PT98995A - Processo para a obtencao de uma sequencia de acido nucleico codificadora de uma proteina de 30 kd da membrana externa de bordetella pertussis, e processo para a producao da referida proteina e de composicoes de vacina contendo-a - Google Patents

Description

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V J 0 presente invento está relacionado com uma sequência de DNA e de aminoácidos de uma proteína da membrana externa de Bordetella pertussis. A proteína em questão é antigénica e portanto, a proteína produzida por via recombinante pode ser usada em composições de vacinas para proteger contra a infecção por EL. pertussis. É também útil como adjuvante em composições de vacinas contra outros microorganismos tais como Haemophilus influenza. A sequência do gene isolado também permite a construção de vectores recombinantes e de células hospedeiras úteis na produção da proteína.

FUNDAMENTO DO INVENTO A bactéria Bordetella pertussis é o agente causador da tosse convulsa ou pertussis. É habitual imunizar as crianças contra Β^_ pertussis com uma vacina compreendendo células completas de B_i_ pertussis inactivadas pelo calor ou quimicamente. Se bem que tais vacinas sejam largamente usadas e sejam muito eficazes na indução de protecção, tais preparações de células completas necessariamente contêm componentes que não são necessários para se conseguir protecção e que podem de facto causar efeitos secundários indesejáveis associados à imunização. É pois preferível identificar os componentes celulares que são essenciais para a imunidade e uitilizar apenas os necessários para se conseguir o efeito pretendido. B. pertussis apresenta muitas proteínas que são potenciais candidatos a tal formulação de vacinas com componentes. Entre estas estão o factor promotor da linfocitose (Morse, J. Exp. Med. 143:1483-1502, 1976), hemaglutinina filamentosa (Cowell et al., em Robbins et al., eds., Bacterial Vaccines, Thieme 3

Stratton, Inc., N.Y., pp. 371-379); e aglutinogênios (Eldering et al., J. Bacteriol. 74: 133-136, 1957). Também são de recente interesse uma série de proteínas do invólucro celular associadas â virulência. (Armstrong e Parker, Infect. Immun. 54:308-314, 1986); Parker e Armstrong, Rev. Infect. Dis. 10 (Supl. 2): S327-S330, 1988). Um ou mais destes componentes da membrana externa foram anteriormente usados como adjuvante numa formulação de vacinas contendo Haemophilus influenza como imunogénio activo (Patente U.S. N24, 474,758). As proteínas da membrana externa também estão presentes numa vacina acelular de pertussis produzida por Takeda por copurificação de várias proteínas de pertussis. É de interesse particular para o presente invento uma proteína de membrana externa de 30 kilodaltons. Um "dupleto associado à virulência", referido como Omp 30/32 foi anteriormente descrito por Parton e Wardlaw. (J. Med. Microbiol. 8:47-57, 1975) Uma fracção de 30 KD das proteínas da membrana externa de B. pertussis encontrou-se ser particularmente útil no aumento da resposta imune contra o polissacárido capsular de IL·. influenzae (Monji et al. Infect. Immun. 51:865-871, 1986). Se bem que a proteína per se tenha sido isolada, o isolamento depende de separação química da membrana externa bacteriana e de outras proteínas da membrana externa. Até agora não se dispôs de um meio para a produção da proteína em grandes quantidades por qualquer outro método. 0 presente invento torna agora possível um meio alternativo para a produção de uma proteína de 30 KD com elevado rendimento sem ir directamente â fonte bacteriana.

SUMÁRIO DO INVENTO 0 presente invento proporciona um novo gene isolado e uma sequência de ácido nucleico codificadora de uma proteína de 4 ϊ

membrana externa de 30 Kilodaltons de Bordetella oertussis. Também é proporcionada uma sequência de aminoácidos completa deduzida da proteína. A disponibilidade da sequência do gene da proteína de 30 KD permite a expressão da proteína numa variedade de células hospedeiras. Assim, o invento também engloba um método para produção de uma proteína purificada da membrana externa de B pertussis que compreende a transformação de uma célula hospedeira com o gene de 30 KD e a cultura da célula hospedeira nas condições que permitem a expressão do gene na célula hospedeira. A recuperação da proteína pode ser feita directamente a partir da célula hospedeira ou a partir do sobrenadante da cultura dependendo do modo de expressão no hospedeiro. A transformação de células hospedeiras pode ser conmseguida directamente por ácido nucleico nu ou através de vectores de expressão projectados de forma a serem portadores da sequência da proteína de 30 KD. O invento também proporciona células hospedeiras transformadas com a sequência de ácido nucleico reivindicada, assim como vectores de expressão compreendendo a sequência. A proteína de 30 KD é útil como imunogénio primário numa composição de vacina para proporcionar protecção contra infecção por B^. oertussis. As células hospedeiras transformadas proporcionam um meio conveniente para a produção da proteína de 30 KD substancialmente pura (i.e., obtida livre sem contaminantes celulares normais e pelo menos preferencialmente cerca de 90% pura). A proteína assim produzida forma a base de uma vacina de subunidades compreendendo uma quantidade eficaz de uma proteína de 30 KD substancialmente pura ou uma sua fracção imunogénica, em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável. Também está englobado pelo invento um método para a imunização de um indivíduo contra a infecção por B^_ oertussis que se caracteriza 5

pela administração a um indivíduo necessitado de tâ.X protecção de uma quantidade eficaz da composição de vacina1 atras referida.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 mostra a sequência de nucleótidos e de aminoácidos prevista. A Figura 2 mostra a expressão da proteína recombinante de 30 KD em E. coli estirpe JM109 (DE3). Faixa 1. padrões, Faixa 2. JM 109 (DE3) + pCLLHOl após indução, lisado celular, Faixa 3. fracção passada na coluna de Affigel-blue, Faixa 4. fracção passada numa coluna de DE53. A. gel de SDS corado com Coomassie Blue. B. Transferência Western hibridada com um anti-soro contra 30K nativa. A Figura 3 mostra um mapa de restrição do fragmento de DNA de B. oertussis contendo o gene da proteína de 30 KD da membrana externa. A grelha de leitura aberta do gene de 30 KD está entre as bases de 770 e 1544. A Figura 4 mostra uma comparação das proteínas 30K e r30K por mapeamento de peptídeos. 5 μg de 30 K nativo (A) ou recombinante (B) foi aplicado em cada uma das faixas de um gel de 15% SDS-poliacrilamida com 0 μg (1), 2,5 μg (2) ou 5 μg (3) de endoproteinase Glu-C e digerido no gel. O gel foi transferido para Nitroplus 2000 e desenvolvido com anti-soro contra a proteína nativa 30K e proteína A-peroxidase de rábano silvestre.

DESCRICÃO DETALHADA DO INVENTO A sequência de DNA codificadora da proteína de 30K foi originalmente clonada por rastreio de uma biblioteca em lambda 6

gtll contendo DNA genómico de Bordetella pertussis. Os fagos recombinantes que expressam a proteína 3 0K' foram identificados por transferência de placas (Mierendorf et al., Meth. Enzymol. 152: 458-469, 1987) usando anti-soro contra a proteína 30K. Os clones recombinantes positivos foram identificados e isolado o DNA. 0 DNA de pertussis foi removido e subclonado num vector plasmídeo para mapeamento de restrição e num bacteriofago M13 (Messing et al., Nucl. Acids Res. 9: 307, 1981) para análise da sequência de DNA. O gene contendo a proteína de 30 KD foi isolado num fragmento de aproximadamente 3,5 Kb de DNA de pertussis. Aproxi-madamente 2,5 Kb foi sequenciado usando o método de terminação didesoxi de Sanger (PNAS USA 74:5463-5467, 1977) a partir de M13 de cadeia simples e de subclones de plasmídeos de cadeia dupla, gerados por métodos de subclonagem com deleções pela exonuclease III. A sequência de DNA da proteína 3 0KD esta apresentada na Figura 1. A proteína recombinante consiste numa sequência de 242 aminoácidos, também mostrada na Figura 1. A proteína é expressa em E. coli usando a RNA-polimerase de T7 e o sistema promotor (Studier et al., Meth. Enzymol. 185: 60-69, 1990). A grelha de leitura aberta codificadora da proteína 30KD foi clonada num plasmídeo pGEM 7Zf+ a seguir a um promotor da RNA-polimerase de T7. O plasmídeo foi usado para transformar E. coli estirpe JM109 (DE3) contendo o gene da RNA-polimerase de T7 sob o controle do promotor lac UV5. A expressão da RNA-polimerase de T7 foi induzida pela adição de isopropil-B-D-tiogalactopiranosido (IPTG). A presença da proteína de 30KD foi confirmada por transferência Western de lisados de células totais, mostrado na Figura 2B. 7

A proteína expressa foi purificada 5a partir dos lisados de culturas bacterianas induzidas com IPTG. A proteína obtida após purificação por dois passos de cromatografia em coluna estava aproximadamente 90% pura. A proteína recombinante purificada derivada de E. coli foi comparada com a proteína nativa de 30K purificada derivada de B. oertussis. As proteínas nativa e recombinante têm o mesmo peso molecular aparente determinado por SDS-PAGE, o mesmo ponto isoeléctrico (cerca de 9) determinado por focagem isoeléctrica, dão ambas reacção cruzada com anti-soro anti-30KD e ambas têm o mesmo padrão de mapeamento peptídico quando digeridas com endoproteinase Glu-C.

Os exemplos que se seguem ilustram a clonagem e expressão do gene da proteína 30KD num sistema de expressão de RNA-po-limerase de T7. No entanto, se bem que este sistema de expressão T7 tenha provado muito eficiente, deve-se entender que este não é o único meio pelo qual se pode produzir proteína 30KD recombinante. A produção da proteína pode ser conseguida por incorporação do gene em qualquer vector de expressão adequado e subsequente transformação de uma célula hospedeira adequada com o vector; como alternativa a transformação das células hospedeiras pode ser conseguida directamente por DNA nu sem a utilização do vector. A produção da proteína por células eucarióticas ou células proca-rióticas é contemplada pelo presente invento. Exemplos de células eucarióticas adequadas incluem células de mamífero, células vegetais, células de levedura e células de insecto. De forma semelhante, hospedeiros procarióticos adequados para além de E. coli incluem Bacillus subtilis.

Podem também ser empregues outros vectores de expressão adequados e são seleccionados com base na escolha da célula hospedeira. Por exemplo, são bem conhecidos numerosos vectores adequados para usar na transformação de células bacterianas. Por 8 f

exemplo, plasmídeos e bacteriófagos, tais.como fago lambda, são os vectores mais vulgarmente usados para hospedeiros bacterianos e para E. coli em particular. Tanto em células de insectos como em células de mamífero os vectores virais são frequentemente usados para obter expressão de DNA exógeno. Em particular, as células de mamífero são normalmente transformadas com SV40 ou com vírus polioma; e as células de insecto em cultura podem ser transformadas com vectores de expressão baculovírus. Os sistemas vectores de levedura incluem plasmídeos com centrómeros de levedura, plasmídeos epissomais de levedura e plasmídeos de integração em levedura.

Será também compreendido que a realização do invento não está limitada à utilização da sequência exacta do gene como definido na Figura 1. São também consideradas modificações da sequência, tais como deleções, inserções ou substituições na sequência que produzam alterações silenciosas na molécula de proteína resultante. Por exemplo, são englobadas as alterações na sequência do gene que reflitam a degenerescência do código genético ou que resultem na produção de um aminoácido quimicamente equivalente num determinado sítio; assim, um codão para o aminoácido alanina, um aminoácido hidrofóbico, pode ser substituído por um codão codificador de um outro resíduo menos hidrofóbico como seja glicina ou um resíduo mais hidrofóbico como seja valina, leucina ou isoleucina. De forma semelhante, as alterações que resultem na substituição de um resíduo carregado negativamente por um outro, como seja o ácido aspártico por ácido glutâmico, ou ou um resíduo carregado positivamente por um outro, como seja lisina por arginina, também se espera que produza um produto biologicamente equivalente. As alterações nos nucleótidos que resultem na alteração das fracções N-terminal e C-terminal da molécula de proteína não se espera que alterem a actividade da proteína. Portanto, sempre que seja usada a frase "sequência de 9

DNA da proteína 30KD" ou "gene da proteína-3QKD^' na especificação ou reivindicações, ela deve ser entendida como englobando todas essas modificações e variações que resultem na produção de uma proteína 30KD biologicamente equivalente. Em particular o invento engloba as sequências de ácido nucleico que são suficientemente duplicativas da sequência na Figura 1 de forma permitir a sua hibridação em condições de restringência convencionais na hibridação Southern, tais como as descritas em Maniatis et al.. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2a Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) ou que codifiquem proteínas que reajam com anti-soros contra a proteína 30KD nativa.

Para além do gene e proteína de tamanho completo, o invento engloba fragmentos de cada um. Em particular o invento inclui fragmentos de ácido nucleico codificadores de peptídeos e os peptídeos per se, os quais retêm a antigenicidade da molécula parental. De preferência os fragmentos em questão codificam peptídeos contendo epítopos que induzem a produção de anticorpos protectores. Para além da preparação por métodos recombinantes, tais peptídeos mais pequenos podem também ser preparados sinteticamente por técnicas conhecidas de síntese de peptídeos. 0 produto do gene na forma purificada ou um peptídeo imunogénico sintético é útil na preparação de uma composição de vacina para a prevenção de pertussis. A proteína completa ou qualquer fracção dela que seja activa pode ser empregue como um agente imunogénico em tal composição. A proteína preparada por métodos recombinantes pode ser isolada a partir de células hospedeiras por técnicas convencionais de isolamento de proteínas. A proteína purificada é então combinada com qualquer um dos veículos aceitáveis normalmente usados tais como água, soro fisiológico, etanol, polióis, tais como glicerol ou propileno-glicol, ou óleos vegetais, assim como qualquer um dos adjuvantes -ν .· 10

de vacinas conhecidos. As proteínas podem,ser também incorporadas em lipossomas para usar numa preparação de vacina. Tal como aqui é usado "veículos farmaceuticamente aceitáveis" engloba todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos e agentes anti-fún-gicos, agentes isotõnicos e retardadores da absorção e similares. Exceptuando qualquer meio convencional que seja incompatível com o ingrediente activo, é considerada a utilização de todos eles na composição terapêutica.

Para além da sua utilização como único ingrediente activo na composição de vacina, a proteína de 30 KD ou suas fracções activas, podem também ser combinadas com outros agentes activos. Por exemplo, uma vacina pertussis pode compreender a proteína 30KD com uma ou mais proteínas de membrana externa isoladas e purificadas ou outras proteínas imunogénicas conhecidas derivadas de Bordetella pertussis. Ainda, a proteína de 30 KD pode ser combinada com um componente activo com agentes imunogé-nicos contra outras doenças infecciosas, tais como influenza, hepatite ou herpes. Também, a proteína de 30KD pode ser usada em composições de vacina, em quantidades eficazes como adjuvantes, para melhorar a resposta imune a outros agentes imunogénicos, tais como os referidos atrás.

Os microorganismos e outros materiais biológicos aqui referidos estão guardados nas colecções da American Cyanamid Company, Lederle Laboratories, Pearl River, New York e E. coli estirpe JM109 (DE 3) contendo o plasmídeo pCLLHOl, foi depositado na American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland e 18 de Setembro, 1990, como ATCC 68402. 0 invento é ainda ilustrado pelos exemplos não limi-tantes que se seguem.

EXEMPLOS 1. Clonaqem do gene de 30KD a oartir de uma biblioteca em lambda qtll

Isolou-se DNA genómico a partir de B. pertussis estirpe 130. Adicionaram-se adaptadores EcoRI a DNA partido mecanicamente e depois clonou-se no sítio EcoRI de lambda gtll. A biblioteca g contem ãproximadamente 1,6 x 10 clones independentes. A biblio-. . 5 teca foi diluída a 1:10 , para cada placa de 150 mm, 0,1 ml foi misturado com 0,6 ml de E. coli estirpe Y1090 e incubado à temperatura ambiente durante 20 minutos. As células foram semeadas em 7,5 ml de agar de topo LB em placas LB e incubadas durante 3 horas a 42°C. Os filtros de nitrocelulose foram embebidos em 10 mM IPTG e secos ao ar. Estes filtros foram colocados sobre as placas que foram incubadas a 37°C durante 3 horas. Os filtros foram bloqueados com 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,05%

Tween 20 (TBST) mais 1% albumina sérica bovina (BSA) durante a noite. Os filtros foram lavados em TBST e adicionado anti-soro contra 30KD. Após uma incubação de 60 minutos os filtros foram lavados com TBST, depois incubados com Proteína A conjugada com peroxidase de rábano silvestre durante 60 minutos. Os filtros foram lavados em TBS (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl) e depois incubados na presença do substrato da peroxidase de rábano silvestre (4-cloro-l-naftol e peróxido de hidrogénio em TBS). As placas positivas foram picadas e eluidas para tampão SM (0,1M NaCl, 10 mM MgSO^, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,01% gelatina). Os fagos positivos foram purificados em placa por repetição do processo de rastreio. 12

2. Seauenciacão do crene de 3 0KD v ; -

Isolou-se o fragmento de aproximadamente 3,6 Kb do DNA de pertussis a partir de clones positivos de lambda. Dois fragmentos EcoRI (1,4 e 2,2 Kb) foram subclonados em M13mpl8 para sequenciação pelo método de terminação didesoxi. Subclones com deleção feita pelo exonuclease III foram gerados em subclones de sequências sobreponíveis (Henikoff, S. (1984) Gene 28:357). 0 sítio EcoRI está situado no meio da grelha de leitura aberta. Para confirmar a sequência ao longo desta junção, clones de plasmídeo contendo toda a grelha de leitura aberta foram sequen-ciados usando Sequenase (US Biochemicals). Uma vez que o DNA de pertussis tem um elevado teor em G+C, as regiões de compressão foram sequenciadas em ambas as direcções. Na Figura 3 está apresentado um mapa de restrição do gene da proteína 30 KD. A comparação deste mapa com o mostrado em Shareck e Cameron (J. Bacteriol. 159: 780-782, 1984; Fig. 2) mostra que o gene do presente invento não codifica a proteína de 30 Kd descrita por estes autores. 3. Expressão e purificação da proteína 30KD recombinante 0 DNA de pertussis foi isolado a partir de fagos positivos e subclonado em pGEM7zf+ para expressão. Um fragmento Kpnl-SacI de 3 Kb do DNA de pertussis foi clonado em pGEM7zf+ a seguir ao promotor da RNA-polimerase de T7 (designado pCLL 1101) e usado para transformar E. coli estirpe hospedeira JM109 (DE3) a qual contem o gene da RNA-polimerase de T7 sob o controle do promotor lacUV5. As culturas de JM109 (DE3) contendo pCLL 1101 foram cultivadas em LB mais ampicilina (50 Mg/ml) a 37°C para uma DO de 1 a 550 nm. Adicionou-se IPTG para uma concentração final de 0,5 mM e as culturas foram incubadas durante mais 3 horas. As células foram colhidas porcentrifugação a 5000xg durante 10 13 13

minutos e lavadas com água. 0 sedimento dé células foi ressus-penso em 10 ml de tampão de lise(50 mM Tris-HCl, pH 80, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl), 0,3 ml de lisozima (10 mg/ml em tampão de lise) foi adicionado e a mistura incubada à temperatura ambiente durante 30 minutos. À medida que a viscosidade aumentava foi-se adicionando 0,07 ml de DNase (1 mg/ml em tampão de lise). A mistura foi centrifugada a I5000xg durante 30 minutos a 4°C. O sobrenadante foi centrifugado a 200000xg durante 30 minutos. A fracção do sobrenadante foi passada através de uma coluna de DE53 em 50 mM Tris-HCl, pH 7,4. O efluente da coluna foi colhido e passado por uma coluna de DE53 em 50 mM Tris-HCl, pH 8,0. Estes dois passos de cromatografia resultam numa preparação de proteína 30KD recombinante que está aproximadamente 90% pura. 4. Caracterização da proteína 30KD recombinante A proteína 30 KD purificada derivada de B. pertussis foi comparada com a proteína recombinante purificada a partir de E. coli por vários métodos. As proteínas quando fraccionadas por SDS-PAGE num gel de 12,5% de acrilamida migram com pesos moleculares idênticos. A análise de transferências Western mostra que as proteínas dão reacção cruzada com anti-soros contra a proteína 30 KD nativa. Ainda, a proteína nativa e recombinante focam num pi de aproximadamente 9 em géis de isoelectrofocagem. 0 pi previsto da proteína madura baseado na sequência de aminoãcidos deduzida a partir da sequência de DNA ê de 9,8.

Para confirmar a identidade da proteína recombinante, fez-se mapeamento de peptídeos como descrito por D.W. Cleveland (Meth. Enzymol., vol. 96, p. 222-229, 1983). Aproximadamente 10 μg de proteína foi aplicado num gel de 15% de poliacrilamida na presença de quantidades crescentes de endoproteinase Glu-C (0, 2,5, 5 μg) em tampão de digestão consistindo em 50 mM Tris-HCl, 14 14

ρΗ 6,8, 10% de glicerol e 0,1% de SDS. As'amostras foram sujeitas a electroforese num gel de concentração e a corrente desligada durante 1 hora para permitir a digestão. A corrente foi ligada e os peptídeos resultantes separados. Um gel foi corado com Coomassie Brilliant Blue e um segundo electrotransferido para membrana de nitrocelulose para análise da transferência Western. A proteína nativa e a proteína recombinante possuem o mesmo padrão de digestão de peptídeos. Uma diferença observada entre as proteínas nativa e recombinante é que a proteína nativa tem um extremo amina bloqueado. Isto não acontece com a proteína 30KD recombinante, onde os 50 primeiros aminoácidos foram determinados por sequenciação de proteína.

Claims (2)

1. REIVINDICAÇÕES: lâ. - Processo para o isolamento de uma sequência de ácido nucleico codificadora de uma proteína de 30KD da membrana externa de Bordete11a pertussis, caracterizado por compreender o rastreio de uma biblioteca de Bordetella pertussis com um anticorpo capaz de se ligar à proteína ou com uma sonda capaz de se ligar ao DNA codificador da proteína, a identificação dos clones positivos, e o isolamento do DNA a partir dos clones positivos. 2a. - Processo de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por a proteína ter um ponto isoeléctrico de aproximadamen-te 9. 3a. - Processo de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por a sonda consistir toda numa porção da sequência descrita na Figura 1: CAGGATTTCGTCCCATATCCCATTCATGCACTTGCGCTGGATGCGCAAGCACCCTCTCCA 6 Ο GACAACGCCMGTAAACATTCAAAAGGTCAAAGGACATACATGAAACGCATCGCCATGCT 12 Ο MetLysArglleAlaMetLeu -15 GGCTGCTGCCTGCGTGATTGCCGTGCCCGCTTTCGCCCAGAACGTGGCGACCGTGAACGG 18 0 AlaAlaAlaCysValIleAlaValProAlaPhaAlaGlriAsnValAlaTiLrValAsnGly -10 -5 15 CAAGCCCATTACTCAGAAGAGCCTGGATGAGTTCGTCAAGCTGGTCGTCAGCCAGGGCGC 24 0 LysProIlôThrGlnLysSerLeuAspGluPheValLysLeuValValSerGlnGlyAla 10 15 20 25 TACCGATTCCCCCCAGCTGCGTGAGCAGATCAAGCAGGAAATGATCAACCGCCAGGTGTT 300 ThrAspSarProGlnLeuArgGluGlnlleLysGlnGluMetlleAsnArgGlnValPhe 30 35 40 45 CGTGCAGGCGGCCGAGAAGGACGGCGTCGCCAAGCAGGCCGACGTGCAGACTGAGATCGA 3 60 50 55 60 65 * * * * * * GCTGGCCCGCCACGGAGTCCTGGTGCGCGCCCTGATGGCCGACTACCTGCAAAAACACCC 420 LeuAlaArgKisGlyValLeuValArgAlaLeuIletAlaAspTyx-LeuGlrLLysHisPro 70 75 , 80 85 CGTCACCGACGCCCAGGTCAAGGCCGAATACGAAAAGATCAAGAAAGAACAGGCCGGCAA 48 0 ValThrAspAlaGlnValLysAlaGluTyrGluLysIleLysLysGluGlnAlaGlyLys 90 95 100 105 GATGGAATACAAGGTCCGTCACATCCTGGTCGAGGACGAAAAGACGGCCAACGACCTGCT 540 MetGluTyrLysValArgEisIleLeuValGluAspGluLysThjcAlaAsnAspLeuLeu. 11Π 115 120 125 GGCCCAGGTCAAGAGCAACAAGAACAAGTTCGACGATCTGGCCAAGAAGAACTCCAAGGA 600 AlaGlnValLysSerAsnLysAsiiLysPheAspAspLeuAlaLysLysAsnSerLysAsp 130 135 140 145 CCCCGGCAGCCCGAGCGCGGCGGCGACCTGGGTTGGGCGCTGCACCAACTACGTCCAGCC 660 ProGlvSerProSerAlaAlaAlaTiirTrpValGlyArgCysThrAsnTyrValGlnPro i=0 155 160 165 17 GTTTGCCGAGGCCGTGACCAAGCTGAAGAAGGGCCAACTGGTCGACAAGCCGGTGCAGAC 720 pheAlaGluAlaValThrLysLeuLysLysGlyGlnLeuValAspI/ysProValGlnThr 170 175 180 185 CCAGTTCGGCTGGCACGTGATCCAGGTCGACGATACCCGTCCGGTCGÀATTCCCCGCCAT 78 0 GlnPheGlyTrpHisValIleGlnValAspAspThrArgProValGluPheProAlaMet 190 195 200 205 GGACCAGGTGCGCCCGCAACTGGAAGAAATGCTGCGCCAGCAAACCCTGGCCAACTACCA 840 AspGlnValArgProGlnLeuGluGluHetLeuArgGlnGlnThrLeuAlaAsnTyrGln 210 220 225 230 GAAGCAATTGCGCGAACAGGCCAAGATCCAGTAAGCGCCAAGCCATCGCCATCAACAAAA 9 00 LysGlnLeuArgGluGlnAlaLysIleGln 235 240 TTGCCCGCTTTCGCGGGAATTTTGTTTTCGGCTGCCGGGCGCCGGCGCCGCTTCGCCTAA 9 6 0 ou um seu fragmento codificador de um peptídeo biologicamente activo.
2. 45. - Processo de acordo com a Reivindicação 1, caracte-rizado por a sequência isolada ser a sequência descrita na Figura 1. 5a. - Processo para a produção de uma proteína de 30 KD da membrana externa de Bordetella pertussis ou de um seu fragmento activo, caracterizado por compreender a transformação de uma célula hospedeira com uma sequência de ácido nucleico codificadora da proteína ou fragmento, e a cultura da célula hospedeira nas condições que permitem a expressão do gene pela célula hospedeira. 6a. - Processo para a obtenção de um vector expressão capaz de expressar uma proteína de 30KD da membrana externa de 18 Bordetella pertussis. caracterizado por compreender a ligação, num vector de expressão apropriado, de uma sequência de ácido nu-cleico codificadora da proteína, numa orientação que permita a expressão pelo vector. 7ft. - Processo para a obtenção de uma célula hospedeira capaz de produzir uma proteína de 30KD da membrana externa de Bordetella pertussis. caracterizado por compreender a transformação de uma célula hospedeira apropriada com uma sequência de ácido nucleico codificadora da proteína ou com um vector de expressão preparado de acordo com a Reivindicação 6. 8a. - Processo para a preparação de uma composição de de vacina, caracterizado por se incluir na referida composição uma quantidade imunogenicamente eficaz de uma proteína de 30 KD da membrana externa de Bordetella pertussis ou seus fragmentos activos, produzida de acordo com o processo da Reivindicação 4, em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável. 9a. - Processo de acordo com a Reivindicação 10, caracterizado por se preparar uma composição que compreende outros antigénios de Bordetella pertussis. 10a. - Processo para a preparação de uma composição de vacina, caracterizado por se incluir na referida composição uma quantidade eficaz como adjuvante de uma proteína de 30 KD substancialmente pura da membrana externa de Bordetella pertussis f produzida de acordo com o processo da Reivindicação 4, em combinação com pelo menos um antigénio que não seja de Bordetella pertussis e um veículo farmaceuticamente aceitável. Lisboa, 18 de Setembro de 1991

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