PT96052A

PT96052A - Metodo para aumentar a producao de megacariocitos

Info

Publication number: PT96052A
Application number: PT96052A
Authority: PT
Inventors: Wee Pang Yung; Karl Welte
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 1989-12-01
Filing date: 1990-11-30
Publication date: 1991-09-13
Also published as: IL96477A0; AU6967391A; EP0456812A1; WO1991007988A1; AU644837B2; EP0456812A4; JPH04503821A; NZ236236A; KR920700693A; US5762920A; CA2031233A1

Description

AMGEM INC. '•MÉTODO PARA AUMENTAR A PRODUÇÃO DE MEGACARIOCITOS" A presente invenção refere-se a métodos Para a produção de megacariocitos e de plaquetas. Mais particularmente, a presente invenção refere-se ao tratamento de doenças que envolvem a carência de megacariocitos e baixos níveis de plaquetas sanguíneas.

Antecedentes da invenção A megacariocitopolese é a produção de megacariocitos. Os megacariocitos são células grandes da medula óssea que, normalmente, não estão na circulação sanguínea. As células megacariocitos maduras apresen tam um nécleo volumoso lobulado cujo citoplasma liberta as plaquetas sanguíneas maduras. As plaquetas sanguíneas (trombocitosí, que são principalmente conhecidas pelo seu papel na coagulação sanguínea, não apresentam nem núcleo nem DNA mas contêm enzimas activas e mitocôndrias.

Os estudos com factores hemopoiéticos recombinantes purificados# em sistemas humanos e murinos demonstraram que o factor estimulante das colónias de granulócitos-macrófagos CGM-CSF) e a interleucina 3 CIL--3} são capazes de estimular a formação de colónias de megacariocitos (MK) na medula ou no sangue periférico, derivados de células progenitoras de megacariocitos (CFU— -MK) (1-7), 0 GM-CSF e a IL-3 estimulam principalmente colónias pequenas de MK constituídas por 5-20 células (6-8). A capacidade de GM-CSF ou de IL-3 de recombinação purificadqs para estimular a formação de colónias MK (1-7) e o efeito aditivo do dois factores (3,6) é um efeito conhecido. 0 factor estimulante de colónias de granulócitos (“G-CSF") tem sido referido como reforçando a formação de colónias de MK dependentes de IL-3 murinas (8) . A actividade estimuladora de colónias específicas de megacariocitos (MK-CSA) tem sido referida por vários investigadores como estando presente em meio condicionado de leucócitos de sangue periférico (PHA— -LCM) (9,10), soro e plasma de vários tipos de doentes, em plasma de doentes com trombocitopénia amegacariocíti— ca (12) ou em extractos urinários provenientes de doentes com anemia aplásica e púrpura trombocitopénica idio-pática (11), assim como de fontes de células estabelecidas (11-13). Além disso, têm sido descritos factores de potenciação ou sinérgicos que reforçam o número de colónias de megacariocitos, o número de células e a maturidade e tamanho das mesmas·(8,14-16) . Contudo, a natureza bioquímica de MK-CSA e destes factores auxiliares, ainda não foi bem definida.

Tayrien e Rosenberg referiram um factor estimulante de megacariocitos (MSF) (13). e McDonald refe 3 riu na presença de uma trombopoietina (36) ambos existen tes em meio condicionado por células embrionárias de rim. Tem sido referida a trombopoietina como carente de acti-vidade estimuladora de colónias MK directa (37) . Ainda aguarda a confirmação através de clonagem genética que o MSP seja uma nova linha de MK-CSA específico com acti-vidade directa de estimulação de colónias MK,

Foi descrita a necessidade de 2 ou mais factores para interactuarem na estimulação óptima para a formação de colónias MK in vitro quer em sistemas muri-noS/ quer humanos (14-16, 38). Estes estudos implicam uma actividade de potenciação da megacariocitopoiese, embora a natureza bioquímica do(s) factor(es) de potenciação esteja ainda por determinar. Numerosos investigadores têm referido a capacidade da eritropoietina (EPO); para estimular a formação de colónias de megacariocitos (39,4o) e para reforçar a eficiência de clonagem de MK (41). Utilizando sub-populaç8es muito enriquecidas de células progenitoras hematopoiéticas e um meio quimicamente definido isento de soro, Lu et al. não conseguiram demonstrar um efeito directo de EPO (6). A interleucina 4 (il-4 ou BSF-1), também referida como reforçando a formação de colónias MK muri-nas (42) , foi também ineficaz.

Sumário da Presente Xnvenção A presente invenção refere—se a um método para a produção de megacariocitos. A presente invenção compreende a administração a um mamífero de uma quantidji 4 de eficaz sob o ponto de vista farmacêutico de G-CSF e de uma quantidade eficaz sob o ponto de vista farmacêuti co de IL-3 ou GM-CSF e, eventualmente, de uma quantidade eficaz sob o ponto de vista farmacêutico de IL-6. a presente invenção também inclui a administração de uma quan tidade eficaz sob o ponto de vista farmacêutiso de GM--CSF e dè uma quantidade eficaz sob o ponto de vista farmacêutico de IL—5. Esta invenção também se refere a composições que contêm quantidades eficazes sob o ponto de vista farmacêutico de G-CSF e de GM-CSF e/ou de IL-3 e, eventualmente, de uma quantidade eficaz sob o ponto de vista farmacêutico de IL-6 e a composições que contêm quantidades eficazes sob o ponto de vista farmacêutico, respectivamente, de GM-CSF e IL-5. A invenção re£ere-se a um método para a produção de plaquetas sanguíneas, que consiste em administrar a um mamífero uma quantidade eficaz sob o ponto de vista farmacêutico de IL-6 e, eventualmente, uma quan tidade eficaz sob o ponto de vista farmacêutico de IL-3, G-CSF ou GM-CSF. A presente invenção também se refere a composições que contêm quantidades eficazes sob o ponto de vista farmacêutico, respectivamente, de IL-6 e de IL--3, G-CSF OU GM-CSF.

Breve Descrição dos Desenfoos

A Figura 1 representa um reforço sinérgi-co na formação de colónias de MK dependente de GM-CSF. Cultivaram-se em placas em triplicado células de medula óssea depletadas a 10^/ml. Utilizaram-se GM-CSF e G-CSF 5 / a lng/ml e IL-5 e IL-6 a 10 ng/ml. o símbolo * representa valores que sob o ponto de vista estatístico são signi ficativamente (p^ 0,05) diferentes de GM-CSF isolado. 0 sinal + representa valores que sob o ponto de vista esta tístico são significativamente diferentes de GM-CSF+G--CSF. A Figura 2 representa um aumento sinêrgi- co na formação de colónias de MK dependente de IL-3.

Cultivaram-se células de medula óssea depletadas em pla- 4 cas triplicadas a 10 /ml, 0 símbolo * representa valores que sob o ponto de vista estatístico são significativamente Cp<0/05), diferentes de IL-3 isolada. 0 sinal + representa o valor estatisticamente significativo diferente de IL-3 + G-CSF, A Figura 3 representa um número de plaque tas sanguíneas de 3 macacos que receberam injecções diárias por via subcutânea de 10 jig/kg de IL-6 durante 18 dias (animal #1) ou 21 dias (animal #2). A Figura 4 representa um número de plaque tas sanguíneas de 1 macaco que recebeu- injeqçSes diárias por via subcutânea de IL-6 e de IL-3 a 10 pg/kg, cada uma delas# durante 32 dias. A Figura 5 representa um número de plaque tas sanguíneas de 2 macacos que receberam injecçSes diárias por via subcutânea de 10 }ig/kg de IL-6 e de G-CSF, também a 10 jug/kg durante 17 dias (animal #51 e 25 dias (animal# 6} , A Figura 6 representa a contagem de pia- 6' quetas sanguíneas de 1 macaco que recebeu injecções diá rias por via subcutânea de IL-6 a 10 pg/kg, e de GM-CSF também a 10 pg/kg durante 21 dias. A placa 1 representa, com uma ampliação de 4oox, colónias de granulócitos macrófagos negativas para imunofosfatase alcalina (a & b). Com baixa amplia-ção (lOOx), a segunda representação mostra colónias MK positivas para imunofosfatase alcalina entre colónias GM negativas para imunofosfatase alcalina (cK Utilizou-se nestas preparações um anticorpo GPIIIa anti-humano mono-clonal murino. 0 uso de anti-FVIII deu resultados similares. A placa 2 representa, com uma ampliação de 400x, uma pequena colónia MK imuno-AP positiva (a).

Um meio com grande ampliação ClOOOx) mostra colónias MK fortemente imuno-AP positivas (b); grande colónia MK fortemente imuno-AP positivas (400x) (c). Hestas preparações utilizou-se como anticorpo principal um anticorpo GPIIIa anti-humano monoclonal murino. 0 uso de anti-FVIII. deu resultados similares.

Descrição Promenorizada da Presente Invenção

De acordo com o objectivo da presente invenção, descrevem-se métodos para reforçar a megacario-citopoiese.

Para se estudar o efeito de varias cito-cinas de recomhmaçao sobre a megacariocitopoiese humana utilizou-se um sistema de cultura clonal em agarose semi -sólida independente de soro ou plasma humanos. Dado que vários estudos demonstraram influências reguladoras de células T, células embrionárias de rim e células NK sobre a megacariocitopoiese in vitro (13, 17-20)# utilizaram--se células de medula exaustivamente depletadas de células T# células B# células NK# macrófagos# granulócitos e elementos eritrócitos maduros (21). como uma fonte de precursores de megacariocitos enriquecida (CFU-MK). Iden tificaram-se as colónias de MK in situ por coloração com imunofosfatase alcalina para ÇSPIIIa# glicoproteína de plaquetas marcadoras específicas de MK/plaquetas e/ou antigene relacionado com o factor VIII (FVIII) (22-25).

Os exemplos que se seguem demonstram o reforço sinêrgico da megacariocitopoiese iri vitro dependente de GM-CSF/IL--3, por IL-5, G-CFS e IL-6. 0 factor estimulante de colónias de granu lócitos macrófagos humano recombinante (GM-CSF) (Cantrell et al.# PNAS, 82 (1985) 6250) ou interleucina 3 (IL-3) # (Yang et al.# Cell# 47 (1986) 3), estimulam a formação dependente da dose de pequenas colónias MK# entre 3 a 20 células. Os níveis de equilíbrio- de colónias MK foram atingidos com concentrações 0,1-1 ng/ml de GM-CSF ou com aproximadamente 1-10 ng/ml de IL-3. Estes resultados estão de acordo com os referidos por outros investigadores (5-7). 0 uso de células auxiliares de medula depletadas e de soro de bovino fetal inactivado pelo calor# em vez de plasma humano minimizou o efeito que produz a presença no plasma humano de factores acessórios e cito-cinas produzidas endogenamente. Sob estas condições de 8 cultura# as colónias induzidas por GM-CSF ou por IL-3 foram predominantemente colónias pequenas (3 a 10 células) · A IL-5 humana recombinante (YoKota et al.# PNAS, 84 (1987) 7388) e o factor estimulante de colónias granulocíticas (G-CSF) (Souza et al., Science, 232 (19861 61) não possui actividade estimuladora de colónias MK. Contudo# a adição de IL-5 ou de G-CSF a culturas contendo GM-CSF resultou no aumento do número de colónias totais# assim como no aparecimento de colónias maiores# até 50 células* Descobriu-se que o G-CSF (a 0#0l-l ng/ml) , que por si próprio não mostrou actividade estimuladora de colónias MK# reforça de forma significativa a formação de colónias MK induzida por GM-CSF ou IL-3, resultan do no aumento do número total e do número das células das colónias. A IL-5 recombinante que# tal como G-CSF, não tem actividade directa de estimulação de colónias MK também mostrou um efeito reforçador da megacariocitopoiese dependente de GM-CSF. A IL-5 não tem efeito sinérgico com G-CSF para aumentar a formação de colónias MK induzi, da por GM-CSF. 0 efeito de IL-5 na formação de colónias MK induzida por IL-3 não se mostra dado que a associação de IL-3 com IL-5 resulta principalmente num reforço da diferenciação eosinófila e na formação de colónias (35).

Embora a IL-6 (Hirano et al.# Nature# 324 (1986) 73)# por si própria não consiga aumentar a formação de colónias MK dependente de GM-CSF# no entanto# é capaz de aumentar o reforço de G-CSF na formação de coió 9 nias MK dependente de GM-CSF. Este reforço foi obtido pela adição simultânea de IL-6 a 1-10 ng/ml. Além disso# as colónias estimuladas por uma associação de GM-CSF, G-CSF e IL-6 eram# de um modo geral# maiores# com colónias até 5o células pu mais facilmente detectáveis. Obser· vou-se um aumento similar com a associação de IL-3# G-CSF e IL-6, Contudo# o reforço da formação de colónias MK dependentes de GM-CSF# pela IL-5# não pôde ser aumentado por IL-6. Os estudos no decurso do tempo mostraram que o G-CSF é mais eficaz quando adicionado conjuntamente com GM-CSF ou com IL-3 ou imediatamente após o início da cultura# embora a IL-^ pareça aumentar o reforço induzido por G-CSF quando adicionado tardiamente, por exemplo# ao fim de 7 dias# com a condição de G-CSF estar presente no início da cultura conjuntamente com GM-CSF ou IL-3.

As designações aqúi utilizadas "G-CSF"# "GM-CSF" # "IL-3", "IL-5" e "IL-6" referem-se 'as proteínas extraídas e purificadas de origem natural ou obtidas a partir de sistemas de culturas de células recombinan-tes. Do mesmo modo# as designações abrangem equivalentes biologicamente activos# diferindo# por exemplo# de um ou mais aminoácidos na sequência total ou nos esquemas de glicolisação. Além disso# as designações também se cons_i deram abranger variantes de substituição# deleção e inserção de aminoácidos ou após modificações translaccio-nais. A presente invenção refere-se a composições que contêm# essencialmente# quantidades eficazes sob o ponto de vista farmacêutico de G-CSF e GM-CSF ou IL-3 e# eventualmente# IL-6. Num outro aspecto da presente invenção -10-^

‘χ descrevem-se composições, que consistem essencialmente em quantidades eficazes sob o ponto de vista farmacêutico de GM-CSF e IL-5. A presente invenção refere-se a métodos Psra reforçar a trjombòpoiese. A fim de analisar os efeitos in vivo de IL-6 isoladamente ou em associação com IL—3, GM-CSF e G-CSF sobre o sistema hematopoíético, selec cionou-se um macaco cinomologus como um sistema de experiência baseado nas similaridades entre a hematopoiese humana e simiana. À IL-6 isolada ou em .associação com IL-3, GM-CSF ou G-CSF foram administradas (10 jxg/kg/d) por injecções subcutâneas diárias durante períodos variáveis. Quando se administrou apenas IL-6, aumentou o númerp de plaquetas sanguíneas periféricas para o triplo e alcançou o máximo fio décimo dia de tratamento. A presente invenção também se refere a composições que contém essencialmente quantidades eficazes sob o ponto de vista farmacêutico de IL-6 e, eventualmente, IL-3, G-CSF OU GM-CSF.

Outro aspecto da presente invenção é a adição de factores de células indiferenciadas a qualquer das composições ou métodos de tratamento descritos ante-riormente, 0 factor de células indiferenciadas está descrito no pedido de patente de invenção norte-americana ns 422 383, de propriedade comum, aqui incluído a título de referência.

Também, a presente invenção abrange com- - 11 - posições farmacêuticas que contêm quantidades eficazes sob o ponto de vista farmacêutico das proteínas designadas anteriormente conjuntamente com diluentes, agentes conservantes# solubilizantes/ emulsionantes, agentes adjuvantes e/ou veículos apropriados.

Devem ter-se em consideração diversas variáveis, na determinação da concentração das proteínas nas composições terapêuticas e nas doses a administrar.

As variáveis terapêuticas também incluem a via de administração e a situação clínica do doente.

Os métodos e as composições da presente invenção são úteis para o tratamento da trombocitopénia, uma doença caracterizada por um número subnormal de plaquetas presente na circulação sanguínea e que é a causa mais corrente de hemorragia. A trombocitopénia resulta de três processos: (lí deficiência na produção de plaque tas, (2) destruição acelerada das plaquetas e (3) distri buiçlo anormal das plaquetas no organismo. No Quadro A indicam-se as doenças específicas relacionadas com a trom bocitopénia. As aplicações vantajosas da presente invenção são na trombocitopénia resultante da produção de pia quetas deficiente e em alguns casos na destruição acelerada das plaquetas.

QUADRO A

Doenças das Plaquetas X* Produção Plaquetária Deficiente A. Hipoplasia ou supressão de megacariocitos por agentes químicos, e físicos (ionização, radia- 12 ção# fármacos antineoplásicos) anemia aplásica# processos mielofísicos de hipoplasia megacario cítica congénita# algumas infecções virais. B. Trombopoiese deficiente.

Doenças provenientes de carência em vitamina B12 ou de ácido fólico. C, Doenças dos mecanismos de controlo#

Carência de trombopoietina# trombocitopénia cíclica. D. Diversos,

Muitas formas hereditárias. II. Destruição Acelerada das Plaquetas A. Devido a processos imunológicos# púrpura trom-bocitopénica idiopática# anticorpos induzidos por fármacos# anemia hemolítica diversa# incom patibilidade fetomaterna# pós-transfusão. B. Devido a processos não imunológicos# síndrome de Kasabach-Merritt# púrpura trombocitopénica trombótica# infecções (virais# bacterianas ou protozoárias)# transfusões massiças. III. Distribuição Anormal das Plaquetas A. Doenças do baço B. Anestesia hipotêrmica A formação deficiente de plaquetas resulta normalmente da hipoplasia ou da supressão dos megaca-riocitos precursores. A depleção de conjuntos de megaca-riocitos pode ocorrer durante afecções da medula provo- cadas por exposição a fármacos ou a irradiação mielossu-pressores. Estes doentes sofrem de trombocitopénia como resultado de quimioterapia ou de terapêutica de irradiação podem tratar-se pela administração de quantidades eficazes sob o ponto de vista farmacêutico de GM-CSF ou de IL-3 em associação com quantidades eficazes sob o ponto de vista farmacêutico de G-CSF e de IL-6 para aumentar o número, de plaquetas sanguíneas e impedir hemorragias. Níveis reduzidos de plaquetas também são provenientes de trombopoiese deficiente pu de doenças relacionadas com o controlo trombopoiético em que os valores dos megacario-citos são normais, mas em que a maturação destes foi interrompida. Nestas circunstâncias, um método vantajoso de tratamento é a administração de uma quantidade eficaz sob o ponto de vista farmacêutico de IL-6 e, eventualmen te, de uma quantidade eficaz sob o ponto de vista farmacêutico de IL-3/ GM-CSF ou de G-CSF. À destruição acelerada das plaquetas pode resultar numa trombocitopénia mesmo se a produção de megacariocitos e de plaquetas não tiver diminuído. As doenças tais como a púrpura trombocitopénica idiopática (ITP) que são caracterizadas pela destruição rápida das plaquetas, induzida por uma resposta auto-imunológica, pode tratar-se mediante a administração de agentes imunos supressores (tais como os corticosteróides) associados a uma quantidade eficaz sob o ponto de vista farmacêutico de IL-6 e, eventualmente, uma quantidade eficaz sob o ponto de vista farmacêutico de IL-3, GM-CSF ou de G-CSF.

0 GM-CSF e a IL-3 desempenham um papel pripordial na formação, de colónias in vitro de CFU-MK humanas. Os resultados apresentados em seguida proporcio nam a prova da função reguladora do G-CSF, da IL-5 e de IL-6 humanos na formação in vitro de colónias de megaca-· riocitos dependentes de GM-CSF ou de IL-3, o G-CSF, a IL-5 e a IL-6 aumentam a eficiência de clonagem e o tama nho das colónias. A capacidade de IL-6 para aumentar o reforço de G-CSF na formação de colónias MK dependentes de GM-CSF ou de IL-3 confirmam mais a existência de mul-tifactores, assim como de mecanismos de controlo de mul-tinível da megacariocitopoiêse humana. Os resultados do estudo ao longo do tempo, apresentados a seguir, sugerem mecanismos de acção, distintos para G-CSF e para IL-6. 0 G-CSF parece afectar a formação de colónias de megaca-riocitos num estádio precoce, possivelmente a indução de autorrenovação dos percursores de MK ou o recrutamento de progenitores precoces para se diferenciarem, enquanto o IL-6 parece afectar um evento tardio, possivelmente por aumento do tamanho das colónias ou indução da distri buição da linhagem de MK. Os exemplos que se seguem são apresentados para melhor ilustrar a presente invenção mas não devem ser considerados como limitativos do seu âmbito. EXEMPLO 1

Anticorpos monoclonais e anti-soros A Becton Dickinson forneceu anti-Leu 1 monoclonal, Leu 5b, Leu 4, Leu 11b, Leu Ml, Leu 16, Leu 19 (Mountain View, CA); obteve-se 0KT4, 0KT9, 0KB2 nos 15

Ortho Diagnostic Systems (Raritan, NJ); ΜΎ4 e M01 na Coulter Immunology (Hialeah, FL) , e obteve-se anti-gli-coforina e I0T8 em MAC, Inc. (Westbrook, ME) ; anti--GPIIIa monoclonal, antigene relacionado cora anti-Factor VIII (FVIII) e B22 em Dako (Santa Barbara, CA) e obteve--se GPIII em Biodesign (Kennebunkport, ME). Adquiriu-se a Accurate Chemical (San Diego, CA) albumina anti-humana de carneiro. Adquiriram-se Ig anti-murganho de caprino purificada por afinidade e uma fosfatase alcalina conjugada com um fragmento F (ab·') 2 de IgG anti-murganho de caprino purificada por afinidade (contendo 81,6 unidades de activ idade enzimática por ml) , à. Cappel/Organon Teknika Corp. (West Chester, PA). Obteve-se albumina anti-humana de carneiro na Serotech (Accurate Chemical). Adquirinam--se pérolas magnéticas revestidas com IgG anti-murganho de caprino (Dynal) de Robbin Scientific (Mountain View, CA) . EXEMPLO 2

Pactores de crescimento recombinantes

As actividades específicas de G-CSP, GM--CSP e IL-3 humanos recombinantes utilizados nas presentes experiências eram aproximadamente cada um a lO^U/mg, analisados de acordo com o método de Nicola et al. (26,27). A IL-5 e a IL-6 recombinantes humanas mostraram activida ç· des específicas de 10 U/mg e 2xl0y U/mg, respectivamen-te, definindo-se uma unidade de actividade como sendo o recíproco da diluição que apresenta metade da actividade máxima nos seus sistemas de ensaio respectivos. A activi. 16 dade de IL-5 foi avaliada por diferenciação eosinófila de progenitores eosinófilos de medula humana (28) e pelo ensaio de peroxidase eosinófila (29). A actividade de IL-6 foi avaliada por determinação da produção de IgM de linha de células linfoplastóide B humana, SKW6-CL4 (3o). EXEMPLO 3

Preparação de células de medula óssea humana

Obtiveram-se as células de medula óssea humana por aspiração da cristã ilíaca de dadores voluntários saudáveis após obtenção do respectivo consentimen to. Separaram-se da medula células de revestimento por centrifugação em Ficoll-paque (densidade 1/077 g/ml; Pharmacia/ Piscataway, NJ) a 5ooxg durante 30 minutos.

As células da interfase foram recolhidas e lavadas com tampão de cloreto de sódio com fosfato (PBS) contendo albumina de soro de bovino a 1% (BSA) e ressuspenso em meio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM) suplementado com 10% de soro de bovino fetal inactivado pelo calor (FBS). Separaram-se as células de medula das células aderentes por aderência a placas de petri de plástico durante 90 minutos á temperatura de 37° C, em atmesfe ra humidificada com 5% de C02-95% de ar num incubador. Salvo indicação em contrário, as células de densidade baixa não aderentes de medula foram tratadas com uma mijs tura de anticorpo monoclonal para depletar as células T (anti-Leu 1, Leu 5b, 0KT4, I0T8) , células B (anti-CD22, 0KB2), células NK (Leu 11b, Leu 19) , monócitos residuais, granulócitos e outras células mielóides diferenciadas 17

(Leu Ml, Mol, My4) , elementos eritróides (anti-glicofo-rina) e células activadas e de proliferação (0KT9). Nalgumas experiências apenas se realizou a depleção de células T nas células NAL, o que se fez por tratamento com anti-Leu 1. Realizou-se a depleção de células ligadas a anticorpos monoclonais por agitação de placas de petri revestidas com IgG de caprino anti-murganho (50 jug/placaí (Bectodishes, 100x15 mm, Fisher Scientific), seguida de lise mediada por complemento com uma diluição a 1:15 de um complemento de coelho Low Tox (Accurate Chemical, Westbury, NY) (31), Para assegurar a depleção completa das células ligadas a um anticorpo as suspensões celulares foram depois tratadas com 100 pl de pérolas magnéticas revestidas com anti-Ig por 10^ células durante 20 minutos e as células ligadas foram removidas por um íman (32). As populações resultantes foram referidas como células de medula óssea auxiliares depletadas (Acc-BMC) células de medula óssea depletadas 0RT (NALT-BMC). As NALT-BMC constituíam aproximadamente 40% da população inicial, embora as Acc-BMC fossem aproximadamente 5% da população inicial. EXEMPLO 4

Desenvolvimento clonal de progenitoras megacariociticas (CFU-MK) em aqarose

Salvo indicação em contrário, cultivaram--se Acc-BMC a 104 células por placa em placas de petri Lux de 35mm (Nunc, Inc.), em triplicado, com 1 ml de agarose a 0,32% em meio IMDM suplementado com 10% de soro 18 bovino fetal inactivado pelo calor (Hyclone), . Incubaram--se as culturas a temperatura de 37° C num incubador humidificado contendo 5% de CO^ e 95% de ar, durante 12 dias. EXEMPLO 5

Identificação das colónias de meqacariocitos

Detectarain-se as colónias de megacarioci-tos por uma modificação da técnica da imuno-fosfatase alcalina descrita por Hanson et al. (34) utilizando anti corpos monoclonais contra glicoproteínas GPIIIa de plaquetas ou GPIIb/IIIa ou factor VIII e fragmento F(abl)2 marcado com fosfatase alcalina da IgG anti-murganho de carneiro purificada por afinidade (AP-anti-Ig). Todos os anti-soros e anticorpos monoclonais foram diluídos em PBS + 1% albumina de soro bovino (BSa). As placas de cul tura foram fixadas com formalina a 2,5% em acetona duran te 1 minuto, lavadas e transferidas para microllminas 75X50 mm Corning e secarahi-se ao ar. As lâminas secas foram mergulhadas em água durante 5 a 10 minutos para remoção dos sais e cor do indicador presente no meio de cultura. As lâminas foram secas ao ar durante a noite, tratadas com PBS contendo uma solução a 2% de soro AB humano e soro de cordeiro a 2% para bloquear os sítios de ligação não específicos, seguidos por uma diluição a 1:150 de anti-GPIIIa ou de GPIIb/IIIa ou de anti-FVIII durante 1 hora â temperatura de 4o C, lavaram-se durante 1 hora em PBS diluído a 1:1. Em seguida trataram-se as lâminas durante 1 hora a temperatura de 4o C, com AP-anti 19 -Ig a uma diluição a 1:250, seguida de lavagem completa com PBS diluído a 1:1 para eliminar o excesso de anticor pos não ligados.

Os controlos eram lâminas não tratadas com anticorpos ou tratadas com o anticorpo de bloqueamen to seguido por AP-anti-lg. As lâminas tratadas e de controlo foram em seguida desenvolvidas durante 20-30 minutos numa mistura recentemente preparada a 0,26 mg/ml de fosfato de d-naftol AS-BI (solubilizada em dimetilforma-mida) e 1 mg/ml de sal Fast Red TR tampão Tris 0,2M (pH 9,0) contendo MgCi^ 5mM e Levamisole lmM (tudo de Sigma) como um agente inibidor da fosfatase alcalina celular e coradas para contagem durante 5 minutos por hematoxilina de‘ Mayer (Sigma) . As colónias de megacario-citos positivas para GPIIIa ou SVIII mostraram uma coloração citoplásmica avermelhada. As lâminas das colónias não tratadas e de colónias tratadas com AP-anti-Ig não coraram ou coraram fracamente no substrato.

Os resultados das culturas em triplicados de experiência única ou de experiências múltiplas foram expressos como a média mais ou menos o desvio-padrão (x - S.D.). 0 significado estatístico, quando indicado, foi determinado utilizando o teste-t de Student de duas--caudas, ("two-tailed"). EXEMPLO 6

Enriquecimento de células progenitoras megacariociticas por depleçto de células acessórias

Determinou-se a capacidade de NALT- e de 20

Acc-BMC para formarem colónias de megacariocitos na presença de lOOOU/ml de GM-CSF. A remoção de células T ou de células acessórias não diminuiu a formação de colónias CFU-MK (Quadro 1) . 21//

Enriquecimento de CFU-MK na medula desprovida de células acessórias U 1 (d ‘4 a 0 U (D ft -μ CQ CD E CQ -μ (D cd G •H (d CQ 0 Q) G fd G *** CM H CM CM O + + + + •H μ <© <d o O Η CM O n CM vl1 U5 £ 3 •ri o o O 0 o O O O O £ -μ μ •h *s % ** ** 0 iH ω 0 £ o o O o 0 O o o O 0 G a • G (D CD O IX) <0 t» +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 5-i (D o •H cd CQ O G co co Ci LO *H CD CM ω •st· O fd CQ O •H 0 O O o O i CM CM co G ri ro r-t * % * * * s * * * cd ri V 0 O Ό O O o O O O O £ CQ a G fd CQ Λ H 0 G ri υ ía O ro m 03 c—1 -μ •cr* * U 0 H Ω I o 0 03 H g CQ S! -H CM H VD Η O co CM 3* CO CD CD 0 B í4 +1 t μ ϊ +1 +1 +| +1 -H +1 +1 +1 (D Ό 0 M CQ £ π O Cl CD lo ro CD CM tn ^}I 0 o fe CM CM si* CM LO CM CM cn CD υ £ E CQ ft O N3 0 ri O G ri ro O ro μ Ή 0 V ro m •—> ri •H a cd fd ri £ H tn G 0 G CQ G •H μ 0 Γ—1 cd Ό 'C O SD 0 0 O cd i—1 g *ro ÊS CD -μ Q) G Ê fd CQ -μ ri tf (tí ta ro cd Λ g 0 01 c—) G ro • -r) & 0. -μ 0 M-l μ P ?ro •ri G (D μ G 0 CQ rd tf 0 (D ro H M a CQ O CQ P. 1 01 in H •CP cd 0 0 0 B o K O μ μ -H P r—! in 3 > G •μ CQ CQ 0 —1 0 CD g 3 d ri ro 0 cd o 'd 0 •H 0 CQ +3 •μ O cd CQ +1 Tfi G S U o •H CD o m g CQ O μ e O g CQ rd • ri • ro cd g PQ 1 ri fd ro CQ +3 -μ m μι 1 0 o o td CQ fd i4 (4 0 td •H ri 0 μ © H < o H H ro B B < * ft a μ + 22 f» A depleção de T que removeu aproximadamen te 4o% de células de medula nucleadas resultou em cerca de duas vezes o aumento da eficiência de clonagem, enquan to a depleção de células acessórias, que removeu 95% das células nucleadas da medula, resultou num aumento de 10 vezes ou mais na eficiência de clonagem.

Uma comparação das várias citocinas mostrou que o 6M-CSF, assim como a IL-3 possuem actividader-estimuladora de colónias ME, enquanto G-CSF, Hj-5 e IL--6 foram inactivos (Quadro 2} , 23

ο μ -μ •Η ρ>α •Η -f. £ μ CM ο 1—1 03 rH Η Η ΐ~< ιΗ β 03 /3 G ο Ο ο **—> 0 *—> *,_* Η 0 Φ a Φ Η 10 ο ι—1 ιη ιη +1 +1 +1 +1 -Η +1 +1 R Οω ρ,+1 Ο Ο Ο ιη ^ oj [Q Φ •Ρ α cti σ» ο «ι ο ^ Η G 0 >«ί •Η +> 03 03 03 JQ •Η .__* w V***· £ ϋ 03 £ £ £ £ 0 0 (ti •μ >-* Ρ Ρ Ρ ϋ •μ •Η Λ Οί Η CS1 Λ a a φ μ α G ΓΟ 03 s-> β G G μ cd '0 «Η Φ w Φ Φ φ Ο r-i a ΓΟ Ω Ω (Μ ΓΟ Ω a a a m Φ 0 Η a a a 0 φ υ 0 +1 +1 +1 +1 0 φ 0 Η £ οι Ω CM -μ a CM Η Η Η *φ Φ •Η υ 0 03 Ρ. ω 0 cd 0 Ο £ •ri ífd tt! φ c ο Q £ '0 cd Η ι< ιΗ μ γΗ Η Ο !=> ω 0 μ g I % * ο α Φ ϋ C3 Ν ι ο 1—1 Ο Ο Ο Ο .Η ο ο ο μ Φ D3 1 γΗ 0 ι—1 γΗ Η γΗ 0 Φ ο α ι—1 -μ υ α 1 | 1 ο ο (ϋ 0 ο rH ι—! γ—i m ω Ο Η U '(ϋ > jrd ο φ £ U Ο ιμ φ υ ο •μ •Η φmw

φ •φμ Λο CQ ο U (0 c ο •Η ϋ Η 13 -«3 μ ο •μο cti ο ι—1 ο μ +) G Ο Ο I ο •Η φ a r Μ U I ã a ο μ £3 Π φ Γ0 Ω 03 m 10 1 Ο ι 1 Ω 1 Ω Ω Η 0 Η Η 24

Plaquearam-se as células de medula óssea depletadas aces-4 sorias a 10 células/ml. + Os resultados estão expressos como o número de colónias médio + o desvio-padrão (SD), n representa o número de experiências reunidas. Algumas células de dador mostraram respostas significativamente mais altas do que outras, pelo que estas foram reunidas separadamente. ND, não determinado. G-CSF estimulou principalmente colónias de neutrófilos e IL-5 estimulou colónias pouco numerosas geralmente menos de 10, de eosinófilos (azul de Luxol positivas) embora a IL-6, nas concentrações testadas não apresentassem actividade estimuladora de colónias. GM-CSF estimulou colónias de MK que, de um modo geral, eram pequenas, a maioria contendo menos de 10 células por colónia. A IL-3 estimulou colónias com tendência para serem ligeiramente maiores (5 a 20 células). A coloração com imuno-fosfatase alcalina seguida de coloração de contagem de Hematoxilina mostrou que estas colónias MK eram fortemente positivas para GPllla assim como para IVIII e para uma relação de núcleo para citoplasma relativamente mais alta (Placa 1). As lâminas de controlo e colónias não MK nas mesmas lâminas não mostraram ou mostraram muito pouca coloração pela fosfatase alcalina (Placa 1). As concentra ções GM-CSF e de IL-3 da ordem de 10 e de 100 U/ml, respec tivamente, verificaram-se serem adequadas para estimularem os níveis máximos de desenvolvimento de colónias MK. Como se utilizaram dadores diferentes para cada experiência observaram-se algumas diferenças na influência de clonagem - 25 - f

entre os dadores. Alguns demonstraram níveis máximos de 10 a 20 colónias/10^ Acc“BMC, enquanto outros foram signi ficativamente mais altos (40-50 colónias}. Deste modo, por razões de clareza, os dados foram reunidos separadamente (Pools 1&2, Quadro 2}.. EXEMPLO 7

Reforço na formação de colónias MK por G-CSF e IL-5

Embora o G-CSF, por si só, seja inactivo como factor estimulante de colónias MK, não é todavia capaz de reforçar a formação de colónias MK estimulada por GM-CSF ou de IL-3 (Quadro 3}. 26

+ o oo 03 03 P P •tf +1 +1 B a a ot σ\ x tf σι H —I t—\ M 0 -8¾ ft + ro Lf) P H •3* LO o a (ti I ca ro u P 4-1 P Q +1 Ή +1 +1 •rl H +1 a B a N X LO ro õ t£) 00 d (D ÍQ H in tf tf D- tf (ti β a •r) •rl CQ β U '0 + + m 1 i—l 03 03 ro VD B g 0 0 0 03 d 3 +> O + | +1 +1 +1 P P •rl P a β β 0 0 01 X ro H to tf © © 0 ft B w —] 03 03 a B B •H u ta (ΰ 0 + Ί o Ό ΓΠ [> Ο a g £ (ti (ti r-l 3 d ro Di o> +1 +1 +1 +i P P © M a q β O g 0 X 00 tf I> © © m 03 tf a B P © © < S-i D α m s (ti ro a CX •H 1 £ rH β p X g 0 H pi a rH X H β £ £ a r-> a* O M a X X β a a a 0 0 1 Di D» iH g g g a rH β β 1 X X X © O O O «—1 Di a D> 0) 'V a 1— * β β β o 1 1 o q o O 0 ia a rH a a a i(ti CQ a •—’ O a s_^ v_> o U 0 CQ tn to ra to to to © 1 Ό O 1 1 υ 1 1 1 E £ (ti 1 P P 1 P P P H 0 g O H H CD H H H 0 o Ί· + + a •rl 4- 4* 4- + 0 /-s >-~N Λ •rl r—1 iH a rH rS í-r* íO 'O £ g S g rH rH a a I—1 <3 X X X X 6 £ £ £ £ Di Di Di Di X X X X X β β β β Di Di Di D> Di co r-i rH a a β β β β β © «w* >—> O O O rH O i—1 rH a X1 a P a a a a S«u^ w 0 ta to CQ CO a -P o D υ υ CO CO ro ω to 0 1 1 1 1 1 i 1 o 1 © S X a a P P 1 P ta O CD o 0 H H H D H Células de medula óssea desprovidas de células acessórias plaqueadaa IO4 células/ml.

Resultados de experiências separadas expressos sob a forma do número médio de colónias de culturas em triplicado + o desvio-padrão. Nos casos em que se indicou um intervalo de concentrações de G-CSF e IL-5 ou IL-6/ os valores apresentados representam as médias de grupo e os desvios-padrão. + estatisticamente significativo comparado com GM-CSF ou IL-3 controlos, p<0,05.

Este aumento pode ser detectado independentemente do nível da linha de base da resposta de colónias MK a GM-CSF ou a IL-3. Assim, as células de medula que mostraram valores baixos ou altos de colónias MK com GM-CSF ou IL-3 mostraram o aumento correspondente quando se- adicionou G-CSF (N.B.- o valor alto de colónias MK com GM-CSF na experiência N2 4 foi uma ocorrência isolada) . Nalgumas experiências o efeito de IL-5 e de IL-6 sobre a formação de colónias MK dependente de GM-CSF ou de IL-3 também foi analisado. Tal como com G-CSF, também se verificou que IL-5 reforça a megacario citopoiese induzida por GM-CSF. Por outro lado, a IL-6 não apresentou efeito directo para aumentar a formação de colónias MK dependente de GM-CSF ou de IL-3. Além disso, o aumento de G-CSF e de IL-5 não se limitou ao número de colónias. Também se observou ura aumento na frequência de colonias com 10 a 5o células (Quadro 4), 28

QUADRO

03 (ti r-i G Ί* O rH H rH iH 00 νΰ '0 & Ή ϋ O O o o +1 +1 +1 +1 G O CO r—j CM rH rP 03 tn rH •H O S A g ψ) 0 r\ P •r! ϋ 03 ϋ -H 0 03 •H (0 03 G •H (ti (ti (ti G r-i G D Ό G (ti H H + 0 tn 0 -0 + + + ro CM 4-> 0 0 ϋ rH cn VÕ 03 H H rH G e o 0) Φ O +1 +1 +1 +! +1 +1 6 0 in •H G 1 O rH CO \o r~ 0 o (M CO 1—1 CM 03 03 P H 0 fti m G •G 0 c +1 Ό 03 Φ 1—| (ti Ti 0 r-i ϋ G m * i—i + + + co 0 03 *4D ro VD cn H rH rH G (ti O o 0 +5 'ti +1 +1 +1 +1 +1 + | +1 ϋ 0 H O cn cn m H o (ti ,G 1 cn ω vo CM 00 ti P G m (ti Φ g (9 •P 0 U3 O 44 1 44 0 G p KO •ri Tti Φ H 1 Φ e P P *H + H H 0 m o IG IG + Φ rg m 03 01 G (ti 1 ϋ u fo IG O G P 1 1 03 03 O H 0 0 O O Φ •H 1 1 ti O + + + 0 0 •H G ε EG (G IG IG + + O f5j G ω 03 03 03 44 42 O ϋ O O SO co cn 0 G 1 1 1 1 1 1 l (ti Φ a a a a P P P IG S o O 0 0 H H H 29 ν. * As percentagens obtiveram-se por contagem de todas as colónias MK em uma placa. Reuniram-se os dados de placas escolhidas casualmente de duas a quatro esperiências.

Os factores GM-CSF, IL-3 e G-CSF foram todos utilizados na concentração de 1 ng/ml, enquanto IL-5 e IL-6 foram testadas a 10 ng/ml nestas experiências. + estatisticamente significativo comparado com os controlos de GM-CSF ou IL-3, p£0,05. EXEMPLO 8

Aumento do reforço de G-CSF por IL-6 na formação de colónias MK

Embora IL-6 não seja capaz de estimular directamente a formação de colónias MK e reforçar a for mação de colónias MK estimulada por GM-CSF e IL-3 é, no entanto capaz, de aumentar posteriormente o reforço de G-CSF para a formação de colónias MK (Fig. 1 e 2). Assim quando se adicionou IL-6 a culturas contendo GM-CSF e G-CSF ou IL-3 e G-CSF, verificou-se um aumento posterior no número de colónias MK. 0 tamanho das colónias MK tam bém aumentou com o aparecimento de mais colónias constituídas por até 50 células ou mais (Quadro 4 e Placa 2a--f]. Este aumento provocado por IL-6 foi específico para o reforço induzido por G-CSF e o seu efeito não foi reprodutível com IL-5. EXEMPLO 9

Acção ao longo do tempo de G-CSF e IL-6 no aumento da formação de colónias MK induzida por GM-CSF ou IL-3.

Para melhor analisar o efeito de G-CSF e IL-6 na formação de colónias MK no estádio ou em estádio diferentes realizou-se um estudo ao longo do tempo.

Como se pode observar no Quadro 5, o aumento de G-CSF na formação de colónias MK induzida por GM-CSF ou por IL- 3 foi óptimo quando ambos os factores estavam presen tes inicialmente (.não depois do 3o. dia) / no período de cultura. 31

Efeito ao longo do tempo de G-CSF VÔ l a H c—BMC ϋ < + •Φ COi •κ * * + + Ο + O C0 tn <>0 LD 00 03 rH V0 νο γΗ Ο í_i ft +! +1 +1 +! +1 +1 +1 +1 Ή +! +1 G) fv. σ\ σ\ 03 CTS •Η νο ΓΟ ΟΙ a H γΊ sf sf ΓΟ θ' to 03 03 ο ω σ\ s 1 1 D + a 03 * * Γ- + + ι ο + o σ* 03 VQ 00 Ο tn ο Γ-1 01 a & ><: w +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 o tn σν Ο ιη σν 03 σι ρΗ ro 0~ c~- νο ΓΟ ΓΟ ΓΟ ΓΟ Ο σι σ\ (Η ιΗ Η H * + + + 03 ro νΟ ιη η •si1 (Μ Η ιη ο- γο & x; H +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 σ> CFi tn ιη σ> i—t νο 00 03 θ' ΓΟ Η Η Η 03 ΓΟ ΓΟ 03 ΓΟ S ε S d d d ρ VÔ t: ί G & Ο ΓΟ ιη ο- ΓΟ ω γ~ I β η β Π 13 13 13 13 13 13 13 ld (D Q) Φ Φ Γ H a a a a φ i3 0 IRJ s O ra d H u Λ ο ro ω Ο ΓΟ m ο Ο ο Ο 13 1 β 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13 < o ω a rtí d 0 •P β co (D 1 ε a 0 H a \ Ρή m ο Q Q Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο D 13 Ο 13 13 13 13 13 13 13 13 13 a 0 32 § Na Experiência 3 utilizou-se IL-3 em vez de GM-CSF, GM-CSF, G-CSF e IL-3 que foram utilizados todos a 1 ng/ /ml/ enquanto IL-6 foi utilizado a 10 ng/ml nestas expe rièncias. a? Diferença estatisticamente significativa Cp < 0,05) quando comparada com os resultados de GM-CSF ou IL-3 isolados. + Diferença estatisticamente significativa dos resultados correspondentes com GM-CSF+G-CSF ou IL-3+G-CSF.

Identicamente o efeito sinérgico de G-CSF e IL-6 observou-se apenas quando ambos os factores se adicionaram conjuntamente com GM-CSF ou IL-3 no início da cultura e não após o 32 dia. Contudo, quando estava presente G-CSF no início da cultura com GM-CSF ou IL-3, então pôde-se observar aumento induzido por IL-6 quando esta era adicionada entre o 5a e o 7e dia. EXEMPLO 10

Efeitos in vivo de IL-6 sobre a bematopoiese Fêmeas de macacos cinomolus jovens saudáveis (Macaque fasicularis), obtidas no Tierlaboratorium da Universidade de Dusseldorf, Alemanha, foram mantidas de acordo com as instruções alemãs para utilização e cuidado de animais de laboratório. Por picada retiraram--se amostras de sangue nas veias periféricas. Antes de qualquer manipulação anestesiaram-se os animais com clo-ridrato de cetamina (Hersteller).

Realizaram-se as contagens hematológicas através de um analisador automático. As contagens dife- 33 - renciais de leucócitos foram realizadas em lâminas coradas com May-Gruenwald-Giemsa.

Para avaliar a actividade biológica de IL-6 sobre a produção das plaquetas, administraram-se por via subcutânea e diariamente injecções de I.L-6 na concentração de lOpg/kg/d a três animais jovens. 0 número de plaquetas no sangue periférico foi determinado diariamente e apresenta-se na Figura 3, 0 animal #1 recebeu IL-6 desde o 12 dia até ao 82 dia, os animais ^2 e 3 desde o 12 dia até ao 21e. Em todos os três macacos aumentou significativamente o número de plaquetas (células po μΐ)ϊ no animal#1 de 254ÓOO para 756000, no animal #2 de 513000 para 786000 e no animal -#-3 de 276000 para 592000. A IL-6 não alterou significativamente o número de neutrófilos, eosinófilos, basófilos, linfóci-tos e eritrócitos no sangue periférico.

Administraram-se IL-6 e IL-3 simultaneamente sob a forma de injecçães subcutâneas diárias a um macaco na concentração de 10 jig/kg/d cada, para se inve_s tigar os efeitos in vivo desta associação. Os níveis de plaquetas no sangue periférico do animal #4, que foi tra tado desde o ls dia até ao 322 dia, estão indicados na Figura 4, Numa associação com IL-3, a IL-6 conduziu a um aumento das plaquetas periféricas de 362000 para um máximo de 675000 no 102 dia de tratamento. Este aumento é equivalente ao observado apenas com a IL-6. A associação de IL-6 e IL-3 aumentou significativamente o número de eosinófilos, de 214 para um máximo de 4089 e um número de basófilos do valor inicial 0 para um máximo de 2 240, o número de outras células sanguíneas# tais como neutrófilos# monócitoé# linfócitos e eritrócitos não se alterou significativamente.

Trataram-se os dois macacos com uma associação de IL-6 e G-CSF a 10 ^xg/kg/d# cada um# por via subcutânea durante um período de 17 dias no animal #5 e 25 dias no animal #5, No animal.#5 o número de plaquetas periféricas aumentou de 252 000 para um máximo de 638 000; no animal#6 aumentou de 342 000 para um máximo de 1 104 000. Estes resultados estão representados na Figura 5. 0s neutrófilos aumentaram de 1 624 para um máximo de 3 3 94 7 (no animal #5) e de 5 060 para 52 809 (no animal #6)·.. Os linfócitos aumentaram de 3 864 no l9 dia para um máximo de 9 693 (no animal #5> e de 5 500 para um máximo de 16 628 (no animal #6) , Não houve alteração significativa no número de outras células sanguíneas periféricas. 0 animal 4t7 foi tratado com uma associação de IL-6 e GM-CSF tal como descrito anteriormente# desde o l9 dia até aô 2ie dia. 0 número de plaquetas aumentou de 334 000 iniciais para um máximo de 538 000 como demonstra na Figura 6. Os neutrófilos aumentaram significativamente de 2 652 para um máximo de 34 286, os eosinófilos de 156 para 4 704 e os linfócitos de 12 480 para 16 800. Não houve alteração-significativa do número de basófilos e monócitos.

Embora a presente invenção tenha sido descrita em relação aos seus aspectos preferidos# não está 35 limitada aos aspectos descritos mas, pelo contrário, entende-se que abrange várias modificações e equivalen tes incluídos no âmbito e no espírito das reivindicações apensas, âmbito este que será o que estiver de acordo com a interpretação mais lata de forma a abranger todas as modificações e equivalentes.

Claims

‘f Γη REIVINDICAÇÕES 1. - Método para o aumento da produção de megacariocitos nos mamíferos, caracterizado pelo facto de se administrar uma quantidade eficaz sob o ponto de vista farmacêutico de G-CSF (factor de estimulação de colónias de granu-locitos) e uma quantidade eficaz sob o ponto de vista farmacêutico de IL-3 (interleucina 3 ou de GM-CSF) (factor de estimulação de colónias de granu-locitos macrofagos)
2. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se administrar G-CSF simultaneamente ou após a administração de-G-CSF ou IL-3.
3.- Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se administrar, ainda, uma quantidade eficaz sob o ponto de vista farma cêutico de IL-6. -37-

η Λ.- Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de se administrar IL-6 durante um periodo entre zero a.7 dias apos a administração de G-CSF.
5. - Método para aumentar a produção de megacariocitos, caracterizado pelo facto de se administrar uma quantidade eficaz sob o ponto de vista farmacêutico de IL-5 conjuntamente com uma quantidade eficaz sob o ponto de vista farmacêutico de GM-CSF.
6. - Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de se administrar IL-5 simultaneamente e/ou exactamente apos a administraçao de GM-CSF.
7. - Método para aumentar a produção de plaquetas sanguíneas nos mamíferos, caracterizado pelo facto de se administrar uma quantidade eficaz sob o ponto de vista farmacêutico de TL-6.
8. - Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de se administrarem ainda uma quantidade eficaz sob o ponto de vista farmacêutico de IL-3, G-CSF ou GM-CSF.
9. - Processo para a preparaçao de composiçoes farmacêuticas, caracterizado pelo facto de se misturar uma quantidade eficaz sob o ponto de vista farmacêutico de G-CSF com uma quantidade eficaz sob o ponto de vista farmacêutico de IL-3 ou de GM-CSF.
10.- Processo de. acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de se adicionar ainda uma quantidade eficaz sob o ponto de vista farmacêutico de IL-6.
11. - Processo para a preparaçao de composições farmacêuticas, caracteri-zado pelo facto de se misturar uma quantidade eficaz sob o ponto de vista farmacêutico de IL-5, com uma quantidade eficaz sob o ponto de vista farmacêutico de GM-CSr.
12. - Processo para a preparaçao de composiçoes farmacêuticas, caracteriza do pelo facto de se misturar uma quantidade eficaz sob o ponto de vista farmacêutico de IL-6 com uma quantidade eficaz sob o ponto de vista farmacêutico de IL-3, G-CSF ou GM-CSF.
13. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 10, 11 ou 12, caracterizado pelo facto de se misturar ainda um dissolvente, agente adjuvante, agente conservante, agente de estabilização, agente de emulsificação e/ou um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
14. - Processo para a preparaçao de um "Kit", caracterizado pelo facto de se incluir um frasco-ampola contendo uma quantidade eficaz sob o ponto de vista farmacêutico de G-CSF e um frasco-ampola contendo uma quantidade eficaz sob o ponto de vista farmacêutico de IL-3 ou de GM-CSF
15. - Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo facto de se incluir ainda um frasco-ampola contendo -uma quantidade eficaz sob o ponto de vista farmacêutico de IL-6, -39- ca
16. - Processo para a preparação de um "Kit", caracterizado pelo facto de se incluir um frasco-ampola contendo uma quantidade eficaz sob o ponto de vista farmacêutico de IL-5 a um frasco-ampola contendo uma quantidade eficaz sob o ponto de vista farmacêutico de GM-CSF.
17. - Processo para a preparaçao de um "Kit", caracterizado pelo facto de se incluir um.frasco-ampola contendo uma quantidade eficaz sob o ponto de vista farmacêutico de IL-6 e, ainda, um frasco-ampola contendo uma quantidade eficaz sob o ponto de vista farmacêutico de IL-3, G-CSF ou GM-CSF.
18. - Método para o tratamento de mamíferos com trombocitopenia, provocada por produção insuficiente de plaquetas, devido à aplicação de quimioterapia ou de radiação terapêutica, caracterizado pelo facto de se administrar uma quantidade eficaz sob o ponto de vista farmacêutico de G-CS2T, simultaneamente ou após a administraçao de uma quantidade eficaz sob o ponto de vista farmacêutico de GM-CSF ou de IL-3.
19. - Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo facto de se incluir ainda a administração de uma quantidade eficaz sob o ponto de vista farmacêutico de IL-6, eventualmente, após o decurso de um período compreendido entre zero e 7 dias da administração de G-CSF.
20. - Método para o tratamento de mamíferos com trombocitopenia causada pela destruição acelerada das plaquetas, por produção insuficiente de plaquetas ou como resultante de purpura trombocitopenia ídíopática, caracterizado pelo -40- -40-

facto de se administrar uma quantidade eficaz sob o ponto de vista farmacêutico de IL-6, isolada ou conjuntamente com uma quantidade eficaz sob o ponto de vista farmacêutico de LL-3, G-CSF ou GM-CSF, Lisboa,30 de Novembro de 1990 O Agente Oficial da Propriedade Industrial ___ , Γ \