PT99520A - Processo para a preparacao de uma substancia activa antiviral por expressao do gene rep do virus adeno-associado tipo 2 ou de sequencias parciais deste gene - Google Patents

Processo para a preparacao de uma substancia activa antiviral por expressao do gene rep do virus adeno-associado tipo 2 ou de sequencias parciais deste gene Download PDF

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Description

°| Cj C2.C)
Descrição referente â patente de invenção de BEHRINGWERKE AKTIENGESELLSCHAFT, alemã, industrial e comercial, com sede em D-3550 Marburg, Repúbli ca Federal Alemã,(inventores; Karola Rittner e Dr. Georg Sezakiel, residentes na República Federal Alemã}, para "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE PSPTIDEOS COM ACT1V1DADE ANTIVIRAL POR EXPRESSÃO DO GENE REP DO VIROS ADENO-ASSO-CIADO TIPO 2 OU DE SEQUÊNCIAS PARCIAIS DESTE GENE"
DESCRIÇÃO A presente invenção refere-se â utilização do gene rep codificado pelo vírus tipo 2 adeno-associado (AAV-2) para a preparação de uma substância activa antiviral específica.
Para alem disso a presente invenção refere-se a plasmídeos dotados de actividade antiviral e a ura conjunto de diagnóstico ("kit*). A sindrome da imunodeficiência adquirida humana (SIDA) tornou-se nos últimos anos um problema importante para a humanidade. Se bem que existam alguns pedidos de patentes que se referem ã luta contra o vírus da imunodeficiência humana (HIV), que se encontra associado com a SIDA (associação causal), 1
a luta contra este vírus atê agora apenas tem desvendado algumas pistas. Algumas substâncias possuem a capacidade reduzir in vivo a propagação do vírus e prolongam em consequência a duração da vida dos pacientes atacados. No entanto, não se descobriu atê hoje ma medicamento ou um tratamento que destrua completamente o vírus e que deste modo possa curar um doente de SIDA. Todos os fãrmacos utilizados ati hoje contra o HIV apresentam o grave inconveniente de terem efeitos secundários muito graves*
Os inventores da presente invenção estavam cons cientes deste importante inconveniente do tratamento do HIV e por conseguinte viraram-se para factores antivirais alternativos que não apresentassem os graves efeitos secundários dos fãr macos conhecidos. A inibição da replicação e a potência para uma transformação do adenovirus (5) e do vírus do Herpes simples: (6) por meio do vírus adeno-associaáo (MV) bera como a inibição da transformação celular# que foi investigada através do vírus do papiloroa bovino (Virology, 172, pãg. 253-261 (1909)) e a inibição da amplificação gênica induzida pelo HSV {Journal of Virolo gy, 64, pãg. 3012-3018 (1990)) foram igualmeate observadas. 0 AAV ê um parvovírus dependente de vírus auxi liares com um genoma de ADN de cadeia simples com um comprimento de cerca de 5 kb (Advances in Virus Research, 32, pãg. 243--307 (1987)). O vírus tem uma ampla gama de hospedeiros e de pende de funções auxiliares de outros vírus. No entanto esce ví rus não parece ser dependente de factores de tecidos ou de factores celulares específicos da espécie. 0 genoma contém dois gua dros de leitura livre não sobrepostos, de que o situado na extremidade 3* codifica para três proteínas do invólucro virai e o segundo, designado por "rep”, codifica para quatro proteínas, designadas por proteínas rep, com pesos moleculares de 78 kD, \ 68 kD, 52 kD e 40 kD (Journal of Virology 60, pãg. 823-832 1 (1986))· Para a proteína rep de 68 kD detectaram-se uma capaci- - 2 -
dade de ligação a ADN bem como uma actividade de endonuclease dependente de ATP e uma actividade de helicase de ADN (Cell, 61, pág. 447-457 (1990)), ê sabido que os produtos do quadro de leitura livre (rep) são regulados pelos próprios promotores p5 e pl9 em trans (J. Virai. 63, pág. 4450-4454 (1989))? Mol. Cel. Biol. 6, pág. 2884-2894 (1989)).
Os inventores da presente invenção investigaram uma possível interferência negativa que pudesse ocorrer na replicação do H1V tipo 1 na presença de ADN de AAV-2 intacto. O objectivo da presente invenção consiste na preparação de factores que apresentam uma actividade antiviral. Um outro objectivo da presente invenção consiste na preparação em especial de um factor que apresente uma actividade de inibição do HIV-1. O objectivo da presente invenção ê alcançado por meio do conteúdo da reivindicação 1. Os inventores da presente invenção verificaram que o chamado gene rep, que ê codifi cado através do vírus adeno-associado tipo 2 (AAV-2), apresenta uma actividade antiviral. Em consequência ê possível usar o gene rep ou uma sequência parcial deste gene para a preparação de um factor antiviral específico. 0 gene rep ou sequências parciais deste gene podem ser especialmente utilizados para o combate contra o vírus HIV tipo 1. O efeito do quadro de leitura livre rep do AAV, que está integrado integralmente no genoma do AAV, foi investigado sobre a replicação do HIV-1 num sistema de ensaio transien te (Biochem. Biophys. Res. Comm. 169, pãg. 643-6S1 (1990))· Este sistema baseia-se sobre a co-microinjecção do ADN do AAV de tipo selvagem ou de um mutante (J. Virol. 64, pág, 3012-3018 (1990)), em conjunto com um ADN proviral de HIV-1 infeccioso (clone pNL4-3) (J.Virol. 59, pãg. 284-291 (1986)) no núcleo de células epiteloides SW 480 humanas, estas células possibilitam - 3 -
a replicagão do HIV após transfecgao e no entanto não podem ser infectadas com o vírus HIV-1 (J. Virol. 59, pãg. 284-291 (1986))· 0 vírus HIV-1 foi de início preparado em células co-microinjec-tadas e foi multiplicado por co-cultura com células MT-4 linfói des T humanas. 0 HIV-1 foi em seguida determinado num sobrena-dante de uma co-cultura de células com o auxílio de uma analise de ELISA por antigênios de HIV-1 comercial (Biochem. Biophys. Res. Comm. 169, pãg* 643-651 (1990)). A partir destes resultados, gue se encontram resumidos na Fig. 1, ê possível concluir gue a forte inibição do HIV-1 a uma proporção molar de ADR de HIV-1 e de ADN de AAV de 1:10 nas células co-raicroinjectadas originarias se encontra correlacionado com a presença de um qua dro de leitura livre rep de AAV intacto. Os plasmídeos apresentados na Fig. 1 (pTAV) foram anteríormente descritos (Heilbronn et al. 1990? J. Virology 64s 3012-3018 e sequência do AAV de ti po selvagem em Laughlin et al. (1983), Gene 23s 65-73). Uma in-activagão do quadro de leitura livre rep, na qual simultaneamen te o quadro de leitura livre cap se conserve intacto, possibili ta uma replicaçlo do HIV-1 completamente normal. Não se observa inibição quando o quadro de leitura livre rep se encontra inac-tivado. Para além disso, observa-se que os mutantes rep*, rep” (pTAV2-3) que não possuem capacidade de produzirem partículas de AAV - mesmo no caso de uma hipotética função auxiliar do vírus HIV-1 para a replicagão do AAV em células SW480 poder ser admitida - apresentam a mesma actividade anti-HIV-1 como o AAV do tipo selvagem (rep+, cap+). Esta observação torna nítido que a inibição da replicagão do HIV-1 tem lugar realmente na micro-injecgão das células SW480 e que este efeito não é de modo nenhum causado por um artefacto que ocorra num estádio raais adian tado da co-cultura. Os produtos da tradução do quadro de leitura livre rep do AAV são responsáveis pela inibição de replicagão do HIV-1. Por conseguinte constitui um elemento adicional prefe rido da presente invenção o facto de os polipeptídeos que resul tam após tradução do quadro de leitura livre do gene rep do AAV poderem ser usados para a preparação de um factor antiviral es-• pecífico. Estas proteínas podem também ser componentes de con-, juntos de diagnóstico que contenham pelo menos uma das quatro - 4 -
proteínas que se obtêm após a tradução do quadro de leitura livre do gene rep do MV» A inibição da replicação do HIV-1 mediada pelo gene rep não é o resultado de uma possível tonicidade celular das proteínas rep e também não se baseia por conseguinte na incapacidade das células atacadas para a replicação do HIV-1 por destruição do sistema de síntese próprio da célula· A co-micro-injecção de um gene da β -gelactosidade com ADN rep+ (pTAV2) ou rep*“ (pTAV2-3) de um vírus do sarcoma de Rous LTR não conduz a qualquer diferença na percentagem da célula microinjectada com expressão do gene da β -galactosidase quando esta expressão é de terminada 24 horas após a injecção. Este facto mostra nitidamen te que as células SW48G permitem perfeitamente a expressão de um gene na presença do gene rep e que por consequência as células microinjectadas conservam a sua potência para a expressão dos genes do HIV-1 e para a multiplicação virai· A inibição da replicação do vírus HIV-1 dependente do AAV depende de um gene rep intacto· Continua porém em aberto a questão de quais os elementos do vírus HIV-1 que são responsáveis pela interferência negativa· A fim de analisar que sequências do quadro de leitura livre 5* do HIV-1 são responsáveis pela inibição da replicação do HIV-1 observou-se a expressão da acetiltransferase do cloranfenicol (CAT) provocada pelo quadro de leitura livre do HIV-1 (fraeção U3/R) na qualidade de gene indicador· Mediu-se o nível da expressão da CAT na presença de um gene rep do AAV intacto. Os resultados mostram que o pTAV2-6 (rep+) inibe a expressão da CAT (Fig. 2a) de modo depen dente da dose (Fig. 2b), enquanto que o pTAV2-3 (rep~) não inibe. Este facto significa que a fraeção U3/R do quadro de leitura livre 5* do HIV-1 ê suficiente para uma inibição dependente de rep da expressão do gene. No entanto não se encontra exclui-do que o gene rep possa influenciar ainda outros passos da replicação do HIV-1.
As posições nucleotldicas são para o HIV-2 de - 5 -
acordo com Machi et al* (1986) J. Virol., 59, 284-291 e para o AAV-2 de acordo com Berns e Bofcenzky (1987) Adv. Virus Res., 32, 243-307 (Pig. 3)* A Fig. 4 mostra a localização da sequência AAH no gene rep
As propriedades bioquímicas e a função biológica das proteínas rep deixam presumir que se trata de uma inter acção entre as proteínas rep e os ácidos nucleicos específicos do HIV-1. Possivelmente o ADN ou possivelmente o ARN, ambos localizados na sequência U3/R do HIV-1, desempenham uma função no mecanismo da inibição do HIV-1» Uma comparação de sequências de ADN entre o ADN do HAV-2 e da sequência LTR do HIV-1 (posições de 1 a 634, «T» Virol. 59, pãg. 284-291 (1986)) mostra um domínio de 25 pb com 72% de identidade da sequência nas posições 16 a 40 do ADN do AAV-2 e nas posições 483 a 507 do ADN do HIV-1, que se encontra parcialmente na sequência tar.
Para alem disso, encontra-se um domínio com um alto grau de homologia entre a zstrutura secundaria local calcu lada da região tar do HIV-1 e a sequência terminal do AAV. Este facto mostra que um reconhecimento da estrutura secundáriaéres ponsável por uma possível interacção directa ou indirecta entre as proteínas rep e a sequência de ARN do HIV-1. O gene rep do AAV inibe a replicaçio do HlVpor meio da interacção com a sequência do quadro de leitura livre do HIV-1. Conforme se demonstrou anteriormente, é possível encontrar uma sequência de 25 pb por comparação das sequências do AAV-2 e da região do quadro de leitura livre do HIV-1, apresentando esta região um alto grau de conservação» Esta região foi designada por "AHH" e apresenta também ao nível da estrutura bi dimensional uma alta homologia entre o AAV-2 e o HIV-1. Por experiências de competição com fragmentos do quadro de leitura li vre do HIV-1 verificou-se que a inibição (neste caso a inibição dependente de rep da expressão de CAT desencadeada pelo quadro de leitura livre do HIV-1) é função da presença da região AAH. - 6 —

Claims (1)

  1. Foi possível observar ama redação ainda mais drástica da expres sao da CAT causada pela inibição mediada pelo gene rep do quadro de leitura livre do HIV-1 para um comprimento de 25 pares de bases de um fragmento de ADN de cadeia dupla com a sequência AHH. Este facto demonstra nitidamente a responsabilidade da região AHH no mecanismo da inibição· Este resultado mostra de modo nítido o potencial antiviral do gene rep codificado pelo AAV. A circunstância de o gene rep não ser tóxico para as células SW480 e de se observar pela presença do gene rep um efeito de inibição extraordinariamente elevado mostra de modo muito claro as propriedades notáveis do objecto da presente invenção e as perspectivas que abre para a sua utilização como agente antiviral. REIVINDICAÇÕES 13 - Processo para a preparação de peptldeos com ac tividade antiviral caracterizado por se expressar o quadro de leitura livre do gene rep do AAV ou uma sua fracção· 23 Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o vírus que se pretende combater ser o HIV-1. 7 ~ 38 ~ Processo de acordo com a reivindicação 1, ca-racterizado por se expressar o plasmídeo pTAV-2 ou pSAV-6. 4ã Processo para a detecção de MV-2 caracteriza-do por se utilizar pelo menos um peptídeo preparado de acordo com qualquer das reivindicações 2 ou 3. A requerente reivindica a prioridade do pedido alemão apresentado em 1? de Novembro de 1990, sob o número P 40 36 784.3. Lisboa, 15 de Novembro de 1991
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