leu | Asn | Ser | |
| 225 | 230 | 235 | 240 | |||||||||||||
| Ala | Leu | Glu | Gin | Gly | Pro | Ile | Ser | Val | Ala | Val | Asp | Ala | Thr | Asn | Phe | 9 |
| 245 | 250 | 255 | ||||||||||||||
| Gin | Phe | Tyr | Thr | Ser | Gly | val | Phe | Lys | Asn | Cys | Lys | Ala | Asn | Leu | Asn | 11 |
| 260 | 265 | 270 | ||||||||||||||
| His | Gly | Val | Leu | Leu | Val | Ala | Asn | Val | Asp | Ser | Ser | Leu | Lys | Ile | Lys | 13 |
| 275 | 280 | 285 | ||||||||||||||
| Asn | Ser | Trp | Gly | Pro | Ser | Trp | Gly | Glu | Lys | Gly | Phe | Ile | Arg | Leu | Ala | |
| 290 | 295 | 300 | 15 | |||||||||||||
| Ala | Gly | Asn | Thr | Cys | Gly | Val | Cys | Asn | Ala | Ala | Ser | Tyr | Pro | Ile | Val | |
| 305 | 310 | 315 | 320 | 17 |
<210> 6
| <21l> 110 <212> PRT <213> Tetrahymena thermophila | 21 | |||||||||||||||
| <400> 6 Met Asn 1 | Lys | Thr | Leu 5 | Ile | Leu | Ala | Leu | Val 10 | Gly | Val | Leu | Ala | Leu 15 | Thr | 23 | |
| Ala | Thr | Thr | Leu 20 | Val | Ala | Phe | His | Asn 25 | His | Ser | His | Asn | Ile 30 | Arg | Val | 25 |
| Asp | Gin | Asp 35 | Pro | Ala | Thr | Leu | Phe 40 | Lys | Gin | Phe | Lys | Gin 45 | Thr | Tyr | Asn | 27 |
| Lys | Lys 50 | Tyr | Ala | Asp | Pro | Thr 55 | Phe | Glu | Thr | Tyr | Arg 60 | Phe | Gly | Val | Phe | 29 |
| Thr 65 | Gin | Asn | Leu | Glu | Ile 70 | Val | Lys | Thr | Asp | Ser 75 | Thr | Phe | Gly | Val | Thr 80 | 31 |
| Gin | Phe | Met | Asp | Leu 85 | Thr | Pro | Ala | Glu | Phe 90 | Ala | Gin | Gin | Phe | Leu 95 | Thr | 33 |
| Leu | His | Glu | Lys 100 | Val | Asn | Ser | Thr | Glu 105 | Val | Tyr | Arg | Ala | Gin 110 |
<210> 7 <211> 210 37 <212> PRT <213> Tetrahymena thermophila <400> 7 39
RO 122298 Β1
| Gly 1 | Glu | Ala | Thr | Glu 5 | Val | Asp | Trp | Thr | Ala 10 | Lys | Giy | Lys | Val | Thr 15 | Pro |
| Val | Lys | Asn | Gin 20 | Gly | Ser | Cys | Gly | Ser 25 | Cys | Trp | Ala | Phe | Ser 30 | Thr | Ile |
| Gly | Ala | Val 35 | Glu | Ser | Ala | Leu | Leu 40 | Ile | Ala | dy | Gin | Gly 45 | Glu | Gin | Asn |
| Thr | Leu 50 | Asn | Leu | Ala | Glu | Gin 55 | Glu | Leu | Val | Asp | cys 60 | Ala | Lys | Ser | Pro |
| Lys 65 | Tyr | Asp | Ser | Glu | Gly 70 | Cys | Asn | Gly | Gly | Trp 75 | Met | Val | Glu | Gly | Phe 80 |
| Lys | Tyr | Ile | Ile | Asp 85 | Asn | Lys | Ile | Ser | Gin 90 | Thr | Ala | Asn | Tyr | Pro 95 | Tyr |
| Thr | Ala | Lys | Asp 100 | Gly | Lys | Cys | Lys | Asp 105 | Thr | Ser | Ser | Phe | Lys 110 | Lys | Phe |
| Ser | Ile | Ser 115 | Lys | Tyr | Ala | Glu | Ile 120 | Pro | Gin | Gly | Asp | Cys 125 | Asn | Ser | Leu |
| Asn | Ser 130 | Ala | Leu | Glu | Gin | Gly 135 | Pro | Ile | Ser | Val | Ala 140 | val | Asp | Ala | Thr |
| Asn 145 | Phe | Gin | Phe | Tyr | Thr 150 | Ser | Gly | Val | Phe | Lys 155 | Asn | Cys | Lys | Ala | Asn 160 |
| Leu | Asn | His | Gly | Val 165 | Leu | Leu | Val | Ala | Asn 170 | Val | Asp | Ser | Ser | Leu 175 | Lys |
| Ile | Lys | Asn | Ser 180 | Trp | Gly | Pro | Ser | Trp 185 | Gly | Glu | Lys | Gly | Phe 190 | Ile | Arg |
| Leu | Ala | Ala 195 | Gly | Asn | Thr | Cys | Gly 200 | Val | Cys | Asn | Ala | Ala 20S | Ser | Tyr | Pro |
Ile Val 210 <210> 8 <2U> 330 <212> ADU <213> Tetrahymena therroophila <400> 8 atgaacaaga ctctcatctt agctttagtt gttgttttgg ctttaactgc caccaccttg gttgctttcc acaaccactc tcacaacatc agagttgact aagaccccgc cactctcttc aagcaattca agcaaactta caataagaag tatgctgatg ctactttcga aacctacaga ttcggtgtct tcacccaaaa cttagaaatc gtcaagactg actctacttt cggtgtcacc taattcatgg acttaactcc tgctgaattc gctcaacaat tcctcacttt acacgaaaag gttaacagca ccgaagttta cagagcttaa <210> 9 <211> 633 <212> ADN <213> Tetrahymena therroophila <400> 9 ggtgaagcta ccgaagttga ctggactgcc aagggtaagg tcacccctgt taagaactaa ggttcttgtg gttcctgctg ggctttctcc accattggtg ccgttgaatc tgctctttgg attgctggtc aaggtgaata aaacactctt aaccttgctg aataagaata agttgactgt gctaagtccc ccaagtacga ctctgaaggt tgcaacggtg gttggatggt tgaaggtttc
RO 122298 Β1 aagtacatca tcgacaacaa gatctcctaa actgctaact atccctacac tgctaaggat 300 ggtaagtgca aggacacotc ttccttcaag aagttctcta tttctaagta cgctgaaatc 360 ccctaaggtg actgcaactc cctcaactct gccttagaac aaggtcctat ctccgttgct 420 gttgatgcca ccaacttcta attctacact tctggtgtct ttaaaaactg caaggccaac 480 ctcaaccacg gtgtcctctt agttgccaac gttgactctt ctctcaagat caagaactcc 540 tggggtcctt cttggggtga aaagggtttc atcagattag ctgccggtaa cacttgcggt 600 gtctgcaatg ctgcctctta ccctattgtt tga 633
Claims (9)
- Revendicări1. Acid nucleic care cuprinde regiunile de codificare și necodificare, caracterizat prin aceea că are SECV. ID. NR 4, în care respectiva regiune codifică fosfolipaza At din Tetrahymena thermophila având SECV. ID. NR. 5 iar respectivele regiuni de necodificare reprezintă regiunile în amontele și în avalul acestei gene.
- 2. Acidul nucleic conform revendicării 1, în care respectivele regiuni de necodificare din amonte și în aval au SECV. ID NR. 2 și 3, iar acidul nucleic al regiunii de codificare are SECV. IDNR. 1,8 și/sau 9.
- 3. Secvență semnal N-terminală a PLA., având SECV. ID. NR. 5 conform revendicării 1, care are SECV. ID NR. 6.
- 4. Proteină de fosfolipază A, având secvența aminoacidă conform SECV. ID NR. 7.
- 5. Utilizarea unui acid nucleic conform revendicărilor 1 la 3, sau părți ale acestuia pentru expresia omoloagă sau heterologă a peptidelor și proteinelor recombinante și pentru recombinarea omoloagă sau heterologă de tip knock-out sau înlocuire genică.
- 6. Metodă pentru expresia omoloagă sau heterologă a proteinelor și peptidelor, și pentru recombinarea omoloagă sau heterologă de tip knock-out sau înlocuire genică, în care ciliatele sunt transfectate cu un acid nucleic conform oricăreia dintre revendicările 1 la 3.
- 7. Metodă conform revendicării 6, în care acizii nucleici menționați sau părți ale acestora sunt combinați cu amplificatori, promotori, operatori, origini, terminatori, gene de rezistență la antibiotice, uzuale pentru expresia omoloagă sau heterologă a proteinelor sau cu alți acizi nucleici sau fragmente de ADN sau alte tipuri de secvențe de viroizi, virusuri, bacterii, arheozoare, protozoare, fungi, plante, animale sau oameni.
- 8. Metodă conform revendicării 6 și/sau 7, în care un acid nucleic este conținut într-un vector, o plasmidă, o cosmidă, un cromozom sau minicromozom, un transpozon, un element IS, un ADNr, sau oricare altă formă circulară sau liniară de ADN sau ARN.
- 9. Vectori, plasmide, cosmide, cromozomi sau minicromozomi, transpozoni, elemente IS, ADNr sau alte tipuri circulare sau liniare de ADN sau ARN, conținând cel puțin unul dintre acizii nucleici conform cu cel puțin una din revendicările de la 1 la 3.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE10105152A DE10105152A1 (de) | 2001-01-22 | 2001-01-22 | Eine DNA-Sequenz des Enzyms Phospholipase A1 aus Ciliaten und die Verwendung dieser |
| PCT/EP2002/000578 WO2002057459A2 (de) | 2001-01-22 | 2002-01-22 | Eine dna-sequenz des enzyms phospholipase a1 aus dem ciliaten tetrahymena und die verwendung dieser |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RO122298B1 true RO122298B1 (ro) | 2009-03-30 |
Family
ID=7672908
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ROA200300631A RO122298B1 (ro) | 2001-01-22 | 2002-01-22 | Secvenţă adn a enzimei fosfolipază a1 din tetrahymena termophila şi utilizarea acesteia |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7045330B2 (ro) |
| EP (1) | EP1360306B1 (ro) |
| JP (1) | JP4295508B2 (ro) |
| KR (1) | KR100855645B1 (ro) |
| AT (1) | ATE346155T1 (ro) |
| AU (1) | AU2002250842B2 (ro) |
| CA (1) | CA2435323C (ro) |
| CY (1) | CY1106337T1 (ro) |
| CZ (1) | CZ20031991A3 (ro) |
| DE (2) | DE10105152A1 (ro) |
| DK (1) | DK1360306T3 (ro) |
| ES (1) | ES2277615T3 (ro) |
| HU (1) | HUP0302801A3 (ro) |
| PL (1) | PL206037B1 (ro) |
| PT (1) | PT1360306E (ro) |
| RO (1) | RO122298B1 (ro) |
| WO (1) | WO2002057459A2 (ro) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100774367B1 (ko) * | 2005-08-31 | 2007-11-08 | 인하대학교 산학협력단 | 섬모충류 특이적 프라이머 및 이를 이용한 섬모충류 검출방법 |
| KR101038914B1 (ko) * | 2008-10-22 | 2011-06-10 | 김세준 | 앨범대지 접착용 테이프 |
| TR201813880A2 (tr) | 2018-09-25 | 2020-04-21 | Anadolu Üniversitesi̇ | TETRAHYMENA THERMOPHILA YAPAY KROMOZOMU (TtAC1) VE REKOMBINANT PROTEIN ÜRETIMI IÇIN KULLANIMI |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH10155493A (ja) * | 1996-10-04 | 1998-06-16 | Sankyo Co Ltd | アスペルギルス属由来のホスホリパーゼａ１をコードする遺伝子 |
-
2001
- 2001-01-22 DE DE10105152A patent/DE10105152A1/de not_active Ceased
-
2002
- 2002-01-22 KR KR1020037009667A patent/KR100855645B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 2002-01-22 PT PT02719712T patent/PT1360306E/pt unknown
- 2002-01-22 AT AT02719712T patent/ATE346155T1/de active
- 2002-01-22 DE DE50208775T patent/DE50208775D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-01-22 WO PCT/EP2002/000578 patent/WO2002057459A2/de not_active Ceased
- 2002-01-22 DK DK02719712T patent/DK1360306T3/da active
- 2002-01-22 PL PL362475A patent/PL206037B1/pl not_active IP Right Cessation
- 2002-01-22 AU AU2002250842A patent/AU2002250842B2/en not_active Ceased
- 2002-01-22 EP EP02719712A patent/EP1360306B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-01-22 ES ES02719712T patent/ES2277615T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-01-22 JP JP2002558511A patent/JP4295508B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2002-01-22 HU HU0302801A patent/HUP0302801A3/hu unknown
- 2002-01-22 US US10/466,110 patent/US7045330B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-01-22 CA CA002435323A patent/CA2435323C/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-01-22 CZ CZ20031991A patent/CZ20031991A3/cs unknown
- 2002-01-22 RO ROA200300631A patent/RO122298B1/ro unknown
-
2007
- 2007-02-22 CY CY20071100254T patent/CY1106337T1/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1360306B1 (de) | 2006-11-22 |
| HUP0302801A2 (hu) | 2003-11-28 |
| JP4295508B2 (ja) | 2009-07-15 |
| WO2002057459A2 (de) | 2002-07-25 |
| ATE346155T1 (de) | 2006-12-15 |
| PT1360306E (pt) | 2007-02-28 |
| CZ20031991A3 (cs) | 2004-03-17 |
| JP2004525622A (ja) | 2004-08-26 |
| DK1360306T3 (da) | 2007-03-19 |
| DE10105152A1 (de) | 2002-07-25 |
| EP1360306A2 (de) | 2003-11-12 |
| PL206037B1 (pl) | 2010-06-30 |
| WO2002057459A3 (de) | 2002-12-12 |
| KR20030087627A (ko) | 2003-11-14 |
| DE50208775D1 (de) | 2007-01-04 |
| CY1106337T1 (el) | 2011-10-12 |
| US20040115673A1 (en) | 2004-06-17 |
| CA2435323C (en) | 2008-09-02 |
| US7045330B2 (en) | 2006-05-16 |
| AU2002250842B2 (en) | 2007-11-22 |
| KR100855645B1 (ko) | 2008-09-03 |
| PL362475A1 (en) | 2004-11-02 |
| HUP0302801A3 (en) | 2011-01-28 |
| CA2435323A1 (en) | 2002-07-25 |
| ES2277615T3 (es) | 2007-07-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102239183B (zh) | 大量分泌的蛋白的筛选和它们作为融合配偶体在重组蛋白制备中应用 | |
| ES2370657T3 (es) | Escisión de precursores de insulinas mediante una variante de tripsina. | |
| US7276605B2 (en) | Method for producing recombinant trypsin | |
| CZ304969B6 (cs) | Způsob přípravy rekombinantní proteinázy K, vektor obsahující DNA kódující zymogenní prekurzor proteinázy K a kvasinková hostitelská buňka transformovaná tímto vektorem | |
| HUE030279T2 (en) | Cloning, expression and use of acid lysophospholipases | |
| CA2435323C (en) | Dna sequence of the enzyme phospholipase a1 of ciliate tetrahymena, and the use of the same | |
| CN108251401B (zh) | 脂肪酶及其应用 | |
| KR100714116B1 (ko) | 췌장의 프로카복시펩티다제 ｂ를 사용한 인슐린의 제조 | |
| Zavalova et al. | Destabilase-lysozyme of medicinal leech. Multifunctionality of recombinant protein | |
| US20060127973A1 (en) | Dna sequences of major secreted proteins from the ciliate tetrahymena and use thereof | |
| ES2763650T3 (es) | Proteasas aspárticas | |
| Salvi et al. | Cloning and characterization of the gene encoding an esterase from Spirulina platensis | |
| AU781876B2 (en) | Beta-hexosaminidase, DNA sequence from ciliates for coding the same and use thereof | |
| CN108103045B (zh) | 脂肪酶及其应用 | |
| Yoshigi et al. | Structure of barley β-amylase and expression in Escherichia coli of cDNA | |
| JP2011167117A (ja) | 耐熱性リパーゼ遺伝子、耐熱性リパーゼ、耐熱性リパーゼ発現ベクター、組み換え生物、耐熱性リパーゼの発現方法、耐熱性リパーゼの反応方法、および耐熱性組成物 | |
| HK1124341B (en) | Cleavage of precursors of insulins by a variant of trypsin | |
| KR20140144356A (ko) | 밍크고래의 유전체로부터 분리된 신규의 당화 효소 및 이의 제조방법 |