PT96571A - Processo para a preparacao de composicoes farmaceuticas contendo n-miristoil-(s)-fenilalanina - Google Patents

Description

ADIR ET COMPAGNIB "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE CQMPOSIÇOES FARMACÊUTICAS CONTENDO N-MIRIST OIL- (S) -FENILALANINA" A presente invenção diz respeito a -um processo para a preparação de composições farmacêuticas comportando N-miris toíl-(S)-fenilalanina como inibidor da N-miristoíl-transfersse (NMT).

Ssbe-se da técnica anterior, qye o grupo amino N-termi-nal das proteínas é bloqueado por grupos acetilo, piroglutamilo e formilo. Ora, SHOJI e colao. demonstraram que o ãcido mirís tico estava ligado por uma ligação covalente ao grupo N-terminal das sub-unidades catalíticas da proteína quinase AMP cíclica dependente /'"Proe. Natl. Acad. Sei. USA", (1982), 22» 6123 -- 6131 J7. A existência, deste grupo miristoílo terminal foi desde então demonstrada em diversas outras proteínas como a calcineu-rina B Z*AITKSN e Colab, "Febs Letters", (1982), l^O, n2 2, 31^ - 318-7 a tirosina proteína quinase (TPiO £%USS e SEFTON, "J. Virol" (1985), 53, 7, 12J.

No domínio dos oneogdnes, BISHQP demonstrou, igualmen-te, que uma proteína transformsnte sofria uma miristoilsção quando da maturação. Demonstrou, alem disso, por outro lado, que esta etapa de maturação passando por uma miristoílação era essencial ao poder trsnsformante desta proteína £KAKPS, BT75S e BEFTQN, "Proc. Natl. Acad. Sei. T7SA", (1985), 82, ^625 - 1*620.7. 2 f -/

3ste conceito foi desde então generalizado a numerosas outras proteínas trsnsformantes de origem virai Z*RH33 s ΗΓΝΤΕίΐ, "«5. Virol", (1907), 61, 10^+5 - 1053-7· 3sta maturação é catalisada por uma enzima chamada N-miristoíltransferase evidenciada por T0WL3R e uLASSB /""Proc. NatL Acad. Sei. USA", (1906, 83, 2812 - 20I67.

Ora, a NMT apenas reconhece praticamente como co-subs-trato o ácido mirístico por um lado e, por outro lado, como substrato, as proteínas comportando uma glicina como último aminoácido do lado N-terminal, com participação da sequência peptídica contígua a esta glicina (participação de ?*aminoáci-dos).

Assim, a miristoílação de resíduo glicina N-terminal de algumas proteínas desempenha um papel muito importante sobre certos mecanismos que intervêm na transformação das cdlu las e o controlo da sua proliferação. Foi demonstrado, por ou tro lado, por SHOJI e Colao. (patentes de invenção japonesas JP 63 - 11+6851, Jp 62 - 255^10 e JP 62-120381+) que a miristoíl--glicina ou os seus derivados oligopeptídicos possuíam um efeito inibidor contra a transformação ou a proliferação celular ou a multiplicação de retrovírus. A presente invenção diz mais particularmente respeito a um processo para a preparação de uma composição farmacêutica comportando N-miristoíl-(S)-fenilalanina como inibidor da miris toilção de proteínas tais como gag por meio da enzima responsável por esta miristoílação, quer dizer a N-miristoiltransfe- rase. A inibição da aetiviáade desta enzima nunca foi até en- tão demonstrada por este composto. Alem disso, a utilização da N-miristoíl-(S)-fenilalanina como inibidor da NKT leva a uma inibição da actividade desta enzima, nitidamente superior a dos compostos descritos na técnica anterior como inibidores da proliferação de células cancerosas e de retrovírus.

Com efeito, um estudo aprofundado da influência exercida pela N-miristoíl-(S)-fenilalanina sobre a proliferação e a transformação celular foi realizado a partir de células cancerosas de origem murina (L 1210). Depois da extracção da enzima deste meio biolégico e medida da sua actividade, parece que a adição de N-miristoíl-(s-fenilalanina inibe fortemente a sua actividade.

Além disso, este composto, apresenta uma actividade cito tdxica sobre células cancerosas em cultura tais como L 1210 (de origem murina) ou HL 60 (de origem humana). Esta eitotoxicidade revela ser nitidamente superior à causada pela N-miristoílglici-na sobre estas células.

Assim, esta. inibição da actividade é tanto mais interes sante quanto esta enzima desempenha um papel preponderante, em particular na maturação quer de proteínas transformantes impli cadas em certos cancros, quer das próprias proteínas implicadas na maturação de retrovírus. A N-miristoíl-(S)-fenilalanina tem, portanto, potencial mente, aplicações no tratamento do cancro e/ou de doenças causa das por retrovírus como a SIDA . A presente invenção diz igualmente respeito a um proces so para a preparação de uma composição farmacêutica, caracteri-zado pelo facto de se misturar a N-miristoíl-(S)-fenilslanina ou um dos seus sais de adiçao com uma base aceitável sob o pon to de vists farmacêutico, como ingrediente activo, com um ou vários excipientes ou veículos inertes não tóxicos.

Entre as composições farmacêuticas de acordo com a pre sente invenção, pode-se citar as que convêm para a administração oral, parenteral ou nasal, os comprimidos simples ou dra-geifiçados, os comprimidos sublinguais, os saquinhos, os papelinhos, as gelulas, os trociscos, as pastilhas, os supositórios, etc. A posologia varia de acordo com a idade e o peso do pa ciente, a natureza e a gravidade da afecção, assim como da via de administração. Esta pode ser oral, nasal, rectal ou parenteral. De uma maneira geral, a posologia unitária está compre endida entre 0,1 e 100 mg para um tratamento compreendido entre 1 e 3 tomas por 2b horas.

Os exemplos seguintes ilustram o processo de acordo com a presente invenção sem contudo o limitarem de modo algum.

Exemplo 1: Síntese da N-miristoíl-(S)-fenilalanina

Estádio A: N-miristoíl-(S)-fenilalaninato de butilo terc.

Utilizando o processo descrito por VAUGHAN J. E. jr. e 0SAT0 R. L. ^fjACS, (1951), Zl> 5553 Ji obtám-se a partir de ácido mirístico e de (S)-fenilalaninato de butilo terc. o composto pretendido.

Rendimento: 92 %.

Estádio B: N-miristoíl-S)-fenilalanina

Dissolvem-se 2 g do composto obtido no estádio A em ' ·*·.Μ^***» 25 ml de diclorometano. Apos adição de 5 ml de acido triflu-oroacético, aoandona-se a solução dursnte 2k horas à temperatura ambiente. Evapora-se então até à segura. Obtém-se 0 com posto pretendido spds cristalização do resíduo em pentano e filtração.

Rendimento: *+9 í»

Ponto de fusão Kicroanálise e Uofler): 7^ lementsr: *4 7* C % H % N % Calculado : 73,56 9,93 3,73. Encontrado: 73,30 9,81 3,58

ESTUDO FÀBMACOL0GICO

Exemplo 2: Método para inibir a N-miristoíl-transferase (NMT) por análogos do produto da reacção que ela catalisa.

Estádio A: Cultura em massa de células cancerosas L 1210. Células leucémicas de origem murina (L 1210) são culti vadas em rolo de 500 a 1 000 ml em um meio comportando: meio BPMI 16^0 (libco); 10 % de soro fetal de vitela; 50 unidades/ml de penicilina; 50jM de estreptomicina; 2 mM de glutamina e 10 mM de HEPSS (Gibco). As células crescem sob agitação permanen te a 37°C sob uma atmosfera de 5 % C02/95 % ar. As células são recolhidas e lavadas. Ressuspende-se o sedimento final comportando tipicamente 2,5·10~"^ células em um tampão de li-se Z"50 mM TRIS, pH 7,9; 1 mM DTT; 1 mM EDTA e 250 mM de saca rose J. As células são lisadas e homogeneizadas. Recolhe-se os microsomas (retículo endoplásmico veziculigad.o) mediante centrifugação a 105 000 g como sedimento.

Estádio B: Solubilização da enzima a partir desta estirpè biológica. A NKT é uma enzima membranar. Para selubilizsr esta enzima, dilui-se a suspensão a 2/3 em um tampão de solubiliz^ ção: ΖΓ50 mM HEPES, pH 7,5, 1 ®M SDTA , 1 mM DTT, 10 % de * glicerol e 3 % de Triton 770J mantendo durante 30 minutos a ^°C sob agitação. Centrífuga-se, em seguida, de nnvo esta sus. pensão a 105 000 g durante 75 minutos. Os compostosrinsolúveis no detergente precipitam no sedimento. 0 sobrenacsnte com preende a totalidade da actividade NMT presente nos microsomaa de L 1210.

Estádio C: Determinação da actividade U-miristoíl-transferase 9 da sua inibição pela N-miristoíl-(Sj-fenilalanina

Os compostos sao então testados sobre o sobrenadante em competição com o substrato peptídico Gly-Asn-(Ala)^-(Arg)2 ( "CiSH” ) segundo as condições seguintes de acordo com 0 proces so descrito por T0WLSR e Colab. ZVmS, (1987), $f, 2708--2711J7. a miristoíl-Coenzima A 4 sintetizada extemporaneamen-te e enzimatieamente mediante incubação do miristato como ATP, Goenzima A (sal de lítio) e da Acil-Coa sintetase de Pseudo monas (20 minutos a 30°G). Adiciona-se depois, o páptido subs, trato e a estirpe biológica tal como obtida antes. Incuba-se a mistura durante 10 minutos a 37°C; interrompe-se depois a re-acção com 110 jil de metanol e 10 nl de ácido tricloroacático 2

Deixa-se o meio a ^°C durante 10 minutos e eentrifuga-se depois a 10 000 g·durante 5 minutos. Injecta-se uma alíquota (30 jal) do sobrenadante final em um sistema HPLC equipado com uma coluna ^iBondapak (Waters) e desenvolve-se com um gradiente linear tal como o descrito por Towler e Colab. 2TPNAS, (1937), 8ͱ , 2708-113. A detecçao do péptido acilado efectua--se com um detector radioactivo em linha (Berthold) graças à adição de 5 ml/minuto de líquido de cintilação (Zinsser). Elui-se o péptido acilado com 85 % de acetonitrilo/TFA/15 $ h2o/tfa.

Suspendem-se os compostos ensaiados como inibidores em uma solução com 0,1 % de Triton 770, depois de uma breve sôf nicsção a frio. Adicionam-se 10 yl da solução de inibidor ao meio reaccional. As condições experimentais são iguais às descritas antes. Determina-se a actividade do composto com base na diminuição da actividade controlo, incubada nas mesmas condições, mas na presença da solução de suspensão.

Nestas condições, a N-miristoíl-(S)-fenilalanina apre-senta uma Cl^ igual a 2.10 Μ, o que corresponde a uma activi dade 15 vezes superior a determinada para a N-miristoílglicina cuja CIc0 é igual a 3.10”^ M.

Exemplo 3: Citotoxicidade A citotoxicidade é determinada mediante utilização do ensaio colorimétrico descrito por AILEY e Colab. C"Câncer Res.”, (1988), 1+8, 589-001 J, Este ensaio automatizado é uti lizado em rotina com 2 linhas celulares: X 121Q, (-Xeucemia :mu-iina)e HL 60 (promielocito humano). A citotoxicidade é aprecia 8

da sobre estas linhas, mediante utilização de 9 concentrações dos compostos. A CI^q é a concentração que inibe $0 % do cres cimento das células.

Os resultados estão reunidos no quadro seguinte: ci50 (K) CI50 <«> sobre células L 1210 • sobre células HL 60 N-miristoíl-(S)- 29,5 12,8 -fenilalsnina N-miristoíl-glicina • 20,5

Estes resultados demonstram que a N-miristoíl-;CS)-fe-nilalanina apresenta uma citotoxicidade.nitidamente superior ã da N-miristoíl-glicina.

Composição Farmacêutica

Exemplo Comprimido; férmula para a preparação de 1000 com primidos doseados com 2 mg de ingrediente activo: N-miristoíl-(S)-fenilalanina c g Hidroxipropil-celulose 2 g Amido de trigo 10 g Lactose 100 g Estearato de magnésslo 3 g Talco 3 g.

Rei-

Claims (1)

1. <r.JVO REIVINDICAÇÃO Processo para a preparação de composições farmacêuticas apropriadas para o tratamento do cancro e de doenças provocadas por retrovírus como o SIDA, caracterizado pelo facto de se misturar uma quantidade eficaz igual a aproximadamente 2 g de N--miristoíl-(S)-fenilalanina ou de um dos seus sais de adição com uma base aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, com um ou vários excipientes ou veículos inertes, não tóxicos, acei táveis sob o ponto de vista farmacêutico, utilizável como inibi dor da N-miristoíl-Transferase. Lisboa, 24 de Janeiro de 1991 n, *. CRácl ^Proprsctadelp.*^’ / *