PT97163B - Processo para a preparacao de uma composicao farmaceutica contendo n-fenil-n-metil-1,2-hidro-4-hidroxi-1-metil-2-oxo-quinolina-3-carboxamida - Google Patents

Description

A presente invenção refere-se à utilização de N-fenil-N-metil-1, 2-hidro-4-hidroxi-l-metil-2-oxo-quinolina3 -carboxamida ou de um seu derivado farmaceuticamente aceitável para a preparação de um medicamento susceptível de poder ser utilizado para o tratamento de infecções provocadas por retrovirus, especificamente as infecções provocadas por VIH, e para o tratamento de pacientes que sofram do síndroma da imunodeficiência adquirida (SIDA) e do complexo relaccionado com a SIDA (CRS).

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Antecedentes

Ο síndroma da imunodeficiência adquirida (SIDA) surgiu como uma doença humana mortal de importância global crescente. Uma vez que não existe nenhuma terapia eficaz conhecida para o tratamento da SIDA, é urgentemente necessário encontrar novos métodos terapêuticos, estando a ser feitos grandes esforços para desenvolver fármacos e vacinas para combater a SIDA.

virus da SIDA identificado pela primeira vez em 1983, foi descrito sob diversas designações. É o terceiro virus conhecido dos linfócitos T (HTLV-III) e tem a capacidade de se replicar no interior das células T de tipo T4 (ou células CD4). Veja-se por exemplo Gallo et al., Science 224, 500 - 503 (1984), e Popovic et al., Ibid.. 497 - 500 (1984). Este virus é conhecido por virus associado de linfadenopatia (VAL) ou virus relaccionado com a SIDA (VRS) e, mais recentemente, conhecido por virus da imunodeficiência humana (HIV ou VIH) . Foram jã descritos dois virus da SIDA distintos, os HIV-1 e HIV-2. O HIV-1 é o virus originalmente identificado em 1983 por Montagnier e seus colaboradores no Instituto Pasteur de Paris [Ann. Viro1. Inst. Pasteur 135 E, 119-134 (1984)], ao passo que o HIV-2 foi isolado mais recentemente por Montagnier e os seus colaboradores em 1986 [Nature 326, 662 (1987)]. 0 termo HIV agora utilizado significa qualquer desses em sentido genérico.

Embora a biologia molecular da SIDA comece a ser compreendida e definida é necessário saber mais e compreender melhor esta doença. Entretanto, estão a ser investigadas diversas abordagens de pesquisa de potenciais fármacos e vacinas anti-SIDA. 0 desenvolvimento de uma vacina contra a SIDA tem sido dificultado pela falta de compreensão dos mecanismos imunológicos de protecção contra os HIV, pela amplitude de variação genética

do virus e pela falta de modelos eficazes em animais contra as infecções de HIV. Veja-se por exemplo Koff and Hoth, Science 241 426-432 (1988).

primeiro fármaco aprovado pela instituição US Food and Drug Administration (FDA) para o tratamento da SIDA foi a zidovudina mais conhecida pela sua designação inicial de azidotimidina (ÂZT). Quimicamente este fármaco ê 3'-azido-3desoxi-timidina. Este fármaco foi seleccionado originalmente como uma arma potencial contra a SIDA uma vez que se demonstrou que era capaz de inibir a replieação do virus in vitro. Todavia existe um sério inconveniente associado ao AZT que reside nos seus efeitos secundários tóxicos. Para além do AZT foram desenvolvids outros agentes anti-virais tais como Anasamicina, Ribovirina, Didesoxicitidina e Foscarnet. Todavia, até ao presente, estes agentes têm demonstrado ser mais vantajosos do que o AZT. Foram testados também tratamentos imunoestimuladores e imunoadoptivos com IFNs ou IL2, hormonas e factores tímicos de transferência e tratamentos com os designados fármacos imunoestimuladores, por exemplo, isoprinosina, azimexona, tufsina, bestatina, cimetidina, transplantes tímicos e transfusões de linfócitos compatibilizados com HLA ou enxertos ou transplantações de medula óssea de gémeos idênticos admitindo-se contudo que tenham sido mal sucedidos conforme realçado em dois artigos recentes (Gottlieb MS et al.,Immunotherapy of the acquired immune deficiency syndrome, In: Gallin JI, Fauci AS, eds. Advances in hos defense mechanisms. New York: Raven Press, 1985;5:149-70, e Lotze MT. Treatement of Immunologic disorders in AIDS. In De Vita VT, Hellman S, Rosenberg SA eds. AIDS etiology, diagnosis, treatment, and prevention. New York:

Lippincott JB company, 1985:235-63).

Sumário da invenção

Em conformidade com a presente invenção veri3

ficou-se agora surpreendentemente que o composto N-fenil-N-metil1,2-di-hidro-4-hidroxi-l-metil-2-oxo-quinolina-3-carboxamida possui propriedades que podem ser úteis para o tratamento de infecções por retrovirus, tais como as infecções dos VIH em mamíferos incluindo os seres humanos e para o tratamento de pacientes que sofrem de SIDA e de CRS. 0 composto N-fenil-N-metil-1,2-dihidro-4-hidroxi-l-metil-2-oxo-quinolina-3-carboxamidaéconhecido também pela designação Linomide e o seu nome genérico é roquinimex. A presente invenção refere-se também à utilização de Linomide ou de um seu sal farmaceuticamente aceitável tal como um sal de Na ou de Ca para a preparação de um fármaco para o tratamento de infecções por retrovirus, especialmente as infecções de VIH, e para o tratamento de pacientes que sofram de SIDA ou do complexo relaccionado com a SIDA. 0 composto Linomide foi descrito pela primeira vez na patente norte-americana n^s4 547 511 como um agente imunoestimulador.

A experimentação cientifica com Linomide demonstrou que o composto Linomide posui múltiplas actividades imunológicas. Descobriu-se desse modo que a Linomide aumenta a resposta proliferativa aos mitogéneos celulares T e B [Larsson, E. L., Joiki, A. L. e Stalhandske, T.: Mechanism of action of the new immunomodulator LS 2616, Int. J. Immunopharmacol. 9:425, 1987], aumenta a produção de anti-corpos [Carlsten, Η. , Tarkowski A., and Nilsson, L-A: The effect of immunomodulating treatment on cutaneous delayed hypersensitivity in MRL (lpr/lpr) mice, APMIS 97:728,1989] e aumenta a actividade das células NK [Kalland T., Alm, G., and Stalhandske, T.: Augmentation of mouse natural killer cell activity by LS 2616, a new immunomodulator, J. Immunol. 134:3956, 1985],

Tendo em consideração o facto de se ter demonstrado que a Linomide estimula os linfócitos T e aumenta a produção IL-2 não seria de prever que a Linomide pudesse apresentar qualquer efeito sobre as infecções de retrovirus uma vez

que as tentativas para tratar pacientes com VIH com a hormona IL2 do crescimento das células T aceleraram o desenvolvimento da doença. Sem dúvida é possível afirmar que a estimulação dos linfócitos T em pacientes infectados por VIH pode ser uma espada de dois gumes. As células auxiliares T sao fulcrais para a geração de uma resposta imune mas são também o reservatório para a replicação do virus VIH. Por outro lado, tendo em consideração o facto de as experiências anteriores com agentes imunoestimuladores não terem sido bem sucedidas, é interessante observar os resultados promissores da Linomide.

A Linomide possui a seguinte fórmula estrutural:

A Linomide pode ser utilizada tal qual ou sob a forma de um sal de um catião farmaceuticamente aceitável. Além disso, a Linomide pode ser utilizada em combinação com outros agentes anti-SIDA.

Como intervalo de dosagem aceitável para a Linomide no tratamento da SIDA recomenda-se uma quantidade compreendida entre 0.1 e 100 mg por dia ou eventualmente superior consoante o estado especifico que se pretende tratar, a idade e o peso do paciente especifico e a resposta especifica do paciente à medicação. A dosagem individual exacta e também a dosagem diária serão determinadas em conformidade com os princípios médicos consagrados sob a direcção de um médico.

As formulações que podem ser utilizadas de acordo com a presente invenção encontram-se descritas na patente norte-americana n²4547511 col. 11, a qual aqui se incorpora como referência.

Conforme anteriormente especificado, a Linomide é um estimulador poderoso dos linfócitos T e aumenta a produção de IL-2. 0 perfil imunofarmacológico, contudo, é dominado por um acrescimento profundo da actividade das células aniquiladoras naturais (NK) com menos efeitos sobre a actividade das células in vivo [Kalland, T.: Effects of the immunomodulator LS 2615 on growth and metastasis of the murine B16-F10 melanoma, Câncer Res. 46:3018, 1986]. Em particular, a frequência das células de expressão CD4 não aumenta durante o tratamento de murganhos com Linomide (Exemplo 2). Esta descobertacombinada com os resultados promissores sobre macacos infectados com retrovirus faz com que a Linomide seja potencialmente útil para o tratamento de retrovirus incluindo as infecções de VIH, SIDA e CRA apesar dos riscos potenciais associados às propriedades estimuladoras das células T que a Linomide possui.

A presente invenção será melhor ilustrada com os exemplos adiante descritos.

Exemplo 1

Efeito da Linomide sobre a actividade das células NK.

% de Citotoxidade

Tratamento	100:1*	50:1*	25:1*
Controlo	18+4	12+2	8+2
Linomide	29 + 5	20 + 4	14±4

* Proporção células efectoras:Células alvo

Através da ãgua de beber administrou-se Linomide (160 mg/kg/dia) durante 4 dias e determinou-se depois a actividade das células NK do baço contra as células YAC-1 através de um ensaio convencional de libertação de ⁵¹Cr conforme descrito em [Kalland T., Alm, G., and Stalhandske, T.: Augmentation of mouse natural killer cell activity by LS 2616, a new immunomodulator, J. Immunol. 134:3956, 1985]. Apresentase o resultado de uma experiência com 3 murganhos C57B1/6 por grupo de tratamento ficando demonstrado que a Linomide melhora significativamente a actividade das células NK.

Exemplo 2

Efeito do tratamento com Linomide sobre as subpopulações de linfócitos T do baço.

	% de Células fluorescentes
Tratamento	Thy 1.2	CD4	CD8
Controlo	44 i 4	31 + 2	11 + 2
Linomide	42 + 5	28 + 4	10 + 3

Administrou-se aos murganhos C57B1/6 uma quan tidade de Linomide (160 mg/kg/dia) na água de beber durante 4 dias. Aos animais de controlo administrou-se apenas ãgua de beber normal. As células do baço foram preparadas conforme descrito em: [Kalland T., Alm, G., and Stalhandske, T.: Augmentation of mouse natural killer cell activity by LS 2616, a new immunomodulator, J. Immunol. 134:3956, 1985] e procedeu-se ao seu exame para verificação da expressão de marcadores à superfície das células por imunofluorescência directa. Foram utilizados os seguintes anticorpos monoclonais marcados com FITC: HO-134 (Thy 1.2), GK 1.5 (CD4) e 19.178c (CD8) [para quaisquer referências aos anticorpos veja-se Kalland, T.: Regulation of NK progenitors: Studies with

a novel immunomodulator with distinct effects at the precursor levei, J. Immunol. 144:4472-6, 1990]· 0 número de células positivas foi determinado pela contagem de 400 células no microscópio de Leitz equipado com um dispositivo de epifluorescência. Os valores representam a média + DP para três murganhos. Os resultados sugerem que a Linomide não altera significativamente a distribui ção das sub-populaçoes de linfócitos T. Os resultados que foram obtidos com a Linomide e que se apresenta nos Exemplos 1 e 2 mostram que a Linomide é potencialmente utilizável para o tratamento de infecções de VIH.

Exemplo 3

As experiências seguintes com virus de tipo VIS suportam os resultados anteriores in vitro.

Antecedentes do modelo de teste

Uma vez que os virus de tipo VIH não infectam a maioria dos animais experimentais vulgarmente utilizados tais como os ratos e os murganhos é necessário recorrer à utilização de modelos alternativos para examinar os efeitos de fármacos potenciais in vivo. É possivel considerar duas abordagens essencialmente diferentes. Foi possível reconstituir com bom êxito murganhos Scid com células hematopoiéticas humanas e verificouse que eram capazes de transportar linfócitos infectados com virus do tipo VIH (Namikawa, R., Kaneshima, Η., Lieberman, Μ., Weissman, I. L., McCune, J. M. : Infection of the Scid-hu mouse by HIV-1. Science 242:1684-6, 1988). Todavia, a relevância deste modelo é de alguma forma questionável, em particular para a investigação de fármacos que não interferem directamente com a replicação dos virus mas que se limitam a actuar sobre as células hospedeiras. Foram submetidas aos testes diversas espécies de macacos como veículos para diferentes virus de tipo VIH ou VIS. A infecção com virus de tipo VIS em macacos cinomolgos origina uma infecção com bastantes semelhanças à infecção da SIDA em seres humanos (Putkonen, P. , Warstedt, K. , Thorstensson, R. , Benthin, R. , Albert, J., Lundgren, B., Oberg, B., Norby, E., Biberfeld, G., Experimental infection of cynomolgus monkeys (Macaca Fascicularis) with simian immunodeficiency virus (SlVsm) . J. AIDS Res. 2:359-365, 1989). 0 virus pode ser isolado a partir de células linfóides e a partir de nodos linfáticos em estádios particulares e infecção, sendo os anticorpos para os VIS fáceis de detectar. Além disso, observou-se consistentemente uma diminuição absoluta no número absoluto e relativo das células T CD4+. Os animais desenvolvem uma doença clinica caracterizada por nodos linfáticos aumentados, infecções oportunísticas, perdas de peso e síndroma de definhamento. Este modelo é provavelmente o mais relevante para testar in vivo vacinas e fármacos concebidos para o tratamento de infecções de VIH em seres humanos.

Materiais e Métodos

Animais

Neste estudo foram utilizados 9 macacos cinomolgos (Macaca Fascicularis), 0 valor médio da massa corporal foi de 2 600 g variável entre 2 260 e 2 930. Os macacos foram alojados em gaiolas individuais numa instituição com o nível 3 de biosegurança. Antes de serem utilizados procedeu-se ao controlo clinico dos animais para verificação da sua saúde por exame médico confirmando-se que eram isentos de anticorpos para os VIS, em conformidade com o ensaio ELISA [Putkonen, P., Warstedt, K., Thorstensson, R., Benthin, R., Albert, J., Lundgren, B., Oberg, B., Norby, E., Biberfeld, G., Experimental infection of cynomolgus monkeys (Macaca Fascicularis) with simian immunodeficiency virus (SlVsm). J. AIDS Res. 2:359-365, 1989]. Procedeu-se ainda à investigação da ausência de retrovirus pré-existentes através de uma co-cultura de CMSP do macaco (células mononucleares do

X

sangue periférico) com CMSP humanas estimuladas por PHA e procedeu-se ao teste de sobrenadantes da cultura para verificação da actividade da transcriptase inversamente.

Fonte do virus

Em estudos anteriores [Putkonen, P.,Warstedt, K. , Thorstensson, R., Benthin, R. , Albert, J., Lundgren, B., Oberg, B., Norby, Ε., Biberfeld, G., Experimental infection of cynomol-gus monkeys (Macaca Fascicularis) with simian immunodeficiency virus (SlVsm). J. AIDS Res. 2:359-365, 1989] utilizou-se uma estirpe de VIS isolados a partir de macacos sooty mangabey infectados naturalmente (SlVsm). Uma reserva deste virus foi titulada previamente em macacos in vivo.

Proiecto experimental

tratamento intraperitoneal com Linomide ou NaCl teve início 4 dias antes do estímulo com virus vivos e subsequentemente em cada dia (não durante os fins-de-semana) por via subcutânea durante o período de acompanhamento. 0 periodo de acompanhamento foi de 75 dias após o estimulo com virus vivos.

Os macacos Ll-3 foram tratados com uma dose baixa de Linomide :0.3 mg/kg p.c.x2.

Os macacos L4-6 foram tratados com uma dose elevada de Linomide : 3 mg/kg p.c.x2.

Os macacos L7-9 foram tratados com cloreto

de sódio x2

Todos os macacos foram estimulados com 10100 SlVsm vivos correspondendo ao valor DI50 por animal. Os animais foram sacrificados quando ficaram moribundos.

Isolamento do virus e detecçao antigénica do virus

Os diversos isolamentos dos virus foram efectuados conforme anteriormente descrito [Putkonen, P.,Warstedt, K., Thorstensson, R., Benthin, R., Albert, J. , Lundgren, B., Oberg, B., Norby, E., Biberfeld, G. , Experimental infection of cynomolgus monkeys (Macaca Fascicularis) with simian immunodeficiency virus (SlVsm). J. AIDS Res. 2:359-365, 1989] com um aperfeçoamento importante. Efectuou-se o rastreio dos sobrenadantes da cultura através de um ensaio antigénico sensitivo de HIV-2/SIV [Thorstensson, R., Walther, L., Putkonen, P., Albert, J., Biberfeld, G: A capture immunoassay for detection of HIV-2/SIV antigen J. AIDS in press] . A presença de antigenos virais no soro foi determinada conforme anteriormente descrito [Thorstensson, R., Walther, L., Putkonen, P., Albert, J., Biberfeld, G: A capture immunoassay for detection of HIV-2/SIV antigen J. AIDS in press].

Ensaios serolóqicos

Não houve qualquer teste até ao presente.

Marcadores da superfície dos linfócitos

Os subconjuntos de linfócitos T no sangue

periférico foram determinados por imunofluorescência conforme anteriormente descrito [Putkonen, P.,Warstedt, K., Thorstensson, R., Benthin, R., Albert, J. , Lundgren, B., Oberg, Β., Norby, E., Biberfeld, G. , Experimental infection of cynomolgus monkeys (Macaca Fascicularis) with simian immunodef iciency virus (SlVsm) . J. AIDS Res. 2:359-365, 1989]. As amostras de sangue periférico foram incubadas com anti-CD4 conjugado com FITC (0KT4, Ortho) e com anti-CD8 (Leu2, Becton Dickinson). As amostras foram analisadas num citómetro de fluxo Spectrum III (Ortho Diagnostics) .

Resultados

Os noves macacos ficaram infectados conforme se determinou pelo isolamento dos virus (Quadro 1). Os virus foram isolados a partir de todos os animais aos 14² , 28² e 62² dias. A presença de antigenos virais no soro foi determinada 14 dias após o estímulo induzido nos nove macacos.

Os macacos L4, L6 e L9 foram sacrificados decorridos 70-82 dias devido à extraordinária perda de peso e à rápida diminuição das células CD4+ (doença semelhante à SIDA). Refere-se que o macaco L7 também estava num péssimo estado clinico .

Foi observado aumento de volume nos nodos linfáticos periféricos nos macacos L3 e L7.

Os macacos Ll-3 permaneceram clinicamente saudáveis.

As figuras 1-4 mostram as curvas de peso, a contagem de células CD4, % de células CD4 e proporção entre

células CD4/CD8.

peso corporal dos animais está indicado na figura 1. Apenas foi observada uma ligeira redução do peso nos macacos Ll-3 tratados com Linomide na proporção 0.6 mg/kg/dia. Em contraste, um macaco em cada grupo de controlo (L9} e um macaco do grupo tratado com dose elevada de Linomide apresentaram uma redução dramática do seu peso corporal.

número absoluto e a percentagem de linfôcitos T CD4+ no sangue periférico foi acompanhado a intervalos regu lares durante a experiência. 0 número de linfôcitos CD4+ foi dras ticamente reduzido no grupo de controlo ao 75^s dia (0.33 xl0⁹/l, 28% do valor inicial) mas apenas ligeiramente reduzido no grupo tratado com dose fraca de Linomide (0.92x10^/1, 70% do valor inicial) (Figura 2). De modo idêntico, a percentagem de células CD4+ no sangue periférico foi reduzida nos macacos de controlo mas ficou praticamente inalterada nos macacos tratados com uma dose fraca de Linomide (Figura 3). 0 tratamento com uma dose elevada com Linomide não alterou significativamente o número ou a frequência de células CD4 nos macacos infectados. Num ensaio de isolamento quantitativo de virus, não foi possível isolar os virus a partir de todos os macacos decorridos 14 dias apôs o estimulo e demonstrou-se a existência de antigenos virais até ao 62² dia, o último momento incluído neste ensaio (Quadro 1).

O periodo de meia vida da Linomide difere notavelmente entre espécies. É de duas horas nos murganhos, seis horas nos macacos cinomolgos, 24 horas nos ratos e cerca de 48 horas nos seres humanos. A dose inferior de Linomide na presente investigação (0.3 mg/kg x2, diáriamente) baseou-se na extrapolação de dados sobre o periodo de meia vida e sobre a actividade imunomodulatória óptima nos murganhos, ratos e seres humanos. Embora se tenha demonstrado que a curva dose-resposta da Linomi13

de em comum com muitos outros modificadores da resposta biológica apresenta uma configuração em forma de sino, inclui-se também uma dose supra-óptima (3 mg/kg x2, diariamente) para examinar os possíveis efeitos directos da Linomide sobre a replicação virai.

Claims (1)

1. Processo para a preparação de uma composição farmacêutica nomeadamente para administração oral ou parental para o tratamento de uma infecção retrovirus caracterizado por se incorporar N-fenil-N-metil-1,2-hidro-4-hidroxi-l-metil-2-oxo-quinolina-3-carboxamida (Linomide) ou de um seu sal farmaceuticamente aceitável.

   - 2^â Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a composição farmacêutica ser utilizada para tratamento de infecções HIV.

   * 1 *

   - 3² Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a composição farmacêutica ser utilizada para tratamento da SIDA e ARC.

   Processo de acordo com as reivindicaçffis ante riores caracterizado por o Linomide ser utilizado em combinação com um ou mais outros agentes anti-SIDA.

   _ ₅a _

   Método para tratar um hospedeiro infectado com um retrovirus caracterizado por se administrar uma quantidade eficaz de Linomide ou um seu sal farmaceuticamente aceitável ao referido hospedeiro.

   Lisboa, 27 de Março de 1991

   RESUMO

   PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA CONTENDO N-FENIL-N-METIL-1,2-HIDRO-4-HIDROXI-1-METIL-2-OXO-QUINOLINA -3-CARBOXAMIDA

   A invenção refere-se a um processo para a preparação de uma composição farmacêutica nomeadamente para administração oral e parental para o tratamento de uma infecção retro virus que compreende incorporar-se N-fenil-N-metil-1,2-hidro-4hidroxi-l-metil-2-oxo-quinolina-3-carboxamida (Linomide) ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.