PT94933A - Processo para a preparacao de 2-(4',5'-epoxi-hex-2'(e)-en)oil-2-hidroxi-4-hidroxi-metil-2,3-(z)-butanolido (butalactina) e de composicoes farmaceuticas que o contem - Google Patents

Description

Descrição referente à patente de invenção de HOECHST AKTI-ENGESELLSCHAFT, alemã, industrial e comercial, com sede em D-6230 Frankfurt am Main 80, República Federal Alemã, (inventores: Dr. Christopher Milton Mathew Franco, Dr. Erra Koteswara Vijayakumar, Dr. Sugata Chatterjee, Dr. Bimal Naresh Ganguli e Dr. Júrgen Blumbach, residentes na Índia), para "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE 2-(4*, 51-EPOXI-HEX--2'(E)-EN)OIL-2-HIDROXI-4-HI-DROXI-METIL-2,3-(Z)-BUTANOLI-DO (BUTALACTINA) E DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS QUE O CONTÊM"

DESCRIÇÃO A presente invenção refere-se ao composto chamado Butalactina, a um processo para a sua produção por cultivo ou duma cultura cuja espécie tem o Número HIL-Y-86.36923) ou dos seus mutantes ou variantes e também ao uso da butalactina como produto farmacêutico e como regulador de bio-síntese. 0 Str. sp. Y-86.36923 foi isolado do solo colhido em Puna, Maharashtra, índia e foi depositado na Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, sob as condições do tratado de Budapeste, 5 de Maio de 1989 (DSM5372). As variantes e os mu- 1

tantes do Str. sp. Y-86.36923 podem ser obtidos de maneira conhecida usando um mutagénio como o N-metil-N-nitro-N'-nitroso-guanidina ou a luz ultra-violeta. 0 micro-organismo Str.sp. Y--36923 pertence à ordem dos Actinomicetales, ã família Strepto-micetaceae e ao género Streptomices. 0 Str. sp. Y-86.36923 é considerado uma nova estirpe pelo facto de diferir das estirpes conhecidas em alguns dos seus aspectos ou características morfológicas, culturais e fisiológicas como aliás fica estabelecido na descrição que a se guir se faz. É considerada uma nova estirpe também porque produz um novo composto antibiótico aqui chamado Butalactina co mo ficará claramente estabelecido na descrição que se segue.

Como se torna aparente na descrição pormenorizada que se segue, referente a esta invenção, a Butalactina des ta invenção é um antibiótico de butanolido 2,3-dissubstituido, mas difere de todos os metabólitos de butanolido dissubstitui-dos como por exemplo o factor A (Bioorg. Khim.2, 1142-1147, 1976), os factores indutores da antraciclina (J.Antibiotics, 35, 1722-1723; Biotechnology Lett.5,591-596, 1983), os butanolidos Virginiae (J.Antibiotics, 40,496-504, 1987) e vários análogos racémicos (J. Antibiotics, 41, 1828-1837) 1988) .

A Butalactina é um composto com a fórmula I H

De acordo com a nomenclatura IUPAC o nome químico do composto desta invenção é o 2-(4',5'-epoxi-11-oxo-21 -. (E)-hexen)-il-2-hidroxi-3-hidroximetil-2,3-(Z)-butanolido ou, 2 Λ alternativamente, 2-(4',51-epoxi-hex-21(Ε)-en)oil-2-hidroxi-4--hidroximetil-2,3-(Z)-butanolido. A Pesquisa Bibliográfica feita Online no Serviço dos Chemical Abstract (CAS) utilizando como chave de pesquisa o peso molecular e a fórmula molecular também confirmou o facto de que a Butalactina é um composto novo. 0 novo antibiótico da presente invenção é acti vo in vitro contra uma série de micro-organismos gram-positivos e gram-negativos. Também é activo na regulação da bio-síntese de metabolitos secundários. Por esse motivo pode ser usado como uma droga ou medicamento terapêutico e como regulador bioquímico no controlo da bio-síntese de antibióticos.

De acordo com a presente invenção proporciona--se também um processo para o isolamento do Str. sp. Y-86.36923 do solo usando um meio nutriente com o pH de 6,5 a 8,5 por um processo conhecido. 0 nutriente de cultura usado para o isolamento do micro-organismo a partir do solo consiste em fontes de carbo no e de azoto, sais nutritivos inorgânicos e agentes solidifi-cantes. As fontes de carbono podem ser por exemplo, a glicose, o amido, a dextrina, o glicerol, a sacarose ou melaço. As fontes de azoto podem, por exemplo ser peptona, extracto de levedu ra, extracto de carne, extracto de malte, caseína ou amino-ãci-dos como a arginina ou a asparagina. 0 agente solidificante,por exemplo, pode ser agar. Os sais nutritivos inorgânicos podem, por exemplo, ser sais de sódio, potássio, magnésio, cálcio, fós foro ou enxofre. 0 micro-organismo desta invenção forma micé-lios aéreos alongados e sem cor a partir de micélios ramificados que servem de substrato.As cadeias de esporos são formadas em espirais no cimo dos micélios aéreos. As espirais são aber-. tas. As pequenas cadeias de esporos, representantes da Secção 3

ί RA, também são frequentes. Não se encontram nem ascosporos nem esporos em turbilhão. As cadeias de esporos maturas contêm 10-20 esporos por cadeia. As características culturais do micro-organismo nos vários meios de agar são a seguir descritas: 1. Extracto de levedura : extracto de malte em agar

Crescimento Micélios aéreos Inverso Pigmento solúvel 2. Agar e aveia Crescimento Micélios aéreos Inverso Pigmento solúvel bom, enrugado, seco escassos, pulverulentos, cinzento claro branco amarelado nenhum : bom, plano, seco : moderados, pulverulentos, brancos : amarelo pálido : nenhum : amido em agar 3. Sais inorgânicos

Crescimento Micélios aéreos Inverso Pigmento solúvel bom, levantado, seco bons, pulverulentos, cinzentos cinzento esverdeado nenhum 4. Glicerol : asparagina em agar

Crescimento : bom, enrugado, seco

Micélios aéreos : fracos, pulverumentos, brancos

Inverso : amarelo pálido

Pigmento solúvel : nenhum 5. Peptona : extracto de levedura - ferro em agar

Crescimento : moderado, plano, com aspecto de areia

Micélios aéreos : nenhum

Inverso : castanho claro

Pigmento solúvel : nenhum 4 ί

Tirosina em agar Crescimento Micélios aéreos Inverso Pigmento solúvel : bom, enrugado, seco : nenhum : amarelo claro : nenhum Sacarose : nitrato em agar Crescimento Micélios aéreos Inverso Pigmento solúvel : bom, enrugado, com aspecto arenoso : escasso, pulverulento, esbranquiçado :amarelo pálido :nenhum Glucose : asparagina em agar Crescimento Micélio aéreo Inverso Pigmento solúvel : bom, enrugado, seco : fraco, pulverulento, cinzento claro : amarelo pálido : nenhum A temperatura para o crescimento óptimo do micro-organismo referido nesta invenção varia de 25°C a 37°C. Este micro-organismo liquefaz a gelatina num meio de glucose-pe-ptona-gelatina, hidrolisa o amido em agar com amido e sais inorgânicos, coagula o leite desnatado, não forma E^S, e não reduz nitratos. 0 Str- sp. Y-86.36923 cresce no agar solúvel de Czapek. Não se observou qualquer produção de pigmento melanoide em tirosina em agar, agar com peptona, extracto de le vedura, ferro ou caldo de triptona e extracto de levedura. 0 padrão da assimilação da fonte de carbono pa ra este micro-organismo é o seguinte (em meio de Pridham-Got-tlieb):

Positivo para : D-glicose, L-arabinose, D-xilose, m-inositol, D-manitol, D-frutose, galactose, maltose, 5 i

a;

'At.M Λ

celobiose, Na- glutamato, manose, lactose, sacarose.

Fraco para : Ramnose, rafinose.

Negativo para : Celulose. 0 Str. sp. Y-86.36923 é inibido pela estrepto-micina quando este se encontra em concentrações superiores a 6,25 jig/ml, pode tolerar o NaCl em concentrações maiores do que 6% mas inferiores a 7%, e tem uma tolerância ao pH que varia en tre 6,0 e 9,0. 0 str. sp. Y-86.36923 difere substancialmente dos micro-organismos conhecidos que podem produzir a Cirenomi-cina B e o produto com ela relacionado Albociclina. Estes são o Streptomices cirenocromoges, o Streptomices bruneogriseus, o Streptomices roseocireneus e o Streptomices roseocromogenes var albociclini. A informação publicada sobre as característi-cas culturais e fisiológicas dos outros micro-organismos conhecidos mostram claras diferenças quando comparadas com as do micro-organismo da presente invenção.

Por outro lado, quando o Str- sp. Y-86.36923 é fermentado ele produz o novo antibiótico Butalactina, em adição ao antibiótico já conhecido Cirenomicina B.

Das observações acima feitas torna-se evidente que o micro-organismo da presente invenção é uma nova espécie de Streptomices.

Pode ser claramente compreendido pelos especia listas da matéria que a presente invenção não é limitada àquele organismo particular que acima foi especificado mas que inclui todos os mutantes e variantes espontâneos e artificiais derivados do referido micro-organismo que são capazes de produzir o • novo antibiótico Butalactina. 6 1

A presente invenção refere-se também ao proces so para a produção da Butalactina, incluindo o referido processo de cultura do Str. sp. Y-86.36923 por fermentação a um pH que oscila entre 6/0 e 9/0/ preferencialmente entre 6 e 7, e a uma temperatura entre 18 e 40°C, preferencialmente entre 20 e 37°C/ sob condições aeróbicas num meio nutritivo de cultura con tendo fontes de carbono e de azoto, sais orgânicos nutritivos, e oligo-elementos, e isolando o composto do caldo de cultura du ma maneira conhecida como a que está descrita nesta invenção.

As fontes de carbono usadas no meio nutritivo de cultura para a produção dos novos antibióticos podem, por exemplo, ser glicose, amido, dextrina, glicerol, sacarose, mela ço ou óleo. As fontes de azoto usadas no meio nutritivo para a produção de novos antibióticos podem, por exemplo, ser farinha de soja, extracto de levedura, extracto de carne de vaca, ex-tracto de malte, macerado de milho, peptona, gelatina ou caseína. Os sais inorgânicos nutritivos ou sais minerais nutrientes usados no meio de cultura para a produção dos novos antibióticos podem, por exemplo, ser cloreto de sódio, sulfato de magnésio, sulfato de amónia ou carbonato de cálcio. Como oligoelemen tos, por exemplo o ferro, o manganésio, o cobre, o zinco ou o cobalto, podem ser usados.

Preferencialmente, o Str. sp. Y-86.36923 é cul tivado a cerca de 27°C, (± Io C) e a um pH de cerca de 7,0. A fermentação é preferencialmente parada após 23 a 48 horas quando a produção máxima dos compostos é obtida. A fermentação pode, preferencialmente, ser uma fermentação submergida. O processo de fermentação e formação de Butalactina pode ser monitorizada pela actividade antibacteriana no meio de cultura e do micélio contra o Stafilococus aureus 209 P e contra a Escherichia coli 9632 em um meio de agar, e por cromatografia em camada fina em placas de gel de sílica com acetato de etilo como solvente de revelação.

Se desejado, pode ser utilizado um agente anti espuma como o Desmofen(R) (Polyols, Bayer AG, Leverkusen, Ale- 7

manha) no meio nutritivo durante a fermentação da cultura. A Butalactina pode ser obtida do caldo de cultura por extracção, preferencialmente com um solvente que seja não miscível com a água depois do pH ter sido ajustado para valores entre 6,5 e 7,5. Os solventes podem ser o acetato de eti-lo ou o clorofórmio; preferencialmente é o acetato de etilo e o pH preferido é de cerca de 7,0. O resíduo do solvente é concentrado para remover o solvente e submetido então a nova cromato-grafia. A Butalactina pode também ser obtida do caldo de cultura por adsorção directa nos absorventes adequados como a Amber-lite(R) XAD-4 ou 7 (resina adsorvente porosa sobre uma base de polistireno ou de um éster de ácido acrílico, Rhom and Haas Co., USA), ou Diaion(R) HP-20 (resina adsorvente altamente porosa so bre uma base de um copolímero de polistireno-divinil-benzeno, Mitsubishi Chemical Industries, Japão); o adsorvente preferencial é o Diaion(R) HP-20. O composto feito de acordo com a presente invenção é eluido a partir do adsorvente utilizando as fa ses móveis apropriadas, tais como clorofórmio, metanol ou aceto na, quer isoladamente, quer em combinação entre eles, ou com água, sendo os produtos da eluição então evaporados até ã secura completa. 0 eluente preferido é o metanol. Os eluidos acti-vos assim obtidos são então recolhidos e concentrados.

Os eluidos concentrados referidos anteriormen-te ou extractos contendo Butalactina podem ser ainda subsequentemente mais purificados de variadas maneiras. Por exemplo por re-adsorção e eluição com carvão activado, Amberlite^ XAD-4 e 7, Diaion(R) HP-20, filtração com gel LH-20 Sephadex(R) (gel de porosidade definida em agarose, Pharmacia Fine Chemicals AB, Suécia) e os seus equivalentes; a adsorção por cromatografia em gel de alumina e sílica pode ser útil e convenientemente usada em combinação para uma purificação levada ainda mais longe. Por outro lado a cromatografia em camada fina também pode ser usada bem como a cromatografia líquida de pressão média ou de alta pressão usando adsorventes adequados como o gel de sílica e o . gel de sílica modificado C^g com sistemas de solventes adequa- 8

dos. Além disso, a cromatografia em contra corrente com um sistema de solventes particular pode também ser muito eficazmente usada para o fim citado. Preferencialmente, a cromatografia de repetição em gel de sílica com o acetato de etilo e o éter de petróleo (40 a 60°C) como solventes de eluição pode ser e deve ser escolhida. Durante esta cromatografia o composto conhecido Cineromicina é objecto de separação. A Butalactina é um líquido xaroposo espesso, amarelo pálido à temperatura ambiente (25°C). Ê solúvel em água, metanol, etanol, propileno glicol, dimetilsulfóxido, cloreto de metileno, acetato de etilo e clorofórmio. É insolúvel no hexano e no éter de petróleo (40 a 60°C).

Nos sistemas de cromatografia em camada fina (TLC), indicados a seguir, a Butalactina tem os seguintes valores :

Placa de CCF (TLC): Placa de gel de sílica pré-revestida: Artigo nQ 5544 da E. Merck, Darmstadt.

Rf de_EtOAc

Butalactina 0,44

Cineromicina B 0,51 A cromatografia líquida analítica de alto rendimento (CLAR) está transcrita na Fig. 1. A CLAR foi efectuada utilizando as seguintes condições:

Carga da coluna : ODS-Hipersil- 10 μ, 4 x (30+100) mm (Material de coluna baseado em Shandon Labortechnik, Frankfurt/Main, Germany) Débito : 0,5 ml/min.

Detecção : 240 nm

Solvente : MeOH : Água (1 : 3)

Os dados espectroscópicos da Butalactina estão 9

t transcritos a seguir: 1. A absorção UV max em metanol e em metanol/HCl 0,1N 242 nm, em metanol/NaOH 0,1N desvia-se para 206 nm. 0 espectro de absorção foi medido no intervalo dos 200 a 800 nm usando um Espectrofotómetro Uvikon 810. 2. O espectro de I.V. (nítido) foi determinado usando um espe-ctrómetro Perkin Elmer P.E. 521 IR - Ver Fig. 2. 3. 0 espectro ^H-NMR foi determinado com um instrumento JEOL FX-90Q a 90MHz utilizando CDCl^ como solvente - Ver Fig. 3. 13 4. 0 espectro C -NMR foi determinado com um instrumento JEOL FX-90Q a 90 MHz utilizando CDCl^ como solvente - Ver Fig. 4 dis desenhos anexos. 5. A Bspectroscopia de Massa foi levada a cabo num instrumento VG ZAB 3F usando Impacto Electrónico (IE), Ionização Química (IC) e bombardeamento Atómico Rápido (BAR) como métodos de ionização. 0 peso molecular determinado foi de 242,0857, que corresponde à fórmula molecular de

Os dados supracitados bem como a análise quími ca indicam que a Butalactina tem um estrutura como a que foi evidenciada na fórmula I. A Butalactina é activa contra bactérias gram--positivas e gram-negativas. Quando testada pelo método das cavidades em agar no meio de ensaio para doseamento do antibiótico revelou ter uma actividade que está exemplificada no quadro I, a seguir representado.

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QUADRO I

Organismo Testado Concentração _2 mq/ml_1 mg/ml * * 1. Staphylococcus aureus 209 P 21 19 2. Staphylococcus epidermidis 823 16 14 3. Staphylococcus haemolyticus 809 16 13 4. Streptococcus faecalis 21777 17 15 5. Streptococcus faecalis Eder 23 21 6. Escherichia coli 9632 21 16 7. Enterobacter cloacae 14 13 8. Citrobacter freundii 17 15 9. Citrobacter 2046 E 16 14 10. Proteus vulgaris 15/21 12/20 11. Proteus mirabilis 18 16 12. Pseudomonas aeruginosa — — 13. Candida albicans — — 14. Aspergillus niger — — * zona de inibição em mm

Além da actividade anti-bacteriana a Butalac-tina revelou também ser capaz de inibir a bio-síntese de metabo litos secundários, como os antibióticos, em comcentrações que não inibem o crescimento do organismo produtor. A invenção será a seguir suplementarmente ilus trada por exemplos preferenciais, mas não deverá de modo algum, ser considerada como limitada por esses exemplos.

Exemplo 1

Isolamento do Streptomices sp. Y-86.36923 do solo. (a) Preparação do meio nutriente que serve para o isolamento 11

Meio 1 : Glicose .............. 1,0 g

Glicerol ............. 1,0 g L-arginina ........... 0,3 g K2HP04 ............... 0,3 g

MgS04x7H20 ........... 0,2 g

NaCl ................. 0,3 g

Extracto de levedura . 2,0 g

FeS04x7H20 ........... 10,0 mg

CuS04x5H20 ........... 1,0 g

ZnSC>4x7H20 ........... 1,0 g

MnSC>4xtH20 ........... 1,0 g

Agar ................. 15,0 g Ãgua destilada ....... 1 litro PH ................. 6,5

Meio 2 : Glucose .............. 2,9 g L-asparagina ......... 1,0 g K2HP04 ............... 0,5 g

MgS04x7H20 ........... 0,5 g

Extracto do solo ..... 200 ml

Agar ................. 15.0 g

Agua destilada ....... 800 ml pH ................... 8,0

Meio 3 : Amido ................ 10,0 g

Caseína .............. 0,3 g KN03 ................. 2,0 g

NaCl ................. 2,0 g K2HP04 ............... 2,0 g

MgS03x7H20 ........... 0,05g

CaC03 ............... 0,02g

FeS04x7H30 .......... 0,01g

Agar ................ 15,0 g Água destilada ...... 1 litro pH .................. 7,2-7,5 . Os meios de cultura foram esterilizados a 121° C durante 30 minutos. Em todos os casos, o meio esterilizado foi 12

arrefecido a 45°C, vertido em placas de petri e deixado a solidificar (b) Preparação da suspensão de solo

Um grama de solo foi aquecido no ar quente de um forno a 110°C durante uma hora. Depois de arrefecer fez-se a sua suspensão em água destilada e agitou-se bem. 0 solo foi deixado a sedimentar e o fluido sobrenadante foi usado para ino cular cada um dos meios acima referidos por sua vez. (c) Inoculação do meio de isolamento

Um ml da suspensão do solo foi inoculado nos discos de petri contendo 50 ml de cada um dos meios nutrientes de isolamento acima mencionados. (d) Isolamento do Streptomices sp. Y-86.36923. O disco de petri inoculado foi incubado a 37° C durante 10 dias e o Streptomices sp. Y-86.36923 isolado de entre os micro-organismos que cresceram.

Exemplo 2

Cultura do Streptomices sp. Y-86.36923 para produção por fermen tação da Butalactina O Streptomices sp. Y-86.36923 foi mantido com extracto de levedura - extracto de malte com a seguinte composi ção:

Extracto de malte ........ 10,0 g

Extracto de levedura ..... 4,0 g

Glicose .................. 4,0 g

Agar ..................... 15,0 g Ãgua destilada ........... 1 litro pH....................... 7,0 - 13 -

» I

0 meio de cultura foi distribuído por tubos de ensaio e esterilizado a 121° C durante 30 minutos. Os tubos fo ram arrefecidos numa posição inclinada para a preparação de ram pas de agar. As rampas de agar (ou superfícies inclinadas de agar) foram inoculadas com a cultura e incubadas a 28°C durante 10 a 15 dias com bom crescimento e esportulação. A suspensão dos esporos em água destilada de uma dessas rampas foi usada para inocular 5 frascos de Erlenmeyer de 500 ml contendo cada um 100 ml do meio de cultura que serviu para a sementeira.

Composição do meio de cultura usado para a sementeira:

Glicose ............. 15/0 g

Extracto de soja .... 15,0 g

Macerado de milho ... 5,0 g

CaCO^ ............... 2,0 g

NaCl ................ 5,0 g Água destilada ...... 1 litro pH .................. 6,5 O meio citado acima foi distribuido em partes iguais a 100 ml para balões de Erlenmeyer de 500 ml e esterilizado a 121°C durante 30 minutos. Os frascos foram arrefecidos, inoculados com uma suspensão de esporos ou com agregados de mi-célios e agitados a 240 r.p.m. durante 72 horas a 27°C (± Io) num agitador rotatório com um excêntrico de 3,73 cm. O crescimento daí resultante foi usado para inocular 200 balões de 500 ml cada um contendo 100 ml do meio de cultura de produção a 2 a 4 % (v/v).

Composição do meio de cultura de produção

Glucose ................... 10,0 g

Amido solúvel .............. 10,0 g

Extracto de malte ........... 7,5 g

Peptona ................... 7,5 g

MgS04x7H20 ................. 1,0 g

NaCl ....................... 3,0 g

CuSO^xSl^O ................ 7, Omg 14 1¾ ^ ______

FeS04x7H20 ....................... 1,0 mg

MnCl2x4H20 ....................... 8,0 mg

ZnSC>4x7H20 ....................... 2,0 mg Âgua destilada .................... 1 litro pH .............................. 6,5 A fermentação foi levada a cabo a 27°C (± 1°C) num agita dor rotatório a 240 r.p.m. com um excêntrico de 1,5 polegadas. Quando a fermentação foi parada ao fim de 45 a 48 horas o diâme tro da zona de inibição contra o Stafilococcus aureus 209 P era de 16 mm e contra a Escherichia coli de 13 mm, quando o filtrado da cultura foi testado no método do poço de agar (diâmetro de 6 mm) e o pH do fluido de cultura variava entre 6,8 e 7,0. O volume do concentrado de células era de 20% (v/v). O caldo de cultura recolhido que continha o antibiótico foi centrifugado para separar os micélios do líquido de cultura, sendo depois processado tal como se descreve no exemplo IV.

Exemplo III

Cultivo do Streptomices sp. Y-86.36923 para o processo de produção da Butalactina, por fermentação O protocolo doexemplo II foi repetido com as seguintes diferenças: O Str. sp. Y-86.36923 foi cultivado num meio de agar com a seguinte composição:

Amido solúvel ........ • • • • • • M O O g K2HP04 ............. • • • • • • O g MgS04x7H20 ......... ...... 1,0 g NaCl ................ ...... 1-0 σ <nh4)2so4 .......... g ...... 2,0 cr CaCO^ ............... FeS04x7H20 ........... ...... 0,1 mg MnCl2x4H20 .......... ...... 0,1 mg ZnS04x7H20 .......... ...... 0,1 mg 15 *

Agar ........................ 15,0 g

Agua destilada ............... 1 litro pH ......................... 7,2 A composição do meio de cultura usado para sementeira é semelhante à do Exemplo II.

Composição do meio de produção

Glicose ................ 20,0 g

Peptona ................ 5,0 g

Extracto de carne ....... 5,0 g

CaCO^ .................. 3,0 g

Agua destilada ......... 1 litro pH ..................... 7,0

Acrescentou-se 2 ml de Desmofen (R) como agente anti-espumífero. Introduziram-se 10 1 do meio acima citado para uma câmara de fermentação de 15 1. O meio foi esterilizado através de vapor directo e indirecto durante 20 minutos a 121°C. O fermentador foi arrefecido e inoculado com a cultura de semen teira (9% v/v). A fermentação foi levada a cabo a 27°C (í 1°C) sendo agitada a 102 r.p.m. com insuflação de ar com um débito de 60 a 70 litros por minuto. Quando a fermentação foi suspensa ao fim de 23 a 27 horas o pH do caldo de cultura era de 7,4 e o diâmetro da zona de inibição contra Stafilococcus aureus 209 P era de 22 mm e contra Escherichia coli era de 14 mm quando o filtrado da cultura foi testado pelo método do poço de agar (6 mm de diâmetro). O volume de células concentradas era de 15% (v/v). 0 caldo de cultura foi processado como no Exemplo V.

Exemplo IV

Isolamento e purificação da Butalactina

Aproximadamente 16 litros de filtrado de cultu • ra tal como se obteve no Exemplo II, foi extraido 2 vezes com . 10 litros de cada vez de acetato de etilo depois de se ajustar 16 -“•«‘^í=tr,5K»,íia: o pH a 7,0. As camadas aquosas foram rejeitadas e os extractos combinados de acetato de etilo foram evaporados sob vácuo até à secagem completa. Obteve-se aproximadamente 6,4 g de extracto não purificado. Este extracto crú foi carregado a seco numa coluna de gel sílica de 5 x 20 cm (230-400 de tamanho de rede) e eluído começando-se com uma mistura (1 : 1) de éter de petróleo (40 - 60°C e acetato de etilo seguida de aumentos graduais (de 10%) da concentração do acetato de etilo até aos 100%. Este pro cesso produziu 1,7 g da Fracção A que foi eluída quando o gradiente do éter de petróleo/acetato de etilo era de 1:1, e 3,2 g de Fracção B que foi eluído quando o gradiente de éter de petró leo/acetato de etilo era de 3:7. A fracção A foi subsequentemen te purificada por carga para uma coluna de gel de sílica 5 x 25 cm (23o - 400 de tamanho de rede) seguida de eluição com um gra diente CHCl^-EtOA de (1:1) até (3:7). As fracções activas que foram obtidas por uma concentração em CHCl^-EtOAc (8:2) foram concentradas e sujeitas a cromatografia numa coluna de Sepha-dex' ' LH' ' com 2,4 x 90 cm em metanol para produzir 400 ml do composto antibiótico. Isto foi depois sujeito a nova cromato grafia com uma coluna de gel de sílica de 3 x 35 cm MPLC (30 p) e eluído a um ritmo de fluxo de 10 ml/min com um gradiente cres cente (0,5%) de clorofórmio contra metanol a 2%. Quando a concentração de metanol se situou entre 1 - 1,5% o composto activo foi extraído por eluição e concentrado de modo a produzir 150 mg de composto puro que foi identificado como o antibiótico já conhecido Cineromicina B. A Fracção B foi carregada, em 3 lotes iguais, em 3 colunas de gel de sílica MPLC (30 ^i) cada uma com 4,5 x 45 cm em que foram eluídas com um gradiente de éter de petróleo/ acetato de etilo de (5:5) a (3:7). O ritmo de fluxo foi mantido a 15 ml/minuto e a eluição foi monitorizada a um detector Knauer UV a 240 nm. A Butalactina elui-se na mistura (4:6) éter de petróleo/acetato de etilo. As Fracções activas foram concentradas sob vácuo para produzir 650 mg do composto puro.

. Exemplo V 17

Claims (1)

1. Isolamento e purificação da Batalactina Juntaram-se os filtrados das culturas de dois lotes de fermentação, tal como foram descritos no Exemplo III, de modo a conseguir-se um volume de 17 litros. Isto foi passado por uma coluna contendo 1 litro de Diaion(R) HP-20; a coluna foi lavada com 10 litros de água desmineralizada e eluída com 5 litros de metanol. As resultantes activas da eluição em metanol foram concentradas em vácuo até uma secagem completa de modo a produzirem-se 8,8 g de produto não purificado. Este foi carrega do em 2 colunas de gel de sílica de 5 x 25 cm (230 - 400 de calibre) eluído com um gradiente de clorofórmio/ acetato de etilo (9:1) a (3:7) de modo a produzirem-se duas fracçóes - Fracção A (2,3 g), contendo Cineromicina B, que se elui com clorofórmio/ acetato de etilo (8:2); e Fracção B (4,3 g), contendo Butalacti na, que se elui com clorofõrmio/acetato de etilo na proporção de 5:5. A Fracção B foi purificada em dois lotes por cromatogra fia de repetição em colunas MPLC (30 ^i) de gel de sílica com 5 x 60 cm com um gradiente de éter de petróleo/acetato de etilo de (5:5) a (3:7). O ritmo do fluxo foi mantido a 20 ml/minuto e a monotorização da eluição foi feita com um detector Knauer a 240 nm. A concentração dos produtos de eluição activos, que se elui am com uma proporção de éter de petróleo/ acetato de etilo de 4:6 produziram 550 mg de composto puro. REIVINDICAÇÕES - 13 - Processo para a preparação do composto da fór- . mula I 18

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   caracterizado por se cultivar a espécie Streptomices Y-86,36923 (DSM 5372), os seus mutantes e/ou variantes, sob condições aerõ bicas num meio nutriente contendo fontes de carbono e de azoto, sais nutrientes inorgânicos e elementos raros, e por se isolar e purificar o composto a partir do caldo de cultura por um pro-cedimento habitual. - 29 - Processo de acordo com a reivindicação 1, cara cterizado por a cultura se efectuar a temperaturas compreendidas entre 18 e 40°C e a um pH entre cerca de 6 e 9. - 3B - Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por a cultura se efectuar a 27°C (± 1°C) e a um pH de 7,0 aproximadamente. - 4§ - Processo de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado por a fermentação se efectuar durante 23 • a 48 horas. 19 r - 5a - Processo de acordo com qualquer das reivindica ções anteriores, caracterizado por a fermentação se efectuar co mo uma fermentação submersa. - 69 - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado por se incorporar como ingrediente activo um composto de fórmula I quando preparado de acordo com a reivindicação 1 em associação com auxiliares e/ou excipientes habituais para a preparação de composições farmacêuticas. A requerente reivindica a prioridade do Pedido de Patente europeia apresentado em 8 de Agosto de 1989, sob o NQ 89114646.6. Lisboa, 7 de Agosto de 1990

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