JPH10506789A

JPH10506789A - 亜鉛フィンガー蛋白質をコードするｄｎａ、亜鉛フィンガー蛋白質およびそれらの使用

Info

Publication number: JPH10506789A
Application number: JP8512260A
Authority: JP
Inventors: シュワルツ，エリザベス; バルテルマン，マティアス; ロイター，マリー−ステラ
Original assignee: ドイチェスクレブスフォルシュンクスツェントルムスチフトゥングデスエッフェントリヒェンレヒツ
Priority date: 1994-10-07
Filing date: 1995-10-06
Publication date: 1998-07-07
Also published as: WO1996011267A1; EP0784680A1; DE4435919C1

Abstract

(57)【要約】本発明は、亜鉛フィンガー蛋白質をコードするＤＮＡおよびこのタイプの蛋白質に関する。さらに、本発明は、癌の診断、治療または遺伝子治療における該ＤＮＡおよび該蛋白質の使用に関する。亜鉛フィンガー蛋白質をコードするＤＮＡは、ｃＤＮＡクローンＣＯＳＡＰ４−Ｅ１の挿入物である。かかるクローンは、子宮頸癌細胞株ＭＥ１８０のｃＤＮＡライブラリー由来であり、ヒトパピローマウイルス６８ＤＮＡを含み、そのエキソン配列中に４個の亜鉛フィンガーを有する。

Description

【発明の詳細な説明】亜鉛フィンガー蛋白質をコードするＤＮＡ、亜鉛フィンガー蛋白質およびそれらの使用本発明は、亜鉛フィンガー蛋白質をコードするＤＮＡおよびこのタイプの蛋白質に関する。さらに、本発明は、該ＤＮＡおよび該蛋白質の使用に関する。正常細胞から癌細胞の変換は、細胞の遺伝子が変化したり、ウイルスの癌遺伝子を獲得するいくつかの部分的な段階で起こる。細胞の遺伝子の変化は、突然変異による癌原遺伝子の活性化、遺伝子増幅、過剰発現または染色体転座ならびに突然変異または欠失による癌抑制遺伝子の不活性化からなる。変化が癌形成との関連性で重要である種々の遺伝子が、現在まで同定されている［一般的な論説を参照：ビショップ(Bishop，J．M.)、Cell 64(1991),235-248 ］。かかる遺伝子産物は、種々の機能を有する。例えば、それらは、それぞれ、転写調節因子として、成長因子、成長因子受容体またはプロテインキナーゼ等の異なるシグナル伝達系の連結としておよび細胞分裂の活性化因子もしくは阻害因子として作用する。転写調節因子の例としては、亜鉛フィンガー蛋白質が挙げられる。これらの蛋白質は、２個のシステイン残基と２個のヒスチジン残基を含み、互いに亜鉛原子を結合させるような相対的に位置する特徴的な構造を有する。亜鉛フィンガー蛋白質は、ＤＮＡ結合蛋白質である。亜鉛フィンガー蛋白質の例としては、その欠失がＷｉｌｍｓ’腎癌の形成に重要な役割を果たすＷｉｌｍｓ’癌抑制遺伝子産物ＷＴ１挙げられる。現在までに、それぞれ、癌形成および成長に関わるすべての遺伝子および遺伝子産物が知られているわけではない。従って、癌の診断および治療は、それぞれ、限られた範囲でのみ可能である。従って、本発明の目的は、癌の診断および治療それぞれをより広範囲に行うことが可能な方法を提供することにある。本発明によれば、これは、請求の範囲で定義した要旨により、達成される。従って、本発明の要旨は、下記からなる亜鉛フィンガー白質をコードするＤＮＡに関する、（ａ）図１の４４６〜１４７６ヌクレオチドのＤＮＡまたはその一部、（ｂ）（ａ）のＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡ、または（ｃ）縮重遺伝コードにより（ａ）または（ｂ）のＤＮＡと関連するＤＮＡ。「ハイブリダイズするＤＮＡ」という用語は、通常の条件下で、特に、該ＤＮＡの融点の２０℃以下で、（ａ）のＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡをいう。図１は、ｃＤＮＡクローンＣＯＳＡＰ４−Ｅ１の挿入断片を示す。このクローンは、子宮頚癌細胞株ＭＥ１８０のｃＤＮＡライブラリー由来である［ロイター(Reuter，M.S.)ら、J．Virol．65(1991),5564-5568］。この細胞株は、ヒトパピローマウイルス６８−ＤＮＡ（ＨＰＶ６８−ＤＮＡ）を安定に組み込まれた状態で含有している。ＣＯＳＡＰ４−Ｅ１クローンは、１〜２１ヌクレオチドの間にＨＰＶ６８−ＤＮＡを含んでいる。さらに、それは、４４６〜１４７６ヌクレオチド間の亜鉛フィンガー遺伝子のエキソン配列である２２〜１４７６ヌクレオチド間に細胞由来の配列を含んでいる。かかるエキソン配列は、４個の亜鉛フィンガーをコードしている：亜鉛フィンガー１：１１３０〜１１９１、亜鉛フィンガー２：１２１４〜１２７５、亜鉛フィンガー３：１２９８〜１３６０、亜鉛フィンガー４：１３８２〜１４３２。ＣＯＳＡＰ４−Ｅ１クローンは、１９９４年９月３０日に、ＤＳＭ９４５０の項目でＤＳＭ（微生物および培養細胞のドイツタイプコレクション）に寄託された。特に４４６〜１４７６ヌクレオチド間の前記挿入ＤＮＡは、完全な亜鉛フィンガー蛋白質をコードするＤＮＡの一部であってもよい。従って、かかるＤＮＡおよびそれによりコードされる亜鉛フィンガー蛋白質は、本発明の要旨に属する。前記亜鉛フィンガー蛋白質をコードするＤＮＡは、通常に供給される。ＣＯＳＡＰ４−Ｅ１の挿入ＤＮＡ、特に４４６〜１４７６ヌクレオチド間のＤＮＡは、肝臓、脳、胎盤または筋肉、好ましくは肝臓由来の通常に利用できるｃＤＮＡライブラリーとのハイブリダイゼーション用プローブとして、実施例の方法により使用される。血液細胞またはＨｅＬａ細胞由来のｃＤＮＡライブラリーも用いることが可能である。該組織および細胞は、ＣＯＳＡＰ４−Ｅ１の挿入ＤＮＡ、特に４４６〜１４７６ヌクレオチド間のＤＮＡとハイブリダイズするのに十分なＲＮＡ転写物を含んでいる（図２参照）。得られるクローンを、シーケンスに付し、前記亜鉛フィンガー蛋白質をコードするＤＮＡを、ＣＯＳＡＰ４−Ｅ１の挿入ＤＮＡ、特に４４６〜１４７６ヌクレオチド間のＤＮＡに基づいて決定する。さらに、ＣＯＳＡＰ４−Ｅ１の挿入ＤＮＡ、特に４４６〜１４７６ヌクレオチド間のＤＮＡおよび非常に特別には１２４０〜１４７６ヌクレオチド間のＤＮＡは、前記亜鉛フィンガー蛋白質をコードするゲノムＤＮＡを同定するために好適である。この目的のために、ＣＯＳＡＰ４−Ｅ１の対応するＤＮＡ、例えば、１２４０〜１４７６ヌクレオチド間のＤＮＡを、ゲノムＤＮＡライブラリーとのハイブリダイゼーション用プローブとして使用される。かかるライブラリーは、前記組織および細胞から調製することができる。本発明によれば、ＣＯＳ１ＡＰＭクローンが得られる。５．５ｋｂの長さのＳａｃＩ断片において、その挿入ＤＮＡは、例えば、１２４０〜１４７６ヌクレオチド間のＤＮＡなどの用いるプローブに対応するＤＮＡを含む。図３および４において、このＣＯＳ１ＡＰＭＤＮＡは、２５６〜４９２ヌクレオチド間に存在している。ＣＯＳ１ＡＰＭクローンは、１９９４年１０月７日に、ＤＳＭ９４６２の項目で、ＤＳＭに寄託された。従って、本発明の要旨は、前記亜鉛フィンガー蛋白質をコードするゲノムＤＮＡならびにそれによりコードされる蛋白質も含む。本発明によれば、亜鉛フィンガー蛋白質をコードする前記ＤＮＡは、ベクターおよび発現ベクター中にそれぞれ存在してもよい。当業者であれば、その実施例に熟知している。大腸菌に対する発現ベクターの場合、例えば、ｐＧＥＭＥＸ、ｐＵＣ誘導体およびｐＧＥＸ−２Ｔが挙げられる。酵母での発現のためには、例えば、ｐＹ１００およびＹｃｐａｄ１が挙げられ、動物細胞での発現のためには、例えば、ｐＫＣＲ、ｐＥＦ−Ｂ０Ｓ、ｃＤＭ８およびｐＣＥＶ４が挙げられる。当業者であれば、発現ベクター中に存在する前記ＤＮＡを発現させる目的に適する細胞に熟知している。かかる細胞としては、大腸菌株ＨＢ１０１、ＤＨ１、ｘ１７７６、ＪＭ１０１およびＪＭ１０９、酵母サッカロミセスセレビシエ株ならびに動物細胞Ｌ、３Ｔ３、ＦＭ３Ａ、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＶｅｒｏおよびＨｅＬａが挙げられる。当業者であれば、前記ＤＮＡを発現ベクターに挿入する方法については公知である。また、当業者であれば、前記ｃＤＮＡは、大腸菌、酵母または動物細胞で発現することができるが、前記ゲノムＤＮＡは、動物細胞でしか発現できないことも熟知している。さらに、当業者であれば、トランスフォームした細胞およびトランスフェクトした細胞それぞれの培養条件に関して公知である。また、発現した亜鉛フィンガー蛋白質の単離および精製方法にも熟知している。従って、前記組換え調製亜鉛フィンガー蛋白質もまた、本発明の要旨に属する。本発明の他の要旨は、前記亜鉛フィンガー蛋白質に対する抗体に関する。それは、通常の方法で調製される。この目的のために、例えば、亜鉛フィンガー蛋白質をＢＡＬＢ／ｃマウスに皮下注射する。この注射は、３週間毎の間隔で繰り返される。最終注射の約２週間後、通常の方法で抗体を含む血清を単離し、試験する。好ましい態様において、抗体はモノクローナル抗体である。前記４回目の注射の後、その調製のためにマウスから脾臓細胞を取り出し、通常の方法で、ミエローマ細胞と融合させる。また、公知の方法に従って、さらにクローニングを行う。本発明は、以前未知の亜鉛フィンガーＤＮＡならびにそれによりコードされる亜鉛フィンガー蛋白質を提供する。本発明のＤＮＡは、診断目的のためのプローブとして好適である。また、当業者が遺伝子治療目的として公知の発現ベクター中で使用することができる。本発明の蛋白質もまた、治療目的のために適している。この目的のために、通常の医薬組成物で投与することができる。また、本発明は、前記蛋白質に対する抗体を提供する。それらは、診断目的のための最良の方法に適している。従って、本発明は、本発明のＤＮＡおよびそれによりコードされる蛋白質に関連する疾病の診断および治療のための新規の方法を提供する。図面の簡単な説明：図１は、ＣＯＳＡＰ４−Ｅ１クローンの挿入ｃＤＮＡを示し、図２は、ＣＯＳＡＰ４−Ｅ１の１２４０〜１４７６ヌクレオチド間のＤＮＡを有する様々な細胞由来のポリＡ⁺ＲＮＡのハイブリダイゼーションを示し、図３は、ＣＯＳ１ＡＰＭクローンのゲノム挿入ＤＮＡの部分配列を示し、及び、図４は、ＣＯＳＡＰ４−Ｅ１クローンの１２４０〜１４７６ヌクレオチド間のＤＮＡと、Ｃ０Ｓ１ＡＭＰクローンのヌクレオチド２５６〜４９２間のＤＮＡとの比較を示す。本発明を以下の実施例によって説明する。実施例：本発明の亜鉛フィンガーＤＮＡの調製ＨｅＬａ細胞から調製したλｃＤＮＡライブラリーを通常のハイブリダイゼーションの過程に付す。この目的のためには、バクテリアに感染させることによって得られたファージプラークを、³²Ｐで標識されたＣＯＳＡＰ４−Ｅ１クローンの挿入ＤＮＡ、特に１２４０〜１４７６ヌクレオチド間のＤＮＡ（図１参照）とインキュベートする。個々のファージプラークとのハイブリダイゼーションが得られる。ファージＤＮＡをそこから単離し、ＥｃｏＲＩで切断する。その結果得られた断片を、０．５％アガロースゲルでの電気泳動法により分離する。アガロースゲルを通常のブロッティング方法に付し、アガロースゲルからニトロセルロース膜へＤＮＡを移す。ＣＯＳＡＰ４−Ｅ１クローンの挿入ＤＮＡの対応するＤＮＡが³²Ｐで標識されたサンプルとして使われることは、ハイブリダイゼーションの方法に入っている。個々のＤＮＡ断片とのハイブリダイゼーションが得られる。それらを単離し、脱リン酸されたＥｃｏＲＩ切断プラスミド（例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）にクローニングする。個々のクローンを分析し、本発明の亜鉛フィンガーＤＮＡを含むクローンを制限酵素による分解ならびにシーケンスによって同定した。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９６年１０月３１日【補正内容】請求の範囲１．亜鉛フィンガー蛋白質をコードするＤＮＡであって、下記からなるＤＮＡ、（ａ）図１の４４６〜１４７６ヌクレオチドのＤＮＡ、（ｂ）（ａ）のＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡ、または（ｃ）縮重遺伝コードにより（ａ）または（ｂ）のＤＮＡと関連するＤＮＡ。２．図３の２５６〜４９２ヌクレオチドのＤＮＡである、請求項１記載のＤＮＡ。３．請求項１または２記載のＤＮＡによりコードされる蛋白質。４．請求項３記載のタンパク質をコードするＤＮＡからなる発現プラスミド。５．請求項４記載の発現プラスミドを含む形質転換体。６．請求項５記載の形質転換体を適当な条件下で培養することからなる、請求項３記載の蛋白質の調製方法。７．診断および／または治療のための試薬としての請求項１または２記載のＤＮＡの使用。８．治療のための試薬としての請求項３記載の蛋白質の使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者バルテルマン，マティアスドイツ連邦共和国シュリーシャイムデー−69198 シュタインシュライフェンウェーク７ (72)発明者ロイター，マリー−ステラドイツ連邦共和国ヒルシュベルクデー −69493 ハンス−トーマ−シュトラッセ８

Claims

【特許請求の範囲】１．亜鉛フィンガー蛋白質をコードするＤＮＡであって、下記からなるＤＮＡ、（ａ）図１の４４６〜１４７６ヌクレオチドのＤＮＡまたはその一部、（ｂ）（ａ）のＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡ、または（ｃ）縮重遺伝コードにより（ａ）または（ｂ）のＤＮＡと関連するＤＮＡ。２．図３の２５６〜４９２ヌクレオチドのＤＮＡである、請求項１記載のＤＮＡ。３．請求項１または２記載のＤＮＡによりコードされる蛋白質。４．請求項３記載の蛋白質をコードするＤＮＡからなる発現プラスミド。５．請求項４記載の発現プラスミドを含む形質転換体。６．請求項５記載の形質転換体を適当な条件下で培養することからなる、請求項３記載の蛋白質の調製方法。７．診断および／または治療のための試薬としての請求項１または２記載のＤＮＡの使用。８．治療のための試薬としての請求項３記載の蛋白質の使用。