PT98276A

PT98276A - Processo de fabricacao de microrganismos que produzem o seu proprio inibidor de crescimento, em particular bacterias lacteas, e dotadas de uma produtividade celular melhorada e controlada

Info

Publication number: PT98276A
Application number: PT98276A
Authority: PT
Inventors: Bernard Bibal; Gerard Goma; Alain Pareilleux
Original assignee: Lacto Labo Sa
Priority date: 1990-07-11
Filing date: 1991-07-10
Publication date: 1992-06-30
Also published as: CA2046719A1; EP0466560A1; NO912655L; FR2664612A1; NO912655D0; IE912420A1; FI913344A; FR2664612B1; FI913344A0

Description

"PROCESSO DE. FABRICAÇÃO DE MICRORGANISMOS" A presente invenção refere-se a um processo de fabricação de microrganismos produtores do seu próprio inibidor de crescimento/ bem como de microroganismos cuja actividade celu lar específica e a produtividade celular são melhoradas. Os referidos microroganismos podem ser, em particular, bactérias lácticas. A fabricação de microroganismos efectua-se de acordo com a maneira clássica num meio de cultura que contém substra tos nutritivos diluídos em água. Este meio de cultura é primeiramente semeado com microrganismos que se desenvolvem assim em meio quase fechado. Esta cultura diz-se que se realiza em cargas descontínuas. A cultura em carga descontínua apre senta a vantagem de ser simples, mas tem pequena eficácia. Com efeito, existem factores que limitam, quer nos substratos nutritivos, quer nos inibidores produzidos pelos microrganismos, cuja acumulação no meio de fermentação reduz a taxa de crescimento dos microrganismos e provoca uma interrupção de fermenta ção. Paralelamente, o rendimento em biomassa formada em relação aos substratos nutritivos introduzidos, nomeadamente em relação as fontes de carbono e de azoto, diminui progressivamente . A requerente verificou igualmente que microrganismos obtidos com esse processo em cargas descontínuas apresentavam uma actividade celular especifica e uma produtividade celular insuficientes e não controláveis, isto ê, de uma cultura de uma carga para a outra, os microrganismos obtidos podem apresentar uma actividade celular específica e uma produtividade celular diferente. Entende-se por "actividade celular específica" a expressão da capacidade de uma quantidade dada de microrgani^ mos para executar a função que se pretende. A produtividade celular é igual à actividade celular específica multiplicada pela concentração bacteriana e dividida pelo tempo de fermen tação. Assim, a actividade celular específica e a produtividade celular são próprios de cada tipo de microrganismos. A actividade celular específica e a produtividade celular só são pois comparáveis no caso de um microrganismo de um certo tipo com outro microrganismo do mesmo tipo. A deter minação da actividade celular e da produtividade celular de um microrganismo só se pode fazer, portanto, de acordo com um método estabelecido próprio para cada tipo de microrganismo.

As técnicas que permitem determinar a actividade celu lar específica e a produtividade celular de um microrganismo dado são geralmente bem conhecidas dos especialistas na matéria. No entanto, no caso de um microrganismo para o qual esses métodos não foram ainda estabelecidos, é possível a qualquer especialista na matéria estabelecer um tal método. Um exemplo da determinação da actividade celular especifica e da produtividade celular é descrito mais adiante na presente memória descritiva relativamente a bactérias lácticas. A fim de evitar os inconvenientes da cultura em car-gas descontínuas, foi proposto preparar microrganismos em con tínuo, isto é, por alimentação regular dos substratos nutriti vos paralelamente à eliminação dos inibidores do meio de fermentação. A eliminação dos inibidores realiza-se de acordo com diferentes meios, por exemplo por diálise ou por ultra-filtração. A patente de invenção europeia Nõ 65 895 descreve um processo de produção de microrganismos com recilagem total da biomassa, em que se utiliza a eliminação dos inibidores do crescimento por ultrafiltração.

No entanto, um tal processo, se permite atingir fortes concentrações de microrganismos, apresenta alguns inconvenientes .

Assim, o aumento da biomassa no fermentador torna a condução do processo delicada, nomeadamente devido ao facto de a viscosidade do meio aumentar fortemente. A requerente verificou igualmente que um processo de reciclagem total da biomassa não permite a obtenção de micror ganismos cuja actividade celular específica e cuja produtividade celular fossem melhoradas ou controláveis. A fim de evitar os inconvenientes da técnica anterior, a requerente estabeleceu um processo de fabricação de microrga nismos que constitui um primeiro objecto da presente invenção. Este processo permite, nomeadamente, melhorar o rendimento de biomassa em relação aos substratos nutritivos e, nomeadamente, em relação às fontes de carbono e de azoto que constituem o meio de cultura utilizado. Permite igualmente uma condução do sistema simplificada. No entanto, permite sobretudo obter microrganismos cuja actividade celular específica e produtividade celular são não só melhoradas, mas principalmente controladas, isto i, podem fabricar-se microroganismos cuja actividade celular específica e cuja produtividade celular podem ser determinadas previamente e mantidas constantes de um processo de fabricação para outro. Um tal processo permite então ao utild. zador dos microrganismos fabricados prever a dose necessária f -4_

de dez microrganismos tendo em vista as suas aplicações ulteriores. 0 processo de acordo com a presente invenção pode ser aplicado, em particular, à fabricação de bactérias lácticas.

Um outro objecto da presente invenção consiste em nd crorganismos cuja actividade celular específica e cuja produ tividade celular são melhoradas. Estes microrganismos podem ser, noemadamente, bactérias lácticas. A presente invenção refere-se, portanto, a um processo de fabricação de microrganismos produtores do seu próprio inibidor de crescimento, de acordo com o qual se faz fermentar um meio de cultura pelos mencionados microrganismos de ma neira a obter-se um meio de fermentação, se separa por um pro cesso físico de separação pelo menos uma parte do citado inibidor do meio de fermentação e se recicla a massa retida, sen do o referido processo caracterizado pelo facto de, quando a taxa de crescimento dos mencionados microrganismos atingir um valor igual ao valor de uma determinada taxa de crescimento , medida em regime permanente, que corresponde a uma actividade celular específica dos microrganismos que foi previamente determinada, se purgar o meio de fermentação usando uma taxa de purga superior ou igual à referida taxa de crescimento.

As outras características e vantagens da invenção se rão pormenorizadas mais adiante.

Os desenhos são em seguida comentados resumidamente. - A Figura 1 representa uma vista esquemática de uma instalação de fabricação de bactérias lácticas de acordo com o processo da presente invenção. - A Figura 2 representa um diagrama que mostra a rela ção entre a actividade celular específica de uma estirpe de

Streptococcus cremoris e a sua taxa de crescimento. - A Figura 3 é um diagrama que representa a concentra ção em ácido láctico em função da condutividade medida. - A Figura 4 representa o rendimento da biomassa de uma estirpe de Streptococcus cremoris em relação ao açúcar do meio de cultura, em função da taxa de purga. A estirpe de Streptococcus cremoris de partida que serviu para a elaboração das Figuras 2 a 4 i uma estirpe con servada na colecção de estirpes da Sociedade Lacto Labo sob o nome de código de Sc 301. Esta estirpe é comercializada pela firma Lacto Labo sob a forma de uma levedura denominada SM 259. A taxa de crescimento que indica a taxa de purga a utilizar no quadro da presente invenção é portanto fixada em relação a uma actividade celular específica previamente deter minada. A requerente verificou que, de uma maneira surpreen dente, a actividade celular específica de microrganismos esta va ligada com a sua taxa de crescimento. A Figura 2 mostra esta relação no caso da mencionada estirpe de Streptococcus cremoris da firma Lacto Labo.

Paralelamente, a requerente verificou que, purgando o meio de fermentação de acordo com a presente invenção, era possível imprimir ao microrganismo uma actividade celular específica escolhida pelo fabricante. Por este motivo, para fabricar microrganismos que têm uma intensa actividade celular especifica, podendo esta última ser controlada, basta pur gar o meio de fermentação de acordo com uma taxa de purga superior ou igual a taxa de purga que corresponde à actividade celular específica previamente determinada e pretendida dos

citados microrganismos. 0 regime permanente ê obtido quando a concentração em biomassa, em substratos nutritivos e em produtos inibido-res presentes no meio de fermentação é sensivelmente constan te. A actividade celular específica de um dado tipo de mi crorganismo é própria desse mesmo tipo. Por este motivo, é conveniente para cada tipo de microrganismo determinar a rela çao existente entre a sua actividade celular específica e a sua taxa de crescimento medida em regime permanente. Esta de terminação pode fazer-se por qualquer meio. No entanto, um meio simples consiste em fermentar um meio de cultura por intermédio de um microrganismo, num quimiostato, isto é, um fer mentador de volume V, alimentado continuamente com meio de cul tura segundo um débito Q e de que se retira continuamente do meio de fermentação o mesmo débito Q. 0 referido débito Q ê, em condições de regime permanente, directamente proporcional as taxas de crescimento ji de acordo com a fórmula ji = Q/V.

Fazendo variar o débito Q, podem fixar-se, portanto, diferentes taxas de crescimento.

De cada vez que se faz variar o débito Q, e depois de se ter atingido o regime permanente, retiram-se amostras dos microrganismos obtidos dos quais se mede a actividade celular específica. Assim, por cada tipo de microrganismo que se quer fabricar, obtém-se a relação entre a taxa de crescimento e a sua actividade celular específica. A Figura 2 representa a actividade celular específica, expressa em g 1 , da referida estirpe de Streptococcus cremoris em função da sua taxa de crescimento. 7- 7-

A determinação da actividade celular específica de um microrganismo faz-se de acordo com um método que é préprio do mencionado microrganismo. A título de exemplo, descreve-se um método de determinação de actividade celular específica das bactérias lácticas. Este método consiste em, num primeiro tem po, determinar um certo volume, V , de meio de fermentação no qual é fabricado o microrganismo; o referido volume, V , é necessário para produzir 75° dornic em 10 ml de leite com 10% de extracto seco, durante quinze horas a 21°C. Um grau dornic é definido como sendo igual a 0,1 grama de ácido láctico por litro de leite. O volume Vq corresponde a uma unidade de actividade (UA) .

Determina-se seguidamente o número de unidades de actividade por litro do meio de fermentação.

Pode então determinar-se a actividade celular específica como sendo o número de unidades de actividade por litro de meio de fermentação dividido pela concentração bacteriana do meio de fermentação. A actividade celular específica é expressa em UA/g.

Quando se purga o meio de fermentação, é evidente que se retira para fora do dispositivo de fermentação uma parte do meio de fermentação, isto é, os substratos nutritivos em solução aquosa que formam o meio de cultura, assim como os mi crorganismos que nele estão contidos. A taxa cfe purga, expressa em h *", é igual ao quociente entre o débito ao qual se purga o meio de fermentação e o volume do meio de fermentação. ' No quadro da presente invenção, basta que a taxa de purga seja superior ou igual à taxa de crescimento previamen- 8-

te detrminada dos microrganismos. No entanto, o valor máximo da taxa de purga deve, de preferência, ser inferior â ta-

xa de crescimento máxima teórica, max, dos microrganismos que se pretendem fabricar, de maneira a evitar ter de se "lavar" o dispositivo que contém o meio de fermentação. Vantajosamente, a taxa de purga é escolhida de maneira a ter um valor compreendido entre 10 e 80% da taxa de crescimento máximo teórico, de preferência entre 15 e 50% da taxa de crescimento máxima teórica dos microrganismos a fabricar. A taxa de cres cimento máxima teórica pode ser determinada para cada tipo de microrganismo de acordo com um método clássico conhecido dos especialistas na matéria.

Pode acontecer que, com certos microrganismos cultiva dos num reactor e em condições particulares, a taxa de cresci mento máxima teórica não possa ser atingida. Neste caso, a taxa de purga deve ser escolhida de maneira a ter um valor compreendido entre 15 e 80% da taxa de crescimento máxima experimental, mais preferivelmente entre 20 e 50% da taxa de cres^ cimento máxima experimental. A taxa de crescimento máxima ex perimental i a taxa de crescimento máxima que os referidos mi crorganismos podem atingir com as condições experimentais escolhidas. Uma tal taxa de crescimento máxima pode ser defini da por métodos clássicos que são conhecidos dos especialistas na matéria.

De uma maneira vantajosa, apenas se purga o meio de fermentação de acordo com a presente invenção quando se atinge a taxa de crescimento predeterminada, sendo a taxa de cres^ cimento determinada pela medição contínua da concentração de inibidores. Esta medição pode fazer-se, por exemplo, de acor do com o método descrito mais adiante na presente memória des-

critiva no caso particular das bactérias lácticas.

No decurso da realização do processo de fabricação de acordo com a presente invenção, mantém-se geralmente constante o volume do meio de fermentação por adição de meio de cultura. Geralmente, o pH do meio de fermentação ê mantido igual a um valor compreendido entre 5 e 8. 0 pH pode ser mantido igual a um valor pretendido por meio da adição de uma base, em particular de uma base mineral. A base mineral utilizada pode ser soda cáustica, potassa cáustica, amoníaco gasoso ou uma solução aquosa de amoníaco. 0 amo nlaco gasoso e o amoníaco em solução aquosa são os preferidos. 0 amoníaco gasoso é preferido de maneira particular.

De acordo com uma maneira de proceder vantajosa, antes de se proceder ã purga do meio de fermentação do acordo com a presente invenção, pode fermentar-se o meio de cultura pelos microrganismos a fabricar em cargas descontínuas. Desta mane_i ra, é possível atingir mais rapidamente a taxa de crescimento que corresponde à da actividade celular específica predeterminada.

Além disso, e eventualmente, depois de se ter fermenta do o meio de cultura em descontínuo, pode jã separar-se por um prcesso físico de separação pelo menos uma parte do mencionado inibidor de crescimento do meio de fermentação antes de se pur gar este último. Esta separação pode também, no caso em que o inibidor está demasiadamente concentrado no meio de fermentação, permitir atingir mais rapidamente e com maior segurança a taxa de crescimento que corresponde ã da actividade celular predeterminada.

No quadro da presente invenção, o referido processo fí sico de separação pode consistir, nomeadamente, numa ultra-filtração, uma decantação, uma centrifugação ou uma diálise.

No entanto, prefere-se empregar a ultrafiltração. Esta pode realizar-se utilizando uma ou várias células de ultrafiltração dispostas em paralelo. Qualquer que seja o processo de separação utilizado, entende-se por "produto retido" no quadro da presente invenção a fracção do meio de fermentação re ciciada. Entende-se por "material permeado" a fracção do meio de fermentação que, no decurso do processo físico de separação não é reciclada e que está isenta ou quase totalmente isenta de microrganismos ou de resíduos microbianos. A separação do inibidor de crescimento faz-se de acor do com uma taxa de diluição D.

Quando se realiza na prática este processo físico de separação, pode purgar-se o meio de fermentação de acordo com a presente invenção em contínuo desde que a concentração do injl bidor de crescimento no referido meio de fermentação seja sensivelmente constante. Geralmente, atinge-se uma tal concentra ção constante depois de três tempos de residência líquida , mais geralmente entre três e dez tempos de residência líquida. 0 tempo de residência liquida é expresso em horas e correspon de ao inverso da taxa de diluição D. 0 processo de acordo com a presente invenção pode ser aplicado a todos os microrganismos que produzam o seu próprio inibidor de crescimento.

Em particular podem citar-se os microrganismos cujo in^L bidor de crescimento ê constituído por um produto como ácido propiónico nomeadamente produzido por propionibactérias, ácido acético obtido por exemplo por acetobactérias e ainda outros ácidos orgânicos, como os ácidos láctico, cítrico, itacõnico, butírico ou álcoois como o etanol. 0 processo de acordo com a presente invenção aplica--se de maneira particular à fabricação de bactérias lácticas.

As bactérias lácticas formam um grupo de bactérias gram positivas não taxonómico, que não formam esporos e que podem fermentar glúcidos solúveis em água para produzir ácido láctico como produto final, de maneira preponderante. Estas bactérias são utilizáveis, nomeadamente, nas indústrias do leite, do queijo, da salga, como probiótico, isto é, como auxílio da manutenção e do enriquecimento da flora intestinal humana ou animal como agente de ensilagem. Estas bactérias pertencem mais particularmente aos géneros Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostococcus e Pediococcus. As bactérias lácticas pertencentes ao género Streptococcus são as preferidas. A taxonomia destes microrganismos foi descrita em "Ber-gey's Manual of Systematic Bacteriology" (Sneath e col., 1986). 0 processo de fabricação de bactérias lácticas de acor do com a presente invenção pode realizar-se num dispositivo como o que se representa na Figura 1. Evidentemente, este dispositivo pode ser utilizado na fermentação de outros micror ganismos.

Este dispositivo compreende um fermentador 1 que contém o meio de fermentação 2, e está ligado: - a um reservatório 3 de fonte carbonaca em solução aquosa, por meio de uma canalização 4, equipada com uma bomba de ali. mentação 5; - a um reservatório 6 de fonte azotada em solução aquosa, por -12

meio de uma canalização 7, equipada com uma bomba de alimen tação 8; - a um reservatório de amoníaco (não representado) por meio de uma tubagem 9; - a uma tubagem de purga 10, dotada de uma bomba de purga 11 e de uma válvula 12; - a uma célula de ultrafiltração 18 através da canalização 14, equipada com uma bomba de recirculação 15, um manómetro 16 e uma válvula 17. A célula de ultrafiltração possui um lado de jusante 18 e um lado de montante 19. O fermentador 1 compreende igualmente: - um dispositivo de adição do nível 20, ligado ã bomba de ali mentação 5 e ã bomba de alimentação 8 por meio de dois dispositivos eléctricos, respectivamente, 21 e 22; - um tubo de amostragem 23, dotado de uma válvula 24; - a um dispositivo de medição do pH 25 do meio de fermentação. O lado de montante 19 da célula de ultrafiltração 13 está ligado ao fermentador por meio de uma tubagem 26 equipada com uma válvula 27, um manómetro 28 e um permutador de calor 29. O lado de jusante 18 da célula ultrafiltração 13 é do tado de uma conduta de 30 equipada com uma sonda condutimêtri ca 31. Depois da sonda condutimêtrica 31, a conduta 30 divide-se em duas tubagens 32 e 33. A tubagem 32 está equipada com uma válvula 34 e é ligada ao fermentador 1. A conduta 33 está equipada com uma válvula 35 e com uma bomba 36. 0 modo de funcionamento do dispositivo que acaba de ser descrito é o seguinte:

No inicio de uma operação de fabricação de bactérias lácticas, introduz-se no fermentador 1 um volume de meio de cultura constituído, por uma parte, pela fonte carbonada em solução aquosa proveniente do reservatório 3 e, por outra par te, pela fonte azotada em solução aquosa proveniente do reser vatório 6 e depois um inoculo da bactéria láctica a fabricar. No presente caso, a fonte carbonada e a fonte azotada estão contidas em reservatórios diferentes, o que, nomeadamente , tem a vantagem de facilitar a esterilização das referidas fon tes. No entanto, pode utilizar-se um único reservatório contendo simultaneamente a fonte carbonada e a fonte azotada em solução aquosa. Geralmente, procede-se de maneira tal que a concentração da fonte carbonada no fermentador esteja compre endida entre 10 e 150 gramas/litro, de preferência entre 35 e 80 g/1 e a concentração da fonte azotada esteja compreendida entre 1 e 50 g/1, de preferência entre 5 e 25 g/1.

Além da fonte carbonada e da fonte azotada, pode igual mente introduzir-se os sais minerais necessários ao crescimen to de certos microrganismos.

Estes sais podem ser introduzidos no fermentador de tal maneira que a sua concentração fique compreendida entre 0,001 e 1 grama/litro, de preferência entre 0,01 e 0,5 grama/ /litro. Os sais minerais podem provir tanto do reservatório da fonte carbonada 3 como do reservatório da fonte azotada 6. A titulo de exemplo de fontes carbonadas, podem citar--se os hidratos de carbono, tais como glucose, galactose, fru-tose, lactose, maltose, sacarose, amido e os hidrolisados de -14- -14-

amido. A título de exemplo de fontes azotadas, podem utilizar-se fontes azotadas orgânicas e/ou minerais. Entre as fon tes azotadas orgânicas, podem citar-se, nomeadamente, as pro teinas e os hidrolisados de proteínas, tais como peptonas, triptonas, gelatina, caseína e caseinatos, farinhas animais e vegetais, tais como farrinhas de milho, de soja, de trigo, de trigo, o líquido de infusão de cereais corn step liquor), pasta de tomate, extractos de levedura. Como fontes azotadas minerais, podem citar-se nitrato de amónio, nitratos de metais alcalinos, cloreto de amónio, carbonatos de monoamónio e de diamónio, sulfatos de monoamónio e de diamónio e os fos-fatos de monoamónio e de diamónio. A título de exemplo de sais minerais, podem citar-se os sulfatos e os fosfatos de metais alcalinos ou alcalino-ter rosos, tais como sulfato de magnésio. As concentrações e os diferentes compostos indicados antes são utilizáveis para a fabricação de bactérias lácticas, mas de uma maneira geral, são igualmente valiosos para a fabricação de outras bactérias ou mesmo de outros microrganismos.

As fontes carbonadas e azotadas em solução aquosa são introduzidas no fermentador 1 através das tubagens 4 e 7, sob a acção das bombas de alimentação 5 e 8. Estas últimas estão ligadas ao dispositivo de medição de nível 20 por dispositivos eléctricos 21 e 22, respectivamente, de tal maneira que as referidas bombas são accionadas de modo a manter constante o volume do meio de fermentação contido no fermentador 1.

Os débitos das bombas de alimentação 5 e 8 são regulados de maneira tal que as concentrações em substratos nutriti- -15-

vos dentro do fermentador 1 se mantenham constantes. A temperatura do meio de fermentação é regulada por meio de um dispositivo clássico, não represetado na Figura 1. A citada temperatura pode estar compreendida entre 25 e 32°C de preferência entre 26 e 28°C. A pressão dentro do fermentador não ê crítica mas i geralmente escolhida de maneira convencional, isto é, compreendida entre 10^ e 5.10^ pa.

Por meio da tubagem 9, introduz-se no fermentador 1 amoníaco gasoso que se faz borbulhar no meio de fermentação. 0 amoníaco gasoso permite conservar o pH do meio de fermentação igual ao valor pretendido. Geralmente, este valor está compreendido entre 6 e 8, de preferência entre 6,3 e 7,5. O valor do pH é controlado por meio de um dispositivo de medição do pH 25. Eventualmente, este dispositivo pode ser ligado ao reservatório do amoníaco gasoso de maneira a comandar automaticamente a alimentação do amoníaco gasoso ao meio de fermentação em função das necessidades de regulação do pH.

Num primeiro tempo, pode escolher-se cultivar a bacté ria láctica em descontínuo. Para esse efeito, fecham-se as válvulas 12 e 35; as válvulas 17, 27 e 34 ficam abertas.

Depois de efectuada a cultura em carga descontínua , pode ser vantajoso, num segundo tempo, eliminar pelo menos par te do lactato de amónio formado. Com efeito, o lactato de amó nio pode impedir que a taxa de crescimento atinja o valor pretendido e predeterminado. Para efectuar isto, fecham-se as válvulas 12 e 34 e abrem-se as válvulas 17, 27 e 35. 0 débito de meio de fermentação 2 que sai do fermentador 1 é regulado por meio da bomba 15. -16

0 meio de fermentação atinge a célula de ultrafiltra ção 13 do lado de montante 19. O produto retido é reciclado para o fermentador 1 através da tubagem 26. 0 permeado, cons_ tituido principalmente por uma solução aquosa de lactato de amónio, passa para o lado de jusante 18 e depois para a conduta 30 e, por fim, para a conduta 33, depois do que é eliminado. A bomba 36 é regulada de maneira a assegurar uma taxa de diluição D para permitir um aumento da taxa de crescimento até ao mencionado valor predeterminado. Nesta fase, a taxa de diluição D, expressa em h \ é igual ao débito do permeado dividido pelo volume reaccional.

Quando a taxa de crescimetno das bactérias lácticas atinge o valor pretendido, pode começar a purgar-se o meio de fermentação a uma taxa superior ou igual à citada taxa de cre£ cimento. Para tanto, abre-se a válvula 12 e regula-se o débito da bomba 11. 0 meio de fermentação purgado sai pela conduta 10. Ã saida desta conduta, trata-se o referido meio de fermen tação purgado de maneira a recuperar os microrganismos. Este tratamento pode consistir, por exemplo, em congelação ou liofi lização.

Durante o processo de fabricação das bactérias lácticas tal como se acaba de descrever, pode avaliar-se permanentemente a taxa de crescimento dos microrganismos de maneira simples por determinação da concentração do lactato de amónio existente no permeato. Com efeito, a taxa de crescimento, ji , está geralmente ligada com a concentração de lactato de amónio, p, de acordo com a seguinte fórmula conhecida:

ji = ji max (1 - p)n PI -17- -17-

na qual o símbolo ju max representa a taxa de crescimento máxima das bactérias lácticas na ausência de qualquer inibi-dor externo no meio de fermentação; e o símbolo pl representa a concentração limite de ácido láctico, isto é, a concen tração mínima em ácido láctico ã qual a taxa de crescimento das bactérias lácticas é nula para uma dada composição do meio de cultura; e o símbolo n representa um número real dependen te da estirpe microbiana empregada. Os valores àe jx max, pl e n são determinados de maneira conhecida pelos especialistas na matéria para cada tipo de microrganismo. A concentração de lactato de amónio p é conhecida per manentemente graças à sonda condutimétrica 31, que indica o valor desta concentração no permeato.

Mutio embora a utilização de uma tal sonda condutimétrica seja vantajosa, ê igualmente possível medir a concentra ção do lactato de amónio por qualquer outro meio apropriado para tal efeito. A medição da concentração do lactato de amónio por meio da mencionada sonda condutimétrica baseia-se na medição da condutividade do lactato de amónio. Com efeito, de maneira surpreendente, verificou-se que, por um lado, a concen tração em lactato de amónio é proporcional à condutividade do permeato e, por outro lado, que esta determinação não é entra vada por outras substâncias orgânicas presentes no permeato. A Figura 3 representa uma curva que mostra a relação entre a concentração do lactato de amónio e a condutividade . Esta medida pode efectuar-se em sais de ácidos orgânicos, produzidos por fermentação, além do lactato de amónio.

Os microrganismos obtidos de acordo com a presente invenção possuem uma actividade celular específica e uma produtividade -18-?* -18-?*

celular melhorada em relação ãs dos mesmos microrganismos obtidos de acordo com os processos da técnica anterior. 0 processo de acordo com a presente invenção permite também obter microrganismos cuja actividade celular específi_ ca e cuja produtividade celular são controláveis. Com efeito, de uma fabricação para outra, basta repetir os diferentes parâmetros, essencialmente a taxa de purga, para fabricar os microrganismos cujas propriedades são muito próximas ou mesmo iguais.

Por outro lado,verificou-se que o facto de se purgar o meio de fermentação nas condições de acordo com a presente invenção permite aumentar o rendimento em biomassa formada em relação à fonte carbonada empregada. A presente invenção refere-se igualmente a microrganismos susceptíveis de serem obtidos de acordo com o processo descrito antes.

Os citados microrganismos podem, em particular, ser bactérias lácticas, de preferência bactérias lácticas pertencentes ao género Streptococcus.

As condições de realização do processo preferenciais que permitem caracterizar os microrganismos, segundo objecto da presente invenção, são as mesmas que as do processo descri to antes, primeiro objecto da presente invenção.

Geralmente, os microrganismos, em particular as bacté rias lácticas, de acordo com a presente invenção, têm uma acti vidade celular específica de 20%, mais geralmente 50 a 100% su perior à actividade celular específica dos microrganismos da técnica anterior do mesmo tipo, mas fabricados de acordo com os processos da técnica anterior. i:

Finalmente, a invenção refere-se a bactérias lácticas, de preferência do género Streptococcus, cuja produtividade ce lular ê maior do que 13 UA/l/h, estando geralmente compreendi^ da entre 15 e 30 UA/l/h.

Os Exemplos seguintes têm como finalidade ilustrar a presente invenção.

EXEMPLOS

Os Exemplos que se descrevem em seguida realizaram--se a partir de uma estirpe de Streptococcus cremoris da fir ma Lacto Labo, estirpe cujo nome de código é Sc 301 e comercializada por esta mesma firma sob a forma de um fermento de nominado SM 259. Originalmente, esta estirpe, fabricada de acordo com um processo clássico, possui uma produtividade celular máxima de 13 UA/l/h. A fermentação efectua-se num dispositivo como o que se re presenta na Figura 1. 0 fermentador 1 tem um volume útil de dois litros. Acé lula de ultrafiltração é constituída por membranas cuja super fície membranaria e igual a 0,1 m . A bomba 15 permite garan tir a velocidade linear do meio de fermentação igual a 5 m/s. A homogeneidade do meio de fermentação é assegurada pela res-pectiva recirculação. Introduzem-se no dispositivo de fermen tação 1,3 litros de meio de cultura em solução aquosa que compreende: - lactose: 68 g/1, extracto de levedura : 5 g/1 - triptona : 7 g/1 - MgS04.7H20 : 0,2 g/1. -2 A lactose e o MgSO^^I^O provêm do reservatório da fonte carbonada 3; o extracto de levedura e a triptona provêm do reservatório de fonte azotada 6.

No decurso da fermentação, o pH é mantido constante o 5 xgual a 6,3, a temperatura a 27 C e a pressão a 10 pa. A produtividade celular é calculada multiplicando a actividade celular específica pela concentração de bactérias e dividindo pelo tempo de fermentação. A actividade celular específica é determinada de acordo com o método descrito antes . A relação teórica que liga a taxa de crescimento das referidas bactérias lácticas com a concentração de lactato de amónio é a seguinte (sendo 0,9 a taxa de crescimento máxima teórica): ji = 0,9 (1 - P/44)

No entanto, nas condições práticas de realização dej3 critas antes, foi possível determinar que a taxa de crescimen to máxima experimental não é de 0,9 mas sim de 0,45.

Exemplo 1 (não de acordo com a presente invenção)

Introduzem-se no dispositivo 3 litros de meio de cultu ra dos quais 1,5 litros são provenientes do reservatório 3 e 1,5 litros do reservatório 6. Semeia-se o meio de cultura com 0,05 grama da referida estirpe de Streptococcus cremoris.

Primeiramente, realiza-se a fermentação em descontínuo. Fecham-se portanto as válvulas 12 e 35 e abrem-se as válvulas 17, 27 e 34. O permeato ê totalmente reciclado para o fermentador

1 depois de passar através da célula de ultrafiltração 13 e da sonda condutimitrica 31.0 sinal condutimétrico fornece permanen temente a concentração em lactato de amónio presente no meio de fermentação.

Quando a concentração em lactato de amónio atinge 30 g/1, a concentração bacteriana está compreendida entre 3 e 6 g/1. Abre-se a válvula 35, fecha-se a válvula 34 e regula- -se o débito da bomba 36 de maneira a garantir uma taxa de di -1 luiçao D igual a 0,6 h . Paralelamente, introduz-se no fer-mentador meio de cultura proveniente dos reservatórios 3 e 6 a fim de manter constante o volume do meio de fermentação. Dezassete horas depois de se abrir a válvula 35, a concentração bacteriana é igual a 38 g/1. A concentração de lactato de amónio é igual a 40 g/1 e a taxa de crescimento das bactérias -1 é igual a 0,08 h . Abre-se então a válvula 12 e regula-se a bomba de purga 11 de tal maneira que se garanta uma taxa de purga igual a 0,054 h ; quarenta horas depois de iniciada a purga, a concentração bacteriana é de 26 g/1 e a do lactato de amónio ê de 40,7 g/1. A produtividade celular dos microrganismos assim fabricados é igual a 11 UA/l/h.

Exemplo 2 (de acordo com a invenção)

Prossegue-se a fabricação do Exemplo 1, mas diminuindo a concentração do lactato até 22 g/1. Para este efeito, regula-se a taxa de diluição D de maneira a ser igual a 1,15 h Adopta-se então uma taxa de purga igual a 0,1 h O volume do meio de fermentação é sempre mantido constante por compensação com meio de cultura proveniente dos reservatórios 0 regime permanente mantido durante vinte e quatro horas permite conseguir uma concentração bacteriana igual a 21,7 g/1 e uma concentração de lactato de amónio igual a 25,5 g/1. A produtividade celular dos microrganismos obtidos é igual a 20 UA/l/h.

Exemplo 3 (de acordo com a invenção)

Prossegue-se a experiência do Exemplo 2 ajustando a taxa de diluição D de maneira a ser igual a 0,60 h ^ e a taxa de purga igual a 0,19 h Quando se atinge o regime permanen te, as concentrações bacterianas e de lactato de amónio são respectivamente de 11,5 g/1 e 31 g/1. A produtividade celular é igual a 26 UA/l/h.

Exemplo 4 (não de acordo com a presente invenção)

Este Exemplo refere-se à fabricação de bactérias lácti_ cas de acordo com um processo descontínuo.

As condições de realização desta fabricação são as mejs mas que se descreveram para a cultura num processo descontínuo realizado no Exemplo 1. Depois de catorze horas de fermentação, obtém-se uma concentração bacteriana de 5 g/1. A produtividade celular dos microrganismos assim fabri cados é igual a 13 UA/l/h.

Exemplo 5 (não de acordo com a presente invenção)

Este Exemplo refere-se à fabricação de bactérias lácti. A-!!- cas de acordo com um processo com reciclagem total da biomas^ sa, empregando a eliminação dos inibidores de crescimento por meio de ultrafiltração. As condições de realização desta fabricação são as mesmas que se descreveram no Exemplo 1, antes da realização da purga, com a diferença de a taxa de diluição D ser igual a 0,5 h

Depois de noventa horas de cultura, recolhem-se os microrganismos cuja concentração no reactor é igual a 75 g/1 e cuja produtividade celular é igual a 10 UA/l/h.

Claims

1

REIVINDICAÇÕES 1. - Processo de fabricação de microrganismos que pro duzem o seu próprio inibidor de crescimento, segundo o qual se faz fermentar um meio de cultura pelos referidos microrganismos de maneira a obter-se um meio de fermentação, se separa por um processo físico de separação pelo menos uma parte do mencionado meio de fermentação e se recircula o produto retido, caracteriza^ do pelo facto de, guando a taxa de crescimento dos citados microrganismos atinge um valor igual ao valor de uma taxa de cres_ cimento medida em regime permanente, correspondente a uma acti-vidade celular específica dos microrganismos que foi previamente determinada, se purgar o meio de fermentação segundo uma taxa de purga maior ou igual à referida taxa de crescimento.

2. - Processo de fabricação de microrganismos que pro 2

duzem o seu próprio inibidor de crescimento, segundo o qual se faz fermentar um meio de cultura pelos mencionados microrganijs mos de maneira a obter-se um meio de fermentação, se separa por um processo físico de separação pelo menos uma parte do citado inibidor do meio de fermentação e se recircula o produto retido, caracterizado pelo facto de se purgar o meio de fermentação de acordo com uma taxa de purga inferior â taxa de crescimento máxima teórica dos referidos microrganismos que, de preferência, está compreendida entre'10 e 80%, mais preferencialmente entre 15 e 50% da mencionada taxa de crescimento máxima teórica.

3. - Processo de fabricação de micorganismos que pr£ duzem o seu próprio inibidor de crescimento, segundo o qual se faz fermentar um meio de cultura pelos mencionados microrganismos de maneira a obter-se um meio de fermentação, se separa por um processo físico de separação pelo menos uma parte do citado inibidor do meio de fermentação e se recircula o produto retido, caracterizado pelo facto de se purgar o meio de fermentação de acordo com uma taxa de purga inferior a taxa de crescimento máxi_ ma experimental dos referidos microrganismos, estando a taxa de purga compreendida entre 15 e 80%, mais preferencialmente entre 20 e 50% da mencionada taxa de crescimento máxima experimental.

4. - Processo de acordo com a reivindicação 1, carajc terizado pelo facto de se purgar o meio de fermentação apenas

quando se atinge a citada taxa de crescimento pré-determinada.

5. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo facto de, antes de se proceder à purga, se fermentar o meio de cultura pelos microrganismos a fabricar, em cargas descontínuas.

6. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo facto de, antes de se purgar o meio de fermentação, se separar por um processo físico de sepa ração pelo menos uma parte do referido inibidor de crescimento do meio de fermentação.

7. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo facto de o mencionado processo físico de separação consistir numa ultrafiltração, uma centri^ fugação, uma decantação ou uma diãlise, sendo a ultrafiltração a preferida.

8,- Processo de acordo com uma qualquer das reiviri dicações 6 e 7, caracterizado pelo facto de se purgar o meio de fermentação em contínuo a partir do momento em que a concentração em inibidor de crescimento no meio de fermentação é sensivelmente constante.

9.- Processo de acordo com uma qualquer das reivin- 4

dicações 1 a 8, caracterizado pelo facto de se manter o pH do meio de fermentação igual a um valor compreendido entre 5 e 8, de preferência entre 6 e 8.

10. - Processo de acordo com uma qualquer das reivin dicações 1 a 9, caracterizado pelo facto de os referidos microrganismos serem bactérias lácticas.

11. - Processo de acordo com a reivindicação 10, ca racterizado pelo facto de as mencionadas bactérias lácticas pertencerem ao género Streptococcus.

12. - Microrganismos obtidos pelo processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 11, caracterizados pelo facto de a sua actividade celular específica ser 20%, mais geralmente 50 a 100% superior em relação à actividade específica de microrga nismos do mesmo tipo obtidos de acordo com um processo da técnica anterior.

13.- Bactérias lácticas, caracterizadas pelo facto de a sua produtividade celular ser maior do que 13 UA/l/h e de preferência compreendida entre 15 e 30 UA/l/h.

14.- Bactérias lácticas de acordo com a reivindicação 13, caracterizadas pelo facto de pertencerem ao género Streptococcus. O Agente OFiciol da Propriedade 'ndasfrjíSÍ