PT99904A

PT99904A - Processo de producao de uma variante de paratormona ou de um seu fragmento ou analogo que possuem actividade substancial de paratormona (pth) e uma sensibilidade reduzida a oxidacao de hospedeiros celulares e de composicoes farmaceuticas

Info

Publication number: PT99904A
Application number: PT9990491A
Authority: PT
Inventors: Richard P Bozzato; Anne K Kronis
Original assignee: Allelix Biopharma; Glaxo Canada
Priority date: 1990-12-21
Filing date: 1991-12-20
Publication date: 1992-12-31
Also published as: AU9103791A; CA2098283A1; IE914484A1; WO1992011286A1

Description

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MEMÓRIA DESCRITIVA

CAMPO DO INVENTO O presente invento refere-se a um processo de produção de variantes de paratormona, particularmente, por tecnologia de ADN recombinante, e de composições farmacêuticas contendo estas variantes .

ANTECEDENTES DO INVENTO A paratormona, ou PTH é uma proteína produto das glândulas paratiróides de mamífero que induz vários efeitos biológicos. 0 papel da PTH como mediadora do processo de reconstituição dos ossos, fisiologicamente normal, tem actualmente um interesse considerável. Em relação a este processo, a PTH actua sobre o tecido ósseo para modular a deposição de cálcio de esqueleto e, deste modo, pode provocar um aumento da massa óssea. Tem sido sugerido que a administração de PTH, ou de seus análogos agonis-ticos, seria terapeuticamente útil para tratar e/ou prevenir as desordens relacionadas com o sistema ósseo tais como a osteopo-rose.

Tem sido também revelado que a PTH exerce um efeito vaso-relaxante no sistema cardiovascular e que pode ser útil no controlo da pressão sanguínea sistémica (ver, por exemplo, o artigo de Tanner et al em Vascular Neuroeffector Mechanisms, 4th International Symposium, Raven Press, 1983, pp289-293). Mais recentemente, tem sido revelado que a PTH é também capaz de modular o crescimento de queratinócitos e pode ser terapeuticamente útil no tratamento de desordens relacionadas com a pele tais como a psoríase (ver WO89/03873).

Deste modo, várias formas de PTH, incluindo a PTH bovina e humana, e os seus análogos, são prometedores como agentes terapêuticos no tratamento e/ou prevenção de um certo número de desordens humanas. As indicações actuais são de que o fornecimento de PTH, em quantidades suficientes para as suas aplicações clínicas e comerciais, pode ser satisfeito explorando a tecnologia de ADN recombinante para a sua produção. Tem sido noticiado -3- 73 495 16777/157/ALLE que o hospedeiro bacteriano E. coli. por exemplo, é capaz de exprimir ADN codificando a PTH humana para produzir um produto de PTH bioactiva (ver Rabbani et al, J. Biol. Chem., 1988, 263(3):1307). A produção de PTH bioactiva na levedura Saccha-romvces cerevisiae tem também sido noticiada (ver Gautvik et al., W088/03165).

Contudo, um inconveniente para o seu valor como produto farmacêutico é o de que a PTH é sensível à oxidação até um nível para o qual a sua actividade biológica pode ser eliminada após exposição a certos oxidantes fortes, especialmente, ao longo do tempo. A inactivação oxidativa de PTH pode deste modo ser problemática durante várias etapas na sua produção e purificação, pode reduzir o seu tempo de vida em prateleira e pode reduzir o seu tempo de semi-vida e/ou a biodisponibilidade da proteína in vivo. Seria deste modo desejável proporcionar variantes de PTH possuindo uma sensibilidade reduzida à oxidação. A sensibilidade da PTH à oxidação foi pela primeira vez notada durante tentativas para marcar a proteína usando um processo de iodação oxidativa. Tal como foi noticiado em J. Biol. Chem., 1976, 251(1):159, Rosenblatt et al verificaram que um fragmento de PTH de bovino, i.e., a PTH (1-34) de bovino, era desactivado quando tratado sob condições de iodação. Contudo, quando se substituíram os dois resíduos metionina, localizados nas posições 8 e 18 no péptido, por um aminoácido, sintético, mas isoestericamente similar, a norleucina, verificou-se que a actividade do análogo de PTH de bovino resultante não foi substancialmente afectada pelo processo de iodação. Se bem que as metioninas substituídas e as suas substituições de norleucina fossem homólogos estruturais próximos, o análogo contendo norleucina exibiu uma bioactividade significativamente reduzida, de menos do que cerca de 50% da do seu recíproco contendo metionina. O uso de um aminoácido sintético, tal como a norleucina, como substituto da metionina apresenta várias desvantagens. Os análogos da PTH contendo norleucina podem ser produzidas apenas -4- 73 495 16777/157/ALLE pela via trabalhosa da síntese de péptidos em fase sólida ou em solução. Essa norleucina não é de ocorrência natural pelo que se levanta a possibilidade de os análogos de PTH que a contêm poderem estimular uma imuno-resposta após a administração. Além disso, a redução na bioactividade, provocada pela substituição da metionina por norleucina, pode ser indesejável num contexto farmacêutico, particularmente, uma vez que ocorrerão provavelmente reduções adicionais na bioactividade, durante o armazenamento e in vivo. Deste modo, seria desejável proporcionar variantes da paratormona que exibissem, tanto uma actividade substancial de PTH, como uma sensibilidade reduzida à oxidação. Seria particularmente desejável proporcionar um processo alternativo para a produção de variantes de PTH possuindo estas características.

Um objectivo geral do presente invento é o de proporcionar novas variantes da paratormona que exibam uma actividade substancial de PTH e uma sensibilidade reduzida à oxidação.

Um outro objectivo do presente invento é o de proporcionar novas variantes da paratormona possuindo uma actividade substancial de PTH e uma sensibilidade reduzida à oxidação, susceptíveis de serem produzidos por tecnologia de ADN recombi-nante. É também um objectivo do presente invento proporcionar uma composição farmaceuticamente útil, contendo uma nova variante da paratormona que exibe uma actividade substancial de PTH e uma sensibilidade reduzida à oxidação.

SUMÁRIO DO INVENTO

No presente invento, as variantes de paratormona exibindo uma actividade substancial de PTH e uma sensibilidade reduzida à oxidação são obtidas substituindo pelo menos uma metionina residente na PTH por um aminoácido codificado geneticamente.

Mais particularmente e de acordo com um aspecto geral do presente invento, é proporcionada uma variante de paratormona possuindo actividade substancial de PTH e sensibilidade reduzida

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à oxidação, com a fórmula

[X8Y18]PTH na qual pelo menos um de X e Y é um aminoácido codificado geneticamente, diferente de metionina e cisteína.

De acordo com uma concretização, as variantes de paratormo-na são aquelas nas quais Y na fórmula anterior é metionina e X é seleccionado de entre alanina, valina, leucina, isoleucina, se-rina e triptofano.

De acordo com outra concretização, as variantes de parator-mona são aquelas nas quais X na fórmula anterior é metionina e Y é um aminoácido codificado geneticamente, diferente de metionina e de cisteína.

De acordo com uma outra concretização do presente invento, Y na fórmula anterior é diferente de metionina e de cisteína e X é seleccionado de entre alanina, valina, leucina, isoleucina, serina e triptofano.

Pelo facto de se usarem aminoácidos codificados geneticamente, em vez de aminoácidos sintéticos, como substitutos da metionina, o presente invento proporciona variantes da PTH que, para além de possuírem uma actividade substancial de PTH e uma sensibilidade reduzida à oxidação, são também susceptíveis de serem produzidos por técnicas de ADN recombinante. De acordo com outro aspecto do presente invento é proporcionado, deste modo, um hospedeiro celular possuindo, incorporada expressavelmente, uma molécula de ADN que codifica uma variante de PTH do presente invento. Num aspecto relacionado do presente invento, é proporcionado um processo para a produção de uma variante de PTH possuindo uma actividade substancial de PTH e uma sensibilidade reduzida à oxidação, compreendendo o passo de cultivar um hospedeiro celular no qual foi incorporado expressavelmente ADN codificando a variante de PTH.

As variantes de PTH do presente invento são utilizadas adequadamente como agentes terapêuticos. Deste modo, de acordo com

73 495

16777/157/ALLE -6 um outro aspecto do presente invento é proporcionado um processo para a produção de uma composição farmacêutica compreendendo um transportador farmaceuticamente aceitável e uma variante de PTH do presente invento.

Estes e outros aspectos do invento serão agora descritos com maior pormenor e por referência aos desenhos nos quais:

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 é um mapa do plasmídeo pX no qual o ADN codificando a PTH humana está ligado a ADN que possibilita a sua expressão em E. coli; a Figura 2 mostra a sequência de nucleótidos da região, codificando a PTH humana, do plasmídeo que se mostra na Figura 1, e mostra também a sequência de aminoácidos da PTH humana. Os resíduos metionina nas posições 8 e 18 estão destacados usando caixas; a Figura 3 ilustra graficamente as actividades relativas da PTH humana e de variantes da PTH humana, antes da oxidação; e a Figura 4 ilustra graficamente as actividades relativas da PTH humana e de variantes de PTH humana, após a oxidação.

DESCRICÃO DETALHADA DO INVENTO E SUAS CONCRETIZAÇÕES PREFERIDAS 0 presente invento refere-se a variantes de PTH que exibem actividade substancial de PTH e uma sensibilidade reduzida à oxidação.

Na presente descrição, a actividade de PTH é definida no contexto do ensaio de adenilato-ciclase, baseado no osteo-sarco-ma, utilizado convencionalmente na arte. Resumidamente, este ensaio permite a determinação in vitro da extensão em que a PTH estimula a actividade de adenilato-ciclase em células de osteo-sarcoma da ratazana da linhagem "UMR" e, deste modo, fornece uma indicação dos efeitos da PTH no tecido ósseo in vivo. Protocolos para a condução do ensaio têm sido descritos por Rodan et al, 1983, J. Clin. Invest., 72:1511 (que utilizam células de osteo-sarcoma da linhagem ROS) e por Rabbani et al, 1988, Endocrinol., 123:2709 (que utilizam a linha UMR-106). As

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variantes de PTH que exibem, no ensaio baseado em UMR, uma CE50 de pelo menos 2000 nM, i.e., de 2000 nM ou inferior, são aqui caracterizadas como possuindo uma actividade "substancial" de

PTH

Para além de manterem uma actividade substancial de PTH, as variantes de PTH do presente invento são também caracterizadas por uma sensibilidade à oxidação que é reduzida em relação a um recíproco de PTH contendo metionina. Uma variante de PTH possuindo uma "sensibilidade reduzida à oxidação" exibirá, após exposição a um oxidante, uma actividade, tal como é medida no ensaio baseado no osteo-sarcoma, que excede a actividade exibida por um controlo de PTH tratado de um modo similar. Um ensaio adequado para a determinação da sensibilidade à oxidação compreende um procedimento em dois passos, no qual a variante de PTH é primeiramente exposta a condições de oxidação, por exemplo, usando peróxido de hidrogénio como oxidante, e, depois, ensaiada para determinar a actividade no ensaio baseado no osteo-sarcoma que se acabou de descrever. Protocolos adequados para testar a sensibilidade à oxidação são descritos por 0'Riordan et al, 1974, J. Endocrinol., 63:117, e são ilustrados aqui depois nos exemplos. As variantes de PTH humana possuindo uma sensibilidade reduzida à oxidação exibirão, no ensaio baseado no osteo-sarcoma, uma actividade que é pelo menos maior do que a de um controlo de PTH humana tratado de um modo similar.

As variantes de PTH do presente invento possuem a fórmula geral:

[X8Y18]PTH na qual pelo menos um de X e Y é um aminoácido codificado geneticamente diferente de metionina e cisteína. Na fórmula anterior, os números identificam a localização dos aminoácidos X e Y na molécula de PTH, em relação ao seu aminoácido do terminal N. Para ser consistente, e, como é convencional na arte, a X e Y são atribuídos o mesmo número de posição, quando presentes no contexto de formas truncadas no terminal N ou estendidas, da PTH, tais como análogos ou fragmentos da PTH. Na fórmula, o termo PTH refere-se a qualquer forma de PTH codificável genetica- -8- 73 495 16777/157/ALLE mente, na qual uma metionina está residente em uma ou em ambas as posições 8 e 18. Estas formas incluem, mas não estão limitadas a, PTH porcina que possui uma única metionina residente na posição 8, bem como a PTH humana e a PTH de bovino, que possuem ambas metioninas residentes na posição 8 e na posição 18. O termo PTH abrange também a PTH de ratazana que possui um resíduo de metionina nas posições 8, 21 e 41 e a PTH de galinha que possui um resíduo de metionina nas posições 5, 8, 26 e 80. o termo "PTH humana" refere-se à forma madura da hormona, que consiste em 84 aminoácidos arranjadas na sequência descrita por Kimura et al, 1983, Biochem. Biophys. Res. Comi., 114(2):493. Os termos "PTH humana", "hPTH" e "hPTH (1-84)" são aqui usados intermutavelmente.

Os termos "PTH de bovino" "PTH de ratazana" e "PTH porcina" referem-se também à forma madura da hormona, consistindo cada uma em 84 aminoácidos arranjados nas sequências descritas por Keutmann et al em Current Research on Calcium Regulating Hormonas, Cooper, C.W. (Ed.), 1987, University of Texas Press, Aus-tin, pp. 57-63.

Embora o termo PTH, a não ser onde se especifique ser de outro modo, se refira à forma madura de uma dada espécie de PTH de mamífero, será de notar que a estratégia aqui descrita pode ser também aplicada a análogos e a fragmentos da PTH contendo metionina, codificáveis geneticamente, que exibam actividade de PTH, por forma a gerar variantes seus exibindo uma sensibilidade reduzida à oxidação. O termo "análogo de PTH" é aqui usado como referência a formas de PTH contendo metionina, possuindo uma sequência de aminoácidos alterada, tal como uma substituição de aminoácido num sítio não contendo metionina. 0 termo "fragmento de PTH" é aqui usado como referência a péptidos contendo metionina possuindo actividade da PTH e compreendendo pelo menos os primeiros 27 aminoácidos da PTH e, mais desejavelmente, os primeiros 34 aminoácidos da PTH.

Será de notar, a partir dos exemplos aqui apresentados, que

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16777/157/ALLE -9-a sensibilidade à oxidação exibida pela PTH pode ser* reduzida substituindo pelo menos uma metionina residente na PTH por virtualmente qualquer aminoácido codificado geneticamente. Claro que a cisteína é um aminoácido oxidável e não deverá ser usado como substituto da metionina. Para as espécies de PTH nas quais as metioninas estão presentes nas duas posições, tais como a PTH humana e a PTH de bovino, verificou-se que o aminoácido usado como substituto da metionina tem de ser seleccionado cuidadosamente por forma a preservar a actividade substancial de PTH. Além disso, o sitio no qual a substituição é efectuada afecta também, tanto a sensibilidade à oxidação como a actividade de PTH da variante resultante.

Mais particularmente, verificou-se que a sensibilidade à oxidação é reduzida e a actividade de PTH substancialmente preservada, quando a metionina na posição 18 é substituída por, virtualmente, qualquer aminoácido codificado geneticamente. Deste modo, de acordo com uma concretização do presente invento, é proporcionada uma variante de paratormona com a fórmula

[Y18]PTH na qual Y é um aminoácido, codificado geneticamente, diferente de metionina e cisteína. Desejavelmente, Y é seleccionado de entre o grupo consistindo em alanina, valina, leucina, isoleucina, serina e triptofano. Muito adequadamente, Y é seleccionado de entre o grupo consistindo em alanina, valina, leucina e isoleucina. Preferivelmente, Y é leucina.

Compostos específicos de acordo com a fórmula [Y^8]PTH incluem variantes de PTH humana tais como [Leu18]hPTH, [Ile18]-hPTH, [Ala-*-8]hPTH e [Val^8]hPTH, bem como os seus equivalentes de PTH de bovino. A substituição da metionina na posição 8 da PTH tem um efeito mais significativo, tanto na sensibilidade à oxidação como na actividade de PTH, do que a substituição da metionina na posição 18. Em relação à substituição da Metl8, obtém-se uma maior redução na sensibilidade à oxidação do que quando se substitui a Met8. Contudo, a substituição da Met8 pode provocar tam-

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16777/157/ALLE -10-bdm um declínio significativo na actividade de PTH e o aminoácido escolhido para substituir a Met8 tem de ser cuidadosamente seleccionado. De acordo com uma concretização do invento são proporcionadas variantes de PTH com a fórmula:

[X8]PTH na qual X é um aminoácido seleccionado de entre o grupo consistindo em alanina, valina, leucina, isoleucina, serina e tripto-fano. Desejavelmente/ X é seleccionado de entre alanina, valina, leucina e isoleucina. Muito adequadamente, X é seleccionado de entre valina, leucina e isoleucina. Preferivelmente, X é leucina.

Compostos específicos de acordo com a fórmula anterior incluem variantes de PTH humana, tais como [Leu8]hPTH, [Ile8]hPTH e [Val8]hPTH, bem como os seus equivalentes de PTH de bovino e de PTH porcina.

Para além das variantes caracterizadas por uma substituição de metionina num sítio único, i.e., de acordo com qualquer uma das fórmulas [X8]PTH e [Y18]PTH, o presente invento proporciona variantes de PTH nas quais se substituem as metioninas presentes em ambas as posições 8 e 18, com a fórmula:

[X8Y18]PTH na qual X e Y são seleccionados independentemente, Y é um aminoácido, codificado geneticamente, diferente de metionina e cis-teína, e X é um aminoácido seleccionado de entre o grupo consistindo em alanina, valina, leucina, isoleucina, serina e triptofano. Em relação a variantes caracterizadas por uma substituição de metionina num único sítio, as variantes de PTH de acordo com a fórmula anterior são virtualmente resistentes à oxidação. Com selecção de X de entre o grupo de aminoácidos an-teriormente descrito, retém-se também uma actividade substancial de PTH.

Variantes de PTH específicas de acordo com a fórmula anterior, i.e., possuindo substituição de metionina em dois sítios, incluem variantes de PTH humana tais como [Leu8Leu8]hPTH, [Ile8Leu18]hPTH, [Val8Leu18]hPTH, [Ser8Leu18]hPTH, [Ala8Leu18]-

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16777/157/ALLE -11-hPTH, [Trp8Leu18]hPTH, [Leu8Ile18]hPTH, [Leu8Val18]hPTH [Ile8Ile^-8]hPTH e os seus equivalentes de PTH de bovino.

As variantes de PTH do presente invento são proteínas codificáveis geneticamente e, deste modo, podem ser produzidas por síntese química, ou mais desejavelmente, usando técnicas de produção baseadas em ADN recombinante. A técnica de síntese de péptidos em fase sólida tem sido aplicada com sucesso na produção de PTH humana e pode ser usada para a produção das variantes de PTH do presente invento (para orientação, ver Kimura et al., supra e Fairwell et al, Biochem., 1983, 22:2691). 0 sucesso com a produção de PTH humana numa escala relativamente grande foi noticiado por Goud et al e J. Bone Min. Res., 1991, 6(8):781, aqui incorporada como referência. Esta abordagem de produção compreende, geralmente, o uso de sintetizadores automáticos e de uma resina apropriada como fase sólida, à qual se liga o aminoácido do terminal C da variante de PTH desejada. A extensão do péptido na direcção do terminal N é depois conseguida acoplando sucessivamente uma forma adequadamente protegida do aminoácido desejado seguinte, usando, tipicamente protocolos químicos baseados em FMOC ou em Boc, até a síntese estar completa. Os grupos protectores são depois clivados do péptido, usualmente, em simultâneo com a clivagem do péptido da resina, e o péptido é depois isolado e purificado usando técnicas convencionais. Estes procedimentos estão em geral descritos em numerosas publicações e pode-se fazer referência, por exemplo, a Stewart e Young, Solid Phase Peotide Synthesis, 2nd Edition, 1984, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois.

Mais desejavelmente, e de acordo com um aspecto do presente invento, as variantes de PTH são produzidas por cultura de um hospedeiro celular no qual está incorporado expressavelmente ADN codificando a variante de PTH desejada. A incorporação do ADN desejado, na forma expressável, pode ser conseguida usando a abordagem, agora convencional, baseada em ADN recombinante, na qual ADN codificando a variante de PTH é ligado operativamente a ADN possibilitando a expressão do ADN codificando a variante de PTH, para formar uma construção de expressão de ADN recombinante

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que é depois introduzida no hospedeiro celular seleccionado por transformação mediada por ADN, por electroporação ou similar. Um hospedeiro celular possuindo ADN, codificando uma variante de PTH, incorporado "expressavelmente", é caracterizado pela capacidade de produzir o produto de expressão desejado quando cultivado apropriadamente. Um hospedeiro celular possuindo ADN, codificando uma variante de PTH, incorporado "estavelmente" é capaz de reter esse ADN durante a cultura e de transmitir este ADN à sua progenia durante pelo menos várias gerações. Para hospedeiros celulares eucarióticos, esta estabilidade é conferida, tipicamente, por integração genómica do ADN codificando a variante de PTH. Em bactérias que, tipicamente, contêm ADN transformante, na forma de plasmídeos de replicação autónoma, esta estabilidade é, usualmente, assegurada cultivando uma estirpe possuindo resistência a antibiótico conferida pelo plasmídeo na presença do antibiótico.

Para expressão no hospedeiro celular, o ADN codificando uma variante de PTH seleccionada pode ser obtido usando técnicas que estão bem estabelecidas na arte. Por exemplo, uma sequência de ADN codificando uma dada variante de PTH pode ser sintetizada de novo de acordo com métodos convencionais na arte da síntese de genes. Resumidamente, este procedimento compreende o acoplamento sucessivo 3' para 5' de reagentes de nucleótidos, adequadamente protegidos, num sintetizador automático tal como o sintetizador de ADN da Applied Biosystems Inc., modelo 380B e, depois, a recuperação, por purificação em gel, do polinucleótido desprotegido. A abordagem de ligação de blocos pode ser utilizada, na qual "blocos" de pares de oligonucleótidos com até cerca de 80 nucleótidos de comprimento, são preparados e ligados na sucessão correcta por complementaridade desemparelhada, tal como se descreveu, por exemplo, em Wosnick et al, Gene, 1989, 76:153). Numa abordagem alternativa, o ADN desejado pode ser sintetizado in loco e depois amplificado por reacção em cadeia com polimerase (PCR), usando a abordagem descrita por Barnett et al em Nucl. Acids Res., 1990, 18(10):3094.

Será de notar que se podem aplicar também estratégias al-

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-13- ternativas para gerar ADN codificando a variante de PTH desejada. Por exemplo, pode-se obter ADN codificando PTH humana e, depois, pode-se usar como molde, p.e., mutageneizado especificamente em certos sítios, para introduzir a modificação de aminoácido desejada ao nível genético. 0 ADN codificando PTH humana pode ser obtido a partir de tuna biblioteca de ADNc humano apropriada, a partir de uma fonte comercial ou por síntese de novo de acordo com os procedimentos anteriormente indicados e de acordo com a sequência de nucleótidos codificando a PTH descrita, por exemplo, por Hendy et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1981, 78:7365, aqui incorporadas como referência, ou um seu equivalente codificando PTH. 0 molde de ADN codificando PTH pode ser convertido em ADN codificando uma variante de PTH usando a técnica bem estabelecida de mutagénese dirigida de oligonucleótidos, tal como é geralmente descrita, por exemplo, por Kunkel et al, 1985, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82:488. Esta técnica é realizada, convenientemente, com uma eficiência elevada usando o sistema baseado em E. coli para síntese e propagação do gene alterado num vector apropriado, tal como M13mpl8. Estão disponíveis comercialmente conjuntos experimentais para a realização destes procedimentos in vitro. Também adequada para a obtenção de ADN codificando uma variante de PTH, a partir de um molde codificando PTH, é a técnica relacionada na qual a mutagénese dirigida a sítios é conseguida usando uma abordagem baseada em PCR. Uma variante deste método, designada por PCR recombinante, é descrita por Higuchi et al, Nucl. Acids. Res., 1988, 16:7351, e uma abordagem de PCR de "mega-iniciador" modificado é descrita em Biotechniques, 1990, 8(1):404.

Uma vez obtido, o ADN codificando a variante de PTH desejada é incorporado, estavelmente e expressavelmente, num hospedeiro celular seleccionado para servir na produção da variante de PTH. Uma variedade de organismos são adequados como hospedeiros para a produção das variantes de PTH. estes incluem leveduras, tais como Saccharomvces. Pichia e Kluveromvces. hospedeiros de fungos filamentosos incluindo espécies de Asperaillus tais como o nidulans. o niaer (ou o awamori) e orvzae. hospedeiros de -14- 73 495 16777/157/ALLE células de insecto e hospedeiros de células de mamífero incluindo as linhas de células CHO e COS. As variantes de PTH não estão dependentes da glicosilação para terem actividade e, deste modo, podem ser produzidas, adequadamente, em hospedeiros bacterianos incluindo Strentomvces. Bacillus e, preferivelmente, em E. coli. Os sistemas de expressão de ADN recombinante e os protocolos/ /meios de cultura possibilitando a produção nestes hospedeiros de uma proteína desejada já foram estabelecidos e estes sistemas podem ser utilizados do modo convencional para o propósito específico de produção de variantes de PTH. A produção em E. coli de variantes de PTH pode ser conseguida, por exemplo, usando sistemas de expressão baseados no promotor lac (ver Rabbani et al, Biochem., 1990, 29:10080) e em sistemas de expressão/ /secreção baseados no promotor tac (ver Wong et al, EP 357391). A expressão em levedura pode ser conseguida usando sistemas de expressão baseados, por exemplo, em regiões de controlo de expressão do gene de factor de emparelhamento alfa-1 tal como é descrito por Gautvik et al, na W088/03165. A produção em Aspergillus pode ser conseguida usando sistemas de secreção baseados em regiões de controlo da expressão do gene alcA de A. nidulans ou do gene da glucoamilase de A. niaer. tal como é descrito, por exemplo, por Gwynne et al na W086/06097. A variante de PTH produzida por cultura do hospedeiro de produção é extraída e purificada usando técnicas que estão também bem estabelecidas na arte. Em geral, as variantes de PTH humana possuem características que são genericamente similares às exibidas pela PTH humana e, deste modo podem ser extraídas e purificadas substancialmente do mesmo modo. Tal como a PTH, as variantes possuem uma carga positiva global a pH neutro (pi de cerca de 9,3) e, deste modo, podem ser purificadas por cr ornato-grafia de permuta iónica, p.e., usando colunas de permuta de ca-tiões. Tal como a PTH, as variantes de PTH são também de natureza hidrofóbica e, deste modo, podem ser purificadas por cromato-grafia de interacção hidrofóbica, p.e., em colunas possuindo uma matriz de fenil-Sepharose. Claro que se podem usar também penei-ros moleculares para separar variantes de PTH, de outras proteínas não relacionadas, pelo tamanho, e podem-se utilizar colunas

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16777/157/ALLE -15-de afinidade que compreendem agentes de afinidade pela PTH tais como a hidroxiapatite ou anticorpo de PTH. Preferivelmente, a purificação da variante de PTH é conseguida aplicando a mistura de proteína a uma coluna de permuta catiónica, p.e., S-Sepharose, e depois aplicando o retido eluído a uma coluna possuindo uma matriz hidrofóbica, p.e., uma coluna possuindo uma cadeia lateral de fenilo, octilo ou butilo, tal como fenil-Se-pharose, fenil-Superose, octil-Sepharose ou butil 650M. 0 retido, eluído da matriz hidrofóbica, é depois submetido a uma purificação final usando cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) de fase inversa.

Embora a sensibilidade à oxidação da PTH humana requeira, tipicamente, grandes cuidados, durante a purificação, para evitar a inactivação oxidativa, tal como o uso de anti-oxidan-tes, p.e., cisteína ou /3-mercaptoetanol, e o uso de baixas temperaturas para retardar o processo oxidativo, a purificação das variantes de PTH do invento requer menos controlo rigoroso durante a purificação e manuseamento. Por exemplo, não são requeridos anti-oxidantes durante a purificação de variantes de PTH humana nas quais estão substituídas ambas as Met8 e Met18, mas estes podem ser usados se desejado.

Para uso terapêutico, uma variante de PTH é purificada, desejavelmente, até um grau em que migra na forma de um único pico em HPLC de fase inversa e exibe uma banda simples em electrofo-rese em gel de poliacrilamida na presença de SDS. Uma vez purificada, a variante de PTH pode ser formulada para proporcionar composições farmacêuticas adequadas para o tratamento de várias condições clínicas para as quais uma terapia de substituição de PTH é indicada. As composições contendo a variante de PTH podem, por exemplo, ser entregues sistemicamente para tratar desordens ósseas tais como a osteoporose e condições cardiovasculares e com estes objectivos podem ser formuladas, adequadamente, quer como preparações injectáveis ou ingeríveis, ou como preparações para insuflação nasal. Preferem-se composições estéreis injectáveis e estas compreenderão, de um modo geral, uma dose eficaz da variante de PTH em associação com solução salina nor- -16- 73 495 16777/157/ALLE mal e um agente de solubilização adequado, p.e., ácido acético diluído. Alternativamente, a variante de PTH pode ser aplicada topicamente, na forma de um creme, loção, pomada, ou na forma de um aerossol, para o tratamento da psoríase e de desordens de pele relacionadas. Um creme adequado compreenderá uma dose eficaz da variante de PTH, em combinação com veículos de composição comuns, p.e., numa base de triglicérido. A dose de variante de PTH eficaz no tratamento de uma dada condição clínica dependerá obviamente da natureza e da gravidade da condição, e de outros factores tais como os que são normalmente considerados e avaliados em ensaios clínicos e pelo médico assistente. Para o tratamento da osteoporose, a variante de PTH é administrada em quantidades suficientemente grandes para estimular a reconstituição óssea, mas não numa quantidade grande demais que provoque a reabsorção óssea global ou o aumento retardado nos níveis de cálcio no soro. Pode-se fazer referência à Patente dos E.U.A. na. 4 698 328 como orientação quanto à administração da PTH para o tratamento da osteoporose. Usando as doses de PTH eficazes numa dada situação clínica, como orientação, a dose de variante de PTH requerida para induzir um efeito similar pode ser calculada com base na actividade relativa da variante de PTH. Por exemplo, a [Leu18]hPTH(1-84), a [Leu8]hPTH(l--84) e a hPTH(1-84) são substancialmente equipotentes e, deste modo, as doses eficazes destas variantes de PTH são similares às da hPTH. Será de esperar que a maior estabilidade oxidativa das variantes de PTH proporcione uma semi-vida in vivo mais prolongada e, deste modo, podem-se usar doses um pouco mais pequenas ou podem-se administrar doses similares menos frequentemente.

Tal como a PTH, as variantes de PTH podem ser administradas em combinação com outros agentes úteis no tratamento de uma dada condição clínica. Quando se trata a osteoporose e outras desordens relacionadas com os ósseos, por exemplo, as variantes de PTH podem ser administradas conjuntamente com um suplemento de cálcio dietético ou com um análogo de vitamina D (ver Patente dos E.U.A. na. 4 658 328). Alternativamente, a variante de PTH pode ser administrada, preferivelmente, usando um regime tera-

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16777/157/ALLE -17- pêutico cíclico, em combinação com bisfosfonatos, tal como se descreveu, por exemplo, na Patente dos E.U.A. nB. 4 761 406, ou em combinação com um ou mais agentes terapêuticos dos ossos tais como a calcitonina e o estrogénio.

Exemplos

Os exemplos que se seguem descrevem a produção de PTH e de variantes de PTH. A produção destas proteínas foi conseguida usando, apenas por conveniência, um sistema baseado em E. coli. substancialmente como descrito por Wong e Sutherland no Pedido de Patente Europeia ns. 89308753.6 (publicado como EP 357 391 em 7 de Março de 1990), cujos conteúdos são aqui incorporados como referência. Este sistema utiliza a estirpe de E. coli JM101, vulgarmente disponível, como hospedeiro e como vector utiliza um derivado de pUC18, designado por pX. Como se mostra na Figura 1, o pX incorpora o elemento par de pSClOl para melhorar a frequência de transmissão do plasmídeo, o gene laclq do pMMB22, para permitir a super-produção do repressor lac, e a cassete de excreção da PTH. Incorporado na cassete de excreção está o ADN codificando a PTH humana que foi sintetizado usando a técnica de ligação de blocos descrita por Wosnick et al, supra. e de acordo com a sequência de nucleótidos codificando a PTH descrita por Hendy et al, supra. Fundida em 5', e precisamente em 5', com o ADN codificando a PTH está a sequência de sinal do gene ompA de E. coli. que é capaz de dirigir a porção PTH do produto de expressão através da membrana interior do hospedeiro e, finalmente, para o meio de cultura. Para a expressão regulada da região de codificação, o plasmídeo incorpora, operativamente, o promotor tac, o promotor lac e um sítio de ligação ribossómico de consenso. A terminação da transcrição é controlada pelo termina-dor do gene trpA de E. coli e codões de paragem da tradução são proporcionados em todas as três cadeias de leitura, imediatamen-te a 3' do ADN codificando PTH.

Deste modo, o vector de expressão pX, usado para a produção de PTH humana e de variantes de PTH, é substancialmente o mesmo que foi descrito por Wong e Sutherland, supra. com excepção que o sítio de clonação múltipla, a jusante do gene da PTH, contém

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16777/157/ALLE -18-sítios de clivagem para as enzimas de restrição Ciai, BamHI, Xbal, StuI e PstI, na ordem indicada na Figura 1. A sequência de nucleótidos precisa da região codificando PTH da cassete de excreção está ilustrada na Figura 2. 0 plasmídeo pX pode assim ser construído incorporando no pUC18, em qualquer sítio adequado (1) uma cassete de excreção possuindo os componentes funcionais descritos por Wong et al, supra; (2) o gene laclS do pMMB22 e (3) o elemento par excisado do pSClOl.

Exemplo 1 - Produção da PTH (1-84) humana

Transformou-se E. coli JM101 competente com o plasmídeo pX usando os procedimentos convencionais. Os transformantes positivos foram identificados após o crescimento de um dia para o outro a 30°C sobre placas contendo 2YT/ágar e 70 £tg/ml de ampici-lina. Os transformantes produzindo PTH foram então examinados quanto à actividade de PTH, após o crescimento em balões agitados, por análise IRMA do meio condicionado, e, subsequentemente, prepararam-se quantidades congeladas dos transformantes selecci-onados por mistura de um volume igual da cultura do balão agitado com glicerol estéril até se obterem suspensões em glicerol a 50% (v/v). Estas suspensões foram armazenadas, subsequentemente, a -80°C. Quando necessário, estes transformantes foram recuperados da reserva por raspagem e, depois, espalhadas sobre placas de 2YT/ágar contendo ampicilina.

Para produzir PTH humana, recolheram-se transformantes, recentemente espalhados sobre placas, na forma de colónias simples, e, depois, inocularam-se em balões Erlenmeyer de 50 ml, contendo 15 ml de um meio líquido que continha 2YT, glucose e ampicilina na mistura padrão. Após crescimento de um dia para o outro, com agitação a 30°C, as culturas foram diluídas 20 vezes com meio fresco e depois cultivadas durante três horas a 30 eC com agitação. A expressão do ADN codificando PTH foi depois des--reprimida por adição de IPTG 1,0 mM. Após o crescimento durante quatro horas na presença de IPTG, a cultura foi arrefecida até 4"C e centrifugada. Depois, colheu-se o sobrenadante e a PTH humana aí contida foi recuperada e testada para determinar a actividade de PTH. -19- 73 495

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Para obter quantidades suficientes de PTH(l-84) humana e de variantes de PTH para purificação e bioensaio, recolheram-se maiores volumes de meios condicionados. Em particular, recolheram-se transformantes, recentemente espalhados sobre placas, na forma de colónias simples, e depois inocularam-se em balões de 500 ml contendo 200 ml do meio descrito anteriormente. Após o crescimento de um dia para o outro, com agitação a 30°c, as culturas foram inoculadas em bio-reactores de 2 1 contendo 1,5 1 do meio líquido e depois desenvolvidas durante 5 horas a 30°C com agitação. A expressão do ADN codificando PTH ou variante de PTH foi depois induzida pela adição de IPTG 1,0 mM. Após o crescimento durante 3-4 horas na presença de IPTG, a cultura foi arrefecida até 4°C e centrifugada. Depois colheu-se o sobrenadante e a PTH ou variante de PTH aí contida foi purificada do modo que se descreve no Exemplo 7.

Os exemplos que se seguem descrevem a produção de variantes de PTH. Para obter ADN codificando estas variantes, aplicou-se a técnica de mutagénese dirigida a sítios, in vitro. descrita por Kunkel et al, supra. Para realizar este procedimento, obteve-se primeiramente o plasmídeo RX que é um plasmídeo baseado em M13mpl8 ao qual falta o promotor funcional tac. O plasmídeo RX serve assim como molde para conduzir a mutagénese no ADN codificando PTH, de modo a gerar ADN codificando uma variante de PTH desejada. A estratégia de mutagénese particular é descrita nos exemplos seguintes.

Exemplo 2 - Produção de uma variante [Leu18] da PTH

Para se obter ADN codificando uma variante de PTH na qual a Met18 está substituída por leucina, o plasmídeo RX foi primeiro recuperado numa forma de cadeia simples e incubaram-se cerca de 1 jug deste plasmídeo, a 85°C em tampão Hin, com cerca de 100 ng de um oligonucleótido mutagénico capaz de se hibridar especifi-camente à região do gene da PTH contendo o codão da Met18. A sequência específica do oligonucleótido designada por M2 é apresentada a seguir onde o sublinhado indica a mudança de codão em relação ao molde codificando PTH: -20- 73 495

16777/157/ALLE M2 oligo: 5' CTCTCTCCAGCGAGTTC 3' molde: 3'.......gagagaggtagctcaag....... 5'

Após arrefecimento lento, o fragmento temperado foi tratado com ADN-polimerase I (Klenow) na presença de todos os quatro dNTP, durante cerca de 2 horas a 37"C e, depois, durante 4 horas à temperatura ambiente, para formar o plasmídeo de cadeia dupla a todo o comprimento, designado por pRXM2. 0 hospedeiro competente JM101 foi depois transformado com pRXM2 e as plaquetas foram pesquisadas por análise de digestão com enzimas de restrição e por sequenciação de ADN para seleccionar aquelas que contêm a mutação desejada. O pRXM2 é depois digerido com NruI e Xbal e o fragmento pequeno resultante é isolado usando agarose de baixo ponto de fusão. O plasmídeo pX é digerido de um modo similar e isola-se o fragmento Nrul/Xbal grande. Os fragmentos isolados relevantes são depois ligados para formar o plasmídeo pXM2, que contêm o ADN codificando a [Leu18]hPTH. Isto foi confirmado por análise de digestão com enzimas de restrição e por sequenciação de ADN.

Transformou-se E. coli JM101 competente com pXM2 e os transformantes foram depois seleccionados de acordo com os procedimentos indicados no Exemplo 1. 0 sobrenadante contendo a [Leu18]PTH para purificação subsequente foi depois obtido por cultura do transformante de pXM2, como se descreve no Exemplo 1.

Exemplo 3 - Produção de uma variante [Leu8] da PTH

De um modo similar ao que se descreve no Exemplo 2, obteve--se ADN codificando uma variante de PTH humana na qual Met8 está substituída por leucina. Em particular, incubou-se pRX de cadeia simples com um oligonucleótido possuindo a sequência que a seguir se apresenta, onde o sublinhado indica a mudança de codão em relação ao molde codificando PTH:

Ml Oligo: 5' CCÃGGTTATGCAGAAGCTGTATTTCAC 3' molde: 3' .....GGTCCAATACGTATTCGACATAAAGTG.....5'

Um plasmídeo de cadeia dupla contendo o codão Leu8, desig- -21- 73 495 16777/157/ALLE nado por pRXMl, é depois cortado com Nrul/Xbal e o fragmento pequeno isolado é ligado com o fragmento grande o pX digerido com Nrul/Xbal. Depois, transformou-se E. coli com o plasmídeo pXMl resultante e cultivou-se o transformante do modo que se indica no Exemplo 1 para se obter sobrenadante contendo [Leu8]hPTH.

Exemplo 4 - Produção de uma variante [Leu8Leu18] da PTH

De um modo similar ao que se descreveu no Exemplo 3, obte-ve-se ADN codificando uma variante de PTH humana na qual ambas as Met8 e Met18 estão substituídas por leucina. Isto foi conseguido por incubação do pEXM2, que já contém o codão de Leu18, com o oligo Ml (Exemplo 3) que introduz o codão da Leu8, para se obter o plasmídeo pRXCl. Após a sequenciação que conformou a incorporação dos codões de Leu8 e de Leu18, clonou-se o fragmento Nrul/Xbal, como se descreve no Exemplo 2, e usou-se o plasmídeo resultante para transformar E. coli JM101. Seleccionaram-se os transformantes, cultivaram-se os transformantes seleccionados em balões agitados e os sobrenadantes dos balões agitados, contendo [Leu8Leu18]hPTH foram recolhidos e armazenados congelados para análise subsequente, tudo de acordo com os métodos descritos no Exemplo 1.

Exemplo 5 - Produção de uma variante [Ala8] da PTH

De um modo similar ao que se descreveu no Exemplo 3, obteve-se ADN codificando uma variante de PTH humana na qual o codão da Met8 está substituído por um codão da alanina. Em particular, o codão da Met8 no pRX foi substituído, especificamente no sítio, usando um oligonucleótido possuindo a sequência que a seguir se apresenta, onde o sublinhado identifica a modificação do codão introduzido:

Me oligo: 5' CCCAGGTTATGAGCAAGCTGTATTTCAC 3' molde: 3' ......GGGTCCAATACGTATTCGACATAAAGTG......5' O fragmento Nrul/Xbal pequeno do plasmídeo gerado pRXM3 é ligado ao fragmento Nrul/Xbal grande do pX para se obter o pXM3. Transformou-se E. coli JM101 com pXM3 e os transformantes foram cultivados para se obterem sobrenadantes contendo [Ala8]hPTH, do modo que se descreve no Exemplo 1.

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Exemplo 6 - Produção de variantes de PTH adicionais

De um modo substancialmente idêntico ao que anteriormente se descreveu no Exemplo 4, obtiveram-se sobrenadantes contendo variantes de PTH adicionais, por cultura de transformantes de E. coli contendo ADN codificando a variante de PTH, tal como a seguir se indica. Em cada caso, usou-se como molde ADN codificando [Leu18]hPTH (Exemplo 2) e alterou-se no codão da Met8 usando o oligonucleótido indicado (o sublinhado é usado para indicar o codão de substituição): i) [Ile8Leu18]hPTH; usando um oligonucleótido possuindo a sequência 5 7-CAGGTTATGGATAAGCTGTATTTC-37; ii) [Asp8Leu18]hPTH; usando um oligonucleótido possuindo a sequência 5 7-CAGGTTATGGTCAAGCTGTATTTC-37; iii) [Asn8Leu18]hPTH; usando um oligonucleótido possuindo a sequência 5 7-CAGGTTATGGTTAAGCTGTATTTC-37; iv) [Tyr8Leu18]hPTH; usando um oligonucleótido possuindo a sequência 5 7-CAGGTTATGGTAAAGCTGTATTTC-3 7 7 e v) [Arg8Leu18]hPTH; usando um oligonucleótido possuindo a sequência 57-CAGGTTATGACGAAGCTGTATTTC-37}

0 ADN codificando as variantes de PTH adicionais seguintes foi também obtido por mutagénese do molde codificando [Leu·*·8]PTH (Exemplo 2):

Vi) [Val8Leu18]hPTH; onde Vai é codificada por GTT vii) [Ser8Leu18]hPTH? onde Ser * e codificada por TCG viii) [Ala8Leu18]hPTH; onde Ala é codificada por GCG xi) [Trp8Leu18]hPTH ? onde Trp é codificada por TGG X) [Gln8Leu18]hPTH; onde Gin é codificada por CAG xi) [Glu8Leu18]hPTH; onde Glu é codificada por GAA xii) [Gly8Leu18]hPTH; onde Gly * e codificada por GGG xiii) [Lys8 Leu18]hPTH; onde Lys é codificada por AAG

Os transformantes de E. coli foram obtidos e cultivados, e os sobrenadantes contendo a variante foram recolhidos individualmente como se descreveu no Exemplo 1, para análise como agora se descreve no Exemplo 7.

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Exemplo 7 - Purificação e Avaliação da PTH e das variantes de PTH O meio condicionado recolhido a partir dos transformantes dos Exemplos 1-6 foi, em cada caso, ajustado até pH de cerca de 4 com ácido acético glacial. Em alguns casos, mas não em todos, adicionou-se depois mercaptoetanol até uma concentração final de 10 mM e a solução foi centrifugada. Verificou-se que o mercaptoetanol era desnecessário no processo de purificação da variante da PTH. O sobrenadante foi recolhido e, depois, fez-se passar através de uma coluna contendo a resina de permuta catiónica S--Sepharose Fastflow (Pharmacia, volume de leito, 50 ml) pré--equilibrada com acetato de amónio 0,04M//3-mercaptoetanol 10 mM (pH 4,0). A PTH, ou uma variante de PTH, ligada à resina, foi eluída aplicando um grandiente de concentração de acetato de amónio de 0,04M-1,OM//?-mercaptoetanol 10 mM (pH 4,0) como eluen-te. A PTH ou a variante de PTH, foi eluída da resina para uma concentração de cerca de 0,6M de acetato de amónio. As fracções de eluente contendo PTH ou a variante de PTH (tal como é medido pelo conjunto experimental IRMA de dois sítios, Allegro, adquirido à Joldan Diagnostics, Califórnia catálogo #40-2170, ou pela absorvância a 280 nm), foram combinadas para se obter a PTH ou a variante de PTH com uma pureza de cerca de 60-70%.

Obtiveram-se amostras de maior pureza submetendo as fracções combinadas a uma separação cromatográfica usando a resina fenil-Sepharose Fastflow (Pharmacia)). Mais particularmente, o pH das fracções de S-Sepharose combinadas foi ajustado a pH8 com NaOH 5N. Depois, esta solução foi aplicada a uma coluna contendo fenil-Sepharose (6 ml de volume de leito), pré-equili-brada com o tampão (6 volumes de acetato de amónio (pH 4,0) e 4 volumes de acetato de amónio 40 mM (pH 4,0) e, depois, ajustado a pH 8,0 com NaOH 5N). A PTH ou a variante da PTH, adsorvida na coluna, foi depois eluída usando, como eluente, um gradiente de concentração de tampão até uma concentração de acetato de amónio 0,6N (pH 8,0).

As fracções contendo actividade de PTH (tal como é medido pelo IRMA de dois sítios Allegro ou determinado pela A2go) foram

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16777/157/ALLE combinadas e, depois, dessalinizadas por passagem através de um cartucho contendo resina C-18 de fase inversa, p.e., Sep-Pak (Waters Inc.) ou resina Amberchrom CG71 (Toso Haas) pré-equili-brada com TFA a 0,1%. A PTH, ou a variante de PTH ligada à resina foi eluida com TFA a 0,1%/acetonitrilo a 80%. As preparações dessalinizadas foram depois congeladas em azoto líquido, liofi-lizadas e armazenadas a -20°C.

As amostras descongeladas ou frescas de PTH(l-84) humana e das variantes de PTH obtidas como anteriormente se descreveu foram depois avaliadas para determinar a actividade biológica num ensaio de adenilato-ciclase baseado em UMR-106 e de acordo com o protocolo descrito por Rabbini et al, 1988, Endocrinology, 123:2709, que é aqui incorporada como referência. Tal como se indicou, as células de osteo-sarcoma de ratazana da linha UMR foram estimuladas por PTH para produzir adenilato-ciclase, uma enzima que catalisa a conversão intracelular do ATP no seu análogo de monofosfato cíclico, AMPc. Deste modo, neste ensaio, a actividade de PTH é determinada ensaiando radiometricamene a formação de AMPc em células UMR estimuladas com PTH. Para comparação testou-se também uma amostra de PTH humana sintética, adquirida na Bachem Inc. (Torrence, Califórnia - catalogue #PCAL 175). Os resultados dos ensaios, expressos em termos da CE5q (concentração da PTH ou da variante eficaz para uma estimulação de metade do máximo de actividade de adenilato-ciclase) são apresentados na Tabela 1. (Segue Tabela I) -25- 73 495

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Tabela I - Actividades relativas das variantes de PTH

Variante de PTH EC50 (nM) PTH humana 1,0 [Leu18] 1,5 [Leu8] 5,5 [Leu8Leu18] 5,7 [Leu8Leu18Tyr34] 22 [IlesLeu18] 32 [Val8Leu18] 90 [Ala8Leu18] 850 [Ala8] 1200 [Ser8Leu18] 1400 [Trp8Leu18] 1900 [Asn8Leu18] >5000 [Gln8Leu18] >5000 [Asp8Leu18] >5000 [GlusLeu18] >5000 [Lys8Leu18] >5000 [Arg8Leu18] >5000 [Tyr8Leu18] >5000 [Gly8Leu18] >5000

Fazendo referência à Tabela l, será de notar que uma actividade substancial de PTH é apenas exibida por certas variantes de PTH com a metionina substituída. Uma actividade substancialmente comparável à da própria PTH é retida por variantes de PTH nas quais a metionina na posição 18 está substituída por virtualmente qualquer aminoácido codificado geneticamente. A substituição de metionina por cisteína, ainda que este seja um aminoácido oxidável e não adequado para se conseguir uma sensibilidade reduzida à oxidação, resultou numa variante de PTH possuindo um valor de CE50 de cerca de 5,0 nM. As variantes nas quais a metionina na posição 8 foi substituída quer sozinha, quer no contexto da Leu18, deram resultados de

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16777/157/ALLE -26- CE50 variáveis dependendo da identidade do aminoácido substituto. Tal como está indicado, observou-se uma actividade de PTH pequena quando se substituiu a Met8 por um aminoácido possuindo (i) uma cadeia lateral de amida, tal como a asparagina e a glutamina; (ii) uma cadeia lateral ácida, tal como o ácido aspártico e o ácido glutâmico; (iii) uma cadeia lateral básica, tal como a lisina e a arginina; (iv) uma cadeia lateral aromática pouco volumosa tal como a tirosina; ou (v) um aminoácido não possuindo qualquer cadeia lateral i.e., glicina.

Contudo, observou-se uma actividade de PTH substancial, tal como é indicado por um valor de CE^q de menos do que 2 000 nM, quando se substituiu o resíduo Met8 por um aminoácido possuindo uma cadeia lateral hidrofóbica tal como a isoleucina, valina, alanina e leucina, e também quando se substituiu a Met8 por se-rina e triptofano.

Exemplo 8 - Análise da sensibilidade à oxidação

Determinou-se também a sensibilidade à oxidação de PTH(1--84) humana recombinante e sintética e das variantes de PTH, medindo a actividade de PTH após a sua exposição a um oxidante. A oxidação foi efectuada por exposição de amostras dos vários compostos de PTH, obtidos como anteriormente se descreveu, ao oxidante peróxido de hidrogénio, de acordo com o protocolo descrito por 0'Riordan et al, 1974, J. Endocrinol., 63:117 que é aqui incorporado como referência. De um modo geral, este procedimento de oxidação compreende a mistura da amostra de PTH com peróxido de hidrogénio durante um período de tempo seleccionado e, depois, a paragem da reacção oxidativa por congelação rápida em azoto líquido e liofilização. Para o bioensaio subsequente a amostra é dissolvida em meio de ensaio e estabelecem-se as diluições apropriadas para uso no bioensaio. A bioactividade das amostras expostas a oxidante foi então determinada no ensaio de adenilato-ciclase baseado em UMR. Os resultados estão apresentados graficamente nas Figuras 3 e 4, que mostram as actividades relativas da PTH humana e das variantes de PTH humana na ausência de oxidante (mas usando um tratamento de oxidação simulado, i.e., incubação na ausência de peróxido de hidrogénio durante 8

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minutos à temperatura ambiente em ácido acético 0,1M) (Figura 3) e após oxidação, i.e., incubação na presença de 1,5% (v/v) de peróxido de hidrogénio durante 8 minutos à temperatura ambiente em ácido acético 0,1M (Figura 4).

Fazendo referência às Figuras 3 e 4, será de notar que a substituição da metionina por um aminoácido codificado geneticamente tem o efeito de reduzir a sensibilidade à oxidação exibida pela PTH, independentemente de a substituição ser efectuada na posição 8 sozinha, na posição 18 sozinha ou em ambas as posições. Será de notar também que a substituição da metionina na posição 8 sozinha resulta numa redução significativamente maior da sensibilidade à oxidação do que a substituição na posição 18 sozinha. A variante [Leu8]hPTH(1-84) é cerca de 6 vezes mais bioactiva do que a hPTH(l-84) sob estas condições, enquanto que a variante [Leu-*-8]hPTH(l-84) é cerca de duas vezes mais activa do que a hPTH(l-84). A maior redução na sensibilidade à oxidação é observada quando se substituem ambas as metioni-nas em ambas as posições 8 e 18 na PTH(l-84). Nestas condições as variantes [Leu8Leu-*-8]hPTH e [Leu8Leu^8Tyr8^]hPTH exibem uma bioactividade que é de cerca de 400 vezes maior do que a da hPTH(1-84).

No conjunto, estes resultados mostram que a sensibilidade à oxidação exibida pela PTH é marcadamente reduzida quando se substitui uma ou ambas as suas metioninas presentes por um aminoácido, codificado geneticamente, diferente de metionina. É contemplado que esta estabilidade à oxidação melhorada é também exibida por análogos das variantes de PTH com a metionina substituída, nas quais se introduziram uma ou mais substituições, adições ou delecções de aminoácidos. Os análogos das variantes de PTH do invento representam deste modo concretizações adicionais do presente invento.

Análogos das variantes de PTH aqui especificamente contempladas incluem aqueles possuindo aminoácidos substituídos em posições diferentes das posições 8 e 18. Análogos desta classe incluem aqueles nos quais a fenilalanina na posição 34 está subs- -28- 73 495 16777/157/ALLE tituída por um resíduo tirosina ou por outro resíduo de aminoácido que seja receptivo à conjugação com um radiomarcador. Alguns destes análogos específicos incluem [Leu18Tyr34]hPTH, [Leu8Tyr34]hPTH, [Ile8Leu18Tyr34]hPTH e [Leu8Leu18Tyr34]hPTH. Para produzir estes análogos, o ADN codificando tuna variante de PTH é mutageneizado especificamente no sítio para efectuar a substituição do aminoácido desejado ao nível genético, e depois expresso num hospedeiro microbiano do modo que aqui depois se exemplifica no Exemplo 9.

No âmbito do presente invento incluem-se também análogos, truncados no terminal C, dás variantes de PTH com metionina substituída que aqui se descrevem. Análogos desta classe incluem fragmentos do terminal N das variantes de PTH que consistem pelo menos nos primeiros 27 aminoácidos do terminal N. Alguns destes análogos específicos incluem aqueles que compreendem os primeiros 34 resíduos do terminal N, tais como [Leu18]hPTH(1-34), [Leu8]hPTH(1-34), [Leu8Leu18]hPTH(l-34), e os seus análogos de Tyr34. Será razoável esperar que, para além duma sensibilidade reduzida à oxidação, estes fragmentos exibam uma actividade biológica comparável à das suas réplicas a todo o comprimento, tal como é medida no ensaio do osteo-sarcoma. Deste modo, estes fragmentos podem ser usados de um modo similar a PTH(l-84) humana. Os fragmentos do terminal N podem também ser produzidos pela técnica do ADN recombinante, usando ADN codificando a variante de PTH que foi mutageneizado especificamente no sítio para introduzir um codão de paragem da tradução imediatamente a jusante do codão do resíduo 34.

Exemplo 9 - Produção de um análogo de Tyr34 da [Leu8Leu18]hPTH (1-84)

Usando o pRXCl, que contém ADN codificando [Leu8Leu18]hPTH (1-84) como molde (ver Exemplo 4), realizou-se a técnica de mu-tagénese dirigida por oligonucleótido, como se descreveu no Exemplo 2, para substituir o codão Phe34 por um codão da tirosina. A modificação foi efectuada usando um oligonucleótido possuindo a sequência: 5'-CTCCAAGGGCAACGTAATTGTGCACATCC-3'

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16777/157/ALLE -29- O plasmídeo resultante pRXC2 é depois cortado com NruI e BamHI e o fragmento pequeno é ligado ao fragmento grande do pX cortado de um modo similar, gerando-se deste modo o pXC2. Os transformantes contendo o pXC2 foram depois cultivados e a [Leu8Leu18Tyr34]hPTH(l-84) contida no meio condicionado foi purificada e testada como se descreveu no Exemplo 7. Os resultados estão incluídos na Tabela 1 e nas Figuras 3 e 4, e mostram que a variante exibe uma sensibilidade reduzida à oxidação e retém uma actividade substancial de PTH. Por introdução do resíduo tirosi-na é obtido um substrato susceptível de ser radiomarcado, com ll25 por exemplo, do modo que se descreve na Patente dos E.U.A. na. 4 409 141 e que é útil para estudos de imageologia e para ensaios de ligação in vitro.

Claims

-30- 73 495 16777/157/ALLE REIVINDICACÕES 1 - Processo de produção de uma variante de paratormona, ou de um seu fragmento ou análogo, que possuem actividade substancial de paratormona (PTH) e uma sensibilidade reduzida à oxidação, caracterizado por compreender o passo de cultivar um hospedeiro celular no qual foi incorporada expressavelmente uma molécula de ADN que codifica uma variante de paratormona ou um seu fragmento ou análogo possuindo actividade substancial de PTH e uma sensibilidade reduzida à oxidação, sendo a referida variante representada pela fórmula: [X1Y18]PTH na qual, pelo menos, um de X e Y é um aminoácido codificado geneticamente diferente de metionina e cisteína.
2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por Y ser metionina.
3 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por X ser seleccionado de entre o grupo consistindo em alanina, valina, leucina, isoleucina, serina e triptofano.
4 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por X ser seleccionado de entre valina, leucina, isoleucina.
5 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por a variante de paratormona ser [Leu1]PTH.
6 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por X ser metionina.
7 - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por Y ser seleccionado de entre o grupo consistindo em alanina, valina, leucina, isoleucina, serina e triptofano. 1 - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por Y ser seleccionado de entre valina, leucina, isoleucina. -31- 73 495 16777/157/ALLE
9 - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por a variante de paratormona ser [Leu18]PTH.
10 - Processo de acordo com a reivindicação l, caracterizado por X e Y serem ambos aminoácidos codificados geneticamente diferentes de metionina e cisteína.
11 - Processo de acordo com a reivindicação 10/ caracterizado por X ser seleccionado de entre o grupo consistindo em alanina, valina, leucina, isoleucina, serina e triptofano.
12 - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por X e Y serem iguais.
13 - Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por a variante de paratormona ser [Leu8Leu18]PTH.
14 - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por X e Y serem diferentes.
15 - Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por Y ser leucina.
16 - Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por a variante de paratormona ser [Ile8Leu18]PTH, [Val8Leu18]PTH, [Ser8Leu18]PTH, [Ala8Leu18]PTH e [Trp8Leu18]PTH.
17 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida molécula de ADN codificar um análogo em que Phe34 foi substituído pela tirosina.
18 - Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por a referida molécula de ADN codificar um análogo que é [Leu8Leu18Tyr3 4]PTH.
19 - Processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado por a variante de paratormona ser uma variante de paratormona humana. -32- 73 495 16777/157/ALLE
20 - Processo de acordo com a reivindicação 19, caracteri-zado por o referido hospedeiro ser E. coli.
21 - Processo de produção de um hospedeiro celular que expressa uma molécula de ADN que codifica uma variante de parator-mona ou um seu fragmento ou análogo possuindo actividade substancial de PTH e uma sensibilidade reduzida à oxidação caracterizado por se incorporar expressavelmente, num hospedeiro celular adequado, uma molécula de ADN que codifica uma variante de paratormona de acordo com as reivindicações 1 a 19.
22 - Processo de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por se incorporar expressavelmente, num hospedeiro celular adequado, uma molécula de ADN que codifica uma variante de paratormona de acordo com a reivindicação 19.
23 - Processo de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por o referido hospedeiro ser E. coli.
24 - Processo de preparação de uma composição farmacêutica caracterizado por se associar uma variante de paratormona como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 19 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
25 - Processo de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por a variante de paratormona ser [Leu8]hPTH.
26 - Processo de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por a variante de paratormona ser [Leu18]hPTH.
27 - Processo de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por a variante de paratormona ser [Leu8Leu18]hPTH. Lisboa ,20. DEZ. 1991 Por ALLELIX BIOPHAEMACEUTICALS INC. e CLAXO CANADA INC. =0 AGENTE 0FICIAL=