PT97165A - Processo para da proteina de ligacao de adn rs1 e de polipeptideos semelhantes a rs1 com actividade biologica de proteina rs1 - Google Patents

Description

Descrição referente à patente de invenção de BEHRINGWERKE AKTIENGESELLS- OHAFT, alemã, industrial e comercial t com sede em D-3550 Marburg, República Federal Alemã, (inventores: Dr. Felix Hoppe-Seyler, Lorenz Hirt, Karin But2, Dr. Dusan Bartsch, Tobias Beuknecht e Dr. Hans-D. Royer, residentes na República Federal Alemã) , para ‘•PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DA PROTEÍNA DE LIGAÇÃO DE ADR RSl E DE P0-LIPEPTÍDEOS SEMELHARES A RSl OOM ACTIYIDADE BIOLOGICA DE PROTEÍNA RSl"

DESORIQÂO A presente invenção refere-se a sequências de ADN que codificam para uma proteína de ligação de ADN (proteína RSl) bem como a uma nova proteína de ligação ADN (proteína RSl) que foi isolada a partir de queratinócitos primários humanos com o auxílio de técnicas de ADN recombinan te. A presente invenção refere-se ainda a moléculas de ADN recombinante para utilização na preparação da proteína RSl ou de proteínas semelhantes a RSl com a activi-dade biológica da proteína RSl bem como a organismos hospedeiros , como bactérias, fungos ou células de mamífero * que tenham sido transformados com estas moléculas de ADN recombinante. - 1 -

A presente invenção refere-se finalmente a composições farmacêuticas que contêm a proteína ESI ou proteínas semelhantes a ESI e dotadas da actividade da proteína ESI.

Os vírus do papiloma são pequenQs vírus de ADN de cadeia dupla e são responsáveis por lesões benignas da pele e das mucosas apiteliais. Para além disso, no entanto, pensa-se que existe uma ligação entre a ocorrência de determinados tipos de vírus do papiloma humano (HPV) e o cancro anogenital (lhe papovaviridae, Vol. 2, Plenum Publishing Gorp New York, páginas 245-263). Uma indicação importante sobre a ligação entre a formação de cancro e a presença de KPV decorre da constatação de que em mais de 90 % dos tumores cervicais após biopsia se verificou a presença de sequências de ADN do HPV. A maior parte destes tumores contêm ADN do tipo 16 de HPV ou do tipo 18 de HPV. Descobriram-se também sequências de ADN de HPV 18 numa série de células de linlras de células obtidas a partir de tumores cervicais. Tanto em tumores cervi cais como também em linhas de células derivadas destes tumores habitualmente o ADN virai está integrado no genoma do hospedai ro. É também sabido que nestas células tem lugar a transcriçã virai. A investigação de linhas de células tumorais estabelecidas sugeriu a presunção de que as sequências de HPV são as sequências responsáveis pelo desenvolvimento do cancro. Existe também uma forte indicação de que a expressão do quadro de leitura livre (OBP) precoce dos genes E6 e E7 dos tipos 16 e 18 do HPV, que codificam para a actividade de transformação ("transforming activity") , desempenham um papel importante no início e na conservação das células transformadas (Oancer Ees. 48j 3780-3786).

Os elementos reguladores da transcrição encontram-se na região designada por UEE ("upstream regulatory region") do genoma do HPV, a qual se caracteriza também como região não codificadora ("non-coding region") ou como a regiãc - 2 -

de regulação de grande dimensão ("long control region"). Esta região estende-se ao longo de mais de 825 pares de bases desde o fim do quadro de leitura livre tardio (ORP Ll) até ao início do gene precoce activo E6 no ADN de HP7 18. A região UBE do HPV 18 contem um promotor que é activo na maioria das lindas tumorais e que é constituído por pelo menos 5 regiões intensificadoras ("enhancer'1) diferentes (J. Virol. 62: 665-672, 1988). 0 objectivo da presente invenção baseia--se nos seguintes pontos: A regulação de genes virais por meio de proteínas celulares desempanha uma função primordial no desen volvimento de tumores. Â desregulação da expressão dos genes precoces Ξ6 e Ξ7 de KP7 16 e 18 trasformados contribui para o processo de desenvolvimento do cancro nas células transformadas. Até agora, a identificação, o isolamento e a preparação de proteínas que apresentam afinidade de ligação com a região de regulação destes genes precoces representam fases importantes no combate aos referidos tumores. As proteínas que se ligam às regiões de desregulação apresentam por conseguinte um agente possivelmente adequado para a preparação de um agente para o combate ao cancro. A presente invenção tem por consequinte como objectivo a identificação de factores que podem influenciar a regulação e a expressão de ADN virai em células humanas infectadas e a sua preparação em quantidades suficientemente elevadas para que possam ser usados como agentes contra o cancro .

Por sua vez este objectivo é atingido de acordo com a presente invenção por meio da preparação de uma sequência de ADB como a representada na Pigura 8 e na Keivin-dicação 1, que codifica para a proteína RS1 de ligação de ADH 1¾ ínn^v-nrrraRiíisibrfr·»' '· ^ à proteína ESI com a celular ou para um peptídeo semelhante actividade biolégica da proteína ESI.

Por outro lado para atingir o obòectivo apontado foi preparada uma proteína de ligação de ADR (ESI) com a sequência representada na Figura 8 e na Reivindicação 11 que possui a propriedade de se ligar de modo específico à região E2 de 28 pb da região de regulação a montante do HPV 18.

Para além disso a presente invenção abrange sequências de ADN que derivam do genoma dos quera-tinócitos humanos primários e que codificam para a proteína ESI de ligação de ADN celular.

Além do referido são abrangidas sequências de ADN que hibridam com uma das sequências de ADN ante-riormente referidas. Estas sequências de ADR podem naturalmente ser semi-sintêtieas ou sintéticas e relacionam-se com uma das sequências de ADN anteriormente referidas por uma mutação como substituição de nucléótidos, supressão de nucleé-· tidos ou inversão de secções nucleotídicas. Para além disso, estas últimas sequências são caracterizadas por codificarem para um peptídeo semelhante à proteína ESI e dotado da activi·. dade biolégica da proteína ESI.

Uma actividade biológica da proteína ESI é por exemplo a afinidade especial ("high affinity binding”) da proteína ESI para com a sub-região E2 de 28 pb de comprimento da região de regulação a montante do HPV tipos 16 e 18. Oonsideram-se proteínas semelhantes à proteína ESI as proteínas que apresentam como a proteína RS1 uma afinidade para a sub-região E2 do ADR da UEE do HPV tipos 16 e 18.

Para além disso a presente invenção abram ge moléculas de ADN recombinante para a olonagem de vectores, - A - i ΐ em que a sequência de ADN é seleccionada do grupo das sequências de ADH anteriormente referidas, que codifica para a proteína ESI de ligação de ADN celular ou para proteínas semelham tes à proteína ESI.

Estas moléculas de ADN recombinante sao ligadas de modo operativo com uma sequência de regulação da expressão. São preferidas as moléculas de ADE recom·· binante com uma sequência de regulação da expressão seleccio-nadas de entre o sistema de promotores de E. coli, como o sistema Lac de E. coli, o sistema de /%-lactamase de E. coli, o sistema trp de E. coli, o promotor de lipoproteína de E* coli , ou com uma sequência de regulação de expressão em leveduras ou uma outra sequência de regulação da expressão em eucarion-tes.

Para além disso, a presente invenção abr^n ge os organismos hospedeiros transformados com pelo menos uma destas moléculas de ADN recombinante. São preferidos os organismos hospedeiros seleccionados de entre o seguinte grupo: Ξ. coli, outras bacte rias, leveduras, outros fungos, ou células animais ou humanas,

De modo especialmente preferido utiliza--se um bacteriófago lambda gt 11 recombinante. A proteína ESI de ligação de ADN de acordo com a presente invenção possui a propriedade de se ligar de modo específico à região E2 de 28 pb da UEE de HPV tipos 18 a 16. As proteínas de ligação de ADET de acordo com a presente invenção abrangem também proteínas com as propriedades biológicas da proteína ESI, por conseguinte todas as proteínas semelhantes a ESI, que apus sentam igualmente a propriedade de se ligar de modo específico à região E2 de 28 pb da UEE de HPV tipos 18 e 16 ou possuem a - 5 -

~ actividade da proteína RS1, nomeadamente de influenciar a regulação dos genes precoces E6 e E7 do HPY por meio de interaç ção específica com a região E2 da HRR ou com regiões sobrepos_ tas.

As proteínas da presente invenção são codificadas por uma das sequências de ADR de acordo com a presente invenção anteriormente referidas e são preparadas con. o auxilio de tecnologia de ADN recombinante de um modo conheci do em si usando um organismo hospedeiro de acordo com a preser. te invenção.

Nestes processos para a preparação da prc teína ESI ou de polipeptídeos semelhantes a ESI com a activids de biológica da proteína ESI transforma-se um organismo hospedeiro de acordo com a presente invenção com uma molécula de ADN recombinante de acordo com a presente invenção. Oultiva--se o organismo transformado e isola-se a proteína ESI ou o polipeptídeo semelhante a ESI do meio de cultura após expressão .

As proteínas obtidas por meio deste processo são igualmente proteínas da presente invenção.

Em virtude da actividade biológica das proteínas da presente invenção, que permite uma influencia sobre a regulação das células transformadas por EPY no que respeita a expressão viraij estas proteínas são apropriadas para a terapia do cancro. A presente invenção abrange por conseguinte também composições farmacêuticas que contêm a proteína ESI ou polipeptídeos semelhantes a ESI. Estas composições podem ser utilizadas para a terapia do cancro ou de tumores.

Na investigação da identificação e do [ isolamento de proteína de ligação à DER adoptou-se uma estra- - 6 - ^¾¾ tégia que permite isolar os factores codificados por ADNs com plementares (ADRc‘s) em virtude das suas propriedades de ligação específica em relação a sequências de fragmentos de ADET. Este método baseia-se numa alta taxa de expressão da região de ligação a ADN que codifica para o factor de ligação a ADR no bacteriófago lambda gt 11. A interacção deste factor com ο ADET de dupla cadeia marcado por isótopos radioactivos provo ca o aparecimento de um sinal de reconhecimento# Em consequâ:. cia é possível isolar os recombinantes correspondentes no ban co de expressão lambda gt 11.

Breve descrição das figuras;

Eig. li

Diagrama esquemático da região de regulação TIRE (upstream regulatory region = região de regulação a montante) com o vírus do papiloma humano BPV 18. A caixa CAAT e a caixa TADA estão marcadas por meio de uma elipse e de um rectângulo, respectivamente. A sub-regiao E2, que contém as duas repetições palindrómicas (pallindromic repeats) encontra-se reproduzida abaixo. As repetições palindrómicas estão marcadas por flechas. Estas repetições apresentam um domínio de reconhecimento para a proteína E2 virai. A sequência nuclear, que ê comum a todos os nucleótidos (Eig. 2), encontra-se enquadrada e I ligada pela proteína RS1 de ligação de ADET.

Eig. 2:

Oligonucleótidos que são utilizados na presente invençãoj Os oligonucleótidos AI a À3 contêm sequências que são originárias da sub-região E2 que Ó descrita na Eigura 1. É comum a estes oligunucleótidos uma sequência nuclear de 28 pares de bases (enquadrada e duplicada em A3).

Os oligonucleótidos B a E e G são monómeros ou tetrâmeros que são originários de outras regiões da URR do HPY 18 ou do HPV 16 a

Pig. 3 s

Sequência do ADNc da proteína ESI e da proteina ESI. A sequência de ácidos aminados é dada segundo o código de 3 letras.

Isolamento do clone ESlc de ADNc: A fim de isolar a proteina ESI de ligação a ADN celular, que se liga à região de regulação EEE do HPV 18 (Pig. 1), ensaiou-se um banco de expressão do fago gt 11 lambda que contém ADNc de queratinóeitos epidérmicos normais,, que são as células hospedeiras naturais do HPV. Para este fim aplicou-se o método original de Singh et al., Ce11 52:415-423, 1988 modificado por Vinson et al. (Genes Dev. 1988 2:801-806). Para sonda (probe) para a selecção das proteínas de ligação utilizcu-se 0 oligonucleótido AJ (Pig. 2). Este oligonucleótido contêm uma duplicação de 2 repetições em série (tandem repeats) que incluem a região de reconhecimento para 0 transactivador/transrepressor E2 virai (Nature 325:70-73, 1987). Numa primeira fase ensaiaram-se 500 000 pfu do banco de expressão do fago lambda gt 11. Para a inibição da ligação não especifica utilizou-se polidldC, que não contém qualquer informação biológica. Numa segunda fase ensaiaram-se outros 500 000 pfu, usando-se nesta fase para inibição da ligação não especifica ADN de timo de vitela desnaturado e revestido. Ambas as fases do ensaio (rounds of . -sceening) conduziram prontamente a um sinal positivo que ocor reu no mesmo local no original e no filtro duplicado. Uma aná lise de restrição e uma sequênciação parcial dos fragmentos de ADNc (inserções) mostraram que os dois clones eram idênticos e presumivelmente representavam duplicados do mesmo -fago. 0 fago identificado (designado por fago ESI) foi purificado por meio de 4 fases de transferência de placa e em seguida foi analisado em pormenor.

Especificidade da ligação: - 8 -

A especificidade da ligação foi analisada com o auxílio de ensaios de ligação a filtros, usando-se 3 oligonucleótidos diferentes (AI, A2 e A3) que contêm todos a sub-região E2 de 28 pares de bases de comprimento. Em comparação com estes nucleótidos, usaram-se para amostras de controlo negativo (Eig. 2) vários nucleótidos que não têm qualquer relação com a sub-região E2 mas que são originários da região de regulação URR do HPV 18 e do HPV 16. Pulverizaram-se amostras de fagos concentradas (5 x IO*'7 pfu) sobre uma cultura fresca de E. coli Y 1090. As propriedades de ligações a ADR da proteína ESI e de um produto de um clone de controlo negativo, que por sua vez foi seleccionado do banco de expressão do fago lambda gt 11, foram analisadas com o auxílio de ensaios de ligação a filtros, Em todos os casos o produto do clone de controlo negativo não interagiu com um dos oligonucletótidos ensaiados. Por outro lado, a proteína ESI ligou-se de modo específico aos oligonucleótidos AI, A2 e A3. Hão se observou qualquer interacçao entre a proteína ESI e outros oligonucleótidos de controlo.

Yerificou-se também que a proteína ESI apresenta uma actividade de ligação elevada e específica para ADR de cadeia simples, e por conseguinte para a cadeia não codogénica (anti-sense) (Eig. 2) dos oligonucleótidos Al, A2 e A3. Hão se observou qualquer afinidade da proteína ESI para com a cadeia codogénica (sense) dos oligonucLeótidos Al, A2 e A3 ou para com qualquer outra cadeia simples dos oligonucleótidos de controlo. Os fagos de controlo negativo não apresentaram qualquer factor que manifestasse uma actividade para com ADR de cadeia simples. A proteina ESI liga-se também sob elevadas concentrações salinas (RaOl 400 mM) a ADR que apresenta uma alta especificidade de ligação.

Também sob elevadas concentrações sali-• nas observou-se uma ligação da proteína ESI exclusivamente con - 9 -

~ oligonucleótidos que contêm a sequência nuclear de 28 pares de "bases de comprimento. Não foi observada qualquer outra interacção com outros fragmentos de ADN de dupla cadeia ou de cadeia simples.

Análise da proteína de fusão com ,3-galao-tosidase codificada pelo fago ESI:

Isolaram-se fagos ESI lisogénicos e fagos de controlo negativos e induziram-se para a produção de grandes quantidades da sua correspondente proteína de fusão com y3-galactosidase. Trataram-se proteínas em manchas de Western de fagos lisogénicos induzidos e não induzidos com anticorpos de rato anti-^-galactosidase e em seguida revestiram-so com um anticorpo anti-rato que foi ligado por uma ligação cova lente a fosfatase alcalina. Induziu-se por IPTG· uma proteína de fusão de cerca de 150 k no fago ESI lisogênico.

As propriedades de ligação da proteína de fusão /3-Gal-ESl foram verificadas com o auxílio de análise South-Western do extracto proteico integral de culturas li-sogénicas induzidas e não induzidas. Após a transferência desnaturaram-se as proteinas imobilizadas durante 60 min com cloridrato de guanidina 7 M e em seguida renaturaram-se duran te 24 h. Science (1988) 241:577-580. 0 ciclo de desnaturação /renaturação melhorou 0 sinal de reconhecimento das proteínas na análise de South-Western e a proteina integral de fagos lisogénicos induzidos de um controlo negativos e a proteína ESI foi analisada com o auxílio da sonda oligonucleotídica marcada por radioisótopos A3b. Detectou-se de modo específico no fago ESI lisogénieo uma única banca que representa uma proteína com uma massa molecular de cerca de 150 k. A especificidade da ligação ao ADN desta proteína de fusão de 150 k na análise de South-Western assegurou adicionalmente a especi, -ficidade da ligação da proteína ESI, por detecção no ensaio de ligação ao filtro. A proteína de 150 k liga-se espeeifi-• camente aos oligonueleótidos Al, A2 e A3 (Eig. 2) e às suas - 10 -

correspondentes cadeias não codogénicas (anti—strand) e não se liga aos oligonucleótidos de controlo·

Estrutura do ADNc existente no fago RS1: 0 fago ESI contém um fragmento de ADNc com um comprimento de 1338 nucleótidos. Uma das cadeias começa na sua extremidade 3 oom um quadro de leitura livre (ORE) de 906 nucleótidos seguido por urna região 3* não codi-ficante de 432 nucleótidos. 0 ORE de 906 nucleótidos, corres_ pondente a 302 ácidos aminados, encontra-se ligado na extremidade 3* do quadro (in frame) no gene da ^-galactosidade. A proteína de fusão J3-galactosidase-proteína RS1 possui uma massa molecular de cerca de 130 k. A fracção de j5-galactosi-dase na proteína de fusão possui uma massa molecular de cerca de 120 KD, de tal modo que a fracção codificada pelo ADNc na proteína de fusão deve ter uma massa molecular de cerca de 30 KD.

Os resultados estão em concordância dum modo geral com o peso molecular de 33)6 k, que pode relacionar -se com um oligopeptídeo de 302 ácidos aminados, que I codifi cado pelo ORE do ADNc do fago RS1 de 906 nucleótidos. No ORE de 906 nucleótidos existe um codão potencial de início de tra dução na base 192. No entanto as bases envolvidas não obdecen à sequência de consenso de Kozak para locais de início de tra dução encarióticos (Cell 44: 283-292). Por conseguinte existe a possibilidade de que 0 codão AUG na posição 192 não represente 0 codão original de inicio de tradução para 0 gene ESI. Encontram-se duas sequências de consenso de poliadenilação (ΑΑΪΑΑΑ) na região 3‘ do ADNc de RS1 e começam nos nucleótidos 1167 ® 1221, respectivamente. No entanto não se segue qualquer apêndice de poli(A) .

Uma comparação da sequência de ADNc de RS1 e da sequência proteica desta deduzida com vários bancos . de dados de sequências (Gene bank, Swiss Prot, Dayboff) não - 11

mostrou qualquer homologia significativa das sequências nucleó tídicas ou de ácidos aminados do ADNc de ESI e da proteína ESI com proteínas conhecidas. A sequência de ácidos aminados da proteína ESI mostra várias características interessantes.

Em primeiro ligar a proteína e rica em arginina (34 ácidos am:. nados em 302) e em prolina (35 ácidos aminados em 302). A pur lina ocorre parcialmente sob a forma de aglomerados (por exemplo , os ácidos aminados 278 e 296). Estes ésteres de prolina são notoriamente intervenientes na activação da transcrição por meio de vários factores de transcrição. Uma região de 51 ácidos aminados (33 a 84) é rica em prolina (20 %) , ácido glu·· támico (10%) , serina (10 %) e tronina (18 %). Existem regiões análogas na sequência de ácidos aminados, um grupo de proteínas com um tempo de meia vida in vivo muito curto (proteínas "PESI") . Os resíduos 10 e 51 têm 11111 alto conteúdo no ácido aminado básico arginina (20 %). A proteína ESI também não contem qualquer região que represente os domínios de Zirikfin-ger, Homeobox ou Eecho de Leucina, que ocorrem em muitos outios factores de ligação a ADN existentes, como ocorrem em muitos outros factores de ligação a ADU (Science 1989, 245: 371-378).

Exemplo 1

Um banco de expressão de ADNc

Obteve-se da firma Clontech Laboratories , Inc., um banco de ADU de AMc de queratinóeitos humanos que são olonados no vector de expressão lambda gt 11, 0 banco continha cerca de 1,7 x 10^ clones recombinantes independen-tes com uma dimensão de cerca de 1,7 x 10 clones recombinantes independentes eom um fragmento medio de cerca de 1,1 kb do dimensão (insert). A busca dos recombinantes do fago lambda gt 11 foi efectuada com o auxílio do organismo hospedeiro E. coli Y 1090. Os fagos lisoglnicos foram conservados em E. coli Y 1089 ou Y I090 (ver: MA-Oloning - A Practieal ApproacL, Vol. 1, DJí. GKLover, ed. (Oxford: IEL Press), 49-78. - 12 -

Exemplo 2

Sondas de ADH e ensaio sobre a proteína de ligação de ADN

Prepararam-se oligonucleótidos com um sintetizador modelo 380A da Applied Biosystems com o auxílio da técnica padrão da fosforimidite. Os produtos foram purificados por meio de electoforese em gel. Em seguida foram marcados sob condiçoes normais com (52P)-dATP com o auxílio de polinucleotidoquinase (da firma Boehringer Mannheim),

Para evitar a ligação inespecífica usou-se ADN de timo de vitela (da firma Pharmacia) e poli-dldO (da firma Pharmacia) revestidos. 0 ensaio das proteínas ligadas a ADH foi efectuado do seguinte modo:

Depositaram-se recombinantes do fago lambda gt 11 em agarose a 0,7 % com um pfu máximo de 1,5 x C 2 7 10v600 cm17 numa placa Nunc Bioassay. Oobriu-se com filtros de nitrocelulose (PA 85, Schleicher & Schuell) durante 3 h a 4-2°0. Ap6s mais 6 horas de incubação a 37°0 retiraram-se os filtros e cobriu-se com novos filtros durante 3 h a 37°0. Secaram-se os filtros durante 10 min à temperatura ambiente e em seguida incubaram-se em tampão A(Ha01 50 mM, ditiotrei-tol (DI!D) 0,5 mM, hepes 25 mM (pH 7,9) e cloridrato de guani-dina 6 M), Apés 10 min com agitação lenta substituiram-se as soluçães por tampão da mesma composição. Após outros 10 min diluiu-se a solução por fases (Genes Dev.: 1988 2:801-806) quatro vezes durante 5 min com o mesmo volume de tampão B (NaCl 50 mM, D TI 0,5 mM e Hepes 25 mM (pH 7,9)).

Em seguida lavaram-se os filtros duas vezes durante 5 min com tampão B e depois incubaram-se durante 30 min em tampão C (carnation nonfat dry milk a 5 %, HaCl 50 mM, DTT 0,5 e hepes 25 mM (pH 7,9)) a 4-°G. Substituiu-se a solução por tampão D (carnation nonfat dry milh a 0,25 NaCl 50 mM, DM) 0,5 mM e hepes 25 mM (pH 7,9)) θ - 13 - 4

incubou-se durante 1 min. A reacção de ligação propriamente dita foi efectuada em tampão D que continha adicionalmente 3 x 10 cpm/ml (1 x 10 cpm/^ig) de oligonucleotido de cadeia dupla marcado e 10 Jig/ml e ADU específico (ADU de timo de vitela revestido desnaturado, comprimento médio: 3000 pb ou polidldC, comprimento médio: 8260 pb). Após 60 min a 4°0 lavaram-se os filtros três vezes durante 5 min com tampão D, secaram-se com o auxílio de papel 3 MM e em seguida expos-se uma película AS x-omat Kodak de un'.d5a paca o outro a -70°0 por intermédio de um diafragma intensificador.

Exemplo 3

Análise da proteína de fusão de ^3-galactosidase

Prepararam-se fagos lisogenicos segundo o método de Huynh (DHA Oloning - A Practical Approach, Vol* 1, Oxford: IRL Presses, 49-78)· Prepararam-se extractos proteicos dos fagos lisogenicos (Oell 1988 32:415-423) e conservaram-se a 70°C em alíquotas. Efectuou-se uma análise de mancha de Western com o auxílio de um anticorpo monoclonal de rato anti-^-galactosidase (da firma Promega) e de um "sistema AP ProtoBlot Wester baseado em fosfatase (Promega)" nas condições recomendadas pelo fornecedor. Para a realização das análises de South-Western aqueceram-se extractos proteicos (50^g de ex tracto bruto) durante 5 min em tampão de amostra (Proc. Bati. Aoad. Sei. USA 82: 6741-6744) e em seguida depositou-se sobre um gel de PAGE a 10 % de SDS. Após a electoforese depositaram-se as proteínas sobre nitrocelulose com o auxílio de elec trodeposição (modelo semi-dry SD1, 0ΪΤ GmbH). Irataram-se em seguida os filtros conforme descrito em Science 1988 241:577-580.

Exemplo 4 Sequenciação: 14 -

Preparam-se fragmentos (inseções) dos fagos recombinantes com o auxílio do sistema de adsorção de fagos lambda (Promega). Subclonaram^se as inserções em M13-mpl8 e em seguida sequenciaram-se com o auxílio do método de didesoxi (SEQUENASE; United States Biochemical, Inc«); Se-quenciarem-se integralmente ambas as cadeias.

Exemplo 5:

Hibridação de mancha de Northern e de Southern:

Isolou-se AM, segundo o método descrito em Molecular Oloning: Elaboratory Manual: Oold Spring Harbor Laboratory, das linhas de células HeLa, 0G13 (híbridos de HeLa tumorgénico-fibroblastos (Science 1982 215:252-259))» 444 (híbridos de HeLa não tumorgénico-fibroblastos), fibro-blastos humanos primários, ST 80 (ST 40-fibroblastos transformados) , HaOat (queratinócitos imortalizados espontaneamente (Journal of Cell Biology, 1988, 106:761-771)), Oaski (carcinoma cervical), SW 480 (carcinoma do célon), Wl=ilms, Hep 02 (hepatoma) e TK humano (osteosarcoma). Separaram-se num gel de agarose a 1 % fracções digeridas por enzimas de restrição e em seguida transferiram-se para membranas GeneScreen Plus (Du Pont). Pré-hibridaram-se os filtros e hibridaram-se com ADNc de ESI marcado com sob condições críticas.

Isolou-se AM citoplasmático segundo o método descrito em Oancer Research 1988, 48: 3780-3786. Efec-(· tuou-se uma análise de mancha de Northern com cerca de 10 jig de AJM citoplasmático, que tinha sido separado num gel de aga rose a 1 %. 0 tampão de eluição do gel tinha uma composição de ácido morfolinopropanossulfonico 0,2 M de pH 7,0; acetato de sódio 50 mlá e EDÍEA 1 iM de pH 8,0, 0 ARN citoplasmático separado foi em seguida transferido para um filtro GeneScreen Plus (Du Pont) . A hibridação e a lavagem do filtro sob condij-ções críticas com sondas marcadas com eventualmente subme tidas a tratamento com iniciadores decorreram de um modo conhà eido em si. - 15 -

Claims (1)

1. (τν- 77· "3íSSE3ESBí^ ^JaptoTt.^

   Exemplo 6: Ensaio de ligação a filtro: Pulverizou—se uma solução concentrada de fagos (1 x 1010 pfu/ml) de lisados de placas directamente sobre uma cultura superficial de E. coli Y 1090 fresca. Após uma incubação de 2 horas a 42°0 revestiu-se esta cultura com filtrados de nitrocelulose saturados com IPIG (10 jaM) . Continuou-se a incubação a 37°0 durante 2 h. Em seguida retiraram-se os filtros e trataram-se como descrito no Exemplo 2.

   REIVINDICAÇÕES - lã - Processo para a preparação da proteína de ligação de ADN ESI e de polipeptídeos semelhantes e RS1 com actividade biologica de proteína ESI, caracterizado por se transformar um organismo hospedeiro com uma molécula de ADN recombinante que contêm (1) uma sequência de ADN

   - 16 - S i „:^-_r-,™,.;,, f'íH»r:.·-; ',,'πΡΤΓΛτν «· t-~~.- * ’“** '**“**►'· ! {—L. ----w2jltnt?»Í»t«ÍHi ^¾¾¾ s' 1 GAA i i CLGGnGCuLULAGi.ACuAAGCiluAGllCuli L»iaLLUuGc.GnC---nCC i l C>. Λ L-L--'_-uv.L I ULLt.Lli\.«jnt;n I L‘..ULLL.^Luv.w ί Li--'—lAÍinbi.-nULL^-^uL-^i.v.- I 1 1 Λ*· <|·Γ < ^ < i , ^Λ· ΐρβΛ·^ »/»Γΐ“ » ί* ' ί·" · A * <"* — ‘ XZJ» U L; ru· — a U i- .λ U L· L UI- U L ; ΛΛΐ.Ι·ΐΑΐ-^ΐΑΛΐ.Ι·.ΛΛΐ.ί.^Ι*!ώΛί.1.,?:Λαΐ.;. i U.".ULwAU.,Mjur.uftuun Iwl GuAGuAGuCAi GAG i GAGuCGGGCGAGGCCAClACCAClACCACCAClAClC;ClCll/aG J J 2Δ1 GC7CCGACGGAGGCGGCCGCGGCGGGiClCCAGGACCClGCGlCCAAGAGCllluiuuuv (wi AUL^U I ULUuL'<.LaUCUL.ULUÚIhmLwUUL^UU.^Lw^U%.aLU i UÍIWAUUAíKaLL^ • JU 1 -21 uUuAGCijAAGACíuCuuAGAAAAAAG ί i C i CGuwACCAAAG i uu i i uuuAC i ‘-j i lAAA i Cl /»G1 ΤΤΓ,Λ ΓΡΤΓ* <Γ· a a rr- ' 7-' 7Γ~ » TTT·' 7- •'•ir-* λ j *- · * r · - - — » " i-C 1 I ! ΙλλΙΙ: » ^r.bnr.n } Uua I a 1 oun I 1 ΙλΙ λγ.π í ^j-,λλ i ^.-.',Λ.-ΛΛΛΰΛΛ^Λ , « . .λ i }ώ! G i ACA i CAGACiGllATCAAGAAGAAiAACCCACGlAAATAiCillGCAG í liAGu^GAi áGl GGAGAAAC i G i AGAG i i i GA i G i Gu i i GAAGuAGAGr\AGuú i uCAGAAGl í ll-AA ; G t (_j íói ACTGCCCCCGATGGAGTTCCTGTGGAAGGGAGTCGTTACGCTGCAGATCGGCGCGGTTAC 7£.1 AGACG i LuC í AC i A i GlAAGGuuClli GuCC- i 0——«.cuAA i GC i GG i GAGA ι i Gunu^u 17 7Η1 λι GAAGuA I GuAG * uCCAGAGGGAGCACAAC i iCAGGuACCCC77CATCGAAA7CCAAC7 TAClulCuaAGlj í ACCGiACCAGouuACC i Cl » Clulí-AClaCl i GCCCCCAGCAG77CG 901 AG AGGl i lAAGAT AAAGAAAA i CAGCAAGCCACCAG t uG t ClAAACCAGCCGTC »G 7 7 CG 9éx Cluí uuA i ACCAull > Cll i ACaA í ! AClGuLl í Clulluu i L*. ι CC* AACuC t lC i TCA 1021 CAAGA ι uGuAAAGAuuCCAAGGCAGG i uAAGwaClAAC i uAGAACCC i lw i CCACllACC ^.CS 1 lAG»-AGaUuÀu i uw l uAG I AACACuAGuW » tw l LaGuwAV.L i I i LUUUAUU l UAL. ii-i C.AAAGAAi iAAíGACCAi líAGAAAfAAAGu.AAAaauuaLuv—auaauw. íaaCua.-.u.-. 1201 CCAâAGAAACATCCAAGCAATAAAuTCuAAGACTAACCAAGA ι T ι CCACA i TGuAATGT: 12sl tactgttattctttaagaaacaactacaaaaagaaaatgtcaacaaatttttcagcaagc 1321 ιGAGAACCiGuuAAiιC OU (2) uma sequência de AM do genoma de queratinócitos primários humanos que codifica para a proteína de ligação celular ESI ou para um polipeptídeo semelhante a ESI com actividade biológica de proteína ESI, cultivar o organismo transformado e isolar depois da expressão a proteína ESI ou o polipeptídeo semelhante a ESI. - 2â - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica caracterizado por se incorporar como ingre diente activo a proteína ESI ou um polipeptídeo semelhante a ESI quando preparados de acordo com a reivindicação 1 em conjunto com substâncias veiculares apropriadas. - 18 - * 4. J i A requerente reivindica a prioridade do pedido de patente alemão apresentado em 30 de Março de 1990, sob o m. P 40 10 237.8. * 4. J i J Lisboa, 27 de Março de 1991

   - 19