PT99054A - Processo para a preparacao de novos derivados peptidicos e pseudopeptidicos terapeuticamente activos na cascata da coagulacao sanguinea - Google Patents

Description

"PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE NOVOS DERIVADOS PEPTlDICOS E PSEUDOPEPTlDICOS TERAPEUTICAMENTE ACTIVOS NA CASCATA DA COAGULAÇÃO SANGUÍNEA" A presente invenção diz respeito a um processo para a preparação de novos derivados de péptidos e de pseudopéptidos terapeuticamente activos na cascata da coagulação sanguínea. É já largamente conhecido que quando o equilíbrio entre factores procoagulantes e anticoagulantes no sangue é perturbado, pode ter lugar a formação de um trombo ou coágulo de sangue. 0 desenvolvimento de uma trombose é favorecido essencialmente por três factores patogénicos principais que são a estase ou diminuição do fluxo sanguíneo, os estados de hiper-coagulabilidade e as lesões do endotélio da parede vascular.

Os anticoagulantes são agentes terapêuticos utilizáveis no tratamento das tromboses venosas agudas, da embolia pulmonar, da embolia arterial das extremidades, das tromboses arteriais como o infarto do miocárdio e de todas as outras manifestações tromboembólicas.

Entre os agentes anticoagulantes conhecidos, a hiru-dina, que ê um polipeptido que comporta 65 aminoácidos, é um -2- inibidor específico da trombina isolado das glândulas salivares da sanguessuga medicinal ("Biochemistry" 2jj, 4622 - 4628, 1986).

Foram já descritas variantes da hirudina utilizáveis como inibidor da trombina. É o caso, por exemplo, dos compostos descritos nas patentes de invenção europeias EP 209061 ou EP 332523. Por outro lado, foram igualmente descritos análogos sintéticos de fragmentos da hirudina com propriedades anticoa-gulantes; é o caso, por exemplo, dos compostos reivindicados nas patentes de invenção europeias EP 276014, EP 291981, EP 291982 e EP 333356. A presente invenção tem por objecto um processo para a preparação de novos péptidos sintéticos que se mostraram ser particularmente interessantes devido à intensidade das suas propriedades anticoagulantes, antitrombóticas e como antiagre-gantes plaquetários sem que estes efeitos sejam acompanhados de uma acção hemorrágica marcada. Estas propriedades são exercidas em doses até 10 vezes mais fracas do que as dos outros compostos descritos na técnica anterior.

Por outro lado, os derivados preparados pelo processo de acordo com a presente invenção apresentam tuna estabilidade elevada em relação ao pêptido natural (hirudina 54 - 65) em ensaios de proteólise "in vitro" que são modelos da sua duração de acção "in vivo". A potência, a selectividade e a -3- estabilidade destes péptidos sintéticos são devidas especialmente à introdução na sequência peptidica de aminoácidos sintéticos, de ligações pseudopeptídicas, de ciclizações não cistei-nicas ou de uma combinação destes factores. A presente invenção diz mais particularmente respeito a um processo para a preparação de novos derivados peptídicos respondendo â fórmula geral (I) : (I)

X-A·^ -A2 -A^ -A^ -A^-Ag-Ay -Ag -A^ -A^q - Y na qual : X representa um grupo amino terminal eventualmente substituído por 1 ou 2 grupos alquilo (Ci-C6) de cadeia linear ou ramificada, um grupo acilo (C^-C^) de cadeia linear ou ramificada, um grupo benziloxicarbonilo (Z), um grupo butoxi terc.-carbonilo (Boc), um grupo 9-fluore nilmetiloxi-carbonilo (Fmoc), um grupo guanidi-noacilo (C-^-Cg) de cadeia linear ou ramificada

HN

tal como os grupos XQ

x ,C-NH-(CH2)3-CO- ΗΝ ou Χ·0 =

X ;C-NH-(CH2)4-CO- -4- η2ν' um grupo guanidino-alquilo de cadeia linear ou ramificada, um grupo piroglutamilo (Glp), um grupo succinilo (Suc) ou um qualquer dos seguintes grupos :

Y . ** I H2N/

C-MH co —

X2 -- H3CO-CO-^__^-NH-CO-CH2-M’rí-CO-(CH2)2-CO-HO :<3 = hoco // % NH-C0-CH2-NH-C0-(CH2)2-C0- 0-COCH3

X4 = HO f Vco- C02CH3 CO — HO—f ^

CO2H -5-

Χ6 = HOCO V % MH-CO-CH2-MH-CO-(CH2)2-CO-

HO •’<7 = HOsC-CHs^ co_

X8 =— OC — CH2\^C0pH

A-^ representa uma ligação ou um resíduo peptídico contendo 1 a 3 aminoácidos quaisquer, A2 representa uma ligação ou um resíduo fenilala-nina (Phe), tirosina (Tyr), isoleucina (Ile), norvalina (Nva), (1,2,3,4)-tetra-hidroisoqui-nolina-3-carbonilo (Tic), um resíduo ácido -aminobutírico (Abu), ácido glutâmico (Glu) ou um resíduo de aminoácidos contendo um grupo arilo, A^ representa uma ligação ou um resíduo de ácido glutâmico (Glu), de ácido aspártico (Asp), de ^-alanina (jpAla) ou de tirosina (Tyr), -6- representa uma ligação ou um resíduo de ácido glutâmico (Glu), de ácido aspártico (Asp), de prolina (Pro), de ácido 2,3-diaminopropiónico (Dpr), de ácido 2,4-diaminobutírico (Dab), de ornitina (Orn), de lisina (Lys), de 2-azabi-ciclo [2.2.2]-octano-3-carbonilo (Abo) ou de 2-azabiciclo[2.2.l]heptano-3-carbonilo (Abh), A^ representa uma ligação ou um resíduo de isoleu cina (Ile), de norvalina (Nva), de fenilala-nina (Phe), de prolina (Pro), de ornitina (Orn) ou de ácido 2,3-diaminopropiónico (Dpr),

Ag representa um resíduo de prolina (Pro), de isoleucina (Ile), de norvalina (Nva), de fenil. alanina (Phe), de ornitina (Orn), de 2-azabi-ciclo[2.2.2]octano-3-carbonilo (Abo), de 2-aza biciclo[2.2.l]heptano-3-carbonilo (Abh), de octa-hidroindol-2-carbonilo (Oic) ou de 3,4--desidroprolina (dhPro),

Ay representa um resíduo de ácido glutâmico (Glu) ou de ácido aspártico (Asp),

Ag representa um resíduo de ácido glutâmico (Glu) de ácido aspártico (Asp), de ácido 2,3-diamino -7- propiónico (Dpr), de ácido 2,4-diaminobutírico -7- (Dab) ou de

representa um resíduo de tirosina (Tyr) eventualmente protegido por um grupo benzilo [Tyr(Bzl)] ou acetilo [Tyr(COCH^)], fenilala-nina (Phe), alanina (Ala), isoleucina (Ile) norvalina (Nva), p-carboxifenilalanina (Pcp), 3-carboxitirosina ou 4-0-acetil-3-carboxitiro-sina, (p-CI^PO^H)-fenilalanina [(pCI^PO^HJPhe],

Aio representa uma ligação, um resíduo de leucina (Leu), valina (Vai), JB-naf tilalanina (Nal), ciclo-hexilalanina (Cha), (2-tienil)-alanina (Thi) , octa-hidroindol-2-carbonilo (Oic) , um resíduo dipeptídico tal como Leu-Glu, Leu-Pro, Leu-pAla, Val-Glu, Nal-Glu, Cha-Glu-, Thi-Glu, Oic-Glu, leucina-ácido-4-aminobutírico (Leu-4--Abu), ou um resíduo tripeptídico tal como Nal-Nal-Leu, Y representa - um grupo carboxi terminal eventualmente substituído por um grupo alcoxi ^1”^6 cac*e*-a linear ou ramificada ou um grupo amino por sua vez eventualmente substi- -8- tuído por um ou dois grupos alquilo de cadeia linear ou ramificada, ou então - um grupo carboxi terminal reduzido no álcool correspondente (ol), e comportando pelo menos : um resíduo de aminoácido não natural tal como o 2-azabiciclo[2.2.2]octano-3-carbo nilo (Abo), o 2-azabiciclo[2.2.l]heptano-3--carbonilo (Abh), o octa-hidroindol-2-carbo nilo (Oic), e/ou - uma ligação pseudopeptídica tal como -ch2-nh-, -ch2-s-, -ch2-so-, -ch2-so2-, -NH-CO-, -CH=CH- substituindo uma ligação peptídica -CO-NH- e/ou - uma ciclização não cisteínica entre as cadeias laterais de dois aminoácidos, ou entre um grupo amino terminal e uma cadeia lateral de um aminoácido ou entre um grupo carboxi terminal e tuna cadeia lateral de um aminoácido ou entre um grupo amino terminal e um grupo carboxi terminal, -9- dos seus sais de adição com um ácido ou uma base aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, sendo cada aminoácido da sequência peptídica opticamente puro e tendo o carbono de cada aminoácido a configuração D ou L, caracterizado pelo facto de os derivados de fórmula geral I se poderem obter por diferentes métodos tais como a síntese sequen ciai em fase sólida, a síntese de fragmentos e a sua ligação em solução, a síntese enzimática, a síntese genética mediante clonagem e expressão de genes em bactérias transformadas ou mediante diversas combinações destas técnicas.

Entre os ácidos aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico pode-se citar a título não limitativo os ácidos clorídrico, bromídrico, sulfúrico, fosfónico, acético, trifluo-roacético, láctico, pirúvico, malónico, succinico, glutárico, fumárico, tartárico, maleico, cítrico, ascórbico, oxálico, metano-sulfónico, canfórico, etc..

Entre as bases aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico pode-se citar a titulo não limitativo o hidróxido de sódio, o hidróxido de potássio, a trietilamina, a butil terc.--amina, etc.. -10-

Os métodos gerais para a síntese de péptidos em fase sólida foram descritos por B. W. ERICKSON e R. B. MERRIFIELD ("The Proteins", Solid-Phase Peptide Synthesis, 3§ edition, 257 - 527, 1976). A síntese em fase sólida pode realizar-se sobre um autómato que efectua de modo repetitivo e programável ciclos de desprotecção, ligação e lavagens necessárias para a introdução sequencial dos aminoácidos na cadeia peptídica. 0 aminoácido, de preferêcnia C - terminal é fixado sobre uma resina convencionalmente utilizada para a preparação de polipeptidos, de preferência um poliestireno reticulado com a ajuda de 0,5 1 a 3,0 % de divinilbenzeno e equipado com restos activados tais como o clorometileno ou o hidroximetileno que permitem a fixação cova-lente do primeiro aminoácido sobre a resina. A escolha apropriada da resina permite a fixação de uma função C-terminal ácido-carboxilico, amida ou álcool.

Introduzem-se então os aminoácidos um a um segundo uma ordem determinada pelo operador. Cada ciclo de síntese que corresponde à introdução de um aminoácido, comporta uma desprotecção, de preferência N-terminal da cadeia peptídica, lavagens sucessivas destinadas a eliminar os reagentes ou a dilatar a resina, uma ligação com activação do aminoácido e de novo lavagens. Cada uma destas operações é seguida de uma filtração realizada graças à presença de um vidro calcinado incorporado no reactor em que se efectua a síntese. -11-

Os reagentes de ligação são reagentes clássicos da síntese peptídica como a diciclo-hexilcarbodiimida (DDC) e o hidroxibenzotriazol (HOBT) ou o l-benzotriazolil-oxitris(dime-tilamino)-fosfónio-hexafluorofosfato (BOP) ou ainda a difenil-fosforilazida (DPPA). São igualmente possíveis activações por formação de anidridos mistos.

Cada aminoácido é introduzido no reactor em uma quantidade aproximadamente quádrupla do excesso, em relação ao grau de substituição da resina e em quantidade aproximadamente equivalente em relação aos agentes de ligação. A reacção de ligação pode ser verificada em cada etapa da síntese pelo ensaio de reacção com a ninidrina descrito por E. KAISER e Colab. ("Analyt. Biochem.", 3h_, 595, 1970).

Após junção da cadeia peptídica com a resina, trata-se com um ácido forte tal como o ácido trifluoroacético ou o ácido fluorídrico na presença de anisol, de etanoditiol ou de 2-metilindol para se separar o péptido da resina, assim como para, eventualmente, se libertar o péptido dos seus grupos protectores. Purifica-se, então, o composto mediante técnicas clássicas de purificação, particularmente cromatográficas. -12- A ciclização total ou parcial dos compostos de acordo com a presente invenção realiza-se em solução de preferência através de funções desprotegidas de modo selectivo e capaz de formar uma ligação covalente com uma ligação amida.

Os péptidos de acordo com a presente invenção podem preparar-se, igualmente, mediante ligação de fragmentos peptídicos selectivamente protegidos, que se podem preparar quer em fase sólida, quer em solução. A utilização dos grupos protectores e o aproveitamento da sua estabilidade diferencial é análoga aos métodos em fase sólida com excepção da ligação da cadeia peptídica sobre a resina. 0 grupo carboxílico C-terminal é protegido, por exemplo, por um éster metílico ou uma função amida. Os métodos de activação quando das ligações são igualmente análogos aos utilizados na síntese em fase sólida. A síntese de péptidos contendo ligações pseudopeptí-dicas tais como -CI^-NH-, -CtL^-S-, -Cl^-SO-, -CH2-S02-,

-NH-CO-, -CH=CH- efectua-se quer pelos métodos em solução quer de um modo combinado com a síntese em fase sólida utilizando métodos clássicos da química orgânica. Assim, por exemplo, a introdução da ligação -CI^-NH faz-se mediante preparação em solução do aldeído Fmoc-NH-CHR-CHO de acordo com a técnica descrita por FEHRENTZ e CASTRO ("Synthesis", 676 - 678, 1983) e mediante condensação com a cadeia peptídica crescente quer em fase sólida de acordo com a técnica descrita por SASAKI e COY -13- (Peptides", 8, 119 - 121, 1988), quer em solução.

Os compostos de fórmula geral I possuem propriedades farmacológicas muito interessantes. São dotados de propriedades anticoagulantes e anti-trombóticas e podem assim ser utilizados para prevenir as complicações pós-tromboembólicas por dissolução dos coágulos ou como agentes preventivos da extensão do processo trombótico utilizando-os como anticoagulantes de acção directa e rápida.

As suas propriedades de inibição da via de activação plaque-tária mediada pela trombina permitem encarar a sua utilização como inibidor das etapas da interacção das plaquetas sanguíneas com a parede vascular implicadas nos fenómenos da trombose e da aterosclerose. A presente invenção tem igualmente por objecto um processo para a preparação de composições farmacêuticas contendo como ingrediente activo pelo menos um composto de fórmula geral (I) ou um dos seus sais de adição com um ácido ou uma base aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, só ou em combinação com um ou vários excipientes ou veículos inertes, não tóxicos.

Entre as composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção, pode-se citar, mais particularmente, as que -14- convêm para a administração oral, parenteral ou nasal, os comprimidos simples ou drageifiçados, os comprimidos sublinguais, os saquinhos, os papelinhos, as gélulas, os trociscos, as pastilhas, os supositórios, cremes, pomadas, geles dérmicos, aerossóis. A posologia varia de acordo com a idade e o peso do paciente, a natureza e a gravidade da afecção assim como a via de administração.

Esta pode ser oral, nasal, rectal ou parenteral. De uma maneira geral, está compreendida entre 0,2 e 100 mg para um tratamento em uma ou várias tomas por 24 horas.

Os exemplos seguintes ilustram a presente invenção sem contudo a limitarem de modo algum.

Os aminoácidos cujas abreviaturas começam por uma letra maiuscula são de configuração L.

Os aminoácidos cujas abreviaturas começam por uma letra minúscula são de configuração D. 0 aminoácido denominado Abo é de configuração 3S. -15- A letra ψ indica a presença de uma ligação pseudo-peptidica cuja natureza é indicada entre parênteses.

EXEMPLO 1 : Z-Asp-Phe-Glu-Abo-Ile-Pro-Glu-Asp-Tyr-Leu-OH

Prepara-se o composto do Exemplo 1 a partir de 2 g de uma resina substituída por 0,33 mmole/g de Fmoc-Leu- OH e seguindo o protocolo repetitivo seguinte : N9 da operação Função Dissolvente/reagente Repetição/ /tempo 1 lavagem DMF 2x2 min. 2 desprotecção 20% piperidina/DMF 1x5 min. 3 desprotecção 20% piperidina/DMF 1 xl5 min. 4 lavagem DMF 3x2 min. 5 lavagem diclorometano 3x2 min. 6 ligação aminoácido protegi do activado 1 x 90 min. 7 lavagem DMF 3x2 min. 8 lavagem álcool isopropílico 3x2 min. 9 lavagem diclorometano 3x2 min. -16-

Cada uma destas operações efectua-se em 30 ml de dissolvente, sob agitação e ã temperatura ambiente, seguindo-se uma filtração através de um vidro calcinado incorporado na célula de vidro (reactor) em que a síntese se desenvolve. 0 filtro retém a resina em que está fixada a cadeia peptídica crescente.

Os aminoácidos protegidos escolhidos são introduzidos pela seguinte ordem: Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Glu-(OtBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Abo-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Z-Asp(OtBu)-OH. 0 2-aza-3-carboxi-biciclo[2.2.2]-octano (Abo) é um aminoácido não codificado descrito na patente de invenção europeia EP 51020. Obtém-se o derivado Fmoc-Abo-OH mediante tratamento do Abo com o 9-fluorenil-metilcloroformato (Fmoc-Cl) em uma mistura de ^200^ (10 %)/dioxano (2/1) durante 4 horas à temperatura ambiente e extrai-se depois, após acidificação da fase aquosa com acetato de etilo e recristalização com uma mistura de éter/pentano.

Obtém-se a activação em via de ligação (operação 6) em cada ciclo mediante dissolução de 4 equivalentes (2,64 mmoles) do aminoácido protegido com 360 mg de HOBt em 30 ml de DMF e depois, após 30 minutos à temperatura ambiente, mediante adição de 6/8 mg de DCC. Introduz-se, então, esta solução -17- imediatamente na célula de reacção com 10 ml de diclorometano.

Ao fim de nove ciclos correspondendo ã fixação sequen ciai de nove aminoácidos, obtém-se assim com a leucina C-terminal, um decapéptido protegido sobre as suas cadeias laterais e fixado sobre a resina. Esta é então tratada com uma mistura de ácido trifluoroacético (18 ml), diclorometano (1 ml) e anisol (1 ml) durante 90 minutos à temperatura ambiente. Reúne-se o filtrado e os dissolventes de lavagem da resina (3 x 20 ml de diclorometano) e evapora-se até à secura. Suspen-de-se o composto em éter, filtra-se, seca-se e purifica-se depois mediante HPLC preparativa, em coluna C18 ( diâmetro interno: 47 mm, comprimento: 300 mm) e liofiliza-se.

Realiza-se a análise do composto obtido após decomposição deste último em aminoácidos mediante hidrólise em ácido clorídrico 6 N durante 18 horas a 110° C e doseamento quantitativo dos aminoácidos obtidos mediante HPLC.

Asp Ile Glu Leu + Abo Phe Pro Tyr calculado 2122111 encontrado 1,98 0,92 2,15 1,80 0,95 1,11 0,90

Espectro de massa (FAB) : MH+, m/z = 1411 -18- EXEMPLO 2 : Fmoc-Asp-Phe-Glu-ppr-Ile-Abo-Glu-Glu-Tyr-

Vf (CH2-NH)-Leu-NH2 O primeiro ciclo é igual ao descrito no Exemplo 1 e permite obter a introdução de Fmoc-Leu-OH sobre uma resina substituída de modo a libertar uma função amida C-terminal quando da clivagem final. Segue-se um meio-ciclo até à operação 6 para se libertar a função amina da leucina.

Faz-se então reagir separadamente 2,3 mmoles de Fmoc-Tyr-(Bzl)-OH com 2,3 mmoles de hexafluorofosfato de fosfónio (BOP) na presença de Ο,Ν-dimetil-hidroxilamina e de trietilamina. Isola-se o composto assim obtido após lavagens usuais em diclorometano e evaporação do dissolvente. Retoma-se então o composto oleoso com éter e faz-se reagir com 2,5 mmoles de LiAlH^ durante 20 minutos à temperatura ambiente. Hidrolisa-se então a mistura reaccional com uma solução de NaHCO^ e extrai-se o aldeído formado com éter, lava-se e evapora-se o dissolvente. Introduz-se então o composto oleoso no reactor contendo a resina em suspensão em DMF na presença de ácido acético. Reduz-se então a imina obtida por adição progreís siva de cianoboro-hidreto de sódio e mantém-se a agitação durante 3 horas.

Continua-se então a síntese utilizando o mesmo protocolo de síntese descrito no Exemplo 1 começando pela operação 7. -19-

Os aminoácidos protegidos são então introduzidos pela seguinte ordem: Fmoc-Glu(OBzl)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Abo-OH, Fmoc-Ile-DH, Fmoc-Dpr(Boc)-OH, Fmoc-Glu-(OBzl)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Asp(OBzl)-OH.

Depois da operação 9 do último ciclo, separa-se o composto da resina e purifica-se utilizando as técnicas descritas no Exemplo 1. Cicliza-se então o composto obtido após dissolução em DMF e tratamento com 4 equivalentes de BOP e 12 equivalentes de etil-diisopropil-amina durante 2 horas à temperatura ambiente.

Após evaporação do dissolvente, purifica-se o composto ciclizado mediante cromatografia e desprotege-se depois dos seus grupos protectores com excepção de Fmoc mediante hidrogenação catalítica (Pd/C).

Após filtração do catalisador, purifica-se o composto pretendido mediante cromatografia liquida preparativa. A sua pureza é controlada de acordo com o processo descrito Exemplo 1. Análise : Asp Phe Glu Dpr Ile Abo calculado 1 1 3 1 1 1 encontrado 0,97 0,98 3,03 0,99 0,95 0,99 Espectro de massa (FAB) : MH+, m/z = 1469 -20- -20- Os os processos exemplos seguintes foram preparados de acordo com descritos nos Exemplos 1 ou 2.

EXEMPLO 3 : Z-Asp-Phe-Glu-Abo-Ile-Abo-Glu-Asp-Tyr-Leu-OH

Análise :

Asp Phe Glu Ile + Abo Tyr Leu calculado 2 1 2 3 1 1 encontrado 2,10 0,96 2,19 2,85 1,10 1,09 Espectro de massa (FAB) : MH+, m/z = 1450 EXEMPLO 4 : nal-Asp-Phe-Glu-Abo-Ile-Pro-Glu-Asp-Tyr-Leu, trifluoroacetato

Análise : nal Asp Phe Glu Ile Pro Tyr Leu+Abo calculado 1 2 1 2 1 1 1 2 encontrado 1,07 1,97 1,01 2,14 0,96 1,07 0,90 1,90

Espectro de massa (FAB) : MH+, m/z = 1474 -21- EXEMPLO 5 : Z-Asp-Phe-Glu-Abo-Ile-Pro-Glu-Asp-Tyr ψ(CH2NH) Leu-OH, trifluoroacetato

Análise :

Asp Phe Glu Abo Ile Pro calculado 2 1 2 1 1 1 encontrado 2,21 0,95 2,13 0,90 0,86 1,18 Espectro de massa (FAB) : MH+, m/z = 1397 EXEMPLO 6 : Z-Asp-Tyr ψ (CH2NH) Glu-Abo-Ile-Pro-Glu-Asp-Tyr ψ (CH2NH) Leu-OH, ditrifluoroacetato

Análise :

Asp Abo Ile Pro Glu calculado 2 1 1 1 1 encontrado 2,16 0,93 1,00 0,91 1,08 Espectro de massa (FAB) : MH+, m/ = 1399 EXEMPLO 7 : Z-Asp-Phe-Glu-Abo-Ile-Pro-Glu-Asp-Tyr-nal-nal-

-Leu-OH -22 -22 Análise : Asp Phe Glu Abo + Ile Pro Tyr nal Leu calculado 2 1 2 2 1 1 2 1 encontrado 2,06 1,02 2,20 1,82 1,04 0,91 1,85 1,1 Espectro de massa (FAB) : MH+, m/ = 1804 £λ EXEMPLO 8 : H- Glu-Om- 1 Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu—j Análise : Glu Pro Leu Orn Tyr calculado 3 1 1 1 1 encontrado 2,85 0,97 0,98 1,1 1,08 Espectro de massa (FAB) : MH+, m/z = 875 EXEMPLO 9 : Suc-Glu-pra-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu—|

Análise :

Glu Pro Leu Orn Tyr calculado 3 1 1 1 1 encontrado 2,95 1,09 0,99 0,91 1,06 975

Espectro de massa (FAB) : MH+, m/ z EXEMPLO 10 H-prn-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu —^

Análise : Glu Pro Leu Orn Tyr calculado 2 1 1 1 1 encontrado 1,84 1,04 0,99 1,08 1,04 Espectro de massa (FAB) : MH+, m/z - = 746 EXEMPLO 11 : p Om-Pro-Glu-Glu-Tyr 13 Análise : Glu Pro Orn Tyr calculado 2 1 1 1 encontrado 2,05 0,91 0,99 1,06 Espectro de massa (FAB) : MH+, m/z = = 633 EXEMPLO 12 H- -Glu-pm-Pro- Glu-Glu-Tyr — Análise : Glu Pro Orn Tyr calculado 3 1 1 1 encontrado 2,92 1,06 1,01 0,99 -24-

Espectro de massa (FAB) : MH+, m/ = 761 EXEMPLO 13 : H-Ora-Pro-Glu-Glu-Tyr

Análise :

Glu Pro Orn Tyr calculado 2 1 1 1 encontrado 1,94 1,00 1,06 1,00 Espectro de massa (FAB) : MH+, m/ = 633

EXEMPLO 14 : Suc-Dpr-Pro-Glu-Glu-Pcp-Leu-OH

EXEMPLO 15 : Suc-Orn-Pro-Glu-Glu-PcD-Leu-OH - 1-1 EXEMPLO 16 : |->0Γη-ΡΓθ-61ιι-61υ-Τ7Γ^βΐΐ —^

Análise :

Glu Pro Leu Orn Tyr calculado 2 1 1 1 1 encontrado 1,92 1,02 1,00 1,09 0,97 746

Espectro de massa (FAB) : MH+, m/ z -25- EXEMPLO 17 : H-Asp-Phe- -Glu-Glu-pm-Pro-Glu- -Glu-Tyr-Leu —^ Análise : Asp Glu Pro Phe Leu Orn Tyr calculado 1 4 111 1 1 encontrado 1,03 3,98 1,01 0,97 1,06 1,00 1,01 Espectro de massa (FAB) : MH+, m/z = 1266 EXEMPLO 18 : Glp-Glu-pm-Pro-Glu- Glu-Tyr-Leu Análise : Glu Pro Leu Orn Tyr calculado 4 11 1 1 encontrado 4,07 1,02 0,96 0,94 1,00 Espectro de massa (FAB) : MH+, m/z = 986 EXEMPLO 19 = x2. -Glu-Glu-j Dm-Pro-Glu- -Glu-Tyr- -Leu—^ Análise : Glu Gly Pro Leu Orn Tyr calculado 4 1 1 1 1 1 encontrado 4,07 0,99 1,03 0,92 0,96 1,03 -26-

Espectro de massa (FAB) : MH+, m/z = 1310 EXEMPLO 20 : X3-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-

-Tyr(CO-CH3)-Leu-OH EXEMPLO 21 : Xg-Gly-Asp-Phe-Glu-Abo-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-

-Leu-OH

Análise :

Asp Glu Gly Phe Leu + Ile + Abo Tyr calculado 1 3 1 1 3 1 encontrado 1,00 3,06 0,95 1,08 2,88 1,02 Espectro de massa (FAB) : M + H+, m/z = 1475 EXEMPLO 22 : H-(4-Abu)-Gly-Asp-Phe-Glu-Abo-Ile-Pro-Glu-Glu-

-Tyx-Leu-OH

Análise :

Asp Glu Gly 4-Abu Phe Leu + Ile + Abo Tyr calculado 1 3 1 1 1 3 1 encontrado 1,00 3,06 0,95 0,99 1,08 2,88 1,02 Espectro de massa (FAB) : MH+, m/z = 1433 -27- EXEMPLO 23 : H-Arg-Gly-Asp-Phe-Glu-Abo-Ile-Pro-Glu-Glu-

-Tyr ψ (CH2NH)Leu-OH

Análise :

Arg Asp Glu Gly Pro Phe Ile + Abo calculado 1 1 3 1 1 1 2 encontrado 1,07 1,06 2,97 0,92 1,01 0,99 2,01

Espectro de massa (FAB) ·. MH+, m/z = 1489 EXEMPLO 24 : X-^-Gly-Asp-Phe-Glu-Abo-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-

-Leu-OH

Análise : Asp Glu Gly Pro Phe Ile + Abo Leu Tyr calculado 1 3 1 1 1 2 1 1 encontrado 1,04 3,02 1,06 1,05 1,01 1,98 1,07 0,95 Espectro de massa (FAB) : MH+, m/z = 1508 EXEMPLO 25 : CH^CO-Arg-Gly-Asp-Phe-Glu-Abo-Ile-Pro-Glu-Glu-

-Tyr-Leu-OH -28-

Análise :

Arg Asp Glu Gly Pro Phe Ile + Abo Leu Tyr calculado 1 1 3 1 1 1 2 1 1 encontrado 1,00 1,00 3,02 1,04 1,08 0,98 1,82 1,10 1,01

Espectro de massa (FAB) : MH+, m/z - 1546 EXEMPLO 26 : Arg-Gly-Asp-Phe-Glu-Abo-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-

-Leu-OH

Análise :

Arg Asp Glu Gly Pro Phe Ile + Abo Leu Tyr calculado 1 1 3 1 1 1 2 1 1 encontrado 1,04 1,02 3,03 0,99 1,07 1,03 1,94 1,02 0,97

Espectro de massa (FAB) : MH+, m/z = 1504 EXEMPLO 27 : phe-Pro-Arg-Abu-Glu-Abo-Ile-Pro-Glu-Glu-tyr-

-Leu-OH

Análise :

Arg Glu Abu Pro Phe Ile Leu + Abo Tyr calculado 1 3 1 2 1 1 2 1 encontrado 1,00 2,83 0,95 2,09 1,03 1,05 2,00 0,99

Espectro de massa (FAB) : MH+, m/z = 1514 -29- EXEMPLO 28 : X-j^-Gly-Asp-Phe-Glu-Abo-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-

-Leu-glu-OH

Análise :

Asp glu Gly Pro Phe Ile Leu + Abo Tyr calculado 1 A 1 1 1 1 2 1 encontrado 1,08 A,21 1,02 1,10 0,99 0,90 1,6A 1,0A

Espectro de massa (FAB) : MH+, m/z = 1638

EXEMPLO 29 : Suc-Glu-Tyr-Abo-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-glu-OH

Análise :

Glu Ala Pro Ile Abo Cha Tyr calculado A 1 1 1 1 1 1 encontrado 4,15 0,99 1,00 0,99 0,95 0,9A 0,97

Espectro de massa (FAB) : MH+, m/z = 1369

EXEMPLO 30 : Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Oic-Glu-Glu-Hla-Thi-glu-OH

Análise :

Ala Pro Ile 111 1,05 0,89 Oic Tyr Thi 1 1 1 0,96 0,95 0,89 0,93

Glu

calculado A encontrado

A , 3A -30-

Espectro de massa (FAB) : MH+, m/z = 1383 EXEMPLO 31 : Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile- Pro-Glu-Glu- -Ala-Oic- -glu-OH Análise : Glu Ala Pro Ile Oic Tyr calculado 4 1 2 1 1 1 encontrado 3,91 0,96 2,04 1,12 0,99 0,97 Espectro de massa (FAB) : MH+, m/z = 1327

EXEMPLO 32 : X^^-Gly-Asp-Phe-Glu-Abo-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Oic--glu-OH

Ala Pro Phe Ile + Abo Oic 1 1 1 2 1 0,95 0,85 0,86 2,23 0,90

Análise :

Asp Glu Gly calculado 1 4 1 encontrado 1,09 4,25 0,87 Espectro de massa (FAB) : MH+ m/z = 1584 -31-EXEMPLO 33 Análise : calculado encontrado Espectro deEXEMPLO 34 Análise : calculado encontrado Espectro deEXEMPLO 35 Análise : calculado

Suc-Tic-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Oic-glu-OH

Glu Ala Pro Ile Oic Tic 4 1 2 1 1 1 4,08 1,07 1,92 0,92 0,91 1,09 massa (FAB) : MH+, m/z = 1323

Suc-tic-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Oic-glu-OH

Glu Ala Pro Ile Oic tic 4 1 2 1 1 1 3,86 1,11 2,00 0,96 0,95 1,07 massa (FAB) : MH+, m/z = 1323

nal-Asp-Phe-Glu-Abo-Ile-Pro-Glu-Asp-Tyr-Leu-OH encontrado

Asp Glu 2 2 1,97 2,14

Pro Phe 1 1 1,07 1,01 0,96

Ile Leu 1 2 1,90 nal Tyr 1 1 1,07 0,90 -32-

Espectro de massa (FAB) : MH+, m/z = 1474 EXEMPLO 36 : Z-Asp-Phe-Glu-Abo-Ile-Pro-Glu-Asp-Tyr-nal-nal-

-Leu-OH

Análise :

Asp Glu Pro Phe Ile + Abo Leu nal Tyr calculado 2 2 1 1 2 1 2 1 encontrado 2,06 2,20 1,04 1,02 1,82 1,10 1,85 0,91 Espectro de massa . (FAB) : MH + , m/z = 1804 EXEMPLO 37 : Z-Asp-Phe -Glu-Abo-Ile-Abo-Glu-Asp-Tyr-leu-OH Análise : Asp Glu Phe Ile + Abo Leu Tyr calculado 2 2 1 3 1 1 encontrado 2,10 2,19 0,96 2,85 1,09 1,10 Espectro de massa (FAB) : MH+, m/z = 1450 -33- EXEMPLO 38 : H-Asp-Phe-Glu-pm-Ile-Pro-ft.sp-Glu-Tyr (Bzl) - -Leu-NI^

Análise : Asp Glu Pro Phe Ile Leu Orn Tyr calculado 2 2 1 1 1 1 1 1 encontrado 1,80 1,84 0,92 0,90 0,87 0,92 1,08 1,03 Espectro de massa (FAB) : MH+, m/z = 1324 EXEMPLO 39 : X'Q-Gly-Asp-Phe-Glu-Abo-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-

-Leu-OH

Análise :

Asp Glu Gly Pro Phe Ile Leu + Abo Tyr calculado 1 3 1 1 1 1,0 2 1 encontrado 1,5 3,19 1,06 0,97 1,00 0,90 1,86 0,55 Espectro de massa (FAB) : MH+, m/z = 1489 EXEMPLO 40 : X^-Gly-Asp-Phe-Glu-Abo-Ile-Pro-Glu-Glu-Pcp-

-Leu-OH EXEMPLO 41 : X^-Gly-Asp-Phe-Glu-Abo-Ile-Pro-Glu-Glu-Pcp-

-Leu-glu-OH -34- EXEMPLO 42 : EXEMPLO 43 : EXEMPLO 44 : EXEMPLO 45 : EXEMPLO 46 X-^-Gly-Asp-Phe-Glu-Abo-Ile-Pro-Glu-Glu-Pcp- -leu-OH X^-Gly-Asp-Phe-Glu-Abo-Ile-Pro-Glu-Glu-Pcp. -Leu-Pro-OH X^-Gly-Asp-Phe-Glu-Abo-Ile-Pro-Glu-Glu-Pcp- -Leu-pro-OH X^-Gly-Asp-Phe-Glu-Abo-Ile-Pro-Glu-Glu-Pcp- -Leu-ol X^-Gly-Asp-Phe-Glu-Abo-Ile-Pro-Glu-Glu-Pcp-

EXEMPLO 47 : EXEMPLO 48 :

X^-Gly-Asp-Phe-Glu-Abo-Ile-Pro-Glu-Glu--(pCH2P03H)Phe-Leu-0H X^-Gly-Asp-Phe-Glu-Abo-Ile-Pro-Glu-Glu--(pC^PO^H^he-Leu-glu-OH -35- EXEMPLO 49 :

X^-Gly-Asp-Phe-Glu-Abo-Ile-Pro-Glu-Glu--(pCH2P03H)Phe-Leu- p Ala-OH EXEMPLO 50 :

X^-Gly-Asp-Phe-Glu-Abo-Ile-Pro-Glu-Glu--(pCH2P03H)Phe-Leu-4Abu-0H EXEMPLO 51

Xy-Phe-Glu-Abo-Ile-Pro-Glu-Glu-(pCH2P03H)-Pbe--Leu-glu-OH EXEMPLO 52

X7-Glu-Abo-Iie-Pro-Glu-Glu-(pCH2P03H)Phe-Leu- -glu-OH EXEMPLO 53 :

Xy-Phe-Glu-Abo-Ile-Pro-Glu-Glu-(pCH2P03H)Phe--Leu-p Ala-OH EXEMPLO 54 :

Xg-Phe-Glu-Abo-Ile-Pro-Glu-Glu-(pCH2P03H)Phe--Leu-glu-OH -36-

ESTUDO FARMACOLÓGICO DOS COMPOSTOS PREPARADOS PELO PROCESSO DE ACORDO COM A PRESENTE INVENÇÃO

EXEMPLO 55 : ACTIVIDADE ANTITROMBÕTICA O modelo de trombose experimental utilizado é o de uma trombose venosa induzida no rato Wistar macho mediante atadura da veia cava inferior sob a veia renal esquerda.

Os animais a ensaiar sao anestesiados por administração intraperitoneal de Brietal® (metohexital sódico) na dose de 1 ml/kg.

Realiza-se então a atadura. 0 composto a ensaiar é injectado 2 horas mais tarde por via sub-cutânea na região sub--clavicular esquerda. Quatro horas depois desta injecção, recolhe-se o sangue por via intracardíaca directa, sendo a veia cortada e o coágulo recuperado e pesado após passagem em uma estufa a 37° C durante 12 horas.

Os compostos preparados pelo processo de acordo com a presente invenção foram ensaiados em uma dose única de 250 yí<,g/kg em relação ã hirudina não sulfatada utilizada como composto testemunha. -37-

Os resultados deste ensaio demonstraram que os compostos preparados pelo processo de acordo com a presente invenção permitem uma diminuição do peso do coágulo 3 a 4 vezes mais importante do que a observada quando da injecção de hirudina não sulfatada.

EXEMPLO 56 : ACTIVIDADE ANTICOAGULANTE, DETERMINAÇÃO DO

TEMPO DE TROMBINA

Na presença de uma quantidade padrão de trombina, um plasma normal coagula em um tempo definido e constante, chamado tempo de trombina (TT). Qualquer aumento neste tempo traduz uma anomalia da fibrinoformação (coagulação).

Os ratos Sprague-Dawley são anestesiados com pento-barbital sódico (60 mg/kg, intraperitoneal), a artéria carótida é caracterizada e as colheitas sanguíneas realizadas em uma solução de citrato trissódico (0,109 M) . Um plasma pobre em plaquetas é obtido mediante centrifugação das amostras sanguíneas (3000 g, 15 minutos). O plasma pode ser conservado durante 8 horas a 20° C. 0 tempo de trombina é realizado com o reagente trombina Prest e determinado automaticamente utilizando um coaguló-metro. -38-

Adiciona-se o antagonista ou o dissolvente (10jjlI) ao plasma (90^0,1) e incuba-se depois durante 2 minutos a 37° C. Adicionam-se 100^tl de trombina disparando-se o cronómetro .

Nas nossas condições, os TT obtidos no plasma testemunho são da ordem de 30 segundos. Determina-se a actividade de um antagonista pela sua capacidade para prolongar este tempo de trombina em relação à testemunha.

Nestas condições, os compostos preparados pelo processo de acordo com a presente invenção permitem um prolongamento do tempo de trombina de 3 a 5 vezes. Este prolongamento é 2 a 3 vezes superior ao obtido com a hirudina 55 - 65 não sulfatada. É o caso, mais particularmente, dos compostos dos exemplos 24, 28 e 30.

EXEMPLO 57 : AGREGAÇÃO PLAQUETÁRIA

Neste ensaio, a actividade antitrombina dos antagonistas é determinada medindo a inibição da agregação plaque-tária induzida pela trombina. -39-

Os coelhos (2—3 kg) são anestesiados com pentobar-bital sódico (30 mg/kg, intravenosa). Após canulação da artéria carótida esquerda, colhe-se o sangue sobre citrato de sódio (0,109 Μ) (1 vol. de citrato para 9 vol. de sangue).

Obtém-se o plasma rico em plaquetas (PRP) mediante centrifugação (20° C) a 250 g durante 20 minutos e o plasma pobre em plaquetas mediante centrifugação a 1000g durante 10 minutos. Ajusta-se o número de plaquetas entre 300 - 350 000 3 pl/mm mediante diluição em PPP autologo. Conserva-se o PRP a temperatura ambiente até ao momento do ensaio e utiliza-se nas 4 horas que se seguem à colheita.

Centrífuga-se de novo o PRP (900 g, 15 minutos) e lava-se as plaquetas com uma solução salina tamponada com Tris, contendo gelatina (0,2 %). Ressuspendem-se em seguida as plaquetas lavadas (PL) em uma solução fisiológica e conservam-se à temperatura ambiente. A agregação plaquetária realiza-se a 37° C em tubos de vidro siliconados com a ajuda de um agregómetro. Agita-se o PRP e as PL a 1000 rpm (rotações por minuto).

Incuba-se a trombina durante 3 minutos a 37° C com a substância a ensaiar (em diferentes concentrações) ou com o dissolvente em um volume de 50 dX. As PL (225 ul) são pré-incu- -40- badas durante 1 minuto a 37° C em uma tina de vidro siliconado sob agitação (1000 rpm). Obtém-se a agregação por adição de 25ytú. da solução contendo a trombina e a substância a ensaiar. A resposta agregante regista-se durante pelo menos 5 minutos.

Estabelece-se a intensidade da agregação plaquetária tomando a amplitude máxima dos traçados agregantes e exprime-se em percentagem de transmissão luminosa (% T). Determina-se uma CI50 para cada um dos compostos ensaiados.

Os compostos preparados pelo processo de acordo com a presente invenção, inibem de modo dose dependente a agregação plaquetária induzida pela trombina. As CI^q obtidas são 4 a 20 vezes inferiores ao valor obtido com a hirudina não sulfatada. Ê o caso, mais particularmente, dos compostos dos Exemplos 22, 24, 26 e 39.

EXEMPLO 58 : DETERMINAÇÃO DA ACTIVIDADE ANTICOAGULANTE MEX VIVO"

TEMPO DE PROTROMBINA

Os ratos OFA, em jejum ou não, são anestesiados com pentobarbital (60 mg/kg, intraperitoneal). Desprende-se a carótida e a jugular e cateterizam-se. Purga-se os cateteres com soro fisiológico citratado (1/40). Após instalação dos cateteres, efectua-se uma colheita de 1,5 ml de sangue arterial sobre citrato 0,109 M (1/9). -41-

Trinta minutos depois administra-se os compostos a ensaiar sob um volume de 1 ml por via intravenosa.

Efectuam-se então colheitas arteriais (1,5 ml) a 1 min. e 30, 3 min., 5 min., 15 min., 30 min. e 60 min..

Por cada colheita, injecta-se 1,5 ml de soro fisiológico citratado no animal via carótida.

Centrifugam-se os tubos de sangue durante 15 minutos a 4000rpm (preparação do plasma).

Incubam-se 100jjJL de plasma com 200 jjX de neoplastina cálcica. Determina-se o tempo de aparecimento do fenómeno de coagulação.

Os compostos preparados pelo processo de acordo com a presente invenção, ensaiados em doses compreendidas entre 4 e 16 mg/kg, aumentam de modo dose dependente o tempo de protrom-bina (TP). 0 seu efeito é mais importante que o da hirudina não sulfatada. Com efeito, aumentam o TP de 1,4 a 1,8 vezes. Por outro lado, enquanto a actividade "in vivo" da hirudina é de curta duração (30 minutos), o aumento do TP verificado com os compostos de acordo com a presente invenção é sempre significativo 60 minutos depois da sua administração. É o caso, mais particularmente, dos compostos dos Exemplos 22, 24, 28, 30 e 39.

Claims (8)

1 C0-H .(5 HG C 0 —<Y_y_ ^ Η - C Ο - C Η 2 - ΜΗ - C Ο - C C Η 2) 7-CG-ΗΟ :ί7 HG>C-CH?. •co —

CO?H 'Í3 = —0C 4 A^ reprenta uma ligação ou um resíduo peptídico contendo 1 a 3 aminoácidos quaisquer; representa uma ligação ou um resíduo fenila-lanina (Phe), tirosina (Tyr) , isoleucina (Ile) , norvalina (Nva), 1,2,3,4-tetra-hidro-isoquinoli-no-3-carbonilo (Tic), um resíduo ácido 0<_-ami-nobutírico (Abu) , ácido glutâmico (Glu) ou um resíduo aminoácido contendo um grupo arilo; A^ representa uma ligação ou um resíduo ácido glutâmico (Glu), ácido aspãrtico (Asp) , p*-alani na ( j3 Ala) ou tirosina (Tyr) ; A^ representa uma ligação ou um resíduo ácido glutâmico (Glu), ácido aspártico (Asp), proli-na (Pro), ácido 2,3-diaminopropiõnico (Dpr), ácido 2,4-diaminobutírico·' (Dab) , ornitina (Orn) , lisina (Lys), 2-azabiciclo[2.2.2]octano-3-car-bonilo (Abo), 2-azabiciclo(2.2.1]heptano-3-carbo nilo (Abh); Aç. representa uma ligação ou um resíduo isoleucina (Ib), norvalina (Nva), fenilalanina (Phe), prolina (Pro), ornitina (Orn) ou ácido 2,3-diami nopropiónico (Dpr); Ag representa um resíduo prolina (Pro), isoleucina (Ile), norvalina (Nva), fenilalanina (Phe), ornitina (Orn), 2-azabiciclo[2.2.2]octano-3-car- bonilo (Abo), 2-azabiciclo(2.2.1]heptano-3-car-bonilo (Abh), octa-hidroindol-2-carbonilo (Oic) ou 3,4-desidroprolina (dhPro); A^ representa um resíduo ácido glutâmico (Glu) ou ácido aspártico (Asp); Ag representa um resíduo ácido glutâmico (Glu), ácido aspártico (Asp), ácido 2,3-diaminopropió-nico (Dpr), ácido 2,4-diaminobutirico (Dab) ou jo -alanina ( Ala); Ag representa um resíduo tirosina (Tyr) eventualmente protegido por um grupo benzilo (Tyr(Bzl)] ou acetilo [Tyr(COCHg)], fenilalanina (Phe), alanina (Ala), isoleucina (Ile), norvalina (Nva), p-carboxifenilalanina (Pcp), 3-carboxitirosina ou 4-0-acetil-3-carboxitirosina, (p-CH2POgH)-fenilalanina [ (pCH2POgH)Phe]; ‘10 na (Leu), valina (Vai), ciclo-hexilalanina (Cha), p -(2-tienil)-alanina (Thi), octa-hidroindol-2-carbonilo (Oic), um resíduo dipeptídico, tal como Leu-Glu, Leu-Pro, A Leu- pAla, Val-Glu, Nal-Glu, Cha-Glu-Thi-Glu, Oic-Glu, leucina-ácido 4-aminobutirí- A,„ representa uma ligação, um resíduo leuci- 0 -naftilalanina (Nal), co (Leu-4Abu), ou um resíduo tripeptídico, tal como Nal-Nal-Leu; Y representa um grupo carboxi terminal que compor ta eventualmente como substituinte um grupo alco-xi C^-Cg, de cadeia linear ou ramificada, ou ami-no, ele próprio eventualmente substituído com um ou dois grupos alquilo C^-Cg de cadeia linear ou ramificada, ou representa um grupo carboxi terminal reduzido no álcool correspondente (ol); e comportando pelo menos: - um resíduo aminoácido não natural tal como 2-azabiciclo[2.2.2]octano-3-carbonilo (Abo) , 2-azabiciclo[2.2.1]heptano-3-carbonilo (Abh), octa-hidro-indol-2-carbonilo (Oic), e/ou - uma ligação pseudopeptídica tal como -CH2~NH-, -CH2-S-, -ch2-so-, -CH2-S02-, -nh-co-, -ch=ch-substituindo uma ligação peptídica -CO-NH-; e/ou - uma ciclização não cisteínica entre as cadeias laterais de dois aminoácidos ou entre um grupo amino terminal e uma cadeia lateral de um aminoácido ou entre um grupo carboxi terminal e uma cadeia lateral de um aminoácido ou entre um grupo amino terminal e um grupo carboxi terminal , dos seus sais de adição de um ácido ou de uma base aceitável sob 7 o ponto de vista farmacêutico, sendo cada aminoácido da sequência peptídica opticamente puro e tendo o carbono OC de cada aminoácido a configuração D ou L, caracterizado pelo facto de se efectuar a síntese sequencial em fase sólida de aminoácidos protegidos, a síntese de fragmentos peptídicos em solução, ou, eventualmente, uma combinação destas duas técnicas, eventualmente, mediante ciclização total ou parcial através das funções desprotegidas de modo selectivo e capaz de formar uma ligação covalente, e, eventualmente, mediante introdução, de acordo com técnicas convencionais da química orgânica, de uma ligação pseudopeptídica em qualquer momento da síntese da sequência peptídica, e eventualmente converter estes derivados'' de fórmula geral I nos seus sais de adição de um ácido ou de uma base aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.

1 REIVINDICAÇÕES 1.- Processo para a preparação de compostos de fórmula geral x-a1-a2-a3-a4-a5-a6-a7-a8-a9-a10-v (I) na qual X representa um grupo amino terminal que comporta eventualmente como substituintes 1 ou 2 grupos alquilo C-^-Cg de cadeia linear ou ramificada; acilo C-|-Cg de cadeia linear ou ramificada; benziloxicarbonilo (Z); t-butoxi-carbonilo (Boc); 9-fluoro-enilmetilo- xicarbonilo (Fmoc); guanidinoacilo C,-C,- de ca- 1 0 deia linear ou ramificada; tal como os grupos X. HNv\ C-NH- (CH2) -C0- h2n ou X HN \ C-NH-(CH2)4-CO- h2n guanidino-alquilo C,-C, de cadeia linear ou ra 1 0 mificada; piroglutamilo (Glp); succinilo (Suc) ou um qualquer dos seguintes grupos 3 ΚΝ Η? Ν' \γ·_· / \—rn — / •3CO-CC MH-C0-CH2-MH-C0-( CK2) 2-C0- 1 :-:ο *3 = iOCG —^ ^—MH-CG-CH2-NH-CO-CCH2) 2-CO- / HQ :(5 = :-:ο C-CCCH3 f — C0— CO2CH3 //“Vco_

2.- Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de compostos de fórmula geral I comportando pelo me nos um resíduo aminoácido não natural tal como 2-azabiciclo [2.2.2]octano-3-carbonilo (Abo), 2-azabici-clo[2.2.1]heptano-2-carbonilo (Abh) ou octa-hidroindol-2-carbo-nilo (Oic), caracterizado pelo facto de se utilizar compostos iniciais correspondentemente substituídos. 8

3. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de compostos de fórmula geral I comportando pelo menos uma ligação pseudopeptídica tal como -CH^-NH-, -CH^-SO-, -Cí^-SC^-, -NH-CO-, -CH=CH—, substituindo uma ligação peptídica -CO-NH-, caracterizado pelo facto de se utilizar compostos iniciais correspondentemente substituídos.

4. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de compostos de fórmula geral I comportando pelo menos uma ciclização não cisteínica entre as cadeias laterais de dois aminoácidos ou entre um grupo amino terminal e uma cadeia lateral de um aminoácido ou entre um grupo carboxi terminal e uma cadeia lateral de um aminoácido ou entre um grupo amino terminal e um grupo carboxi terminal, caracterizado pelo facto de se utilizar compostos iniciais correspondfentemente substituídos.

5.- Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 e 2, para a preparação do composto de fórmula geral X^-Gly-Asp-Phe-Glu-Abo-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH, na qual X^ re presenta um radical

cio[2.2.2]octano-3-carbonilo representa um resíduo 2-azabici- caracterizado pelo facto de se uti rizado pelo facto de se utilizar compostos iniciais corresponder, temente substituídos.

9.- Processo de acorde com uma qualquer das reivindicações 1 e 2, para a preparação do composto de fórmula geral X ' Q-Gly-Asp-?he-Glu-Abo-Ile—Pro-Glu—Glu-Tyr-Leu—OH, na qual X' representa um radical KN \ ,C-NH- {CK2) 4 -C0- e Abo representa um resíduo 2-azabiciclo[2.2.2]octano-3-carbonilo, caracterizado pelo facto de se utilizar compostos iniciais correspondentemente substituídos. í- .í

λ lizar compostos iniciais correspondentemente substituídos.

6.- Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 e 2, para a preparação do composto de fórmula geral X^-Gly-Asp-Phe-Glu-Abo-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Glu-OH, na qual representa um radical

Abo representa um resíduo 2-azabiciclo[2.2.2]octano-3-carbonilo, caracterizado pelo facto de se utilizar compostos iniciais correspondentemente substituídos.

7. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 e 2, para a preparação do composto de fórmula Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Oic-Glu-Glu-Ala-Thi-Glu-OH, na qual Oic representa um resíduo octa-hidroindol-2-carboniloj Thi representa um resíduo j3-(2-tienil)-alanina, caracterizado pelo facto de se utilizar compostos iniciais correspondentemente substituídos.

8. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 e 2, para a preparação do composto de fórmula geral H-4Abu-Gly-Asp-Phe-Glu-Abo-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-0H, na qual 4Abu representa um resíduo de ácido 4-aminobutírico e Abo representa um resíduo 2-azabiciclo[2.2.2]octano-3-carbonilo, caracte- 11 11 ► II ►Λ ??.;CI33C ???.E?ARAÇAC ΕΞ MCVCS ΕΞ EI 7 AEG 3 ~C°E?TÍGIGOS GEHAEEUTIGAMEMTE ACTIVCS NA. CA.S SANGÍJÍN Descreve-se ua processo para a prs tos de fómula geral x"Ài_Α2~'^3 “ A4 “ A5“ AS - A7-A8~A9 ~A10~‘ ^ ~ dos seus sais de adição de um ácido ou de uma o ponto de vista farmacêutico, que consiste em efectuar a síntese sequencial aminoácidos protegidos, a síntese de fragmente lução ou, eventualmente, uma combinação destas eventualmente, mediante ciclização total ou pa funções desprotegidas de medo selectivo e capa gação covalente, e, eventualmer.ee, mediante introdução, de acordo com técnicas convencionais da químic ligação pseudopeptícica em qualquer momento ca cuência ceocídica.

paração de ccmpos-) base aceitável sob em fase sólica de s peptídicos em so-duas técnicas, rcial através das z de formar uma li a orgânica, de uma sínrese da se-