PT94562A - Processo de preparacao de ligandos dos receptores cck do tipo b,tetrapeptidicose de composicoes farmaceuticas que os contem - Google Patents

Description

71 183 4693.PG.01 -3- MEMÓRIft DESCRITIVfi

Este invento é uma continuação em parte do pedido de patente dos E.U.ft. n2. de série 375 107, depositado em 30 de Junho, 1989.

Campo Técnico 0 presente invento refere~se a novos compostos e composições que possuem actividade biológica como ligandos dos receptores de colecistoquinina, processos de preparação destes compostos, intermediários sintéticos empregues nestes processos e métodos para o tratamento de perturbações do sistema nervoso central, abuso de substâncias, perturbações gastrintestinais, perturbações endócrinas, perturbações relacionadas com a alimentação e tratamento do choque, insuficiências respiratória e cardiocircu-latória,

Antecedentes do Invento A colecistoquinina (CCK) e moléculas relacionadas constituem uma família de polipéptidos que estão amplamente distribuídos em várias partes do corpo incluindo o tracto. gastrintestinal, as glândulas endócrinas e os sistemas nervosos periférico e central. A CCK foi primeiro isolada a partir de intestinos de porco na forma de um fragmento de 33 aminoácidos (CCK-33) (Mutt and Jorpes, Biochem. J.. 125, 628 (1981)). Recentemente, a CCK-33 foi identificada no cérebro juntamente com dois fragmentos menores: um octapéptido (CCK-8), que é a forma predominante no cérebro, e um tetrapéptido (CCK-4) (Dockray, Nature. 264. 402 (1979)).

Identificaram-se dois sub-tipos do receptor de CCK. Os receptores do tipo A, encontrados predominantemente na periferia, ligam o CCK-8 com alta afinidade mas têm baixa afinidade para o CCK-8 dessulfatado e para o CCK-4. 0 cérebro contém, predominantemente, os receptores do tipo B que ligam o CCK-8, o CCK-8 dessulfatado e o CCK-4 com alta afinidade. O CCK tem uma grande variedade de funções reguladoras na periferia, incluindo contracção da vesícula biliar, secreção da enzima pancreática, inibição da desocupação gástrica e secreção de insulina. Adicionalmente, sugeriu-se que o CCK, no cérebro,

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-4— tem um papel importante no controlo do apetite, na esquizofrenia, na memória e cognição, e como uma potencial terapia para o abuso de drogas. As altas concentrações de CCK e receptores de CCK encontradas no cérebro, confirmam, adicionalmente, uma importante função cerebral para este péptido. 0 CCK-8 e a forma dessulfatada mostraram ser equipotentes na intensificação da aprendizagem e da memória em ratinhos e em macacos (Pietrusiak, et al. Soc. Neurosci. Abstr. 15. 1030, 1988). A equipotência pelos dois compostos sugere que as acções são mediadas pelos receptores de CCK do tipo B. Adicionalmente, as acções do CCK administrado centralmente não foram afectadas pelos antagonistas administrados per ifer icamente, que são selectivos para os receptores de CCK do Tipo A. Várias referências descreveram agonistas de CCK ou análogos do CCK-8 e CCK-4. Por exemplo, Rivier, Patente dos E.U.A. NQ. 4 490 364, concedida em 25 de Dezembro, 1984, descreve análogos do CCK-8 heptapéptidos, octapéptidos e nonapèptidos como agonistas de CCK para a estimulação das contracções da vesícula biliar, retenção da secreção de ácido gástrico e tratamento de convulsões.

Bertolini, Pedido de Patente Europeia η°. EP0239716, publicado em 7 de Outubro, 1987, descreve fragmentos de gastrina contendo o tetrapéptido L-triptofi1-L-metioni1-L-asparti1-L-fe-nilalanilamida, para a terapia do choque e de insuficiências respiratórias e cardiocirculatórias. 0 Pedido de Patente Alemã N<2. DT2245459, publicado em 22 de Março, 1973, descreve a preparação de formas N-protegidas de L--triptofil-L-metionil-L-aspartil-L-fenilalanilamida. 0 pedido de Patente Japonesa N°. JA7138992, publicado em 16 de Novembro, 1971, descreve a preparação de formas protegidas de L-triptofil-L-metionil-L-aspartil-L-fenilalanilamida.

Morley, Fed. Pro o,, 27 1314 (1968), descreve análogos da L--triptofil-L-metionil-L-aspartil-L-fenilalanilamida incluindo Cbz-L-triptofil-L-metionil-L-3-(5-tetrazolil)alani1-L-fenilalani-

71 183 4693.PG.01 lamida.

Morley, Nature, 207 1356 (1965), descreve análogos da L~ -triptofil-L-metionil-L-aspartil-L-fenilalanilamida incluindo: C'0Z“Phe-Met-Asp~Phe-NH2? Boc-Trp-Met-ftsp-Phe-NH2;

Boc-(4-Me)Trp-Met-Asp-PheNH2 5 Boc-(5-Me)Trp-Met-Asp--PheNH25 Boc-(6-Me)Trp-Met-Asp-PheNHÍ25 2-indoli1-CH2-C(0)-Met-Asp-PheNH2> Boc-Trp-Nle-Asp-PheNH25 Cbz-Trp-Eth-Asp-PheNH25 Cbz-Trp-Nval-Asp-PheNH2; Cbz- Trp--Ala-Asp~PheNH2j CbZ“Trp-Met~Asp~TyrNH2 > e Cbz-Trp-Met--Asp-(OMe)TyrNH2.

Charpentier, Peptides, 9, 835 (1988)) descreve péptidos análogos do CCK tendo afinidade para receptores centrais de CCK.

Charpentier, Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 85. 1968 (1988), descreve péptidos cíclicos análogos do CCK tendo afinidade para receptores centrais de CCK.

Horwell, J. Med. Chem., 30. 729 (1987), descreve pequenos péptidos análogos do CCK como sondas para receptores de CCK do sistema nervoso central.

Nenhuma das referências acima mencionadas descreve ou sugere os tetrapéptidos análogos do CCK do presente invento, que possuem afinidade e selectividade para os receptores de CCK do tipo B.

Sumário do Irivento

De acordo com o presente invento há agonistas de colecistoquinina selectivos para receptores do tipo B, com a fórmula:

A-B-C-D

I ou um seu sal farmaceuticamente aceitável. A ê um acetilo funcionalizado ou Rg-C(O)- onde R9 é heterotricíclico ou carbotriciclico.

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-6- B é um resíduo 2-aminopropionilo funcionalizado. ftlternativamente, A-B, tomados conjuntamente, são um piperazinodionilo funcionalizado ou um 5-amino-3-aza-4-ceto--hexanoílo funcionalizado. C é

R 21 na qual r20 é hidrogénio ou um alquilo inferior, e f?2i é carboxi ou tetrazolilo.

Alternativamente, B-C, tomados conjuntamente, são um resíduo Ala-Asp com ponte ou um resíduo Ala-(tetrazolil)Ala com ponte. D é etilamino funcionalizado, tetra-hidro-isoquinolilo funcionalizado, piperazinon-l-ilo funcionalizado, desidro-Phe--amida ou um análogo de desidro-Phe.

Alternativamente, C-D, tomados conjuntamente, são succinimi-dilo funcionalizado. 0 termo "alquilo inferior", quando usado no presente invento, refere-se a radicais alquilo de cadeia linear ou ramificada possuindo de 1 a 7 átomos de carbono, incluindo, mas não lhe estando limitado, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec-butilo, pentilo, hexilo, heptilo e similares. 0 termo "alcenilo", quando usado no presente invento, refere-se a uma cadeia de átomos de carbono, linear ou ramificada, de C2 a C12 <?ue contém uma ligação dupla carbono--carbono incluindo, mas não lhe estando limitado, vinilo, alilo, propenilo, butenilo, isoprenilo e similares. O termo “alquileno", quando usado no presente invento, refere-se a um grupo separador de cadeia linear ou ramificada contendo 1 a 6 átomos de carbono incluindo, mas não lhe estando

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limitado, -CH(CH3)-, -(012)4- e similares. 0 termo "alcenileno", quando usado no presente invento, refere-se a um grupo separador de cadeia linear ou ramificada contendo 2 a 6 átomos de carbono e uma ligação dupla carbono--carbono incluindo, mas não lhe estando limitado, -CH=CH-, -C(CH3)=CH-, -CH=CH-CH2~ e similares. 0 termo "halo" ou "halogéneo", quando usado no presente invento, refere-se a cloro, bromo, iodo ou fluoro. 0 termo "haloalquilo", quando usado no presente invento, refere-se a um radical alquilo inferior no qual um ou mais átomos de hidrogéneo são substituídos com halogéneo, incluindo, mas não lhe estando limitado, clorometilo, fluorometilo, dicloroetilo, trifluorometilo e similares. 0 termo "alcoxi", quando usado no presente invento, refere--se a -OR51 onde R51 é alquilo inferior. O termo "tioalquioxi", quando usado no presente invento, refere-se a -SR52 onde R52 é alquilo inferior. 0 termo "acilo", quando usado no presente invento, refere-se a -C(0)R53 onde R53 é alquilo inferior. 0 termo "acetilo funcionalizado", quando usado no presente invento, inclui:

na qual Rj é (1) hidrogénio, (2) halo, (3) hidroxi, (4) alcoxi, (5) tioalcoxi, (6) amino,

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-8- (7) alquilamino, (8) amino(N-protegido) (9) alquilarnino(N-protegido) (10) dialquilamino (11) alquilo inferior substituído, no qual o substituinte é, independentemente, seleccionado de entre amino(N--protegido), alquilamio e dialquilamino, (12) alcenilo substituído no qual o substituinte é, independentemente, seleccionado de entre amino(N--protegido), alquilamino e dialquilamino, (13) R5-R4-C(0)-N(R6)- no qual R4 é alquileno C± a C& ou alcenileno C2 a C^, R5 é fenilo, fenilo substituído, amino N-protegido, amino, alquilamino, dialquilamino, alcoxi ou tioalcoxi e é hidrogénio ou alquilo inferior; e R3 é (1) naftilo, (2) naftilo substituído, (3) fenilo, (4) fenilo substituído ou (5) benzo-heterociclico; II) R7-R3-Y- no qual Y é inexistente ou -C(0)~, R7 é (1) naftilo, (2) naftilo substituído ou (3) benzo-heterociclico e «8 6 (1) alquileno a C& ou (2) alcenileno C2 a C^; -9~ 71 183 4693,PG,01

III) na qual R10 é (1) (2) (3) Rn ê (D (2) (3) naftilo, naftilo substituído ou benzo-heterociclico e fenilo, fenilo substituído ou heter©aromático monocíclico; IV)

na qual r12 é (D (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) hidrogénio, alquilo inferior, halo, amino, alquilamino, dialquilamino, hidroxi, alcoxi ou tioalcoxi e 71 183 4693,PG.01 -10-

R13 é (1) hidrogénio, (2) alquilo inferior ou (3) acilo; s 0

V)

H 0 termo "2-aminopropionilo funcionalizado" tal como usado no presente invento inclui: I)

R 15 na qual r14 é (1) hidrogénio ou (2) alquilo inferior e r15 ê (1) alquilo inferior, (2) cicloalquilo ou (3) alquileno a C4 substituído com tioalcoxi ou alcoxi; e II)

na qual R]_7 é alquileno C2 a C4,

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-11- r18 é (1) hidrogénio, (2) alquilo inferior, (3) alcoxi ou (4) tioalcoxi e

Rj9 é (1) S, (2) 0 ou (3) inexistente. 0 termo "piperazinodionilo funcionalizado" tal como usado no presente invento inclui: 0

na qual R38 é alquilo inferior ou R38 é alquilo inferior substituído com alcoxi ou tioalcoxi, R40 é (1) naftilo, (2) naftilo substituído ou (3) benzo-heterocíclico e R41 é (1) hidrogénio ou (2) alquilo inferior. 0 termo "succinimidilo funcionalizado" tal como usado no presente invento inclui

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na qual ^80 é (1) fenilo, (2) fenilo substituído, (3) naftilo, (4) naftilo substituído, (5) alquilo inferior, (6) cicloalquilo, (7) heterocíclico ou ¢8) bicíclico heterocíclico e

Rqi é (1) -NHR25 no qual R25 é hidrogénio, alquilo inferior, hidroxi ou alcoxi ou (2) -NHNHR26 no qual R26 ® hidrogénio ou alquilo inferior. 0 termo "5-amino-3~aza-4-ceto-hexanoilo funeionalizado", tal como usado no presente invento inclui

R 43 na qual R42 é (1) hidrogénio ou (2) um grupo N-protector, R43 é (1) naftilo, (2) naftilo substituído ou (3) benzo-heterociclico, R44 é alquileno C2 a C4 e R45 é (1) alquilo inferior ou (2) alquilo inferior substituído por -SH, tioalcoxi, -OH ou 71 183 4693,PQ.01 -13-

alcoxi. 0 termo "alcoxicarbonilo" tal como usado no presente invento refere-se a -C(0)0R54 no qual R54 é alquilo inferior. O termo ,,alquilamino“, quando usado no presente invento, refere-se a -NHR55 no qual R55 é alquilo inferior. 0 termo "dialquilamino", quando usado no presente invento, refere-se a “NR56R57 no qual R55 e R57 são, independentemente, seleccionados de entre alquilo inferior, 0 termo "amino N-protegido", quando usado no presente invento, refere-se a -NHR75 no qual R75 é um grupo N-protector.

R 23 0 termo "etilamino funcionalizado", quando usado no presente invento, incluis na qual

Roo e (1) hidrogénio ou (2) alquilo inferior, R23 ê (1) fenilo, (2) fenilo substituído, (3) naftilo, (4) naftilo substituído, (5) alquilo inferior, (6) cicloalquilo, (7) heterocíclico ou (8) biciclico heterocíclico e R24 é (1) -NHR25 no qual R2s é hidrogénio, alquilo inferior, hidroxi ou alcoxi ou (2) -NHNHR26 no qual R26 é hidrogénio ou alquilo inferior. -14- fí / r~ 71 183 4693,ΡΘ.01

Os termos "desidro-Phe amida" e "análogo de desidro-Phe arnida", quando usados no presente invento, incluem

H

na qual R34 é (1) fenilo, (2) fenilo substituído, (3) naftilo, (4) naftilo substituído, (5) heterociclico ou (6) bicíclico heterociclico e *35 é (1) -NHR36 no qual R36 é hidrogénio, hidroxi, alcoxi ou alquilo inferior ou (2) -NHNHR37 no qual R37 é hidrogénio ou alquilo inferior.

Os termos "resíduo Ala-Asp com ponte" e "resíduo Alaste trazolilo)Ala com ponte", quando usados no presente invento, incluem

na qual R48 é (1) hidrogénio ou (2) alquilo inferior R49 é alquileno C2 a C4 e

J 71 183 4693.PG.01 -15 «50 é (1) carboxi ou (2) tetrazolilo. 0 termo "alquilsulfonilo inferior", quando usado no presente invento, refere-se a -SO2R58 no qual Rgg é alquilo inferior. 0 termo "cicloalquilo", quando usado no presente invento, refere-se a um radical alquilo cíclico possuindo de 3 a 8 átomos de carbono, incluindo, mas não lhe estando limitado, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclo-hexilo e similares. 0 termo "fenilo substituído", quando usado no presente invento, refere-se a um grupo fenilo, o qual é substituído com um, dois ou três substituintes, seleccionados independentemente uns dos outros, de entre alquilo inferior, halogéneo, haloalqui-lo, alcoxi, benziloxi, tioalquioxi, hidroxi, alcoxicarbonilo, carboxi, amino, alquilamino, dialquilamino, nitro e -OSO3H. 0 termo "naftilo substituído", quando usado no presente invento, refere-se a um grupo naftilo o qual é substituído com um, dois ou três substituintes seleccionados, independentemente uns dos outros, de entre alquilo inferior, halogéneo, haloalqui-lo, alcoxi, benziloxi, tioalquioxi, hidroxi, alcoxicarbonilo, carboxi, amino, alquilamino, dialquilamino, nitro e -OSOjH. 0 termo "heterociclico" quando usado no presente invento refere-se a um anel de 5 membros ou de 6-membros contendo um, dois ou três átomos de azoto; um átomo de azoto e um de enxofre; ou um átomo de azoto e um de oxigénio; no qual o anel de 5 membros possui 0-2 ligações duplas e o anel de 6 membros possui 0-3 ligações duplas; no qual os heteroátomos azoto e enxofre podem estar, opcionalmente, oxidados; e, no qual, o heteroátomo azoto pode estar opcionalmente quaternizado. Os heterociclicos incluem, mas não lhes estão limitados, piridilo, furilo, tienilo, tetra-hidrofurilo, imidazolilo, piperazinilo, piperidinilo, pirrolidinilo, tiazolilo e similares. Os heterociclicos podem estar não substituídos ou substituídos com um ou dois substituintes seleccionados, independentemente um do outro, de entre

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alquilo inferior, halogéneo, haloalquilo, alcoxi, benziloxi, tioalquioxi, hidroxi, alcoxicarbonilo, acilo, formilo, carboxi, amino, alquilamino, dialquilamino, nitro, alquilsulfonilo inferior e -OSO3H. 0 termo "heter©aromático monociclico" refere-se a um anel aromático de 5 membros ou de 6 membros, contendo um, dois ou três átomos de azoto; um átomo de azoto e um de enxofre; ou um átomo de azoto e um de oxigénio incluindo, mas não lhe estando limitado, piridilo, pirimidilo, furilo, tienilo e similares. Os heteroaromáticos monociclicos podem estar não substituídos ou substituídos com um ou dois substituintes seleccionados, independentemente um do outro, de entre alquilo - inferior, halogéneo, haloalquilo, alcoxi, benziloxi, tioalquioxi, hidroxi, acilo, formilo, alcoxicarbonilo, carboxi, amino, alquilamino, dialquilamino, nitro, alquilsulfonilo inferior e -OSO3H. 0 termo "biciclico heterocíclico", quando usado no presente invento, refere-se a um sistema de dois anéis fundidos, um dos quais é um anel heterocíclico e sendo o outro seleccionado de entre benzeno e heterocíclico. Os biciclico—heterocíclicos podem estar não substituídosou substituídoscom um ou dois substituintes seleccionados, independentemente um do outro, de entre alquilo inferior, halogéneo, haloalquilo, alcoxi, benziloxi, tioalquioxi, hidroxi, acilo, formilo, alcoxicarbonilo, carboxi, amino, alquilamino, dialquilamino, nitro, alquilsulfonilo inferior e -OSO3H. 0 termo "benzo-heterocíclico", quando usado no presente invento, refere-se a um anel heterocíclico ao qual está fundido um anel benzeno. Os benzo-heterocíclicos incluem, mas não lhes estão limitados, indolilo, indolinilo, benzofurilo, benzotienilo, henzimidazolilo, quinolilo, isoquipolilo e similares. Adicionalmente, os benzo-heterocíclicos podem estar não substituídos ou substituídos com um ou dois substituintes, independentemente um do outro, seleccionados entre alquilo inferior, halogéneo, haloalquilo, alcoxi, benziloxi, tioalquioxi, hidroxi, acilo, formilo, alcoxicarbonilo, carboxi, amino, alquilamino, dialquila- -17- β3/ ττ 71 183 4693.PQ.01 mino, nitro, alquilsulfonilo inferior e -OSO3H. 0 termo “heterotriciclico", quando usado no presente invento, refere-se a um sistema de três anéis fundidos, sendo um deles um anel heterociclico definido como anteriormente, e sendo os outros dois seleccionados, independentemente um do outro, de entre heterociclico, como definido anteriormente, e benzeno. Os grupos heterotricíclicos podem estar não substituídos ou substituídos com um ou dois substituintes seleccionados, independentemente um do outro, de entre alquilo inferior, halogéneo, haloalquilo, alcoxi, benziloxi, tioalquioxi, hidroxi, acilo, formilo, alcoxicarbonilo, carboxi, amino, alquilamino, dialquilamino, nitro, alquilsulfonilo inferior e -OSO3H. Os heterotricíclicos incluem, mas não lhe estão limitados, carbazolilo, β-carbolinilo e similares. 0 termo “carbotricíclico", quando usado no presente invento, refere-se a um sistema de três anéis carbociclicos fundidos, contendo, cada anel, 5 ou 6 átomos de carbono e sendo, cada anel, insaturado ou saturado. Os grupos carbotricíclicos podem estar não substituídos ou substituídos com um ou dois substituintes seleccionados, independentemente um do outro, de entre alquilo inferior, halogéneo, haloalquilo, alcoxi, benziloxi, tioalquioxi, hidroxi, acilo, formilo, alcoxicarbonilo, carboxi, amino, alquilamino, dialquilamino, nitro, alquilsulfonilo inferior e -OSO3H. 0 termo "tetra-hidroisoquinolilo funcionalizado", quando usado no presente invento, inclui

na qual r27 é (1) -NHR28 no qual R23 é hidrogénio, hidroxi, alcoxi ou alquilo inferior,

71 183 4693,Ρ6.01 -18- (2) alcoxi ou (3) -NHNHR29 no qual R29 é hidrogénio ou alquilo inferior, 0 termo "piperasinon-l-ilo funcionalizado", quando usado no presente invento, inclui

R30 é (1) fenilo, (2) fenilo substituído, (3) riaftilo, ¢4) naftilo substituído, (5) alquilo inferior, (6) heterocíclico ou (7) biciclico heterocíclico e R31 é (1) -N(R32)~ no qual R32 é hidrogénio ou alquilo inferior ou (2) -N(NH(R33))- no qual R33 é hidrogénio ou alquilo inferior. 0 termo "N-protegido" ou "grupo N-protector", quando usado no presente invento, refere-se àqueles grupos destinados a proteger o terminal N de um aminoácido ou péptido, ou a proteger um grupo amino contra reacções indesejáveis durante um processo sintético, ou para prevenir o ataque de exopep t i dases nos compostos, ou para aumentar a solubilidade dos compostos e inclui, mas não lhe está limitado, sulfonilo, acetilo, pivaloilo, t-butiloxicarbonilo (BOC), benziloxicarbonilo (Cbz), benzoilo ou um resíduo L- ou D-aminoacilo, que pode, ele próprio, estar N--protegido.

Todos os resíduos ^aminoácido identificados no presente invento estão na configuração natural L, a não ser que designado em contrário com "D-" (p, ex., D-Trp). Em conformidade com a -19- -19- 71 183 4693.PG.01

vÉÍT nomenclatura Standard de péptidos, J. Biol. Chem.. 243:3557-59, (1969), são usadas no presente invento as abreviaturas para os resíduos^aminoácidos. Os compostos de fórmula I contêm dois ou mais átomos de carbono assimétricos e, assim, podem existir na forma de diastereómeros puros, misturas de diastereómeros, race-matos dias ter eornéricos ou misturas de racematos diastereomér icos. 0 presente invento inclui, dentro do seu campo, todas as formas isoméricas.

Outras abreviaturas usadas no presente invento são como se mostra na seguinte Tabela de Correspondência:

TABELA DE CORRESPONDÊNCIA SÍMBOLO REPRESENTA Tyr L-tirosina Gly glicina Phe L-fenilalanina Met L-metionina Ala L-alanina Ser L-serina Ile L-isoleucina Leu L-leucina Thr L-treonina Vai L*-valina Pro L-prolina Lys L-lisina His L-histidina Gin L-glutamina Glu ácido L-glutâmico Trp L-triptofano Arg L-arginina Asp ácido L-aspártico Asn L-asparagina Cys L-cisteína a-Nal 3-(l-naftil)alanina 0-Nal 3-(2-naftil)alanina Cha 3-(ciclo-hexil)alanina Pip ácido pipecolínico

71 183 693.Ρ8.01

-20-

(OBSidro)Phe

0 Μ -

Asu 0

J 71 183 4693.Ρ6.01 A abreviatura y/'(CH=CH) indica que a ligação peptidica (-C(O)NH-) de um péptido foi substituída por uma ligação dupla. Por exernplo, Trp- y^(CH=CH)Leu representa um resíduo triptofano ligado a um resíduo leucina no qual a ligação peptidica está substituída, como se mostra em seguida.

Note-se que todas as sequências de r esí duoá-f aminoácido estão representadas no presente invento, por fórmulas cuja orientação da esquerda para a direita está na direcção convencional do terminal amino para o terminal carboxi.

Os compostos típicos do presente invento incluem:

Ctp-Leu-Asp-Phe~NH2 ? BOC-TRp-Leu-Asp-T iq-NH2 s B-Carbolina-3-carbonil-Leu-Asp-Phe-NH2;

Nct-Leu-Asp-Phe-NH21 BOC-T rp-Leu-Asp-(N-Me)Phe~NH2 ϊ

Ctp-Leu-Asp-(N-Me)Phe-Ní-52; 2(S)-[3-((terc-Butiloxicarbonilamino)-3-(indol-3-il-metil)--2-oxo-l-pirrolidinil) ]-4~metil-pentanoil-Asp-Phe-NH2> 4-Carboxam i da-[3,4,5,6-c,d]-indolil)-Leu-Asp-Phe-NH2 ? B0C-Trp-Leu-[B-l(2)H-tetrazol-5-il]-L-alanil-Phe-NH2s D-Ctp-Leu-Asp-Phe~NH25 3-(3-Quinolil)-propionil-Leu-Asp-Phe-NH2ϊ 3-(2-Naf til)-propionil-Leu-Asp-Phe-NH2; 3-(9-Fenantr i1)-propioni1-Leu-Asp-Phe-NH2í Cbz-Trp-(NMe)Leu-Asp-Phe-NH2 » fenilalaninaamida do ácido 3-Carboxi-2(S)-[3(R)-(Boc--Triptofano carboxamida)-2-oxo]-l-pirrolidinil-2(S)-propi-ónico; N-(4-Hidroxicinamoil)-Trp-Met-Asp-Phe-NH2í

J 71 183 4693,PS,01 -22-

N-(J3~Naf toil)-( des idro )Phe-l_eu-Asp-Phe-NH2ϊ N-(α-Naf toi1)-(desidro)Phe-Leu-Asp-Phe-NH2 ΐ BOC-T r p-Leu-Asp- ( desidro ) Phe-NH2 í BOC-Trp-Leu-Asp-(m-ni tro)Phe-NH2? BOC-Trp-Leu-Asp-(m-[N-eti1]amino)Phe-NH2 í

Ctp-Leu-Asp-(desidro)Phe-NH2 ϊ BOC-Trp-Met-Asu-Phe-MH2» BOC-Trp-Tpp-Asp-(N-ile)Ph e-NH21 BOC-Trp-Mle-Asp-(N-Me)Phs-NH2s

BOC-Trp-Nle-Asp-(desidro)Phe-MH2S BOC-trp-Leu-Asu-Phe-NH^» 5 N«-BOC-Nin-formil-Trp-Leu-Asp-Phe-NH2; N£X-B0C-NÍn-(273-di-hidroindolo-Trp)-Leu-Asp-Phe-NH2; (2,3-Di-h idroi ndolo-Trp)-Leu-Asp-Phe-NH2 5 B0C-5-ami no-2-(3’indolilmetil)pentanoil-Leu-fisp-Phe-NH2ϊ B0C-5-amino pentanoil-Leu-Asp-Phe-NH2â B0C-5-amino-2-(3!'-indolilmetil)-2-pentenoil-Leu-Asp-Phe-NH2i;

Na-BOC-Nin-propionil-Trp-Leu-Asp-Phe-NHÍ25 3-(3-Indolil)propionil-Nle-Asp-Phe-NH2; 8-(N-( t-Butoxicarbonil )arni no )-2-( 3-i ndolometi 1 )-2-octanoil~ -Leu-Asp-Phe-NH2 ? N-(Indolo-2-propil)Leu-Asp-Phe-NH2; BOC-eiy-*^(CH=CH )-Trp-Leu-Asp~Phe-NH2; BOC-Trp-Leu-Asp-Phe-OCH3;

Ctp-Leu-Asp-Phe-NHNH2; BOC-Trp-Leu-Asp-Trp-NH2* BOC-Trp-Leu-Asp-a-Nal-NH25 B0C-Trp-Leu-Asp-B-Nal-NH2 BOC-Trp-Leu-Asp-Cha-NH25 BOC-Trp-Pro-Asp-Phe-NH2 ? BOC-Trp-Tpp-Asp~Phe-NH2i Ctp-Tpp-Asp-Phe-NH2; B0C-B-Nal-Leu-Asp-Phe-NH2 s BOC-T rp-Leu-Asp-3(S)-ben2 il-2-oxo-4-piperazi na; C tp-Tpp-Asp-(NMe)Phe-NH21 Ctp-Cpp-Asp~Phe-NH2; BOC-T rp-Tpp-Asp-Trp-NH21 -23-

-23- J 71 183 4693.PG.01 B0C-6-Nal-Tpp-Asp-<s-Nal-NJl21 BOC-fí-Na 1 -Tpp-ftsp-0-Na I-NH2.' C tp-T pp-Asp-a-Nal-NH2;

Ctp-Tpp-Asp-B-Nal-NH2I Ctp-Tpp-Asp-Cha-NH2l Ctp-1,4-tiazaηο-3-carboni1-Asp-Ph8-NH25 Ctp-Pip-Asp-Phe-NH2» 2-(3-[Indolo-3-metil]dicetopiperazinil)valeril-Asp-Phe-NH2; 2-(3-[Indolo~3-metil]dicetopiperazinil)isocaproil-Asp-Phe~ -nh2; 2-(3-[Indolo-3-meti1]dicetopiperaz i ni1)caproil~Asp~Phe~NH2 i B0C-Trp-(N-l,4-tiazepino-2-carbonil)“Asp-Phe~NH2 BQC-Trp-Cha-Asp-Phe-NH^? e 2-(3-[Naftil-2-metil]dicetopiperazinil)isocaproil-Asp-Phe--NH2.

Os compostos preferidos do presente invento incluem:

Ctp-Leu-Asp-Phe~MH2 ? 80C-Trp~Leu-Asp-Tiq-NH2?

Ctp-Leu-Asp-N-Me-Phe-MH2 S

Ctp-Leu-Asp-(desidro)Phe-NH25 BOC-Trp-Tpp-Asp-Rhe-NH2 ΐ Ctp-Tpp-Asp-Phe-NH25 C tp-T pp-Asp-(NMe)Phe-UU2ϊ

Ctp-Tpp-Asp-a-Nal-NH2 S

Ctp-Tpp-Asp-3-Nal-NhÍ2s e

Ctp-1,4-tiazano-3-carboni1-Asp-Phe-NH2-

Processos sintéticos gerais

Os compostos do presente invento, representados pela fórmula I, podem ser preparados por vários processos que são considerados Standard na síntese de péptidos. Uma descrição detalhada destes processos está incluída em “The Peptides, Vol. 1", Gross and Meienhofer, Eds., Academic Press, New York, 1979. Os processos de acoplamento que são empregues incluem o método de carbodiimida (1,3-diciclo-hexilcarbodiimida [DCC], hidrocloreto de l-(3--dimetilaminopropil-3-etilcarbodiimida [EDCI]) com a opção de

71 183 4693.ΡΘ.01 aditivos de prevenção [HOBT]), o método do cloroformato de isobutilo), o método da azida, o método do ácido clorídrico, o método do anidrido simétrico, o uso de cloreto bis(2-oxo-3-oxazolidinil)fosfínico (B0P-C1), e o processo do éster activo (ésteres de M-hidroxisuccinimida, ésteres de 4--nitrofenol, ésteres de 2,4,5-triclorofenol, e similares).

Os compostos do presente invento preparam-se por acoplamento, por passos, dos aminoácidos, ou por acoplamento de fragmentos de tamanho de dipéptido ou maiores. Assim, a porção ácido carboxilico livre de um aminoácido ou de um fragmento de péptido, é activada e deixada condensar com o grupo azoto livre do segundo aminoácido ou fragmento de péptido. As reacções de acoplamento são conduzidas em solventes tais como o cloreto de metileno (CH2CI2), o tetra-hidrofurano (THF), a dimetilformamida (DMF) ou outros solventes similares, sob uma atmosfera inerte tal como azoto (1¾) ou argon (Ar).

Durante o processo de acoplamento, os ácidos carboxílicos ou aiainas não participantes no conjunto reaccional de aminoácidos ou fragmento de péptido, são protegidos por grupos protectores que podem ser, selectivamente, removidos, posteriormente, se desejado. Uma descrição detalhada destes grupos e da sua selecção e química está contida em "The Peptide, Vol. 3", Qross and Meienhofer, Eds>, ftcademic Press, New York, 1981. Assim, são grupos protectores úteis para os grupos amino, o benziloxicarbonilo (Cbz), o t-butiloxicarbonilo (BOC), o 2,2,2--tricloroetoxicarbonilo (Troe), o t-amiloxicarbonilo, o 4-metoxi-benziloxicarbonilo, o 2-(trimetilsilil)etioxicarbonilo, o 9— -fluoroenilmetoxicarbonilo (FMGC), o ftaloilo, o acetilo, o formilo, o trifluoroacetilo, e similares.

Exemplos de grupos protectores úteis para o ácido carboxilico incluem ésteres, tais como de metilo, etilo, benzilo, t-butilo, 2,2,2-tricloroetilo, alilo, 4-nitrobenzilo, e similares. A remoção destes grupos protectores pode ser conseguida, selectivamente, empregando várias condições hidrolí-

J 71 183 4693.PG.01 -25- tica, hidrogenolítica, térmica ou dissolução de metais, catalisadas por ácido ou base.

Para a produção de um composto do invento, onde qualquer um, ou vários, dos aminoácidos constituintes transportam um grupo N--alfa-alquilo, especificamente metilo, o correspondente N-alfa--alquilaminoácido pode ser preparado pelo método descrito por Benoiton (Can. J. Chem., 55, 906 (1977)) ou Shuman ("Peptides = Proceedings of the Seventh American Peptide Symposium", D. Rick, E. Gross, Eds.,Pierce Chemical Co., Rockford, IL 1982, p 617) nos quais o aminoácido protegido com BOC ou Cbz, é tratado com uma base na presença de um agente quelante tal como um éter coroa e, depois, extinto com iodeto de metilo. Um método alternativo descrito por Freidinger (J. Org. Chem., 48, 77 (1983)) no qual a redução com trietilsilano da oxazolidinona de um aminoácido produz, directamente, o derivado N-alfa-metilo, pode, também, ser utilizado.

Os exemplos seguintes servirão para ilustrar adicionalmente a preparação dos novos compostos do invento.

Exemplo 1 CTP-Leu-Asp-Phe-NHo

Exemplo la

Bromoacetil-L-Trp-OBn

Adicionou-se a uma solução de hidrocloreto de L-Trp-OBn (15,0 g, 45,35 mmol) e trietilamina (9,18 g, 90,68 mmol) em etanol absoluto (200 ml) arrefecida a 02C, cloreto de bromoacetilo (7,13 g, 45,34 mmol), gota a gota, durante 10 min. Agitou-se a mistura reaccional durante a noite com aquecimento até à temperatura ambiente. Removeu-se o solvente em vácuo e submeteu-se o resíduo a partição entre HC1 aquoso 0,1N (150 ml) e acetato de etilo (250 ml). Após secagem com N32S04, concentrou-se a fase orgânica em vácuo e cromatografou-se o resíduo (acetato de etilo/hexanos) para dar 12,60 g de um óleo límpido incolor.

J 71 183 4693.PG.01

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Exemplo lb 4-Benz iloxicarbonil-6-oxo-5,4,5,6-tetra-hidro-ΙΗ„5H-azoci ηΓ 4,5,6--c.dlindolo (Ctp-QBn)

Preparou-se o composto do título por uma adaptação de um procedimento original descrito por 0. Yonemitsu et al. ΓJ. Am.

Chem Soc.. 88. 3941-3945 (1966)]. Irradiou-se durante 3 h uma solução^composto do exemplo la (6,7 g, 16,14 mmol) em etanol a 40%/água (1 1) a 802C (Hanovia 450W. lâmpada Hg/filtro vycor). Concentrou-se a mistura resultante em vácuo até 600 ml de extractou-se a fase aquosa com acetato de etilo (3x). Após secagem com Na2S04, removeu-se o solvente em vácuo e cromatografou-se o resíduo (acetato de etilo) para dar uma mistura de produtos ciclizados substituídos na posição 2 e na posição 4 (1,20 g) juntamente com 4,90 g de material de partida que não reagiu. Recristalizou-se a mistura (acetato de etilo/éter dietílico/hexanos) para dar 0,45 g de sólido cristalino branco. l-H-RMN (DMS0-d6, 300 MHz) Ô 3,42 (m, 3H), 4,10 (d largo, 1H), 4,30 (s largo, 1H), 5,25 (s, 2H), 6,75 (d, 1H), 6,94 (t, 1H), 7,12 (m, 3H), 7,30 (m, 5H), [a]D= -75,12 (c=l, MeOH), pf 149- 1512c.

Exemplo 1c

Ctp-Leu-Asp(QBn)-Phe-NHo

Hidrogenou-se uma mistura do composto do exemplo lb (0,20 g, 0,60 mmol) e Pd 5%/BaS04 (0,04 g) em metanol (10 ml), sob uma atmosfera de hidrogénio à temperatura ambiente durante 0,5 h. Filtrou-se o catalisador e removeu-se o solvente em vácuo para dar 0,13 g de ácido livre (CTP-QH) na forma de um sólido cor - de--rosa suficiente para usar sem purificação adicional.

Adicionaram-se ao ácido (0,13 g, 0,55 mmol) em DMF (8 ml), arrefecido a 02C, hidrocloreto de Leu-Asp(OBn)-Phe-NH2 [J. Martinez, et al., J. Med. Chem.. 28. 1874 (1985)] (0,28 g, 0,55 mmol), difenilfosforilazida (DPPfi) (0,18 g, 0,65 mmol), e N--metilmorfolina (0,12 g, 1,20 mmol). Agitou-se a mistura durante a noite, com aquecimento, até à temperatura ambiente. Concentrou-se o solvente até 2 ml e dissolveu-se o resíduo em 71 183 4693.ΡΘ.01 acetato de etilo (50 ml). Lavou—se a fase orgânica com soluçoes aquosas de NaHC03 saturada (3x) e HC1 0,1N (3x). Após secagem com Ν32$θ4, removeu-se o solvente em vácuo. Triturou-se o resíduo a partir de acetato de etilo/éter dietílico e recolheu-se o sólido resultante e recristalizou-se a partir de etanol/água para dar 0,34 g de sólido branco em duas colheitas. MS(FAB+) m/e 709 (M+H)+. iH-RMN (DMS0-d6, 300 MHz) <S 0,85 (m, 6H), 1,40 (m, 1H), 1,55 (m, 1H), 2,59 (m, 1H), 2,79 (m, 2H), 2,95 (m, 1H), 3,25--3,56 (m, 4H), 4,15 (m, 1H), 4,32 (m, 2H), 4,55 (m, 1H), 5,10 (s, 2H), 6,74 (d, 1H), 6,95 (t, 1H), 6,99 (d, 1H), 7,10 (m, 9H), 7,30 (m, 5H), 7,83 (d, 1H), 8,20 (d, 1H), 8,37 (d, 1H), 10,93 (s largo, 1H).

Exemplo ld Ctp-Lau-ftsp-Phe-NH?

Hidrogenou-se uma mistura do composto do exemplo 1c (0,21 g, 0,29 mol) e Pd 5%/BaS04 (0,05 g) em DMF (10 ml) sob hidrogénio a uma atmosfera, à temperatura ambiente, durante a noite. Filtrou--se duas vezes o solvente através de celite e concentrou-se até 1 ml. Triturou-se o solvente com acetato de etilo para dar 0,17 g de sólido branco. MS (FAB+) m/e 619 (M+H)+- ÍH-RMN (DMS0-d6, 300 MHz) <5 0,85 (m, 6H), 1,35 (m, 2H), 1,55 (m, 1H), 2,45 (m, 1H), 2,65 (m, 2H), 2,77 (m, 1H), 2,97 (m, 1H), 4,12 (m, 2H), 4,45 (q, 1H), 6,73 (d, 1H), 6,93 (t, 1H), 6,97 (d, 1H), 7,05 (m, 8H), 7,30 (s largo, 1H), 7,83 (d, 1H), 8,18 (d, 1H), 8,27 (d, 1H), 10,93 (s largo, 1H), 12,35 (s largo, 1H). Anal. calc. para C32H33Mé°7-H2Oϊ C 60,35, H 6,13, N 13,20; Encontrados C 60,71, H 6,12, N 13,15. pf 236-237,500 (dec).

Exemplo 2

Boc-Trp-Leu-Asp-T iq-MHo

Exemplo 2a 5(S)—1,2.5,4-tstra-hidroisoquinolino-5-carboxamida

Sumeteu-se a partição entre acetato de etilo (300 ml) e NaHC03 (300 rnl), p-tolusnossulfonato de 3(S)-1,2,3,4-tetra-hidro-isoqui noli ηο-3-carboxilato de benzilo (11,68 g, 26,62 mmol) preparado de acordo com o processo de K. Hayashi et al., Chem.

J 71 183 4693.PQ.01 -28-

Pharm. Buli. 31(1), 312-314, (1983). Após secagem com Na2S04, filtrou-se a fase orgânica e removeu-se o solvente em vácuo para dar 7,11 g de óleo levemente amarelo. Dissolveu-se este óleo (7,11 g) em metanol e arrefeceu-se a -202C. Saturou-se a solução com amónia gasosa seca, cobriu-se com um septo e deixou-se em repouso a 020, durante a noite. Removeu-se o solvente em vácuo e triturou-se o resíduo com éter dietílico para dar 4,08 g de sólido branco, pf. 157-15820. [cí]d -5720 (c=l, MeGH).

Exemplo 2b Boc-fisp(QBn )T iq-Mi-ig A uma suspensão gelada do composto do exemplo 2a (7,0 g, 39,27 mrnol) e Boc-Asp(0Bn)0H (12,86 g, 39,27 mmol) em acetato de etilo (250 ml) adicionaram-se 4-dimetilaminopiridina (4-DMftP) (0,97 g, 0,79 mmol), e N,W?-diciclo-hexilcarbodiimida (DCCI) (9,84 g, 47,72 mmol) em acetato de etilo (20 ml). Agitou-ss a reacção a 02C durante 4 h e então filtrou-se a solução. Lavaram--ss os orgânicos com soluções aquosas de HC1 0,1N (3x) e de

NaHCOj saturada (3x). Após secagem com Na2S04 removeu-se o solvente em vácuo e cromatografou-se o resíduo (acetato de etilo/hexanos) para dar 10,10 g de sólido amorfo branco. MS (EI) m/e 481 (M+). iH-RMN (CPCI3, 300 MHz) <3 1,39 (s, 9M), 2,78 (dd,

Exemplo 2c Boc-Asp-Tiq-NHb

Hidrogenou-se uma mistura do composto do exemplo 2b (0,66 g, 1,38 mmol) e Pd 10%/C (0,050 g) em metanol (25 ml) sob hidrogénio a uma atmosfera à temperatura ambiente durante 0,5 h. Filtrou-se o catalisador e removeu-se o solvente em vácuo para dar 0,54 g de sólido amorfo branco. -H-RMN (CDCI3, 300 MHz) ó 1,39 (s largo,

J 71 183 4693,PG.01

-29-

Exemplo 2d

Trif luoroacetato de Leu-Asp-Tiq-Nffo

Tratou-se uma solução do composto do exemplo 2c (0,54 g, 1,38 mmol) em ácido acético (5 ml) com HC1 1,4 N/ácido acético (10 ml) à temperatura ambiente durante 0,5 h. Triturou-se a solução com éter dietílico para dar 0,37 g de um sólido higroscópico branco o qual se usou sem purificação adicional, A uma solução do sólido (0,37 g, 1,13 mmol) e éster de Boc-Leu-N--hidroxissuccinimida (0,37 g, 1,13 mmol) em DMF (10 ml) arrefecida a Q2C adicionou-se N,N-diisopropiletilamina (0,15 g, 1,13 mmol). Agitou-se a mistura durante a noite com aquecimento até à temperatura ambiente, Concentrou-se o solvente em vácuo até 5 ml e triturou-se com acetato de etilo para dar 0,42 g de sólido branco contendo o sub-produto dicetopiperaz i na. Tratou-se o sólido bruto com ácido trif1uoroacético 80%/água durante 0,3 h e triturou-se com éter dietilico para dar 0,29 g de sólido branco isento do sub-produto dieetopiperazina. Ij-S-RMN (DMSO-d^, 300

Exemplo 2e

Boc-Trp-Leu-Asp-T iq-NHg

A uma solução do composto do exemplo 2d (0,073 g, 0,14 mmol) em DMF (3 ml) arrefecida a 02C, adicionaram-ss éster de Boc-Trp-2,4,5-triclorofenilo (0,068 g, 1,14 mmol) e N,N~ -diisopropiletilamina (0,18 g, 0,14 mmol), Agitou-se a mistura durante a noite com aquecimento até à temperatura ambiente. Adicionaram-se ciclo-hexano (15 ml) e água (15 ml) e aqueceu-se suavemente a mistura num banho de vapor formando uma suspensão túrbida. Filtrou-se o sólido e lavou-se com ciclo-hexano (2x) para dar 0,11 g de sólido branco. MS (EI) m/e 691 (M+). 1h-RMN

-30- 71 183 4693.ΡΘ.01 (t, 18), 7,12 (s largo, 18), 7,15 (m, 68), 7,55 (d, 18), 8,82 (m 2H), 8,25 (d, 18), 10,78 (s largo, 1H), 12,38 (s largo, 1H)

Anal. calc. para 0358458503.820= C 60,43, H 6,76, N 12,09; Encontrada: C 60,50, 8 6,61, N 11,95. p.f. 200-201,5QC.

Exemplo 3 ,β-Car boi i ηο-5-csrbonil-Leu-Asp-Phe-NHo

Exemplo 5a B-Carbolino-3-carbonil-Leu-AspfOBn)-Phe-MH2 A uma solução de ácido 8-carbolino-3-carboxílico (0,15 g, 0,70 mmol) preparado de acordo com o processo de M. Cain et. al. J, Med, Chem. 25, 1081—1091, (1982) em BMF (10 ml) arrefecida a 02C adicionaram-se hidrocloreto de Leu-Asp(QBn)-Phe-NHg (0,37 g, 0,70 mmol), difenilfosforilazida (0,21 g, 0,78 mmol), e trietilamina (0,14 g, 1,41 mmol). Agitou-se a mistura durante a noite com aquecimento até à temperatura ambiente. Adicionou-se acetato de etilo (30 ml) e lavou-se a fase orgânica com soluções aquosas de HC1 0,10 N (3x) e NaOH 0,50 N (3x). Após secagem com Na2S04 removeu-se o solvente em vácuo e triturou-se o residuo com acetato de etilo frio para dar 0,26 g de sólido amarelo. MS(FAB+) m/e 677 (M+8)+. 1H-RMN(DMSO-d^, 300 MHz), <5 0,85 (m, 68), 1,45

12,00 (s largo, 18), Anal. calc. para €338408505.0,5820= C 66,29, 8 5,83, N. 12,26; Encontrado: C 66,29, H 5,68, N 12,03. pf 187--189,5QC.

Exemplo 3b B-Carbolino-5-carbonil-Leu-Asp-Phe-WHo

Hidrogenou-se uma mistura do composto do exemplo 3a (0,15 g, 0,22 mmol) e Pd 5%/BaS04 (0,035 g) em metanol (10 ml) sob hidrogénio a uma atmosfera à temperatura ambiente durante 1,2 h. Filtrou-se o catalisador e removeu—se o solvente em vácuo. Dissolveu-se o resíduo em metanol (1 ml) e triturou-se com éter dietílico para dar 0,96 g de sólido castanho amarelado. MS(FAB+) m/e 587 (M+8)+. *H-RHW (DMS0-d6, 300 MHz), <3 0,85 (m, 6H), 1,45 71 183 4693,PG.01

-31-

1H), 12,35 (s largo, 1H). Anal. Cale. para C31H34N606.2H20: C

Exemplo 4

Nct-Leu-Asp— Phe-NMo

Exemplo 4a ácido 2—bromononanóico

Adicionou-se a uma mistura de ácido nonanóico (20 g, 126 mmol) e bromo (24,3 g, 152 mmol), tricloreto fosforoso (5,2 g, 38 mmol), lentamente durante 0,5 h. Refluxou-se a mistura durante 3 d. e então diluiu-se com acetato de etilo (200 ml). Lavou-se a fase orgânica com NaHSQ3 aquoso saturado (3x), separou-se, secou-se (Na2S04), e removeu-se o solvente em vácuo para dar 27,0 g de óleo castanho. ^-Í-RMN (CDC13, 60 MHs), Ô 0,70 (m, 3H), 1,20 (m, 9H), 1,90 (m, 3H), 4,13 (m, 1H), 10,80 (s largo, 1H).

Exemplo 4b 2-Bromononanoil-Trp-OSn A uma solução do composto do exemplo 4a (1,5 g, 6,30 mmol) em acetato de etilo (150 ml) arrefecida a 0°C adicionaram-se hidrocloreto de L-trp-OBn (2,10 g, 6,30 mmol), trietilamina (0,64 g, 6,30 mmol) e N,NP-dicicIo~hexilearbodiimida (1,57 g, 7,60 mmol). Agitou-se a suspensão resultante durante a noite com aquecimento até à temperatura ambiente. Filtrou-se a solução e lavou-se o sobrenadante com soluções aquosas de HC1 0,1 N (3x) e NaOH 0,5 M (3x). Após secagem com Na2S04 removeu-se o solvente em vácuo para dar 3,10 g de óleo castanho. -Ή-RMN (CDCI3, 60 MHz), 6 0,80 (m, 3H), 1,10 (s largo, 9H), 1,67 (m, 3H), 3,20 (d, 2H),

71 183 4693.PG.01

Exemplo 4c 4-Benzioxicarbonil-6-oxo-7-hepti1-5.4.6„7-fceira-h idro-1H-5H--asocinr4,5.6-c.dlindolo. (Nct-OBn)

Fez-se reagir uma solução do composto do exemplo 4b (3,10 g, 6,0 mmol) em etanol 40%/água (1 1) sob condições similares às descritas no exemplo 1b. Cromatografou-se o resíduo (acetato de etilo/hexanos) para dar 0,19 g de óleo ceroso. MS (EI) m/e 432 (M+). in-RMN (CDCI3, 300 MHz), Ô 0,85 (m, 3H), 1,15 (m, 10H), 1,93 (m, 1H), 2,35 (m, 1H), 3,47 (dd, 1H), 3,93 (q, 1H), 4,43 (q, 1H), 4,80 (m, 1H), 5,19 (m, 2H), 6,20 (d, 1H), 6,75 (s largo, lh'), 7,05 (d, 1H), 7,13 (t, 1H), 7,20 (d, 1H), 7,93 (m, 5H), 8,00 (s largo, 1H).

Exemplo 4d Mct-OH

Hidrogenou-se uma mistura do composto do exemplo 4c (0,16 g, 0,37 mmol), e Pd 5%/8aS04 em metanol (5 ml) sob uma atmosfera de hidrogénio à temperatura ambienta durante 1,0 h. Filtrou-se o catalisador e removeu-se o solvente em vácuo para dar 0,13 g de pó cor - de-laranja claro. li-i-RMNI(DMS0-d£, 300 MHz), d 0,84 (m, 3H), 1,15 (m, 9H), 2,12 (m, 1H), 3,40 (m, 2H), 3,86 (m, 1H), 4,34 (m, 1H), 6,73 (d, 1H), 6,96 (t, 1H), 7,13 (d, 1H), 7,16 (s largo, 1H), 7,18 (m, 1M), 8,23 (d, 1H), 10,85 (s largo, 1H).

Exemplo 4e

Nct-Lsu-Aspf 08n l-PSie-Ml·^

Agitou-se a 02C durante 3 dias, uma solução do composto do exemplo 4d (0,13 g, 0,37 mmol), hidrocloreto de Leu-Asp(OBn)-Phe~NH2 (0,21 g, 0,37 mmol), N-metilmorfolina (0,09 g, 0,91 mmol), e DPPA (0,11 g, 0,41 mmol) em DMF (3 ml). Concentrou-se o solvente em vácuo até 1 ml e diluiu-se com acetato de etilo (30 ml). Lavaram-se os orgânicos com soluções aquosas de HC1 0,IN (3x) e NaOH 0,5M (3x). Após secagem com Na2S04 removeu—se o solvente em vácuo e triturou-se o resíduo com acetato de etilo frio para dar 0,60 g de sólido castanho amarelado. MS (FAS+) m/e 806 (M+H)+. ^H-RMN(DMSQ-d£, 300 MHz), <3 0,75 (rn, 9H), 1,15 (m, 12H), 1,45 (m, 3H), 1,80 (m, 1H), 2,05 -33- -33- 71 183 4693.PG.01 ff* iinri (m, 1H), 2,43 (dd, 1H), 2,93 (q, 1H), 3,05 (dd, 1H), 3,30 (m, 2H), 3,55 (m, 1H), 3,93 (m, 1H), 4,25 (m, 2H), 4,50 (m, 1H), 4,65 (rn, 1H), 6,75 (d, 1H), 7,02 (m, 13H).

Exemplo 4f Nct-Leu-ftsp-Phe-NH?

Hidrogenou-se uma mistura do composto do exemplo 4e (0,045 g, 0,056 mmol) e Pd 5%/BaS04 (10 mg) sob hidrogénio a uma atmosfera à temperatura ambiente durante 1 h. Filtrou-se o catalisador, removeu-se o solvente em vácuo e cromatografou-se o resíduo sobre sílica gel utilizando acetato de etilo/piridina/ácido acético/água (31,4/4,0/1,2/2,2). Removeram--se os solventes em vácuo e suspendeu-se o resíduo em água (2 ml) e liofilizou-se para dar 0,014 g de sólido branco. MS(FAB+) m/e 717 (M+H)+. lH-RMN(DMS0-d6, 300 MHz), d 0,70 (m, 9H), 1,10 (m, 12H), 1,55 (m, 1H), 1,70 (m, 1H), 2,05 (m, 1H), 2,30 (m, 2H), 2,65 (m, 1H), 2,98 (m, 1H), 3,05 (m, 1H), 3,40 (m, 1H), 3,55 (m, 1H), 3,70 (m, 1H), 4,25-4,60 (m, 3H), 6,71 (d, 1H), 6,75-7,10 (m, 10H), 7,45 (s largo, 1H), 8,01 (d, 1H), 8,05 (s largo, 1H), 8,25 (d, 1H), 10,85 (s largo, 1H). Anal. calc. para C4oH52Né°7-2>5H2°: C 62,08, H 7,42, N 10,86; Encontrada C 62,00, H 7,09, N 10,65.

Exemplo 5

Boc-Tr ρ-Le u-fisp-( Ntie )Phe-NHo

Exemplo 5a N-CBz-fNMe^Phe-QH A uma solução de L-N-Me-Phe-0H (2,73 g, 15,23 mmol) e N,N--diisopropiletilamina (4,13 g, 18,27 mmol) em dioxano/água (1:1 v/v, 100 ml), arrefecida a 02C adicionou-se cloroformato de benzi lo (3,10 g, 18,27 rnmol), gota a gota, durante 0,3 h. ftgitou--se a reacção durante a noite com aquecimento até à temperatura ambiente. Adicionou-se água (75 ml) e acidificou-se a solução a pH 3-4 com ácido cítrico sólido e extractou-se a fase aquosa com acetato de etilo (3x). Após secagem com Na2S04, removeu-se o solvente em vácuo para dar 4,54 g de óleo límpido incolor. MS(EI) m/e 313 (M+).1H-RMN (CDC13, 300 MHz) o 2,65 (m, 3H), 2,96 (m, 1H), 3,28 (m, 1H), 4,84 (m, 1H), 5,02 (m, 2H), 7,10 (m, 10H). 71 183 4693.PO.01 -34-

hxemplo 5b N—CBz-(NMe)—Phe—NHip A urna solução do composto do exemplo 5a (4,54 g} 14,5 mmol) e N-metilmorfolina (1,47 g, 14,5 mmol) em THF (100 ml) arrefecida a -2020 adicionou-se cloroformato de etilo (1,56 g, 14,5 mmol). Após agitação durante 0,25 h saturou-se a solução com amónia gasosa seca. Aqueceu-se a solução a 02C e agitou-se durante 2,5 h. Removeu-se o solvente em vácuo e submeteu-se o resíduo a partição entre acetato de etilo (100 ml) e água (100 ml). Separou-se a fase orgânica , secou-se com M2SO4, e removeu-se o solvente em vácuo. Recristalizou-se o resíduo (acetato de etilo/hexanos) para dar 2,34 g de sólido branco em duas colheitas. MS(EI) m/e 312 (M+). 1H-RMN(DMSO-d^, 300 MHz) ó 2,70

Exemplo 5c (NMe)-Phe-NH2

Hidrogenou-se uma mistura do composto do exemplo 5b (2,0 g, 6,40 mmol) e Pd 5%/BaS04 em metanol (100 ml) sob hidrogénio a uma atmosfera à temperatura ambiente durante a noite. Filtrou-se o catalisador e removeu-se o solvente em vácuo para dar 1,14 g de sólido branco. MS(EI) m/e 179 (M+H)+.

Exemplo 5d

Boc-fisp(QBn)-(NMe)Phe-MH„ A uma solução do composto do exemplo 5c (1,0 g, 5,61 mmol) em acetato de etilo (100 ml) arrefecida a 02C adicionaram-se Boc-Asp(0Bn)0H (1,81 g, 5,61 mmol), 4-DMAP (0,07 g, 0,56 mmol) e DCII (1,39 g, 6,73 mmol). Agitou-se a suspensão vigorosamente a 02C durante 4 h e filtrou-se. Lavou-se o filtrado com soluções aquosas de HC1 0,1 N (3x) e NaHC03 saturada (3x). Após secagem com Nâ2S04 removeu-se o solvente em vácuo. Crornatografou-se o resíduo (acetato de etilo/hexanos) para dar 1,62 g de sólido amorfo. MS(EI) m/e 483 (M+).

J 71 183 4693.P6.01

Exemplo 5b

Hidrocloreto de AspfOBn^-fMMelPhe-NHo

Tratou-se o composto do exemplo 5d (1,62 g, 3,35 mmol) em ácido acético (10 ml) com HC1 l,5N/ácido acético (8 ml) durante 0,3 h. Triturou-se a solução com éter dietílico para dar 1,40 g de sólido branco. MS(FAB+) m/e 384 (M+H)+.

Exemplo 5f

Boc-Leu-Aspf OBn)-fNMe)Phe-NHo fi uma solução de Boc-Leu-OH (1,10 g, 4,77 mmol) em cloreto de metileno (50 ml) arrefecida a 02C adicionou-se l-(3--dimetilaminopropi1)-3-carbodiimida (EDCI) (0,45 g, 2,38 mmol). Após agitação a OQC durante 1,5 h adicionou-se o composto do exemplo 5e (1,00 g, 2,38 mmol). Adicionou-se lentamente N--metilnorfolina (0,48 g, 4,77 mmol) durante lha Q2C e depois possibilitou-se à solução aquecer até à temperatura ambiente. Removeu-se o solvente em vácuo e submeteu-se o resíduo a partição entre acetato de etilo (100 ml) e NaHCOg aquoso saturado (100 ml). Separaram-se os orgânicos, secaram-se com Ma2S04, e removeu-se o solvente em vácuo. Cromatografou-se o resíduo (acetato de etilo/hexanos) para dar 1,0 g de sólido amorfo branco. MS(FAB+) m/e 597 (M-s-H)+. 1H-RHN(DM30-d6, 300 MHz) S 0,73 (m, 6H), 1,13 (m, 1H), 1,25-1,60 (m, 11H), 2,14-2,95 (m, 5H), 3,05 (m, 2H), 3,85 (m, 1H), 4,6-5,10 (m, 4H), 6,75 (t, 1H), 7,02 (m, 5H), 7,30 (m, 5H), 8,11 (m, 1H). Anal. calc. para C32H44N4O7. . 0,5H20: C 63,43, H 7,49, N 9,26* Encontrado: C 63,55, H 7,43, N 9,07.

Exemplo 5g

Hidrocloreto de Leu-Asp(OBn)-(NMe)Phe-NH2 A uma solução do composto do exemplo 5f (0,68 g, 1,12 mmol) em ácido acético (2 ml) à temperatura ambiente adicionou-se HC1 1,5N/áeido acético (5 ml). Após 0,5 h removeu-se o solvente em vácuo e dissolveu-se o resíduo em metanol (1 ml). Triturou-se a solução com éter dietílico para dar 0,59 g de sólido branco. MS(FAB+) m/e 497 (M-5-H)+. 1H-RMM(DilSO-dg, 300 MHz), ô 0,82 (m, 8H), 0,93 (m, 1H), 1,23 (m, 2H), 2,18-2,90 (m, 4H), 3,12 (m, 1H), 3,59 (m, 1H), 4,40 (m, 1H), 4,98 (m, 3H), 7,03 (m, 5H), 7,32 (rn,

J 71 183 4693,PG.01 -36- 58), 7,53 (s largo, 1H), 8,18 (s largo, 2H), 8,88 (dd, 1H).

Fxemplo 5h

Boc-Trp-Leu-fisP(QBn)-(NMe)Phe-NHg

Agitou-se a QS>C durante 18 h uma solução do composto do exemplo 5 g ¢0,1 g, 0,18 rnmol), ester de Boc—Trp—N- -hidroxissuccinimida (0,75 g, 0,18 mmol), e N-metilmorfolina (0,24 g, 0,18 mmol) em DMF (2 ml). Adicionou-se acetato de etilo (30 ml) e lavaram-se os orgânicos com soluçoes aquosas de HC1 0,IN (3x) e NaHGOs saturado (3x). Após secagem com Na2S04, removeu-se o solvente em vácuo e cromatografou-se o resíduo (acetato de etilo) para dar 0,08 g de sólido branco. MS(FfiB+) m/e 783 (M+H)+.

Exemplo 5i

Roc-Tr P-L eu-flsp-fNMe)Phe-NHo

Hidrogenou-se uma mistura do composto do exemplo 5h (0,06 g, 0,07 mmol) e Pd 5%/BaS04 (0,02 g) em metanol (5 ml) sob hidrogénio a uma atmosfera ã temperatura ambiente durante 1,5 h. Filtrou-se o catalisador e removeu-se o solvente em vácuo. Cromatografou-se o resíduo sobre sílica gel utilizando acetato de etilo/piridina/ácido acético/água (31,4/4,0/1,2/2,2). Removeram--se os solventes em vácuo e suspendeu-se o resíduo em água (5 ml) e liofolizou-se para dar 0,04 g de sólido castanho amarelado. MS(CI/NH3) m/e 693 (M+H)+. lH-RMN(DMSQ-d6, 300 MHz ) <S 0,78 (m, 6H), 1,10 (m, 28), 1,23 (m, 10H), 2,01-2,40 (m, 1H), 2,70 (m, 8H), 4,12 (m, 2H), 4,60-5,20 (m, 28), 6,70 (m, 1H), 6,90 (m, 12H), 7,56 (m, 18), 7,80 (m, 18), 8,22 (m, 18), 10,75 (m, 1H).

Exemplo 6

Ctp-Leu-Asp-íNMe)Phe-MH2 Exemplo 6a

Ctp-Leu-AspíQBnWNMe^Phe-NHo A uma solução de CTP-08 (0,096 g, 0,40 mmol), preparada como no exemplo 1c, e composto do exemplo 5g (0,21 g, 0,40 mmol) em DMF (5 ml) arrefecida a 020 adicionaram-se DPPft (0,13 g, 0,47 mmol) e N-metilmorfolina (0,087 g, 0,87 mmol). Agitou-se a

“37- mistura durante a noite com aquecimento até à temperatura ambiente. Adicjonou-se acetato de etilo (50 ml) e lavaram-se os orgânicos com soluções aquosas de HC1 0,1N (3x) e NaHC03 saturada (3x). Após secagem com Wa2S04 removeu-se o solvente em vácuo e eromatografou-se o resíduo (acetato de etilo) para dar 0,10 g de sólido branco. MS(FAB+) m/e 723 (M-í-H)^. 1H-RMN(DMS0-d6, 300 MHz) Ó 0,83 (m, 7H), 1,23 (m, 1H), 1,30 (m, 1H), 1,52 (m, 1H), 2,12- 2,60 (m, 1H), 2,62-2,95 (m, 4H), 3,06-3,50 (m, 6H), 4,13 (m, 3H), 4,53-5,12 (m, 3H), 6,73 (d, 1H), 6,92-7,25 (m, 9H), 7,34 (m, 5H), 7,48 (s largo, 1H), 8,12 (dd, 2H), 8,37 (d, 15-5)3 8,61 (d, 1H), 10,90 (s largo, 1H).

Exemplo 6b

Ctp-Leu-Asp-(NMe)Phe-NHo

Hidrogenou-se uma mistura do composto do exemplo 6a (0,96 g, 0,13 mmol) e Pd 5%/BaS04 (0,015 g), em metanol sob hidrogénio a uma atmosfera à temperatura ambiente durante 0,5 h. Filtrou-se o catalisador e removeu-se o solvente em vácuo para dar 0,075 g de sólido castanho amarelado. MS(FAB+) m/e 633 (M+H)+. ^H-RMM(DMSQ— -d6, 300 MHz) <5 0,82 (m, 7H), 1,23 (m, 1H), 1,31 (m, 1H), 1,51 (m, 5H), 2,12-2,60 (m, 1H), 2,56-3,60 (m, 6H), 4,12 (m, 3H), 4,54 (m, 1H), 4,33 (m, 1H), 5,10 (m, 1H), 6,73 (m, 1H), 6,92 (m, 2H), 7,10 (m, 6H), 7,45 (m, 2H), 8,10 (d, 1H), 8,19 (d, 1H), 8,59 (d, 1H), 10,91 (s largo, 1H). final. calc. para C33H40N-6Q7.2H2G: c 59,25, H 6,58, N 12,57; Encontrado: C 59,31, H 6,44, N 12,00.

Exemplo 7 2(S)-r3fS)-f(Terc-butiloxicarbonilamino)-3-(indol-3-ilmetil)-2--oxo-l-pirrolidinil) ]-4-me t i 1 -pe n ta no i 1 -fisp-Ph e-NHo

Exemplo 7a Éster metílico do ácido 2(3)(3- carboxi-5(indol-5-ilmetil1-2-oxo— -l-pirrolidiniiy-4-metilpentanóico O éster metílico do ácido 2(S)(3—carboxi-2-oxo-l-pirrolidi— nil)-4-metilpentanóico preparou-se de acordo com o método de R.H. Freidinger, J. Org. Chem. 50 (19), 3631-3633, (1985). fiqueceu-se a 65QC durante Ih, uma solução de ciclopropano-1,1-dicarboxilato de isopropilideno (5,0 g, 29,30 mmol), hidrocloreto de éster -33-

-33- J 71 183 4693.PG.01 metílico ds leucina (5,31 g, 29,3 mmol), e trietilamina (2,97 g, 29,3 mmol) em DMF desgaseifiçado (50 ml). Arrefeceu-se a solução à temperatura ambiente e verteu-se dentro de uma mistura de H23O4 aquoso a 10¾ (100 ml) e acetato de etilo (100 ml) e separou-se a fase orgânica, Após secagem com N32S04, removeu-se o solvente em vácuo para dar 7,55 g na forma de um óleo castanho. Ao óleo bruto (7,55 g) em DMF desgaseifiçado (50 ml) adicionaram-se metiodeto de gramina(l3,2 g, 42,94 mmol) e 1,8-diazabiciclo[5,4.0]undec-7--erto (DBU) (5,16 g, 33,90 mmol). Aqueceu-se a mistura a 3520 durante 18 h e arrefeceu-se até à temperatura ambiente, Verteu-se a mistura dentro de acetato de etilo (100 ml) e NaHC03 aquoso saturado (100 ml). Separou-se a fase aquosa, acidificou-se a pH 3-4 com H2SO4 aquoso a 10%, e extractou-se com acetato de etilo (3x). Após secagem com Na2SQ4, removeu-se o solvente em vácuo e cromatografou-se o resíduo (ácido acético a 1%/acetato de etilo) para dar 1,56 g de sólido branco. MS(FAB+) m/e 387 (M+H)+. *H--RMN(DMS0-d6, 300 MHz), Ô 0,65 (m, 6H), 1,23-1,80 (m, 3H), 1,90

Exemplo 7b Éster metílico de ácido 2fS)-r5—f(Terc-butiloxicarbonilamino)-5— indol-5-ilmetil)-2-oxo-l-pirrolidinia]-4-metilpentanóico1

Manteve-se ao refluxo, durante 48 h, sob azoto, uma solução do composto do exemplo 7a (1,22 g, 3,16 mmol), e DPPA (0,96 g, 3,49 mmol) em álcool terc-butílico (50 ml). Removeu-se o solvente em vácuo e cromatografou-se o resíduo (acetato de etilo/hexanos) para dar 0,48 g de óleo límpido. MS(EI) m/e 457 (M+)_ 1h—RMM (CDCI3, 300 MHz) ô 0,68 (m, 6H), 1,35-1,73 (m, 12H), 2,25 (m, 3H), 3,05 (m, 3H), 3,58 (m, 3H), 4,52-4,82 (m, 1H), 5,23-5,38 (m, 1H), 7,05 (m, 3H), 7,32 (m, 1H), 7,61 (t, 1H), 8,06 (m, 1H). -39- 71 183 4693.PG,01

Exemplo 7c Ácido (2S)-|5-((terc-butiloxicarbonil3minol-5-ifindol-3-ilmetill--2-oxo~l-pirrolidinil)l-4-metilpenit.anóico A urna solução do composto do exemplo 7b (0,46 9, 0,10 mmol) em metanol (5 ml), arrefecida a 020, adicionou-se NaOH 0,5N (2,1 ml). Agitou-se a solução a Q2C durante 18 h, acidificou-se a pH 3-4 com ácido cítrico sólido, e extractou-se com acetato de etilo (3x). Após secagem com N32S04 removeu-se o solvente em vácuo para dar 0,40 g de óleo límpido. MS(EI) m/e 443 (M-5-).

Exemplo 7d 2(S j—Γ3—(fcerc-butiloxicarbonilarriino)-5-f indol-5-ilmetil )-2-oxo-l--pirrolidinil)]-4-rnetilpentanoil-Asp(0Bn)-Phe-NH2 A uma solução do exemplo 7c (0,34 g, 0,78 mmol) e N- -metilmorfolina (NMM) (0,08 g, 0,78 mmol) em THF (5 ml) a 02C adicionou-se cloroformato de isobutilo (0,107 g, 0,78 mmol). Após 10 íííin, adicionou-se uma solução fria (02C) de trifluoroacetato de Asp(0Bn)-Phe-MH2 (0,38 g, 0,78 mmol) e NtlM (0,08 g, 0,78 mmol) em DS1F (5 ml). Aqueceu-se a mistura reaccional a 02C e agitou-se durante 1 h. Adicionou-se acetato de etilo (30 ml) © lavaram-se os orgânicos com soluções aquosas de ί-JCl 0,1M (3x) e NaHC03 saturada (3x). Após secagem com Wâ2S04, rsmoveu-se o solvente em vácuo para dar 0,58 g de sólido ceroso. MS (CI/NH3) m/e 795 (M+H )''.

Exemplo 7e 2(S)-r3-f fTerc-butiloxicarbonilamino)-3-(indol-3-ilmetil)-2-oxo--1-pirrolidinil iM—metilpentanoil-ftsp-Phe-NlHo

Hidrogemou-se uma mistura do composto do exemplo 7d (0,58 g, 0,73 mmol), com Pd 5%/BaS04 em metanol (15 ml), sob hidrogénio a uma atmosfera, à temperatura ambiente, durante a noite. Filtrou--se o catalisador e removeu-se o solvente em vácuo. Cromatografou-se o resíduo sobre sílica gel utilizando acetato de etilo/piridina/ácido acético/água (31,4/4,0/1,2/2,2) para dar 0,14 g de um diastereómero mais estável (isómero A) e 0,12 g de um diastereómero menos estável (isómero 8). Isómero A: MS(CI/NI-Í3) m/e 705 (M+H)+. 1H-RMM(DMS0-d6, 300 MHz) 6 0,38 (dd, 6H), 0,72 -40- m 71 183 4693,PS-01 (m, 1H), 1,30 (m, 11H), 2,17 (m, 2H), 2,38 (m, 1H), 2,50 (m, 2H), 2,72 (m, 5H), 4,28 (m, 2H), 4,46 (m, 1H), 6,93 (t, 1H), 7,04 (t, 1H), 7,10 (m, 4H), 7,21 (m, 5H), 7,51 (m, 3H), 7,92 (d, 1H), 10,98 (s largo, 1H), 12,12 (s largo, 1H), Anal. calc. para 037^48^6^8-^"?0: 0 61,46, H 6,97, N 11 ,t>3; Encontí soo- C 61,70, H 6,81, N 11,52. Isõmero B: MS(CI/NH3) m/e 705 (M+H)+. *H-RMN(DMS0,

largo, 1H), Anal Calc. para ¢37^48^6¾-H2O: C 61,46, H 6,97, N 11,63; Encontrado: c 61,30, H 6,90, N 11,12.

Exemplo 6 4-Car boxamida-r 5.4.5,6-c . d 1 -i ndol i 1 )-Leu-Asp-Phe-NH?

Exemplo 8a Éster metilico do ácido 4—{1—acetilindol-4—il)—but-2—enóico A uma solução de 1-aceti1indolo-4-carboxaldeído (2,40 g, 11,93 mmol) preparado de acordo com o processo de H. Plieninger et. al. Chetri Ber. 89, 270, (1956), em THF (100 ml) adicionou-se (trifenilfosforanilideno)acetato de metilo (4,78 g, 14,3 mmol). Agitou-se a solução â temperatura ambiente durante a noite. Removeu-se o solvente em vácuo e cromatografou-se o resíduo (acetato de etilo/hexanos). A recristalização a partir de acetato de etilo/hexanos resultou em 2,12 g de sólido branco em duas colheitas. MS(CI/NH3) m/e 258 (Μ+Η)ψ. iH-RMN (CDCI3, 300 MHz) 6 2,60 (s, 3H), 3,70 (s, 3H), 3,75 (dd, 2H), 3,75 (m, 1H), 6,63 (dd, 1H), 7,05 (d, 1H), 7,12-7,22 (m, 2H), 7,29 (t, 1H), 7,43 (d, lhi), 8,35 (d, 1H).

Exemplo 8b Éster metilico do ácido 4-findol-4-il)~but-2-enóico A uma solução do composto do exemplo 8a (1,0 g, 3,89 mmol) em metanol (60 ml) à temperatura ambiente adicionou-se etóxido de magnésio (1,0 g, 8,73 mmol). Agitou-se vigorosamente a reacção durante 10 min, e verteu-se sobre HC1 0,1N (100 ml). Extractou-se a fase aquosa com acetato de etilo (3x) e lavou-se a fase -41- 71 183 4693.PG,01 orgânica com salmoura saturada (3x). Após secagem com Na2SC'4 removeu-se o solvente em vácuo para dar 0,81 g de óleo esverdeado. MS(EI) m/e 215 (M+).

Exemplo 8c Éster metilico do ácido 4-f3-formilindol-4-il)-but-2-enólco

Adicionou-se oxicloreto fosforoso (0,65 g, 4,16 mmol) gota a gota a DMF (3 ml) a Oôc. Após 0,5 h adicionou-se o composto do exemplo 8b (0,81 g, 3,70 mmol) em DMF (3 ml) a G2C, então aqueceu-se a mistura a 35í?C durante 0,75 h. Arrefeceu-se a solução até à temperatura ambiente e adicionou-se gelo moído (10 g). Adicionou-se NaHCOg sólido e ajustou-se a pH 8, diluiu-se a mistura com água (100 ml), e extractou-se o aquoso com acetato de etilo (3x). Separou-se a fase orgânica, secou-se com Na2S04, e removeu-se o solvente em vácuo. Cr orna togr af o u-se o resíduo (acetato de etilo/hexanos) para dar 0,39 g de sólido púrpura. MS(CI/NP«3) m/e 244 (M+H)+. ÍH-RMNÍCDCIs, 300 MHz) ó 3,68 (s, 3H), 4,26 (m, 2H), 5,14 (rn, 1H), 7,06 (d, 1H), 7,18 (m, 3H), 7,84 (d, 1H), 9,09 (s largo, 1H), 9,88 (s, 1H).

Exemplo 3d 4-Metoxicarbonil-r5,4,5,6-c.dl-indolo A uma solução do composto do exemplo 8c (0,34 g, 1,38 mmol) em benzeno (10 ml) adicionou-se BBU (0,25 g, 1,65 g) e refluxou- -se a mistura durante a noite. Após arrefecimento até à temperatura ambiente verteu-se a mistura dentro de HC1 0,1N (100 ml) & extractou-se com acetato de etilo (3x). Após secagem com Na?S04 removeu-se o solvente em vácuo para dar 0,29 g de sólido púrpura. MS (CI/NH3) m/e 225 (M+). 1h-RMN (CDC13, 300 MHz) 6 3,70 (s, 3H), 5,65 (d, 1H), 5,85 (dd, 1H), 6,11 (dd, 1H), 6,64 (m, 3H), 7,08 (s largo, 1H), 7,78 (s largo, 1H).

Exemplo 8-e ácido-r3.4,5,6—c.dl—indolo 4-Carboxilico A uma solução do composto do exemplo 8d (0,10 g, 0,44 mmol)

em metanol (5 ml) â temperatura ambiente adicionou-se K0H 0,05N ίΊΠ 67 ml). Refluxou-se a solução durante a noite e então

J 71 183 4693,PG.01

-42-verteu-se dentro de acetato de etilo (100 ml) e água (100 ml). Separou-se a fase aquosa, acidificou-se a pH 3-4 com H2SO4 aquoso a 10%, e extractou-se com acetato de etilo (3x). Após secagem com Na2S04 removeu-se o solvente em vácuo para dar 0,086 g de sólido púrpura. MS(EI) m/e 211 (M+).

Exemplo 8f 4-Carboxami da-f 3,4,b,6~c, d 1 -i ndoli11-Leu-Asp-Phe-NHo fí uma solução do composto do exemplo 8e (0,05 g, 0,23 mmol) em THF (3 ml) a -202C adicionaram-se N-metilmorfolina (0,024 g, 0,23 mmol) e cloroformato de isobutilo (0,033 g, 0,23 mmol). Após 10 rnin. aqusceu-se a reacção a Q2C e adicionou-se, gota a gota, L.eu-Asp-Phe-NH2 (0,097 g, 0,23 mmol) em DMF/H2O (80:20 v/v, 3 ml) frio (Q2C). Agitou-se a reacção durante a noite com aquecimento até à temperatura ambiente. Verteu-se a mistura em água (50 ml) e extractou-se com acetato de etilo (3x). Após secagem com ^2884 removeu-se o solvente em vácuo e cromatografou-se o resíduo sobre sílica gel utilizando acetato de etilo/piridina/ácido acético/água (31,4/4,0/1,2/2,2) para dar 0,01*3 g de sólido branco. MS(CI/NH3) m/e 586 (M+H)+. (DMSQ-dg,, 300 MHz) ô

Exemplo 9

Bo ÇrI.rp-Leu-[,6-l(2IH-tetrazol-S-il1-L-alanil-Phe-NHo

Exemplo 9a N-terc-butiloxicarbonil-L-S—cianoalanil-Phe-NK2 A uma solução de N-Boc-0-cianoalanina (1,68 g, 7,85 mmol) em THF (100 ml) a -2Q2C adicionou-se N-metilmorfolina (MMM) (0,79 g, 7,80 mmol) e cloroformato de isobutilo (1,07 g, 7,80 mmol), Após 0,25 h adicionou-se,gota a gota,uma solução de L-Phe-NHg (1,56 g, 7,85 mmol) e NMM (0,79 g, 7,80 mmol) em DMF (20 ml) arrefecida a 02C, Após agitaçao a -202C durante 1 h aqueceu-se a reacção a 02C e depois, durante a noite, com aquecimento até à temperatura ambiente. Removeu-se o solvente em vácuo e recristalisou-se o

J 71 183 4693.PS=01

-43- residuo a partir de isopropanol para dar 1,78 g na forma de um sólido cristalino branco. iH-RMM (DMS0-d£, 300 MHz) ô 1,38 (s.

Exemplo 9b goc-r,e-lf2)hi-teirazol-5-in-L-alanil-Plhe-is!Í-lp

Empregou-se o processo cie J. S. Horley J. Chem. Soe, (C), 809-813, ¢1968). Aqueceu-se uma mistura do composto do exemplo 9a (1,0 g, 2,77 mmol), azida de sódio (0,40 g, 6,10 mmol) e cloreto de amónio (0,33 g, 6,10 mmol) em DMF (5 ml) a 9590 durante 24 h sob N2- Removeu-se o solvente em vácuo e triturou-se o resíduo com HC1 0,1N frio. Recolheu-se o precipitado e dissolveu-se em NH4OH diluído (10 ml) e filtrou-se. Acidificou-se a solução aquosa com HC1 4M e filtrou-se o precipitado resultante para dar 0,24 g de sólido amarelo. MS(EI) m/e 403 (M+). ^H-RMN (DMSQ-d^,

Exemplo 9c

Boc-Leu-Γ fí-l(2)H-tetrazol-5-in-L-alanil-Phe-NHo A uma suspensão do composto do exemplo 9b (0,30 g, 0,74 mmol) em cloreto de metileno (5 ml) arrefecida a 09C adicionou-se ácido trifluoroacético (5 ml). Agitou-se a solução homogénea resultante durante 0,3 h e removeu-se o solvente sob vácuo para dar 0,30 g de óleo castanho que se usou sem purificação adicional. Ao óleo (0,3 g, 0,72 mmol) suspenso em acetato de etilo/cloreto de metileno (1:1 v/v, 5 ml) à temperatura ambiente adicionou-se éster de Boc-Leu-N-hidroxissuccinimida (0,24 g, 0,72 mmol) e W,W-diisopropiletilamina (0,09 g, 0,72 mmol). Agitou-se a reacção durante a noite à temperatura ambiente e removeu-se o solvente em vácuo. Dissolveu-se o resíduo em acetato de etilo (20 ml) e lavou-se com soluções aquosas de HC1 0,1N (3x) e salmoura saturada (3x). Após secagem com Na2S04 removeu-se o solvente em vácuo e triturou-se o resíduo com acetato de etilo/éter dietílico -44— j 71 183 4693.PG.01 para dar 0,14 g de sólido branco. MS(FAB+) m/e 517 (M+H)+. -RMN(DMS0-d6, 300 MHz) ô 0,79 (m, 6H), 1,23 (m, 2H), 1,33 (s, 9H), 1,46 (m, 1H), 2,72 (m, 1H), 3,02 (m, 1H), 3,18-3,52 (m, 2H), 3,85 (m, 1H), 4,13 (m, 1H), 4,61 (m, 1H), 6,95 (d, 1H), 7,14 (m, 7H), 7,56 (s largo, 1H), 8,03 (d, 1H), 8,13 (d, 111).

Exemplo 9d

Boc-Trp-Leu-rB-lf2)H-tetrazol-5-il1-L-alanil-Phe-NHo A uma solução do exemplo 9c (0,12 g, 0,21 mmol) em ácido acético (2 ml) adicionou-se HC1 1,45N/ácido acético (2 ml). Possibilitou-se ã mistura repousar à temperatura ambiente durante 0,5 h e removeu-se o solvente em vácuo para dar 0,093 g de sólido branco que foi suficiente para usar sem purificação adicional. Ao sólido (0,093 g, 0,20 mmol) em DMF (2 ml) à temperatura ambiente, adicionaram-se N,N-diisopropiletilamina (0,027 g, 0,20 mmol), e éster de Soc-Trp-N-hidroxissuccinimida (0,083 g, 0,21 mmol). Após 1 h de agitação, diluiu-se a reacção com acetato de etilo (50 ml) e lavou-se com uma solução aquosa de HC1 0,IN (3x). Após secagem com Wa2S04 removeu-se o solvente em vácuo e triturou-se o resíduo com acetato de etilo/éter dietílico para dar 0,10 g de sólido branco. MS(FAB+) m/e 703. ^H-RMN(DMS0-d&3 300 MHz) ô 0,80 (m, 6H), 1,28 (s, 9H), 1,31 (m, 2H), 1,53 (m, 2H), 2,78 (m, 1H), 3,02 (m, 2H), 3,16 (m, 2H), 4,16 (m, 1H), 4,24 (m, 2H), 4,59 (m, 1H), 6,77 (d, 1H), 6,92 (t, 1H), 7,01 (t, 1H), 7,11 (m, 8H), 7,57 (d, 1H), 7,78 (s largo, 1H), 7,87 (m, 1H), 8,16 (d, 1H), 8,22 (d, 1H), 10,82 (s largo, 1H). Anal. cale. para θ35Η4^Νιο°6^: c 57,58, H 6,77, H 19,195 Encontrado: C 57,50, H 6,39, H 18,97.

Exemplo 10 D-Cfcp-Leu-Asp-Phe-NHo

Exemplo 10a Bromoacetil-D—Trp-OBn A uma solução de hidrocloreto ds D-Trp-0Bn (9,30 g, 28,11 mmol) e trietilamina (6,11 g, 60,40 mmol) em etanol absoluto (200 ml) arrefecida a 02C adicionou-se cloreto de bromoacefcilo (5,31 g, 33,70 mmol), gota a gota, durante 10 min. Agitou-se a mistura reaccional durante a noite com aquecimento até à temperatura

71 183 4693.PG,01 ambiente. Removeu-se o solvente em vácuo e submeteu-se o resíduo a partição entre HC1 aquoso 0,1N (250 ml) e acetato de etilo (250 ml). Após secagem com Na2S04, concentrou-se a fase orgânica em vácuo © cromatografou-ss o resíduo (acetato de etilo/hexanos) para dar 4,60 g de um óleo límpido incolor.

Exemplo 10b D-Ctp-QBn

Irradiou-se uma solução do composto do exemplo 10a (4,0 g, 9,66 mmol) em etanol 40%/água (1 1) a 80SC durante 3 h (Hanovia 450W, lâmpada Mg/filtro vycor). Concentrou-se a mistura resultante em vácuo até 600 ml e extractou-se a fase aquosa com acetato de etilo (3x). Após secagem com removeu-se o solvente em vácuo e cromatografou-se o resíduo (acetato de etilo) para dar uma mistura de produtos ciclizados substituídos na posição 2 e na posição 4. Recristalizou-se a mistura (acetato de etilo/éter dietílico/hexanos) para dar 12 g de sólido cristalino branco. iH-RMN (DMS0-d6, 300 MHz) <5 3,42 (m, 3H), 4,10 (d largo, 1H), 4,30 (s largo, 1H), 5,25 (s, 2H), 6,75 (d, 1H), 6,94 (t, 1H), 7,12 (m, 3H), 7,30 (m, 5H).

Exemplo 10c D-Ctp-Leu-Asp(OBnl-Phe-NHç

Hidrogenou-se uma- mistura do composto do exemplo 10b (10 g, 0,29 mmol) e Pd 5%/BaSG4 (0,02 g) em metanol (10 ml) sob hidrogénio a uma atmosfera à temperatura ambiente durante 0,5 h. Filtrou-se o catalisador e removeu-se, o solvente em vácuo para dar 0,063 g de ácido (D-CTP-0H) livre na forma de um sólido cor--de-rosa suficiente para usar sem purificação adicional. Ao ácido (0,063 g, 0,26 mmol) em DMF (5 ml) arrefecido a QQC adicionaram--se hidrocloreto de Leu-Asp(0Bn)-Phe-NH2 (0,13 g, 0,26 mmol), difenilfosforilazida (0,085 g, 0,30 mmol) (DPPA), e N--meti1morfo1ina (0,057 g, 0,56 mmol). Agitou-se a mistura durante a noite com aquecimento até à temperatura ambiente. Concentrou-se o solvente até 2 ml. e dissolveu-se o resíduo em acetato de etilo (50 ml). Lavou-se a fase orgânica com soluções aquosas de NaHC03 saturado (3x) e HC1 0,IN (3x). Após secagem com Na2S04, removeu- 71 183 4693,Pâ.01 -46“

-se o solvente em vácuo. Triturou-se o resíduo a partir de acetato de etilo/hexanos para dar 0,07 g de sólido branco, MS(FA8+) •n/e 709 (M+H)+, ijH-RMN (DMS0-d6, 300 MHz) <5 0,90 (m, 6H), 1,35-

Exemplo IQd D-Gtp-Leu-Asp-Phe-MHo

Hidrogenou-se uma mistura do composto do exemplo 10c (0,04 g, 0,056 mol) e Pd 5%/BaS04 (0,01 g) em ácido acético (5 ml) sob hidrogénio a uma atmosfera à temperatura ambiente durante a noite. Filtrou-se o solvente duas vezes através de celite e removeu-se em vácuo. Suspendsu-se o resíduo em água (1 ml) e liofolizou-se para dar 0,28 g. MS (FAB+) m/e 619 (M+H)+. (DMS0~d6, 300 MHz) <5 0,78 (m, 6H), 1,30 (m, 2H), 1,55 (m, 1H),

hxemplo 11 5-(3-Quinolil)-propiónico-Leu-ftsp-Phe-NHo

Exemplo 11a Éster 2,4,5-triclorofenílico do ácido 3-(5-quinolil)propiónico A uma solução de quinolina-3-carboxaldeído (490 mg, 3,1 mmol) em IMF (10 ml) adicionou-se (carboetoximetileno)trifenil-fosforano e então deixou-se a reacção à temperatura ambiente durante dois dias. Evaporou-se o solvente em vácuo e cromatografou-se o resíduo sobre sílica gel (acetato de etilo/hexanos 1*2) para produzir um sólido branco que então se dissolveu numa mistura de acetato de etilo-metanol e adicionou—se Pd 10%/G. Agitou-se vigorosamente a mistura reaccional sob 1 atmosfera de hidrogénio durante 2,5 h tempo após o qual se removeu o catalisador por filtração através de celite e se evaporaram os solventes para produzir um óleo cor- de- laranja, Dissolveu-se este óleo numa mistura de hidróxido de sódio

J 71 183 4693,PG,01 -47- U « lN/THF/rnetanol e deixou-se à temperatura ambiente durante 1 h. Acidificou—se a mistura reaccional com ácido clorídrico IN e extractou-se o produto com acetato de etilo. A evaporação dos solventes em vácuo deu 200 mg de um sólido amarelo que se dissolveu numa mistura de acetato de etilo, cloreto de metileno, e THF. Adicionou-se à solução DCC (205 mg, 1 mmol) e 2,4,5-tri-clorofenol (200 mg, 1 mmol) e agitou-se a mistura reaccional à temperatura ambiente durante 2 h. Evaporaram—se os solventes em vácuo e purificou-se o produto por cromatografia sobre sílica gel (acetato de etilo/hexanos 2-3) para produzir 160 mg de um óleo incolor; MS (EI) m/e 379 (M)+. ÍH-RMN (CDC13, 60 MHz) ô 2,8-3,5 (rrt, 4H), 7,1 (s, 1H), 7,4 (s, 1H), 7,5-8,2 (m, 4H), 8,8 (d, 1H, J=2,5 Hz),

Exemplo 11b 3-(3~QuinolllIpropiónico-Leu-Asp—Phe-NHb A uma solução de Leu—Asp—Phe—NH2 (157 mg, 0,4 mmol} em DMs-(2 ml) adicionou—se diisopropiletilamina (156 mg, 1,2 mmol) e o éster activo do exemplo 11a (155 mg, 0,41 mmol), Deixou-se a mistura reaccional à temperatura ambiente durante a noite e então diluiu-se com água, tornou-se acídica com ácido clorídrico IN, e então liofilizou-se. Recristalizou-se o resíduo sólido espumoso branco a partir de etanol aquoso para produzir 1^5 mg de um sólido branco pf 235-2372C (dec. ). MS (FAS-5-) m/e 576 (M-i-H)"1 , ^H— -RMN (DMS0-d6 , D2O , 300 MHz) ô 0,54 (d, 3H , J=6,3 Hz ), 0,62 (d, 3H, J= 6,3 Hz ), 1, 0-1,4 (ffl, 3H) , 2,4-2,7 ( m, 4H), 2,82 (dd, 1H, J=14, 5 w 7 9,0 Hz), 2,97-3,10 (m , 3H), 3,7 (HOD), 4,17 (dd, 1H, J=10, 5 w 7 4,8 Hz), 4 ,33 (dd, 1H, J=9, 4,5 Hz ), 4,46 (dd, 1H, J= 6,3, 6 2 3 Hz \ ~f 'j "7 ~K ' 7 (m, 5H), 7,58 (rn, 1H), 7 ,72 (m, 1H), 7,89 (d, 1H), 7, 98 (d. 1H, J=8,4 Hz), 8, 10 (d, 1M), 8,75 (d 1, 1H, J=3 Hz), Anal. calc. para C31H37M5O0-1 ,5H20: C 61 ,77, H 6 .,69, N 11 ,62; Encor 1 trado: C 61,79, H 6,59, H 11,68.

J 71 1S3 4693.PG,01 -48-

Exemplo 12 5-f 2-Naftil)propiomil-Leu-fisp-Phe-NHh

Exemplo 12a •ister 2,4,5-triclorofenilico do ácido 5-f2-naftil)propiónico

Fez-se reagir 2-naf taldeido (388 mg, 2,43 mmol) de urna maneira similar ã descrita no exemplo 11a para produzir 355 mg de um óleo incolor. ll-i-RMM (CDCI3, 300 MMz) <3 3,03 (t, 2H, J=7,0

Exemplo 12b 5-f2-naftil)-propionil-Leu-flsp-Phe-NHg A uma solução do sal hidrocloreto de Leu-Asp-Phe-NH2 (73 mg, 0,17 rnmol) em DMF (1 ml) a 42C, adicionou-se diisopropiletilarnina (54 mg, 0,42 mmol) e o éster activo do exemplo 12a (65 mg, 0,17 mmol). Armazenou-se a mistura reaccional a 0QC durante cinco dias, tempo após o qual se diluiu com água e se recolheu o precipitado por filtração de sucção. Purificou-se-se o sólido por crornatografia em coluna de silica gel utilizando acetato de etilo/piridina/ácido acético/água (62/10/3/5,5). Evaporaram-se os solventes em vácuo e liofilizou-se o resíduo para dar 45 mg de um sólido branco; p.f. 224-2262C (dec); [«]^'d -30,82 (c=G,5, DMF). ih-RMN (DMS0-d6, 300 MMz) Ô 0,67 (d, 3H, J=7 Hz), 0,71 (d, 3H,

C32H38N406*0>5H20: C 65,85, H 6,73, N 9,59? Encontrado: C 65,60, H 6,34, N 9,37.

J 71 183 4693.PG.01 —49—

Exemplo 13 3-f9-Fenantril)propionil-ILeu-Asp-Phe-NHz

Exemplo 15a éster 2,4,5-trlclorofenilico do écido 3-(9-fenantril)propiónico

Fez-se reagir fenantreno-9-carboxaldeido (760 nig, 3,68 mmol) de uma maneira similar à descrita no exemplo 11a para produzir 547 mg de um sólido branco. 1h-RMN (CDCI3, 60 MHz) 6 2,8-3,3 (rn;

Exemplo 15b 5-(9-Fenantril)propionil-Leu-Asp-Phe-NH2 A uma solução de Leu-Asp-PheNH2 (137 mg, 0,35 mmol) e diisopropiletilamina (90 mg, 0,70 mmol) em DMF adicionou-se o éster activo do exemplo 13a (143 ng, 0,35 mmol) e agitou-se a mistura reaccional durante a noite à temperatura ambiente. Diluiu-se a mistura com ácido clorídrico diluído e removeu-se o solvente em vácuo. Triturou-se o resíduo sólido com etanol aquoso quente e recolheu-se o precipitado restante por filtração de sucção. Dissolveu-se o precipitado num pequeno volune de DMF, diluiu-se com água, e então liofilizou-se para produzir 140 mg de um sólido branco; p.f. 244-2462C (dec.); MS (FAB+) m/e 625 (M+H)+. iH-RMN (BMS0-d6, 300 MHz) <3 0,56-0,9 (m, 6H), 1,2-1,6 (m, 3H), 2,48 (encoberto dd, 1H), 2,55-2,75 (m, 3H), 2,85 (dd, 1H,

036^40^4^6-0>75H20: C 67,74, H 6,55, N 8,78; Encontrados C 67,74, H 6,52, N 8,67. -50- -50- 71 183 4693.PG.01

IMPP

Exemplo 14

Feriilalanina-amida do ácido 5-carboxi-2»rS)-r3(R)-(8oc-triptofano-carboxamida)-2-oxolpirrolidinil-proplóniço

Exemplo 14a

Ester benzílico do ácido-g(2,5-dimetilpirazolo amida)-g Boc-D--aspártlco A uma solução de Boc-D-Asp(OBn) (750 mg, 2,2 mmol) e N~

-metilmorfoli na (682 mg, 2,6 mmol) em THF (15 ml) a GQC adicionou-se cloroformato de isobutilo (314 mg, 2,3 mmol), gota a gota, com agitação. Após se ter completado a adição agitou-se a mistura reaccional a G2C 10 min. adicionais, adicionou-se o 2,5--dimetilpirazolo (240 mg, 2,6 mmol) numa só porção. Continuou-se a agitação durante 10 min., então parou-se a reacção por adição de água. Extractaram-se os orgânicos com acetato de etilo (3x); lavou-se a fase orgânica com ácido clorídrico 1M, bicarbonato de sódio aquoso saturado, e finalmente com salmoura. Secou-se a fase orgânica (Na2SG4) e concentrou-se em vácuo para produzir um óleo incolor o qual foi realizado sem caracterização.

Exemplo 14b

Ester benzílico do ácido 2-(R)-f(terc-butiloxicarbonil)amino)-4--oxo-butir ico

Preparou-se o aldeído via uma modificação do processo descrito por R, Nishizawa et. al. fJ. Med. Chem,, 20. 510 (1977)]. A uma solução do produto bruto preparado no exemplo 14a (218 mg, 0,57 mmol) em THF anidro (25 ml) a -78QC sob azoto ãdicionou-se uma solução 1H em THF de L1AIH4 (190 wl, 1,9 mmol) e manteve-se a reacção a -78SC durante 30 min. Parou-se a reacção a -78QC por adição rápida de ácido clorídrico IN (4 ml) e então aqueceu-se a mistura até à temperatura ambiente, Extractou-s© o produto com acetato de etilo e secou-se a fase orgânica (Na2S04) e então concentrou-se sob pressão reduzida para dar um resíduo oleoso que se purificou por cromatografia flash (acetato de etilo/hexanos 1:2) para dar 76 mg de um óleo incolor, (CDCI3, 60 MHz) <5 1,4 (s, 9H), 2,9 (m, 2H), 4,3 (m, 1K), 5,1 (s, 2H), 7,3 (s, 5H), 9,6 (s, 1H). 71 183 4693-PG.01 -51-

Exemplo 14c

Fenilalanina-amida do ácido 3-carboxi-r3-(R)—f(terc-butiloxicar-bonil )amind)-2~oxo1-l-pirrolidinil-2(S)-propiónico A uma solução do composto do exemplo 14b (45 mg, 0,21 mmol) e Asp-Phe-NH2 (58 mg, 0,21 mmol) em etanol à temperatura ambiente adicionou-se cianoboro-hidreto de sódio (32 mg, 0,52 mmol) e aqueceu-se a mistura reaccional a 40QC durante 48 h. Após arrefecimento até à temperatura ambiente, evaporou-se o solvente em vácuo e purificou-se o resíduo por cromatografia em coluna de sílica gel utilizando acetato de etilo/piridina/ácido acêtico/água (78:10=3:5,5). Removeram-se os solventes em vácuo e liofilizou-se o resíduo para dar 35 mg de um sólido branco; p.f. 144-1462C; [α]26β -38,72 (c=0,5, etanol); MS (FAB+) m/e 463 (M+H)+, aH-RMN (DMS0-d6, 300 MHz) <5 1,38 (s, 9H), 2,26 (dd, 1H,

Hz), 8,09 (d, 1H, J=8,4 Hz).

Exemplo 14d

Fenilalanina-amida do ácido 3-carboxi-2{'S)-r3(R)-fBoc-triptofano-carboxamida)-2-oxolpirrolidinil-propiónico A uma solução do composto do exemplo 14c (26 mg, 0,056 mmol) em cloreto de metileno (2 ml) a 02C adicionou-se ácido trifluoroacético (2 ml) e manteve-se a mistura reaccional a 02C durante 2,5 h. Após diluição com tolueno (4 ml), evaporaram-se os solventes em vácuo e deixou-se o resíduo sólido sob alto vácuo durante a noite. Dissolveu-se o sólido em DMF (2 ml) ao qual se adicionaram diisopropiletilamina (29 mg, 0,22 mmol) e éster de Boc-Trp N-hidroxissuccinimida (34 mg, 0,08 mmol) e deixou-se a mistura reaccional à temperatura ambiente durante a noite. Evaporou-se o DMF em vácuo e cromatografou-se o resíduo sobre sílica gel usando acetato de etilo/piridina/ácido acético/água (78=10=3=5,5). Evaporaram-se os solventes e diluiu-se o resíduo com água e liofilizou-se. Dissolveu-se o sólido espumoso em acetato de etilo e lavou-se com ácido clorídrico 0,25N.

J 71 183 4693.PG.01 -52

Evaporou-se o solvente em vácuo e dissolveu-se o resíduo em acetona* diluiu-se com água, e liofilizou-se para dar 10 mg de um sólido branco; p.f. 145-148SC; MS (FAB+) m/e 649 (M+H)+. 1H-RMN

1H, J=7,8 Hz), 7,52 (d, 1H, J=7,8 Hz). Anal. calc. para C33H40N6OQ.1,75H20: C 58,26, H 6,44, N 12,35; Encontrado: e 58,26, H 6,44, N 12,35.

Exemplo 15

Cbz-Trp-(NMe)Leu-Asp-Phe-NHo

Exemplo 15a Asp(QtBu)-Phe-NHz

A uma suspensão de Cbz-Asp(OtBu) (1,313 g, 4,0 rnmol) em THF (50 ml) e DMF (20 ml) a -10QC sob azoto adicionaram-se N--metilmorfolina (415 mg, 4,1 rnmol) e cloroformato de isobutilo (560 mg, 4,1 rnmol). Agitou-se a suspensão a -102C durante 15 min e então adicionou-se fenilalanina-amida numa mistura de DMF (5 ml) e água (2 ml), numa só porção. Continuou-se a agitação ao mesmo tempo que se permitiu à reacção aquecer gradualmente até à temperatura ambiente durante a noite. Concentrou-se a mistura reaccional em vácuo e diluiu-se o resíduo com acetato de etilo e então lavou-se com ácido clorídrico IN (3x), bicarbonato de sódio aquoso saturado (3x), e com salmoura (Ix). Secou-se a fase orgânica (Na2S04) e então evaporou-se o solvente em vácuo. Recristalizou-se o sólido residual a partir de acetato de etilo--hexano a quente para produzir 770 mg de um sólido branco que se dissolveu em metanol (20 ml). A esta solução adicionou-se Pd 10%/C (50 mg) e agitou-se vigorosamente a mistura sob hidrogénio a uma atmosfera durante 1 h. Removeu-se o catalisador por filtração e evaporaram-se os voláteis em vácuo para dar 500 mg de um óleo; MS (FAB+) m/e 336 (M+H)+. ÍH-RMN (DMS0-d6, 300 MHz) <S 71 183 4693.Ρ6.01

-53-

Exemplo 15b

Cbz-Trp-fNMe^Leu-AspfOtBuVPhe-NHz A uma solução de Cbz-(NMe)Leu-OH (160 mg, 0,57 mmol) e do dipéptido do exemplo 15a (192 mg, 0,57 mmol), em cloreto de metileno (3 ml) adicionaram-se diisopropiletilamina (155 mg, 1,2 mmol) e cloreto bis(2-oxo-3-oxazolidinil)-fosfínico (B0P-C1) (160 mg, 0,63 mmol). Agitou-se a mistura reaccional à temperatura ambiente durante três dias. Lavou—se a solução com bicarbonato de sódio aquoso saturado e salmoura, depois com ácido clorídrico IN e salmoura. Secou-se a fase orgânica (Na2S04) e então evaporou-se o solvente em vácuo. Purificou-se o resíduo por cromatografia sobre sílica gel (acetato de etilo/hexanos 3=1) para produzir 150 mg de um óleo que se dissolveu em metanol (5 ml) e adicionou-se Pd 10%/C. Agitou-se vigorosamente a mistura reaccional sob hidrogénio a uma atmosfera durante 1 h. Removeu-se o catalisador por passagem através de um filtro de papel e concentrou-se o sobrenadante em vácuo. Formou-se um azeótropo com o resíduo e tolueno? para produzir um sólido branco que se dissolveu então em cloreto de metileno e adicionaram-se diisopropiletilamina (41 mg, 0,32 mmol), Cbz-Trp (54 mg, 0,16 mmol), e B0P-C1 (43 mg, 0,17 mmol). Agitou-se a mistura reaccional à temperatura ambiente durante a noite e então diluíu-se em cloreto de metileno, lavou--se com ácido clorídrico IN, bicarbonato de sódio aquoso saturado e salmoura. Secou-se a fase orgânica (N32S04) e evaporaram-se os solventes em vácuo para dar um resíduo oleoso que se purificou por cromatografia em coluna de sílica gel (acetato de etilo) para dar 61 mg de uma espuma branca a qual foi realizada sem caracterização.

Exemplo 15c

Cbz-Trp-(NMe)Leu-Asp-Phe-NHz A uma solução do tetrapéptido do exemplo 15b (61 mg, 0,08

-54- J 71 183 4693.PS-01

jSL^memHtÊÊÊÊti2Z mmol) em cloreto de metileno (1 ml) a 02C adicionou-se anisolo (50 mg, 0,46 mmol) e ácido trifluoroacético (1 ml) e armazenou-se a mistura reaccional a 42C durante 2 dias. Diluíu-se a mistura reaccional com tolueno e então evaporaram-se os solventes em vácuo. Purificou-se o resíduo por cromatografia em coluna de sílica gel (acetato de etilo/piridina/ácido acético/água, 15=2:0,6:1,1). Reuniram-se as fracções do produto, diluiram-se com água, e então liofilizaram-se para dar 38 mg de um sólido branco5 p.f. 107-1092C; MS (FAB-) m/e 725 (M-H)". 1H-RMN (DMS0-

1H, J=7,5 Hz). Anal. calc. para C39H46N6Q8.1,25H20: C 62,51, H 6,52, N 11,21; Encontrado: C 62,74, H 6,33, N 10,84.

Exemplo 16 N-(4-hidroxicinamoíl)-Trp-Met-Asp-Phe-NH2 Exemplo 16a Éster N-hidroxissuccinimida do ácido 4-hidroxicinâmico A uma solução de ácido 4-hidroxicinâmico (1,0 g, 6,09 mmol) e N-hidroxissuccinimida (0,72 g, 6,09 mmol) em 45 ml de tetra--hidrofurano (THF) arrefecida num banho de gelo adicionou-se diciclo-hexilcarbodiimida (DCC) (1,22 g, 5,91 mmol). Tapou-se o balão com um tubo de secagem cheio com drierite e deixou-se em agitação aproximadamente 60 h enquanto se aqueceu lentamente até à temperatura ambiente. Arrefeceu-se subsequentemente a mistura reaccional num banho de gelo e filtrou-se em vácuo. Concentrou-se o filtrado em vácuo para dar o produto bruto que se purificou por cromatografia flash sobre sílica gel (acetato de etilo-hexano) e por recristalização das fracções relevantes a partir de acetato de etilo-hexano para dar 0,85 g de um sólido branco. 1-H-RMN (Acetona-d^, 300 MHz) <5 2,50 (s, 4H), 6,60 (d, J=16,5Hz, 1H),

Anal. calc. para C13H11NO5: C 59,76, H 4,25, N 5,36; Encontrado: -55- 71 183 4693.Ρβ.01 C 59,58, Η 4,26, N 5,08. p.f 199-203,590 (d).

Exemplo 16b N-(4-hidroxicinamoíl ^-Trp-íiet-fisp-Phe-NI-fo A uma mistura do éster activo preparado no exemplo 16a (0,032 g, 0,12 rnrnol) e sal hidrocloreto de Trp~Met~Asp-Phe-NH2 preparado de acordo com Morley, et. al. J. Chem, Sco. 555 (1966) (0,080 g, 0,12 mmol) em dimetilformamida (DMF) num banho de gelo sob uma atmosfera de azoto , adicionou-se diisopropiletilamina (DIEA) (0,045 ml, 0,25 mmol). Deixou-se a mistura em agitação durante a noite enquanto aqueceu lentamente até à temperatura ambiente. Adicionaram-se 0,015 g, 0,06 mmol, adicionais do éster activo seguido de duas gotas de DIEA. Após 4 h adicionais de agitação à temperatura ambiente parou-se a reacção vertendo-a numa solução gelada de ácido cítrico a 10¾. Recolheu-se o produto bruto por filtração em vácuo e purificou-se por HPLC preparativa de CiQ de fase inversa · (acetonitrilo-50 mmol acetato de amónio, pH 4,5) para dar, após liofilização, 0,015 g de sólido branco. MS (FAB+) m/e 743 (M+H)+. in-RMN (DMS0-d6) <S 1,7-1,96 (cm, 2H), 2,0 (s, 3H), 2,3-3,5 (cm, 8H), 4,33 (cm, 2H), 4,48 (cm, 1H), 4,68 (cm, 1H), 6,5 (d, J=16,5Hz, 1H), 6,77 (d, J=9Hz, 2H), 6,95 (t, 1H), 7,04 (t, 1H), 7,1-7,5 (cm, 14H), 7,62 (d, J=7,5Hz, 1H), 8,0 (cm, 1H), 8,23 (cm, 3H), 9,88 (s largo, 1H), 10,84 (s largo, 1H). Anal. calc. para 038Η42Ν6083.2H20: C 58,59, H 5,96, N 10,79; Encontrado: C 58,36, H 5,63, N 10,66. p.f. 214-2162C (d).

Exemplo 17 N-(8-naftoíl)-f desidro)Phe-Leu-Asp-Phe-NHp

Exemplo 17a Éster N-hidroxissuccinimida de ácido 2-naftóico A uma solução de ácido 2-naftóico (2g, 11,62 mmol) e N--hidroxissuccinimida (1,34 g, 11,62 mmol) em 75 ml de uma mistura 2:1 v/v de acetato de etilo-1,2-dimetoxietano (glima) que foi arrefecida num banho de gelo, adicionou-se DCC (2,4 g, 11,62 mmol) de uma só vez. Tapou-se o balão com um tubo de secagem cheio com drierite e deixou-se em agitação durante a noite enquanto aqueceu lentamente até à temperatura ambiente.

Subsequentemente filtrou-se a mistura reaccional e concentrou-se o filtrado em vácuo. Recristalizou-se o residuo a partir de acetato de etilo-hexano para dar 2,73 g (duas colheitas) de cristais brancos. 1h-RMN (CDCI3, 300 MHz) 6 2,95 (s, 4H), 7,5--7,75 (cm, 2H), 7,85-8,2 (cm, 4H), 8,76 (s, 1H), Anal. calc. para c15h11N04: c 66,90, H 4,12, N 5,20; Encontrado: C 66,87, H 4,13, N 5,17.

Exemplo 17b 2-B-naftil-4-benzilideno-5(4H)-oxazolona

Combinou-se o produto do exemplo 17a (1,07 g, 3,98 mmol) com hidrocloreto de éster metílico de glicina (0,55 g, 4,38 mmol) em dimetilformamida (DMF) (10 ml) e arrefeceu-se a solução resultante num banho de gelo. A solução arrefecida adicionou-se DIEA (0,76 ml, 4,4 mmol) seguido da remoção do banho de gelo. Tapou-se o balão com um tubo de secagem cheio com drierite e deixou-se em agitação durante a noite. Subsequentemente submeteu-se a mistura reaccional a partição entre acetato de etilo e água. Lavou-se a fase orgânica com HC1 a 103», água, secou-se com sulfato de magnésio, filtrou-se e concentrou-se em vácuo para dar 0,91 g de produto bruto sólido suficiente para usar sem purificação adicional. Dissolveu-se o éster (0,91 g, 3,74 mmol) em metanol (25 ml) e tratou-se à temperatura ambiente com hidróxido de potássio (0,7 g, 12 mmol) em água (10 ml), Após uma hora, submeteu-se a mistura reaccional a partição entre acetato de etilo e HC1 aquoso diluído. Lavou-se a fase orgânica com água, uma vez, secou-se com sulfato de magnésio, filtrou-se e concentrou-se em vácuo para dar 0,74 g do produto bruto na forma de um sólido branco suficiente para usar sem purificação adicional. Suspendeu-se o ácido (0,74 g, 3,23 mmol) em anidrido acético (30 ml) ao qual foi adicionado acetato de sódio tri-hi-dratado (1,3 g, 9,81 mmol) e benzaldeído (0,33 ml, 3,27 mmol). Tapou-se o balão com um condensador de água fria/tubo de secagem, cheio com drierite e aqueceu-se a mistura num banho de vapor durante uma hora. Subsequentemente concentrou-se a mistura reaccional em vácuo e submeteu-se o resíduo a partição entre água e acetato de etilo. Lavou-se a fase orgânica com solução de

J 71 183 4693.PG.01 bicarbonato de sódio a 59;, água, secou-se com sulfato de magnésio, filtrou-se e concentrou-se em vácuo. Recristalizou-se o produto bruto a partir de acetato de etilo-hexano para dar 0,34 g de um sólido amarelo claro, Obtiveram-se 0,09 g adicionais de produto a partir das águas mães por cromatografia flash sobre sílica gel (acetato de etilo-hexano). (DMSQ-d^, 300 MHz) <5 7,6 (s, 1H), 7,5-7,8 (cm, 5H), 8,0-8,4 (cm, 6H), 8,75 (s, 1H).

Anal. calc. para C2oHi3N02: C 80,24, H 4,39, N 4,68; Encontrado: C 80,43, H 4,51, N 4,35. p.f. 164-168,520.

Exemplo 17c N-(0-Naftoíl)-(desidro)Phe-Leu-ftsp-Phe-NHg

Combinou-se a azalactona do exemplo 17b (0,336 g, 1,12 mmol) com Leu-Asp-Phe-WH2 preparado de acordo com Kenner, G.W., et. al. J- Chern- Soe. (C), 761 (1968) (0,44 g, 1,12 mmol) em DMF (15 ml) contendo uma quantidade catalítica de p~dimetilaminopiridina (DMAP) seguida de adição de DIEA (0,2 ml, 1,23 mmol) e aquecimento, sob azoto, a 55-602C. Após 2,5 h submeteu-se a mistura reaccional a partição entre acetato de etilo e HC1 aquoso diluído. Lavou-se a fase orgânica uma vez com água, secou-se (sulfato de magnésio), filtrou-se e concentrou-se em vácuo. Recristalizou-se o produto bruto a partir de etanol aquoso para dar 0,637 g de um sólido branco cristalino. MS(FftB+) m/e 692 (M+H)+_ iH-RMN (DMS0~d6, 300 MHz) Ó 0,9 (d, J=6Hz , 6H), 1,4-1,8 (cm, 3H), 2,55-3,1 (cm, 4H), 4,2-4,6 (cm, 3H), 7,0-7,24 (cm, 8H), 7,26-7,45 (cm, 3H), 7,6-7,75 (cm, 5H), 8,0-8,16 (cm, 4H), 8,2 (d, J=7,5 Hz, 1H), 8,5 (d, J=7,5Hz, 1H), 8,7 (s, 1H), 10,45 (s, 1H), 12,47 (s largo, 1H). Anal. calc. para 039842^507.0,58201 C 66,83, H 6,05, N 9,99; Encontrado: C 66,77, H 6,02, N 9,86. p.f. 212,5--214ÔC (d).

Exemplo 18 N-(a-Naftoíl)-(desidro)Phe-Leu-ftsp-Fhe-NH2

Exemplo 18a Éster N-hidroxissuccinimida do ácido 1—naftóico

Preparou-se o éster por acoplamento de ácido 1-naftóico (2 g, 11,62 mmol) com N-hidroxissuccinimida (1,34 g, 11,62 mmol) -58- -58- 71 183 4693.PG.01 Λ X_ jjy como se resumiu no exemplo 17a para dar 2,57 g de um produto branco cristalino. Ιπ-RMN (CDCI3, 300 MHz) ô 2,95 (s largo, 4H), 7,5-7,8 (cm, 3H), 7,93 (d, J=9Hz, 1H), 8,6 (d, J=7,5Hz, 1H), 8,46 (dd, J=7,5Hz, 1,5Hz, 1Π), 8,81 (d, J=9Hz, 1H). ftnal. calc. para Ci5HhN04: C 66,90, H 4,12, N 5,20? Encontrado: C 66,77, H 4,22, N 5,33.

Exemplo 18b 2-a-naf til-4-benzilideno-5('4H )-oxazolona

Fez-se reagir o produto do exemplo 18a (1,07 g, 3,98 mmol) com hidrocloreto de éster metílico de glicina (0,55 g, 4,38 mmol) como no exemplo 17b para dar um produto bruto, 1,0 g, que subsequentemente se tratou com hidróxido de potássio (0,7 g, 12 mmol) em metanol (25 ml) como no exemplo 17b para dar 0,75 g do ácido correspondente na forma de um sólido branco cristalino. Preparou-se a azalactona por condensação do ácido anterior (0,75 g, 3,27 mmol) com benzaldeido (0,33 ml, 3,27 mmol) na presença de acetato de sódio tri-hidratado (1,38 g, 9,81 mmol) como no exemplo 17b para dar, após cromatografia flash sobre sílica gel (acetato de etilo-hexano), 0,346 g de um sólido cristalino amarelo. l-H-RMN (DMS0-d6, 300 MHz) Ó 7,45 (s, 1H), 7,5-7,65 (cm, 3H), 7,65-7,8 (cm, 2H), 7,8-7,9 (t, 1H), 8,14 (d, J=7,5Hz, 1H), 8,25-8,4 (cm, 2H), 9,4 (d, J=9,0Hz, 1H). final. calc. para C20H13NQ2 = C 80,24, H 4,39, N 4,68? Encontrado: C 80,29, H 4,48, N 4,55. p.f. 134-1372C.

Exemplo 18c N-Çct-Naf toíl)-( desidro IPhe-Leu-ftsp-rPhe-NHg

Condensou-se a azalactona do exemplo 18b (0,18 g, 0,60 mmol) com Leu-ftsp-Phe-NH2 (0,24 g, 0,60 mmol) como no exemplo 17c para dar 0,272 g de um produto cristalino. MS (Ffí8+) m/e 692 (M+H)+, m/e 714 (M+Na)+. ^-H-RMN (DMS0-d6, 300 MHz) <$ 0,92 (cm, 6H), 1,4- -1,88 (cm, 3H), 2,45-3,1 (cm, 4H), 4,26-4,6 (cm, 3H), 7,04-7,29 (cm, 8H), 7,3-7,49 (cm, 3H), 7,5-7,7 (cm, 5H), 7,78-7,9 (t, 2H), 8,0 (d, J=7,5Hz, 1H), 8,08 (d, J=9Hz, 1H), 8,24-8,4 (cm, 3H), 10,3 (s, 1H), 12,4 (s largo, 1H), final. calc. para C39H4j:N5O7: C 67,70, H 5,98, N 10,12; Encontrado: C 67,57, H 6,05, N 10,02.

J 71 183 4693.PG.01 -59-

Exemplo 19

Boc-Trp-Leu-Asp-fdesidrolPhe-NH?

Exemplo 19a ftzalactona de Boc-(3-t-butil)Asp-,6-fenil-serina A uma solução de ácido Boc-(S-t-butil)aspártico (0,34 g, 1,17 mmol) em THF (20 ml) sob uma atmosfera de azoto adicionou-se N-metilmorfolina (NliM) (0,13 ml, 1,17 mmol). Arrefeceu-se a mistura a -10/-1520 e adicionou-se cloroformato de isobutilo (IBCF) (0,15 ml, 1,17 mmol) numa só porção por meio de uma seringa. Após 7 min. a baixa temperatura, aqueceu-se a suspensão resultante a 0/+52C e adicionou-se uma suspensão de hidrato de d,l-3~fenil-serina (0,21 g, 1,17 mmol), previamente preparada, num total de 6 ml de água contendo NMM (0,13 ml, 1,17 mmol), gota a gota, durante 2 min.. Deixou-se a solução límpida resultante em agitação enquanto aquecia, lentamente, até à temperatura ambiente. Parou-se a reacção vertendo—a numa solução de ácido cítrico a 10¾ e recuperou-se o produto bruto por extracção com acetato de etilo, secou-se (sulfato de magnésio), filtrou-se e concentrou-se em vácuo, ft purificação por cromatografia flash sobre sílica gel (acetato de etilo/hexano/ácido acético, depois acetato de etilo/acetona/ácido acético) deu uma espuma (0,29 g).

Subsequentemente, dissolveu-se este material em anidrido acético e adicionou-se acetato de sódio tri-hidratado (0,26 g, 1,91 mmol). Tapou-se o balão com um tubo de secagem cheio com drierite e agitou-se a mistura à temperatura ambiente, durante 6 h. Concentrou-se a mistura reaccional em vácuo até à secura e, então, submeteu-se a partição entre clorofórmio e solução de ácido cítrico a 10¾. Extractou-se a fase aquosa duas vezes com clorofórmio. Secaram-se os extractos combinados (sulfato de magnésio), filtraram-se e concentraram—se em vácuo. Purificou-se o produto bruto por cromatografia flash sobre sílica gel (acetato de etilo-hexano) para dar 0,221 g da azalactona pura na forma de uma espuma. 1h-RMN (DMS0-d6, 300 MHz) <5 1,4 (s, 1SH), 2,65-3,0

-60- J 71 183 4693.PG.01

JhÁ-m

Exemplo 19'o

Boc-(g-t-butil )fisp—( desidro)Phe-NHo

Dissolveu-se o produto do exemplo 19a (0,029 g, 0,071 mmol) em dioxano (2,5 ml) e tratou-se, à temperatura ambiente, com solução concentrada de hidróxido de amónio (2,5 ml). Após 30 min, parou-se a reacção vertendo-a numa solução de ácido cítrico a 10¾. Recuperou-se o produto bruto por extracção com clorofórmio, secou-se (sulfato de magnésio), filtrou-se e concentrou-se em vácuo. A purificação por cromatografia preparativa em camada fina (silica gel-GF/1 mm, acetato de etilo) deu o produto bruto (0,015 9). 1H-RMN (DMS0-dó, 300 MHz) Ô 1,4 (s, 18H), 2,4-2,8 (cm, 2H), 4,36 (q, 1H), 7,22 (s, 1H), 7,26-7,4 (cm, 5H), 7,57 (cm, 2H), 9,55 (s, 1H).

Exemplo 19c

Boc-Leu-Asp- ( des i dr o ) Ph e-N'4?

Tratou-se a amida dipéptido preparada como no exemplo 19b (0,127 g, 0,293 mmol), com 5 ml de HC1 1,5N em ácido acético glacial. Após uma hora gelou-se a mistura reaccional e liofilizou-se para dar, em rendimento quantitativo, a amida dipéptido totalmente desprotegida na forma do sal hidrocloreto. Subsequentemente, combinou-se este material (0,092 g, 0,293 mmol) com Boc-Leu-OSu (0,098 g, 0,29 mmol) em solução de DMF (5 ml), num banho de gelo, e tratou-se com DIEA (0,11 ml, 0,645 mmol). Tapou-se o balão com um tubo de secagem cheio com drierite e deixou-se em agitação durante a noite enquanto, aquecia, lentamente, até â temperatura ambiente. Parou-se a reacção vertendo-a em ácido cítrico aquoso e isolou-se o produto bruto por extracção com acetato de etilo seguida de secagem (sulfato de magnésio), filtração e concentração em vácuo. A recristalização a partir de acetato de etilo deu 0,091 g do composto puro. RMN (DMS0-d6, 300 MHz) <S 0,85 (t, 6H), 1,34 (s, 9H), 1,3-1,7 (cm, 3H), 2,55-2,9 (cm, 2H), 3,96 (cm, 1H), 4,57 (cm, 1H), 7,08 (d, J=6Hz, 1H), 7,15 (s largo, 1H), 7,25-7,45 (cm, 5H), 7,55 (d.

J=7,5Hz, 1H), 8,47 (d, J=6Hz, 1H), 9,35 (s, 1H), 12,55 (s largo, 1H). Anal. calc. para C24H34N4Q7.0,5H2O: C 57,69, H 7,07, N {

71 183 4693.PG.01 -61- •\ 11,22; Encontrado: C 57,86, H 6,71, N 11,08. p.f. 178,5-180,520 (d).

Exemplo 19d

Boc-Trp-Leu-Asp-(desidro)Phe~NH?

Tratou-se o produto do exemplo 19c (0,084 g, 0,171 mmol) com 5 ml de HC1 1,5N em ácido acético glacial à temperatura ambiente. Após uma hora gelou-se a mistura reaccional e liofilizou-se para dar, em rendimento quantitativo, a amida tripéptido desprotegida na forma do sal hidrocloreto. Subsequentemente combinou-se este material (0,073 g, 0,171 mmol) com Boc-Trp-OSu (0,069 g, 0,171 mmol) em solução de DMF (2 ml) num banho de gelo e tratou-se com DIEA (0,066 ml, 0,376 mmol). Tapou-se o balão com um tubo de secagem cheio com drierite e deixou-se em agitação durante a noite enquanto aqueceu lentamente até ã temperatura ambiente. Parou-se a reaeção vertendo-a em ácido cítrico aquoso gelado e isolou-se o produto bruto por filtração de vácuo. A recristalizaçao a partir de etanol deu 0,065 g de tetrapéptido puro. MS (FAB+) m/e 677 (M+H)+. *Η RMN (DMS0-d6, 300 MHz) <$ 0,85 (cm, 6H), 1,15 e 1,3 (s, 9H total), 1,4-1,75 (cm, 3H), 2,5-3,2 (cm, 4H), 4,2 (cm, 1H), 4,4 (cm, 1H), 4,6 (cm, 1H), 6,86 (d, J=7,5Hz, 1H), 6,97 (t, 1H), 7,06 (t, 1H), 7,12 (s, 1H), 7,17 (s, 1H), 7,27 (s, 1H), 7,27-7,45 (cm, 5H), 7,55-7,65 (cm, 3H), 8,0 (d, J=7,5Hz, 1H), 8,52 (d, J=7,5Hz, 1H), 9,54 (s, 1H), 10,78 (s,

1H), 12,6 (s largo, 1H), Anal. calc. para C35H44N6OQ.H2O: C 60,49, H 6,69, N 12,08; Encontrado: C 60,16, H 6,26, H 11,74, p.f. 192-1942C (d).

Exemplo 20 a 8oc-T rp-Leu-Asp-(m-ni tr o)Phe-NH?

Exemplo 20 N-acetilamlno-(m-nitro)benzil-dietilmalonato * A uma solução de etoxido de sódio (0,1 g, 4,3 mmol sódio, 25 ml de etanol absoluto) recentemente preparada, adicionou-se sob azoto ã temperatura ambiente, N-acetilaminodietilmalonato sólido (1 g, 4,60 mmol). Após 25 min. adicionou-se brometo de m~ -nitrobenzilo sólido (1 g, 4,60 mmol) e aqueceu-se a mistura

J 71 183 4693.PG.01 resultante ao refluxo durante a noite. Isolou-se o produto bruto submetendo a mistura reaccional a partição entre acetato de etilo e solução de ácido cítrico a 10¾. Lavou-se a fase orgânica uma vez com água, secou-se (sulfato de magnésio), filtrou-se e concentrou-se em vácuo. A purificação por cromatografia flash sobre sílica gel (acetato de etilo-hexano) deu 0,58 g de um produto sólido. ÍH-RMN (DMSQ-dé, 300 MHz) 6 1,18 (t, 6H), 1,95 (s, 3H), 3,58 (s, 2H), 4,17 (cm, 4H), 7,46 (d, J=7,5Hz, 1H), 7,61 (t, 1H), 7,8 (s, 1H), 8,15 (d, 1H), 8,23 (s, 1H). Anal. calc.

para Cj.6H20N2°7: c H 5,73, N 7,95; Encontrado: C 54,35, H 5,65, N 7,80. p.f. 156-1572C.

Exemplo 20b 8oc-m-nitro-fenilalanina

Suspendeu-se o produto do exemplo 20a (0,061 g, 0,172 mmol) em HC1 6N (6 ml) e refluxou-se durante 4 h. Concentrou-se a mistura reaccional em vácuo, diluiu-se com dioxano-água 1:1 v/v e tornou-se básica com hidróxido de sódio. A esta adicionou-se um excesso de Boc-carbonato e deixou-se a mistura em agitação durante a noite à temperatura ambiente. Diluiu-se a mistura reaccional com solução de ácido cítrico a 10¾ e isolou-se o produto bruto por extracção com acetato de etilo, seguida por secagem (sulfato de magnésio), filtração e concentração em vácuo. A purificação por tlc preparativa deu 0,038 g de produto na forma de um vidrado cor de ambar. -H-RMN (BMSO-dg, 300 MHz) <5 1,28 (s, 9H), 2,85-3,3 (cm, 2H), 4,15 (cm, 1H), 7,18 (d, J=9Hz., 1H), 7,6 (t, 1H), 7,75 (d, J=7,5Hz, 1H), 8,1 (d, J=9Hz, 1H), 8,15 (s, 1H). Anal. calc. para C^H^qí^O^: C 54,18, H 5,86, N 9,03; Encontrado: C 54,25, H 5,70, N 8,59. p.f. 117,7-118,520.

Exemplo 20c

Boe-m-nitro-fenilalanina amida

Dissolveu-se o produto do exemplo 20b (1,7 g, 5,48 rnmol) em THF (50 ml) e tratou-se com NMM (0,58 ml, 5,30 mmol). Arrefeceu--se a solução resultante num banho de gelo sob uma atmosfera de azoto e adicionou-se a esta solução arrefecida, cloroformato de etilo (0,46 ml, 4,82 mmol). Após 10 min, fez-se borbulhar 71 183 4693.PQ.01 -63-

lentamente amónia gasosa na suspensão durante aproximadamente 10 min.. Subsequentemente tapou—se o balão com um tubo de secagem cheio com drierite e deixou-se aquecer lentamente até à temperatura ambiente. Isolou-se o produto bruto por concentração da mistura reaccional em vácuo, diluição com água e filtração de vácuo, Secou-se o produto sólido em vácuo ã temperatura ambiente. Purificou-se o produto por recristalização a partir de acetato de etilo-hexano. l-H-RMN (DMS0-d6, 300 MHz) Ô 1,25 (s, 9H), 2,75-3,2

1H), 8,2 (s, 1H). Anal, calc. para C14H19N3O5: C 54,35, H 6,20, N 13,59; Encontrado: C 54,35, H 6,24, N 13,51. p.f. 189-191,520 Cd).

Exemplo 20d

Boc-Aspíg-terc-butil)-(M-nitro)Phe-NHo

Tratou-se o produto do exemplo 20c (0,98 g, 3,18 mmol) com 16 ml de HC1 1,5N em ácido acético glacial à temperatura ambiente. Após 45 min. adicionou-se gota a gota éter anidro (100 ml) com agitação vigorosa. Recolheu-se o hidrocloreto por filtração de vácuo para dar, após secagem em vácuo à temperatura ambiente, 0,77 g de um sólido branco suficientemente puro para usar como foi isolado. A uma solução de éster de Boc-Asp(j3-t--butilo) (0,92 g, 3,18 mmol) em THF (50 ml) sob azoto ã temperatura ambiente adicionou-se NMM (0,35 ml, 3,18 mmol) e arrefeceu-se a solução resultante a -102C, Adicionou-se cloroformato de isobutilo (IBCF) (0,41 ml, 3,18 mmol) em duas porçóes e permitiu-se o prosseguimento da activação 6 min., antes de se adicionar gota a gota, durante 2 min., uma pasta previamente preparada do hidrocloreto anterior (0,77 g, 3,13 mmol) numa mistura de DMF (16 ml)/DMS0 (0,25 ml) contendo NMM (0,35 ml, 3,18 mmol). Subsequentemente, aqueceu-se a mistura reaccional a 0/+52C e deixou-se em agitação aproximadamente 2,5 h. Parou-se a reacção vertendo-a numa mistura de acetato de etilo, ácido cítrico a 10¾ e água. Lavou-se a fase orgânica uma vez com ácido cítrico a 10¾, duas vezes com solução de bicarbonato de sódio a 5%, e uma vez com água, então secou-se 71 183 4693.PS,01 -64-

(sulfato de magnésio), filtrou-se e concentrou-se em vácuo para dar o produto bruto na forma de um vidrado cor de rosa. A purificação por recristalização a partir de acetato de etilo--hexano deu 0,57 g (duas colheitas) de um produto sólido, Tornou--se claro a partir da análise por RMN que se recuperou um diastereómero por recristalização. A análise por HPLC (Cie fase inversa acetonitrilo-50 mrnol de acetato de amónio, pH 4,5) do produto recristalizado assim como do material recuperado a partir das águas mães após cada um ter sido desprotegido por tratamento com HC1 em ácido acético glacial sob condições Standard, mostrou que o primeiro era o componente da mistura de longo tempo de retenção (isómero A), 0 material recuperado a partir das águas mães era rico no componente de curto tempo de retenção (isómero B). A amostra para análise obteve-se por cromatografia flash sob silica gel (acetato de etilo-hexano) do material recuperado a partir das águas mães. ^-H-RMN (DMSO-d^, 300 HHz) isómero A <$ 1,35

2H)« Anal. calc, para C22^32^4®8: ^ 54,98, H 6,72, N 11,66; Encontrado: C 54,76, H 6,86, N 11,30.

Exemplo 20e

Boc-Leu-fisp-(m-nitro)Phe-NI-Í2 (Isómero A)

Tratou-se o isómero A do exemplo 20d (0,46 g, 0,95 mrnol) com um excesso de HC1 1,5N em ácido acético glacial à temperatura ambiente. Tapou-se o balão com um tubo de secagem cheio com drierite e deixou-se em agitação 5 h. Subsequentemente gelou-se a mistura reaccional e liofilizou-se. Usou-se o hidrocloreto bruto sem purificação adicional. Combinou-se o hidrocloreto (0,95 mrnol) com Boc-Leu-OSu (0,31 g, 0,95 mrnol) num balão arrefecido num banho de gelo ao qual se adicionou DMF (15 ml) préarrefecido, seguido de DIEA (0,36 ml, 2,09 mrnol). Tapou-se o balão com um tubo de secagem cheio com drierite e deixou-se em agitação durante a noite enquanto aqueceu lentamente até ã temperatura ambiente. Subsequentemente concentrou-se a mistura reaccional em vácuo e verteu-se numa solução aquosa de ácido cítrico. -65- 71 183 4693,PQ.01

Recolheu-se o produto bruto por filtração em vácuo e lavou-se com água, fi purificação por recristalização a partir de etanol aquoso deu 0,32 g de produto sólido (duas colheitas). (DMSO-d^, 300 MHz) δ 0,83 (m, 6H), 1,2-1,65 (cm, 3H), 1,37 (s, 9H), 2,4-2,7 (cm, 2H), 2,85-3,25 (cm, 2H) 3,92 (cm, 1H), 4,45 (cm, 2H), 6,83 (d, J=9Hz, 1H), 7,25 (s, 1H), 7,38 (s, 1H), 7,55 (t, 1H), 7,67 (d, J=7,5Hz, 1H), 7,95-8,2 (cm, 3H). Anal. calc. para C24H35N5O9: C 53,61, H 6,57, N 13,03; Encontrado: C 53,44, H 6,61, N 12,97.

Exemplo 20f

Boc-Trp-Leu-flsp-(m-nitro)Phe-NHp flsómero A)

Tratou-se o produto do exemplo 2Ge (0,259 g, 0,48 mmol) com 7 ml de HC1 1,5N em ácido acético glacial à temperatura ambiente. Tapou-se o balão com um tubo de secagem cheio com drierite e deixou-se em agitação durante uma hora. Subsequentemente gelou-se a mistura reaccional e liofilizou-se. Usou-se o hidrocloreto bruto sem purificação adicional. Combinou-se o hidrocloreto (0,48 mmol) com Soc-Trp-OSu (0,2 g, 0,48 mmol) num balão ao qual se adicionou DMF e arrefeceu-se a solução resultante num banho de gelo. Adicionou-se à solução arrefecida DIEA (0,184 ml, 1,06 mmol) e tapou-se o balão com um tubo de secagem cheio com drierite e deixou-se em agitação durante a noite enquanto aqueceu lentamente até ã temperatura ambiente. Verteu-se a mistura reaccional numa solução aquosa diluída de ácido cítrico e recolheu-se o produto por filtração de vácuo e lavou-se com água. fi purificação por recristalização a partir de etanol aquoso deu 0,30 g de um produto sólido. MS (FAB+) m/e 724 (M+H)+. 1H-RMM (DMS0-dó, 300 MHz) ô 0,84 (rn, 6H), 1,1-1,7 (cm, 12H), 2,4-3,3 (cm, 6H), 4,2 (cm, 1H), 4,33 (cm, 1H), 4,46 (cm, 2H), 6,84 (d, J=9Hz, 1H), 6,96 (t, 1H), 7,05 (t, 1H), 7,1 (s, 1H), 7,26 (s largo, 1H), 7,31 (d, J=7,5Hz, 1H), 7,38 (s largo, 1H), 7,5-7,7 (cm, 3H), 7,89 (d, J=9Hz, 1H), 7,96 (d, J=9Hz, 1H), 8,06 (d, J=7,5Hz, 1H), 8,11 (s, 1H), 8,23 (d, J=7,5Hz, 1H), 10,78 (s, 1H), 12,45 (s largo, 1H), final. calc. para C35H45M7O10.0,5H2Q: C 57,36; H 6,34, N 13,38; Encontrado: C 57,48, H 6,30, N 13,33. p.f. 197-198,50c (d)

J 71 183 4693.PG.01

-66-

Exemplo 21

Boc-Trp-Leu-Asp-fm-amino^Phe-iviHp (Isómero A)

Dissolveu-se o produto do exemplo 20f (0,064 g, 0,089 mmol) em DMF (2 ml) e a esta solução adicionou-se Pd 5%/8aSQ4 (15,3 mg). Subsequentemente desgaseificou-se a mistura reaccional e então pressurizou-se a uma atmosfera, com hidrogénio (balão de ensaio) à temperatura ambiente. Após aproximadamente uma hora filtrou-se a solução para remover o catalisador e purificou-se o produto bruto por HPLC preparativa de fase inversa (acetonitri1o~50 mmol de acetato de amónio, pH 4,5) para dar após liofilização, 0,048 g de um sólido branco. MS (FAB-) m/e 692 (M- -H)-, iH-RMN (DMS0-d6, 300 MHz) <3 0,85 (m, 6H), 1,1-1,7 (cm,

para C35H47N7O8.1,5H2O' C 58,31, H 7,00, N 13,60; Encontrados C 58,46, H 6,66, H 13,24.

Exemplo 22

Boc-Trp-Leu-Asp-Γ m-(N-etil)amino1Phe-NH^

Exemplo 22a

Boc-(m-(N-etil)amino)-Phe-NHg

Dissolveu-se o produto do exemplo 21 (0,16 g, 0,53 mmol) em metanol (15 ml) e a esta solução adicionou-se Pd 5%/ BaS04 (84 mg). Subsequentemente desgaseificou-se a mistura reaccional e, então, pressurizou-se a uma atmosfera, com hidrogénio (balão de ensaio) ã temperatura ambiente. Após meia hora filtrou-se a mistura reaccional através de celite para remover o catalisador, concentrou-se o filtrado à secura para dar 0,158 g do produto bruto, adequado para usar sem purificação adicional. Dissolveu-se o produto anterior (0,53 mmol) em ácido acético glacial (10 ml) e arrefeceu-se a solução a 1020. A esta adicionou-se boro-hidreto de sódio sólido (0,22 g, 5,81 mmol) em porções, durante vários minutos. Subsequentemente tapou-se o balão com um septo de borracha e deixou-se em agitação durante a noite à temperatura

J 71 133 4693.PG.01

-67- ambiente. Gelou-se a mistura reaccional e liofilizou-se. Submeteu-se o resíduo a partição entre acetato de etilo e solução de bicarbonato de sódio a 5¾. Extractou-se a fase aquosa duas vezes com acetato de etilo e secaram-se as fases orgânicas combinadas (sulfato de magnésio), filtrou-se e concentrou-se em vácuo. Purificou-se o produto bruto por cromatografia flash sobre sílica gel (acetato de etilo-hexano-ãcido acético, depois acetato de etilo-ácido acético-metanol) para dar 0,117 g de produto. If-i-

Exemplo 22b

Boc-Aspf β-benzil )-f m-fN-etil )amino~I-Phe-NHg

Tratou-se o produto do exemplo 22a (0,117 g, 0,381 mmol) com 6 ml de HC1 1,5N em ácido acético glacial ã temperatura ambiente. Tapou-se o balão com um tubo de secagem cheio com drierite e deixou-se em agitação durante uma hora. Subsequentemente gelou-se a mistura reaccional e liofilizou-se. 0 hidrocloreto bruto isolado desta maneira era suficientemente puro para o uso directo em passos subsequentes. A uma solução de éster de Boc-Asp(J3--benzilo) (0,12 g, 0,37 mmol) em THF (15 ml) sob azoto adicionou-se NMM (0,13 ml, 1,17 mmol) e arrefeceu-se a solução resultante a -10/-152C. A esta adicionou-se de uma só porção, cloroformato de isobutilo (IBCF) (0,05 ml, 0,37 mmol) e permitiu-se prosseguir a activação 5 min. Adicionou-se subsequentemente uma solução previarnente preparada do hidrocloreto anterior (0,37 mmol) em DMF (4 ml), por meio de uma seringa durante 4 min. Quando completada a adição aqueceu-se a mistura a 0/+52C) e deixou-se em agitação enquanto aqueceu lentamente até à temperatura ambiente. Após aproximadamente uma hora, parou-se a reacção vertendo-a em água e isolou-se o produto bruto por extracção com acetato de etilo. Secaram-se as fases orgânicas combinadas (sulfato de magnésio), filtraram-se e concentraram-se em vácuo. A purificação por cromatografia flash sobre silica gel (acetato de etilo-hexano) deu 0,139 g de

J 71 183 4693,PG.01 -68- produto, iH-RMN (DMSO-d^, 300 MHz) <5 1,12 (cm, 3H), 1,37 (s, 9H), 2,4-3,1 (cm, 6H), 4,32 (cm, 2H), 5,5 e 5,8 isómeros A e B (s, 2H), 5,33 (t, 1H), 6,37 (m, 3H), 6,91 (cm, 1H), 7,1-7,4 (cm, 8H), 7,72 e 7,98 isómeros A e B (d, J=9Hz, total 1H).

Exemplo 22c

Boc-Leu-Aspfg-bemzil )-f m-(N-etil "Íaminol-Phe-MH?

Tratou-se o produto do exemplo 22b (0,139 g, 0,264 mmol) com 6 ml de HC1 1,5N em ácido acético glacial à temperatura ambiente. Tapou-se o balão com um tubo de secagem cheio com drierite e deixou-se em agitação uma hora. Subsequentemente gelou-se a mistura reaccional e liofilizou-se. 0 hidrocloreto bruto era suficientemente puro para usar na forma em que foi isolado. Combinou-se o hidrocloreto (0,264 mmol) com Boc-Leu-OSu (0,09 g, 0,264 mmol) e a esta mistura adicionou-se DMF (5 ml). Arrefeceu--se a solução resultante num banho de gelo e adicionou-se à solução arrefecida DIEA (0,10 ml, 0,58 mmol). Tapou-se o balão com um tubo de secagem cheio com drierite e deixou-se em agitação durante a noite enquanto aqueceu lentamente até â temperatura ambiente. Subsequentemente verteu-se a mistura reaccional em água e extractou-se com acetato de etilo. Secaram-se os extractos combinados (sulfato de magnésio), filtrou-se e concentrou-se em vácuo. Purificou-se o resíduo por crornatografia flash sobre sílica gel (acetato de etilo-hexano) para dar 0,089 g de produto puro. l-H-RMN (DHS0-dó, 300 MHz) <5 0,83 (m, 6H), 1,12 (q, 3H), 1,25-1,7 (cm, 12H), 2,5-3,05 (cm, 6H), 3,91 (cm, 1H), 4,28 (cm, 1H), 4,45-4,65 (cm, 1H), 5,03 e 5,07 isómeros A e B (s, 2H), 5,35 (cm, 1H), 6,36 (cm, 3H), 6,85-7,45 (cm, 8H), 7,8 e 7,87 isómeros A e B (d, J=9Hz, total 1H), 8,17 (d, J=7,5 Hz) e 8,31 (d, J=9Hz) isómeros A e B total 1H).

Exemplo 22d

Boc-Tro-Leu-Asp-fm-f N-etil lamino! Phe-NH-o

Dissolveu-se o produto do exemplo 22c (0,089 g, 0,142 mmol) em metanol (7 ml). A esta solução adicionou-se Pd 10%fC (10 mg). Subsequentemente desgaseificou-se a mistura reaccional e então pressurizou-se a uma atmosfera com hidrogénio (balão de ensaio) à

J 71 183 4693,PG.01

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temperatura ambiente. Após 45 min. filtrou-se a solução através de celite e concentrou-se o filtrado à secura, Tratou-se o resíduo corri 6 ml de MCI 1,5W em ácido acético glacial à temperatura ambiente. Tapou-se o balão com um tubo de secagem cheio com drierite e deixaram-se os conteúdos em agitação 45 min. Subsequentemente gelaram-se os conteúdo do balão e liof ilizararn-se. Combinou-se o hidrocloreto bruto com Boc-Trp-OSu (0,06 g, 0,142 mmol) sob uma atmosfera de hidrogénio e a esta adicionou-se DMF (2 ml). Arrefeceu-se a solução num banho de gelo e adicionou-se à solução arrefecida DIEA (0,08 ml, 0,47 mmol), Deixou-se a mistura em agitação durante a noite enquanto aqueceu lentamente até à temperatura ambiente. Concentrou-se a mistura reaccional em vácuo e suspendeu-se o produto em ácido acético aquoso, Recolheu-se o sólido por centrifugação, dissolveu-se em ácido acético glacial, gelou-se e liofilizou-se. Purificou-se o produto bruto por HPLC preparativa de fase inversa Cjg (acetonitrilo-50 mmol de acetato de amónio, pH 4,5) para dar, após liofilização, 0,028 g de um produto sólido. MS (FAB-) m/e 720 (M-H-, (FAB+) m/e 722 (M+H)+. ^-Η-ΒΜΝ (DMSG-d6, 300 MHz) <S

largo), 7,95 e 8,06 isómeros A e B (d, J=7,5Hz total 2H), 8,3 e 8,37 isómeros A e B (d, J=7,5Hz, total de 1H), 10,83 (s largo, 1H). Anal, calc. para C37H51NyOg.2H2Q: C 58,62, H 7,33, N 12,94; Encontrado: C 58,26, H 6,81, N 12,66.

Exemplo 25

Ctp-Leu-Asp-f desidro ^Fhe-NHg

Tratou-se o produto do exemplo 19c (0,099 g, 0,201 mmol) com 6 ml de HC1 1,5N em ácido acético glacial à temperatura ambiente e tapou-se o balão com um tubo de secagem cheio com drierite, Após 45 min. gelaram-se os conteúdos do balão e liofilizaram-se. 0 hidrocloreto bruto era suficientemente puro para usar na forma como foi isolado. A uma solução de Ctp (0,05 g, 0,191 mmol) preparada de acordo com Yonemitsu et. al., J. Am. Chem. Soc.. 88 (17), 3941 (1966), em DMF (1 ml) e THF (2 ml) sob uma atmosfera 71 183 4693.PQ.01 -70-

de azotOjadicionou-se NMM (0,05 ml, 0,42 mmol) e arrefeceu-se a solução resultante a -32C com um banho de gelo e sal, A esta adicionou-se, de uma só porção, ISCF (0,026 ml, 0,191 mmol) e permitiu-se à activação prosseguir 7 min. Subsequentemente, uma solução previamente preparada do hidrocloreto anterior (0,201 mmol) em DMF (2 ml) adicionou-se gota a gota durante 3 min. e permitiu-se à mistura aquecer até à temperatura ambiente. Após 2,5 h concentrou-se a mistura reaccional em vácuo, Dissolveu-se o resíduo em metanol e então suspendeu-se em solução de ácido cítrico a 10¾. Recolheu-se o produto bruto por centrifugação e purificou-se por HPLC preparativa de fase inversa C^g (acetonitrilo-50 mmol de acetato de amónio, pH 4,5) para dar, após liofilização, 0,018 g de produto.MS (FAB+) m/e 617 (M+H)+. iH-RMN (DMSQ-dó, 300 MHz) <5 0,89 (rn, 6M), 1,5 (t, 2H), 1,65 (cm,

para €3283^,1^0-7.2,Bí-ígQ: C 58,07, H 6,26, N 12,70? Encontrado: C 57,75, H 5,55, N 12,44.

Exemplo 24

Boc-Trp-Met-fisu-Phe-NH? A uma mistura de Boc-Trp-Met-Asp-Phe-NM2 (0,153 g, 0,220 mmol) preparada de acordo com Morley, et. al., J. Chem. Soe,. 555 (1966) e anidrido de ácido p-clorobenzóico (0,135 g, 0,457 mmol) o qual se preparou como descrito em J. Amer. Chem. Soc., 40. 424 (1918) adicionou-se, à temperatura ambiente, DMF (10 ml), seguido por DIEA (0,045 ml, 0,253 mmol). Tapou-se o balão com um balão cheio com azoto e deixaram-se os conteúdos em agitação aproximadamente 3 h. Subsequentemente verteu-se a mistura em salmoura e extraíu-se o produto com acetato de etilo, Secaram-se os extractos combinados (sulfato de magnésio), filtraram-se e concentraram-se em vácuo. Purificou-se o produto bruto por cromatografia flash sobre sílica gel (acetato de etilo-hexano--ácido acético) para dar 0,083 g de produto sólido. IfH-RMN (DMS0-d&, 300 MHz) <3 1,15 e 1,3 (s, total 9H), 2,04 (s, 3H), 1,88 (cm

J 71 183 4693,PG,01

-71-

(s, 1H), final. calc. pra C 59,36, H 6,31, N 12,22; Encontrado: C 59,41, H 6,39, N 11,88.

Exemplo 25

Boc-Trp-Tpp-Asp-(N-Me)Phe-NHg Exemplo 25a

Boc-Tpp-ftspf B-benzil VfN-ilelPhe.NHo ft uma solução de Boc-(trans-3-propil)Prolina (1,03 9, 4,00 mmol) preparada como no exemplo 52g, em THF (75 ml) sob azoto à temperatura ambiente., adicionou-se NMM (0,5 ml, 4,4 mmol) e arrefeceu-se a solução resultante a -10/-153C. fi esta adicionou--se IBCF (0,52 ml, 4,0 mmol) e perrnitiu-se à activação prosseguir 6 min.. Uma solução recentemente preparada de hidrocloreto de Asp(B-benzil)-(N-Me)Phe-NH2 (1,68 g, 4,0 mmol), preparada como no exemplo 5e, em DMF (40 ml), adicionou-se subsequentemente (rapidamente) ^ gota a gota»,durante 5 min seguida pela adição (lenta)^ gota a gota *,tíe uma solução de NMM (0,5 ml, 4,4 mmol) em THF (75 ml) durante uma hora enquanto a mistura reaccional aqueceu lentamente até 0SC. Após 30 min. adicionais de agitação, submeteu-se a mistura a partição entre acetato de etilo e HC1 aquoso diluído. Lavou-se a fase orgânica com água, bicarbonato de sódio a 5% e água, uma vez cada, a secou-se (sulfato de magnésio), filtrou-se e concentrou-se em vácuo. Purificou-se o produto bruto por cromatografia flash sobre silica gel (acetato de etilo-hexano) para dar 2,01 g do produto na forma de uma espuma. MS m/e 623 (M+H)+, m/e 640 (M+NH4)+. ÍH-RMN (DMS0-d6, 300 MHz) <5 0,82 (cm, 3H), 1,1-1,6 (cm, Í4M), 1,85 (cm, 2H), 2,2-3,7

8,3-8,6 (cm, 1H). final. calc. para C34H46N407.0,5H20: C 64,63, H 7,51, N 8,87; Encontrado: c 64,46, H 7,51, N 8,68. 71 133 4693.PG.01

-72

Exemplo 25b

Hidrocloreto de Tpp-Aspf0-benzil)-fN-Me)Phe-Ni-i 2

Tratou-se o produto do exemplo 25a (2,01 g, 3,23 mmol), à temperatura ambiente, com 10 ml de HC1 1,44N em ácido acético glacial. Tapou-se o balão com um tubo de secagem cheio com drierite e deixou-se em agitação 40 min. Precipitou-se o produto com éter etílico (400 ml), recolheu-se por filtração em vácuo e secou-se em vácuo à temperatura ambiente para dar 1,56 g de um produto sólido branco. Anal, Cale. para C29H33N4O5.HCI-Η2ΟΪ C 60,34, H 7,00, N 9,71; Encontrados C 60,67, H 6,90, N 9,76.

Exemplo 25c

Boc-Trp-Tpp-fispfβ-benzil)—(M-Me)Phe-NH2

Combinou-se o produto do exemplo 25b (1,56 g, 2,79 mmol) com Boc-Trp-QH (0,85 g, 2,79 mole). HOBt (0,33 g, 2,79 mmol) e EDCI (0,54 g, 2,79 mmol) sob azoto e a esta mistura adicionou-se DMF (20 ml). Arrefeceu-se a solução resultante num banho de gelo e à solução arrefecida adicionou-se DIEA (0,53 ml, 3,07 mmol). Permitiu-se ã mistura reaccional aquecer até à temperatura ambiente. Após aproximadamente 3,5 h submeteu-se a mistura a partição entre acetato de etilo e ácido clorídrico diluído, Secou-se a fase orgânica (sulfato de magnésio), filtrou-se e concentrou-se em vácuo. Purificou-se o produto bruto por cromatografia flash sobre sílica gel (acetato de etilo-hexano) pra dar 1,59 g de produto. MS (FAB+) m/e 809 (M+H)+, m/e 831 (M+Na)+. 1H-RMN (DMSO-d^, 300 MHz) <5 0,83 (cm, 3H), 1,1-1,6 (cm,

1H), 10,75-10,92 (cm, 1H). Anal. cal. para C45H55N5O3.1,5H2O:

Exemplo 2Bd

Boc-Tr p-Tpp-Asp- f M-He ) Ph e-Niiig

Dissolveu-se o produto do exemplo 25c (0,072 g, 0,089 mmol) em metanol (5 ml) ao qual se adicionou Pd 10%/C (0,035 g). Desgaseificou-se a mistura e, então, sujeitou-se a hidrogenólise num misturador Parr sob 4 atmosferas de hidrogénio à temperatura -73-

-73- J 71 183 4693,PG.01 ambiente. Filtrou-se a mistura reaccional através de celite e concentrou-se o filtrado em vácuo, Purificou-se o produto bruto por HPLC preparativa de fase inversa C-^g (acetonitrilo-50 mmol de acetato de amónio, pH 4,5) para dar, após liofilização, 0,037 S de produto. MS (FAB+) m/e 719 (M+H)+. iH-RMM (DMS0-cI6, 300 MHz) <5 0,83 (cm, 2H), 1,1-1,6 (cm, 13H), 1,8-2,1 (cm, 2H), 2,3-3,5 (cm, 10H), 3,7-4,0 (cm, 2H), 4,2-4,5 (cm, 18), 4,75-5,2 (cm, 3H), 6,9-7,6 (cm, 138), 8,2-8,5 (cm, 18). Anal. calc. para 038^50^603-2820: C 60,45, 8 7,22, 8 11,13; Encontrado: C 60,19, 8 6,67, N 11,14.

Exemplo 26

Boc-Tro-Nle-Asp-fM-Me^Phe-NHo Exemplo 26a

Boc-81e-Asp(0-benzil)-8-He)Phe-MH2

Acoplou-se Boc-Nle-OH (1,82 g, 7,87 mmol) com hidrocloreto de Asp(/3-benzil )-H-metil-Phe-8H2 (3,3 g, 7,87 mmol) usando a metodologia descrita no exemplo 25a. Isolou-se o produto bruto e purificou-se como descrito para dar 3,84 g do produto desejado. MS (FAB-) m/e 595 (M-8)-. %-BMN (DMS0-d6, 300 M8z), Ô 0,75-1,6 (cm, 18H), 2,2 (cm, 18), 2,5 (cm, 18), 2,7-3,3 (cm, 58), 3,83 (cm, 18), 4,65 e 4,85-5,15 (cm, 48), 6,8 (cm, 1H), 7,0-7,55 (cm, 128), 8,15 (d, J=9Hz) e 8,44 (d, J=7,58z) total 18. Anal. calc. para 0328448407.0,25 H20 = C 63,91, H 7,47, 8 9,32; Encontrado: C 63,89, 8 7,37, 8 9,27.

Exemplo 26b

Hidrocloreto de Nle-ftsp(g-benzil)-(8-Me)Phe-NH2

Tratou-se o produto do exemplo 26a (3,84 g, 6,43 mmol) com 20 ml de 8C1 1,58 em ácido acético glacial à temperatura ambiente. Tapou-se o balão com um tubo de secagem cheio com drierite e deixaram-se os conteúdos em agitação uma hora. Precipitou-se o produto por adição gota a gota de éter etílico (300 ml), recolheu-se por filtração a vácuo e secou-se em vácuo à temperatura ambiente para dar 3,16 g de um sólido branco. Anal. calc. para €278358405.801.0,5 820= C 59,81, 8 7,08, 8 10,34; Encontrado: c 59,50, 8 6,79, 8 10,27.

71 183 4693.PG.01 -74-

Exemplo 26c Boc, Trp. Nle-fisp(B-ben z i 1) - f N-Me ) Ph e-NhP>

Combinou-se o hidrocloreto tripépíido do exemplo 26b (1,54 g, 2,89 mmol) sob uma atmosfera de azoto, com Boc-Trp-OSu (1,16 g, 2,89 ímioI) e a esta mistura adicionou-se DMF (20 ml).

Arrefeceu-se a solução resultante num banho de gelo e adicionou--se DIEA (0,55 ml, 3,18 mmol). Removeu-se o banho de gelo e permitiu-se à mistura aquecer até à temperatura ambiente. Após aproximadamente 2,5 h submeteu-se a mistura reaccional a partição entre acetato de etilo e ácido clorídrico aquoso diluído. Lavou--se a fase orgânica uma vez com água, secou-se (sulfato de magnésio), filtrou-se e concentrou-se em vácuo. Purificou-se o produto bruto por cr orna togr afia flash sobre sílica gel (acetato de etilo-hexano ) para dar 1,91 g de produto sólido, MS (FAB+) m/e 805 (M+Na)+. Anal. calc. para C43H54N6O0-0,5 H?0: C 65,20, H 7,01, N 10,61; Encontrado: C 65,07, H 6,82, M 10,54.

Exemplo 26d

Boc-Trp-Nle-Asp-f N-Me)Phe-NHo

Sujeitou-se o produto do exemplo 26c (0,181 g, 0,23 mmol) a hidrogenólise como descrito no exemp,o 25d. A purificação por HPLC preparativa de fase inversa C^g (acetonitrilo-50 mmol de acetato de amónio, pH 4,5) deu, após liofilização, 0,086 g de produto sólido. MS (FAB+) m/e 693 (M-fH)+. iH-RMN (DM80-d6, 300 MHz) <3 0,84 (cm, 1H), 1,0-1,6 (cm, 15H), 2,08 e 2,36 (cm, 1H), 2,65-3,5 (cm, 3H), 4,1-4,4 (cm, 2H), 4,65 e 5,0 (cm, 1H), 4,88 e 5,15 (q, 1H), 6,82 (cm, 1H), 6,9-7,7 (cm, 12H), 7,8 e 7,88 (d, J=9Hz, total 1H), 8,26 (d, 3=9Hz) e 8,61 (d, J=7,5Hz) total 1H. final. calc. para 03^48^^00.0,5 H2O: C 61,59, H 7,05, N 11,98| Encontrado: c 61,50, H 7,07, M 12,06.

Exemplo 27

Boc-Trp-Mle-Asp-f desidro)Phe-NHo

Exemplo 27a

Boc-Nle-Asp-fdesidroIPhe-NHg

Tratou-se o desidropéptido totalmente protegido (0,78 g,

J 71 183 4693.P6,01

-75- 1,81 mmol) preparado como se descreveu no exemplo 19c, à temperatura ambiente sob azoto, com excesso de HC1 1,4N em ácido acético glacial. Após 2,5 h adicionou-se metanol até que a solução se tornou homogénea e precipitou-se subsequentemente o produto por adição, gota & gota,de éter etílico (125 ml), ft filtração a vácuo, seguida de secagem em vácuo à temperatura ambiente, deu o hidrocloreto, 0,55 g, na forma de um sólido branco adequado para se usar sem purificação adicional. A uma solução de Boc-Nle-OH (0,19 g, 0,80 mmol) em THF (10 ml) sob azoto, adicionou-se NMM (0,20 ml, 1,75 mmol) e arrefeceu-se a solução resultante a -15/-2020. A esta adicionou-se de uma só vez IBCF (0,10 ml, 0,80 mmol). Permitiu-se à activação prosseguir 8 min, tempo após o qual se adicionou uma solução previamente preparada do hidrocloreto anterior (0,25 g, 0,80 mmol) em DMF (7 ml), gota a gota, durante 3 min. Subsequentemente aqueceu-se a mistura reaccional a 0/'-f52C. Após uma hora submeteram-se os conteúdos do balão a partição entre acetato de etilo e ácido clorídrico aquoso diluído. Lavou-se a fase orgânica com água uma vez, secou-se (sulfato de magnésio), filtrou-se e concentrou-se em vácuo. Purificou-se o produto bruto por reeristalização a partir de acetato de etilo-acetona para dar 0,20 g de produto sólido. MS (FAB-Í-) m/e 491 (M+H)+, rn/e 513 (M+Na)+. ^H-RMN (DMS0--d6, 300 MHz) Õ 0,82 (cm, 3H), 1,15-1,65 (cm, 15H), 2,6-2,9 (cm,

1H), 9,32 (s, 1H), 12,53 (s largo, 1H). Anal. calc. para C24H34N4°7£ c 58,75, H 7,00, H 11,42; Encontrados C 58,46, H 6,92, N 11,08. p.f. 180-1822C (d),

Exemplo 27b

Boc-Trp-Mle-Asp-f desidro ^Phe-MHp

Tratou-se o produto do exemplo 27a (0,184 g, 0,375 mmol) com excesso de HC1 1,S7M em ácido acético glacial. Tapou-se o balão com um tubo de secagem cheio com drierifce e deixaram-se os conteúdos em agitação à temperatura ambiente. Após aproximada-mente 1,5 h, gelaram-se os conteúdos do balão e liofilizaram-se. 0 hidrocloreto bruto era suficientemente puro para usar na forma 71 183 4693.PG.01 -76-

como foi isolado. Combinaram-se o hidroclareto (0,375 rnmol) e Boc-Trp-OSu (0,15 g, 0,375 mmol) e & esta mistura adicionou-se, sob azoto, DMF (5 ml), firrefeceu-se a solução resultante num banho de gelo e adicionou-se DIEA (0,15 ml, 0,825 mmol). Deixou--se a mistura em agitação durante a noite enquanto aqueceu lentamente até a temperatura ambiente. Subsequentemente verteu-se a mistura reaccional em ácido clorídrico aquoso diluído. Recolheu—se o produto bruto por filtração a vácuo e lavou—se com água. A purificação por recristalização a partir de etanol aquoso deu 0,184 g de produto sólido. MS (FA-B-) rm/e 675 (M-H)-. ^H-RMN

12,58 (s largo, 1H). Anal. calc. para C35H44N6O8 .0,5 H2O: C 61,29, H 6,63, N 12,26; Encontrado: C 61,40, H 6,60, N 12,37. p.f. 193,5-194,520 (d).

Exemplo 28

Soc-T rp-Leu-Asu-Phe-NHb A uma mistura de Boc-Trp-Leu-Asp-Phe-NHo (0,5 g, 0,74 mmol) preparado de acordo com Θ. W. Kenner, et. al., J. Chem. Soc. C, 761 (1968) e anidrido benzóico (0,19 g, 0,81 mmol) sob uma atmosfera de azoto, adicionou-se DMF (10 ml) seguido de DIEA (0,14 ml, 0,81 mmol). Deixou-se a mistura reaccional em agitação durante a noite à temperatura ambiente. Subsequentemente submeteram-se os conteúdos do balão a partição entre acetato de etilo e ácido clorídrico diluído. Lavou-se a fase orgânica uma vez (cada) com água, com bicarbonato de sódio a 5% e com água, então secou-se (sulfato de magnésio), filtrou-se e concentrou-se em vácuo. Purificou-se o produto bruto por cromatografia flash sobre sílica gel (acetato de etilo-hexano) para dar 0,45 g de um produto sólido. MS (FAB+) m/e 561 (M+H)+. IfHI-RMN (DMSG-dé, 300

71 183 4693.PG,01 -77-

(s, 1H). Anal. calc. para C35H44N6O7.0,25 C4HQO2 (acetato de etilo): C 63,31, H 6,80, N 12,31; Encontrado C 63,05, H 6,84, N 12,27.

Exemplo 29 N^-Boc-M1n-formil-Trp-Leu-fisp,Phe-MH? Exemplo 29a Éster de N^-Boc-N^n-formil-Trp-succinimida A urna solução de Na-Boc-Nin-formil-Trp (200 mg, 0,60 mmol) em 6 ml de DME anidro adicionou-se N-hidroxissuccínimida (69 mg, 0,60 mmol) e DCC (200 mg, 1,0 mmol) à temperatura ambiente e agitou-se durante 48 h sob atmosfera de azoto. Removeu-se dieiclo-hexilureia por filtração, evaporou-se o solvente e dissolveu-se o resíduo em EtOAc. Repetiu-se o processo de filtração. Evaporou-se então o EtOAc para dar o produto (205 mg, 80¾) na Forma de uma espuma branca quebradiça. ^H-RMN (CDCI3, 60 MHz) Ó 1,4 (s, 9H), 2,8 (s, 411), 3,4 (dd, 2H), 5,1 (s largo, 1H), 7,2-7,6 (m, 5H), 9,1 (s largo, 1H).

Exemplo 29b N^-Boc-N*n-formi1-Trp-Leu-Asp-Phe-NHo A uma solução de Leu-Asp-Phe-NH2-HC1 (349 mg, 0,80 mmol) em 6 ml de DMF anidro adicionou-se DIEA (0,28 ml, 1,60 mmol) e uma solução do produto do exemplo 29a (350 mg, 0,82 mmol) em 6 ml da DMF anidro a Q2C. Agitou-se a solução resultante durante 24 h com aquecimento até à temperatura ambiente sob atmosfera de azoto. Verteu-se a mistura reaccional numa solução, em agitação rápida, de ácido cítrico a 10¾ arrefecida formando-se um precipitado branco. Recolheu-se o sólido e recristalizou-se a partir de EtOH para dar o produto (280 mg, 50¾) na forma de um sólido branco: p.f. 215-218QC., [a]25D = -30,ÓQ (c=0,3, DMF), MS (FAB+) m/e 707 (M+H)+. 1Í-S-RMN (DMS0-dó, 300 MHz) Ô 0,81-0,87 (2d, 6H), 1,29 (s,

1H), 7,18-7,38 (m, 10H) e seis protões permutáveis do D20. Anal. Calc. para ^36^46^6^9.0,5 H20: C 60,42? H 6,34; N 11,75. 71 183 4693.PG,01 -78-

Encontrado: c 60,62; H 6,54; N 11,60.

Exemplo 30 N^-Boe-N* n-Boe-f 2,5-di-Siiàro~Trp )~Leu-Asp-Phs-MH;

Exemplo 30a Éster de isF-Boc-N3-n-Boc-2,5-di-hidro-Trp succinimida A uma solução de Na-Boc-N*n-Boc-2,3-di-hidro-Trp (407 mg, 1,0 mmol) em 10 ml de DHE anidro adicionou-se N--hidroxissuccinimida (115 mg, 1,0 mmol) e DCC (309 mg, 1,5 mmol). Agitou-se a mistura reaccional à temperatura ambiente durante 48 h sob atmosfera de azoto. Removeu-se diciclo-hexilureia por filtração, evaporou-se o solvente e dissolveu-se o resíduo em EtOAc, Repetiu-se o processo de filtração, Evaporou-se então o EtOAc para dar o produto (400 mg, 80¾) na forma de uma espuma ligeiramente amarela, quebradiça -^H-RMN (CDCI3, 60 MHz) <3 1,5 (d, 18H), 1,9-2,4 (s, 2H), 2,8 (s, 4H), 3,3-5,3 (m, 7H), 6,8-7,8 (m, 4H).

Exemplo 30b

Ma—Boc—n-Soc-(2.3-di-hidro-Trp)-Leu-Asp-Phe-NH2 A uma solução de Leu-Asp-Phe-M^-HCl (420 mg, 1,0 mmol) em 8 ml de DMF anidro adicionou-se DIEA (0,35 ml, 2,0 mmol) e uma solução do produto do exemplo 30a (500 mg, 1,0 mmol) em 6 ml de DMF anidro a 02C. Agitou-se a solução resultante durante 24 h à temperatura ambiente sob atmosfera de azoto. Verteu-se a mistura reaccional numa solução rapidamente agitada de ácido cítrico a 10¾, fria, formando-se um precipitado que se recolheu e recristalizou a partir de EtOH/f-^O para dar o produto (429 mg, 55/a) na forma de um sólido brancos p.f. 293-1953C, /"õt_725D = -30,4Q (c=G,5, DMF, mistura de um par de diastereómeros), MS(FAB+) m/e 781 (M+H), ^-H-RMNÍDMSG-dé/^O, 300 MHz) ô 0,85 (2d,

^40^56^6^10-1^2°“ C 60,11; H 7,32; N 10,52. Encontrados C 60,18; H 7,33; N 10,13. 71 183 4693.PG.01

-79-

Exemplo 31 { 2, S-di-hidro-indolo-Trp )-Leu-Asp-Phe-NFo-HCl

Tratou-se o tetrapéptido protegido do exemplo 30b (200 mg, 0,26 mrnol) com 6 ml de HC1 4N/dioxano e agitou-se sob azoto à temperatura ambiente, durante 3 h. Adicionou-se éter anidro à reacção com agitação vigorosa causando a formação de um precipitado branco. Recolheu-se o precipitado e recristalizou-se a partir de EtOH/EtOAc para produzir o produto (150 mg, 90¾) na forma de um sólido de cor ligeiramente creme. [oc]25p = 0,272 (c=0,75, DMF, mistura de um par de diastereómeros no carbono benzilico da porção indolina), p.f. Í752C (d), MS(FAB+) m/e 581(M+H)+ para base livre, ^H-RMN (DMS0-d6/D20, 300 MHz) Ô 0,90 (2d, 6H), 1,34-1,55 (m, 2H), 1,61-1,83 (m, 1H), 1,94-2,11 (m, 1H), 2,20-2,33 (m, 1H), 2,45-2,85 (dois dd e um m, 5H), 3,03 (dd, 1H), 3,39 (dd, 1H), 3,56-3,67 (m, 1H), 3,90-4,0 (m, 1H), 4,3-4,45 (m, 1H), 4,45-4,60 (m, 1H), 7,15-7,45 (m, 9H).

Exemplo 32

Boc-5-amino-2-(3:'-indolilmetil)-pentanoíl-Leu-Asp-Phe-MH2

Exemplo 32a «-(3-indolilmetil)-«-(trifenilfosforanilideno)acetato de benzilo

Preparou-se o composto de uma maneira idêntica à descrita por M. Strandtmann, et. al. J. Org. Chem,. 53. 4306 (1968). p.f. 152-154ÔC. MS(01) m/e 540 (h+H)+. ÍH-RMNCCDCIs, 300 MHz) Ô 3,56 (d, J=18Hz, 2H), 4,84 (s largo, 1H), 5,15 (s largo, 1H), 6,60 (s, 1H), 6,67 (s largo, 1H), 6,93 (t, J=7,5Hz, 1H), 7,03 (s largo, 1H), 7,08 (t, J=7,5Hz, 1H), 7,20-7,38 (m, 10H), 7,38-7,57 (m, 10H), 7,73 (s, 1H). Anal. Cale. para C36H30N02P.G,5H20: C 78,80, H 5,71, N 2,55; Encontrado: c 79,05, H 5,80, N 2,36.

Exemplo 52b Éster benzilico de ácido Boc—5—amino—2—(5?-indolilmetil)-2- -pentenóico fi uma solução de ilideto do exemplo 32a (lOg , 18 mrnol) em 100 ml de CH2C12 anidro adicionou-se uma solução de Boc-3--aminopropanol (E.J. Corey, et al, Tetrahedrom Lett. 1979, 399) 71 183 4693.ΡΘ.01

-80- (2,1 g, 12 mmol) em 30 ml de CH2CI2 anidro. Após agitação â temperatura ambiente durante três dias, purificou-se o produto por cromatografia flash em sílica gel usando EtOfic/Hexano (1/3-3/1, v/v) como eluentes para produzir o produto (4,2 g, 80¾) na forma de um óleo amarelo. Ij-i-RMN (CDCI3, 300 MHz) «5 1,4 (s, 9H), 2,6 e 2,6 (2q, 2H), 3,17 s 3,24 (2q, 2H), 3,77 e 3,83 (2s, 2H), 4,56 e 4,8 (largo, 1H), 5,16 (s, 2H), 5,95 (t, 1H), 6,84 (s largo, 1H), 6,9 (t, 1H), 7,1 (t, 1H), 7,18 (t, 1H), 7,24-7,38 (m, 6H), 7,6 (d, 1H), 7,96 (largo, 1H), m/e calculada para 026^30^2¾ 434,2205, encontrado^ 434,2208.

Exemolo 32c Ácido Boc-S-amino^-rS^-indoIilmetil)~2-pentanóico

Dissolveu-se o produto do exemplo 32b (766 mg, 1,7 mmol) em 30 ml de EtOAc e a esta solução adicionou-se 600 mg de Pd IQSs/C. Agitou-se a mistura reaccional sob atmosfera de hidrogénio durante 6 h. A filtração da mistura reaccional através de uma almofada de celite, seguida de várias lavagens com MeOH, produziu um filtrado que após concentração se purificou por cromatografia flash sobre sílica gel usando HOAc 1%/EtOAc (1/2-1/1, v/v) como eluente para fornecer o produto (480 mg, 81¾) na forma de um óleo: If-S-RMM (CDCI3, 300 MHz) <5 1,4 (s, 9H), 1,5-1,75 (m, 4H), 2,5 e 2,8 (m, 1H), 3,05 (dd, 2H), 3,10-3,28 (m, 2H), 3,8 e 4,6 (2 s largo, 1H), 6,9 (s largo, 1H), 7,1 (t, 1H), 7,16 (t, 1H), 7,33 (d, 1H), 7,58 (2d, 1H), 8,2 (s largo, 1H), m/e calculada para C19^26N2°4 346,1892, encontrado: 346,1898.

Exemplo 52d Éster 2,4.5-triclorofenólico do ácido Boc-5-amino-2-indolometii--pentanóico A uma solução do composto do exemplo 32c (233 mg, 0,67 mmol) em 10 ml de CH2CI2 anidro adicionou-se 2,4,5-trielorofenol (133 mg, 0,67 mmol) e EDCI (191 mg, 1,0 mmol). Agitou-se a solução ã temperatura ambiente durante 24 h sob atmosfera de azoto. Lavou--se a mistura reaccional com H2O (2x) e salmoura. Concentrou-se a fase orgânica e purificou-se o resíduo por cromatografia flash sobre sílica gel usando HOAc 1^/EtOAc/hexano (1/5-1/3, v/v) como

J

71 183 4693.PG.GX

-81- eluentes para produzir o produto (183 mg, 52¾) na forma de uma espuma quebradiça,branca: ^H-RMi^CDClg, 300 MHz) ô 1,44 (s, 9H),

Exemplo 32e 8oc-5-amino-2-f5*-inàoiilmstil )-2-pentanoí 1-Leu-Asp-Phe-NHo

Tratou-se uma solução de Leu-ftsp-Phe-NH2-HG1 (129 mg, 0,30 mmol) em 5 ml de DMF anidro com DIEA (0,12 ml, 0,68 mmol), HOBt (40 mg, 0,30 mmol) e uma solução do composto do exemplo 32c (158 mg, 0,3 mmol) em 5 ml de DMF anidro a 02C. ftgitou-se a solução resultante com aquecimento até à temperatura ambiente durante 24 h sob uma atmosfera de azoto. Verteu-se a mistura numa solução fria, com agitação rápida, de ácido cítrico a 10¾ causando a formação de um precipitado branco que se recolheu e purificou por cromatografia flash sobre sílica gel usando Et0Ac/Py/Si0Ac/H20 (24/4/1,2/2,2) como eluente e após liofolização produziu o produto (120 mg, 55¾) na forma de um sólido branco: p.f. 179--1B12C. A análise por HPLC (Cjg-ultrasfera 0DS com CH3CN/H20/TFft= 40/60/0,1 como eluente) revelou uma razão diastereomérica de 45/55 no carbono que suporte a porção indolometileno. r<r*D --28,62 (c=0,6, DMF), MS(FAB+) m/e 721 (M+H)+, iH-RMM(DMS0-d6, 300 MHz) <3 0,61, 0,69, 0,81, 0,85 (4d, 6H), 1,34, 1,36 (2s, 9H), 1,11-1,60 (m, 5H), 2,40-2,70 (m, 4H), 2,70-3,10 (m, 5H), 4,13- -4,24 (m, 1H), 4,25-4,40 (m, 2H), 4,40-4,50 (m, 1H), 6,90-7,60 (m, 10 ftr-H), e oito protões permutáveis do D2O- Anal. calc. para C38H52N6°8-°J5 H20 = c 62,55, H 7,32, N 11,52, encontrado: C 62,80, H 7,43, N 11,63.

Exemplo 53

Boc-5-amino-pentanoíl-Leu-Asp-Phe-NH2

Tratou-se uma solução de Leu-Asp-Phe-MH2-HC1 (300 mg, 0,48 mmol) em 10 ml de DMF anidro com DIEA (0,17 ml, 0,96 mmol) e éster triclorofenólico do ácido Boc-5-amino-pentanóico (190 mg, 0,48 mmol) em 2 ml de DMF anidro a G2C. Agitou-se a solução resultante com aquecimento à temperatura ambiente sob atmosfera

J 71 183 4693.PG.01

-•82-de azoto durante 24 h. Verteu-se a mistura numa solução rapidamente agitada de ácido cítrico a 10%, fria, causando a formação de um precipitado branco que se recolheu e recristalizou a partir de EtOAc para dar o produto (185 mg, 50¾) na forma ds um sólido branco: p.f. 189-1912C, MS(DCI) m/e 795 (M+NH4)+, [<x]25D= -29,82 (c=0,5, DMF), ÍH-RMN (DMS0-d6, 300 MHz) <5 0,81, 0,85 (2d, 6H), 1,36 (s, 9H), 1,20-1,65 (m, 7H), 1,95-2,10 (m, 2H), 2,35--2,63 (m, 2H), 2,75-2,95 (m, 4H), 3,0-3,21 (m, 2H), 4,20-4,36 (m, 2H), 4,42-4,50 (q, 1H), 4,45-4,62 (fíi, 1H), 6,94 (t, 1H), 7,09 (t, 1H), 7,21 (s largo, 1H), 7,32 (d, 1H), 7,57 (d, 1H), 7,15-7,27 (m, 5H) e nove protões permutáveis de D2O. final. calc. para ϋ40Η55Ν7°9·2Η20' c 59,04, H 7,25, N 12,05, encontrado: C 58,96, H 7,12, N 11,58.

Exemplo 34

Boc-5-ami no-2- ( 53 -i ndol i Ime t i 1 ~i-2-pen tenoí 1-Leu-Asp-Phe-NH·?

Exemplo 54a Ácido Boc-5-amino-2-f3?-indolilmetil)-2-pentenóico

Tratou-se uma solução do composto do exemplo 32b (400 mg, 0,92 rnmol) em 18 ml de EtOH com 400 mg de Pd 10¾ em carbono, sistema injectado com azoto, e arrefeceu-se num banho de gelo, adicionou-se então 1,4-ciclo-hexadieno (2,6 ml, 28 rnmol) à mistura reaccional anterior. Agitou-se a mistura à temperatura ambiente sob atmosfera de azoto durante 4 h- A filtração da mistura reaccional através de uma almofada de celite, seguida por várias lavagens com EtOH e evaporação, produziu um resíduo oleoso que se purificou por cromatografia flash sobre sílica gel eluindo com EtOftc/hexano (1/1, v/v, com 1¾ de HOAc) para produzir o ácido (269 mg, 85¾)^ MS m/e 344 (H+), Ih-RMNCCDCIs, 300 MHz) ô 1,4 (s,

Exemplo 54b Éster 2,4,5-triclorofenílico do ácido_Boc-5-am i no-2-f 33--indolilmetil)-2-pentenóico

Tratou-se uma solução de ácido do exemplo 34a (195 mg, 0,57 -83-

-83- J 71 1S3 4693,PG.01 mmol) em 8 ml de CH2CI2 anidro com 2,4,5-triclorofenol (112 mg, 0,57 mmol) e EDCI (160 mg, 0,85 mmol). Agitou-se a mistura reaccional durante 24 h à temperatura ambiente sob atmosfera de asoto, Lavou-se a mistura com ácido cítrico a 10¾ e salmoura, Secou-se a fase orgânica sobre 1^32804 e concentrou-se para dar um resíduo que se purificou por cromatografia flash sobre sílica gel. A eluição com EtOAc/Hexano (1/5~1/1, v/v, com 1¾ de HQAc) produziu o produto (158 mg, 54¾) na forma de um óleos í-H-RMN (CDCI3, 60 MHz) Ô 1,45 (s, 9H), 2,58 (q, 2H), 3,28 (q, 2H), 3,85

Exemplo 34c

Boc-S-amino-Z-O^indoliimetil )-2~penteno-oil-Leu-físp-Phe-NHg

Tratou-se uma solução de Leu-ftsp-Phe-NHg-HC1 (124 mg, 0,29 mmol) em 5 ml de DMF anidro com DIEft (0,10 ml, 0,58 mmol), HOBt (30 mg, 0,22 mmol) e uma solução do composto do exemplo 34b (153 mg, 0,29 mmol) em 5 ml de DMF anidro a Q2G. Agitou-se a solução resultante à temperatura ambiente sob atmosfera de azoto durante 24 h. Verteu-se então a mistura numa solução rapidamente agitada de ácido cítrico a 10¾ frio causando a formação de um precipitado branco, o qual, após recolha, se recristalizou a partir de EtOAc para dar o produto (124 mg, 60¾) na forma de um sólido branco, p.f, 179-1812C, [<x]25d = -13,72 (c=0,58, DMF), MS (FAB+) m/e 719(M+H )+. ^H-RMNÍDMSO-d^, 300 MHz) ¢3 0,72 e 0,72 (2d, 6H), 1,36 (s, 9H), 1,25-1,47 (m, 3H), 2,35 (q, 2H), 2,55 (dd, 2H), 2,88 (dd, 2H), 2,95-3,08 (m, 2H), 3,63 (q, 2H), 4,28-4,40 (m, 2H), 4,48 (q 1H), 6,21 (t, 1H), 6,93 (t, 1H), 6,95 (d, 1H), 6,97 (s largo, 1H), 7,04 (t, 1H), 7,15-7,25 (m, 6H) e oito protões permutáveis de D2O, Anal, calc, para C33H50N6O8: C 63,47, H 7,01, N 11,69, encontrado: C 63,21, H 7,24, N 11,47.

Exemplo 3b ívjg-Boc-i\ji n-pr opionii-Trp-Leu-Asp-Phe-MH?

Exemplo 35a Éster benzilico de N^-Boc-M1n-prgpionil-Trp

Agitou-se vigorosamente uma solução de éster benzilico de 71 183 4693.ΡΘ.01

-84-

Boc Trp (200 mg, 0,5 mmol), (n—Bu ^NHSQ^. (30 rng, eat.) e solução aquosa a 40¾ de MaOH (2 ml) em 6 ml de benzeno. Adicionou-se anidrido propiónico (excesso) em porções, à mistura anterior e monitorizou-se o progresso da reaeção por tlc, Assim que se consumiu o material de partida como indicado pelo tlc, verteu-se a mistura reaceional em 10 ml de água destilada e extractou-se com benzeno. Seeou-se a fase orgânica sobre Nâ2S04, filtrou-se e evaporou-se o solvente. Purificou-se o resíduo por cromatografia flash sobre sílica usando EtOAc/hexano (1/5-1/3, v/v) como eluentes para produzir o produto, 110 mg (48¾) na forma de um sólido branco. 1H-RMN (CDC13, 60 MHz) Ó 1,24 (t, 3H), 1,20 (s, 9H), 2,77 (q, 28), 3,22 (d, 28), 4079 (m, 18), 5,17 (s largo, 28), 7,0-7,6 (m, 98), 8,15-8,30 (m, 18).

Exemplo 35b Éster de N^-Boc-M*n-propionil-Trp-triclorofenilo

Usou-se o mesmo procedimento que se descreveu para o exemplo 32b para produzir o éster activo com rendimento de 63¾ a partir do composto do exemplo 35a. ^-RMNCCDClg, 60 M8z) ô 1,32 (t, 38), 1,38 (s, 98), 2,90 (q, 28), 3,30-3,60 (largo, 28), 4,90-5,25 (m, 18), 7,1 (s, 18), 7,20-7,70 (m, 58), 8,30-8,70 (m, 18).

Exertuplo 35c N^-Boc-N*n-propionil-Trp-L.8U-Asp-Phs-N8g

Usou-se o mesmo procedimento que se descreveu para o exemplo 34c para produzir o tetrapéptido com rendimento de 67¾ a partir do composto do exemplo 35b. p.f. 2G7-2G8ÔC, MS(FAB-) m/e 733 (M- -8)~, 18-RMN (D8S0-d6/3G0 MHz) Ó 0,85 (2d, 68), 1,18 (t, 38), I, 30 (s, 98), 1,27-1,52 (m, 28), 1,55-1,67 (m, 18), 2,56 (dd, 28), 2,50 (largo, 18), 2,78-3,15 (m, 58), 4,25-4,42 (m, 38), 4,52 (q, 18), 7,1-7,40 (m, 108) s sete protões permutáveis do D2O-

final. calc. para €33850^^09.0,582O: C 61,34, 8 6,91, N II, 30. Encontrado: c 61,47, 8 7,13, H 11,13.

J 71 183 4693.PG-01

-85-

Exemplo 36 3-f5-Indolillpropionil-Nle-Asp-Phe-NI-h?

Exemplo 36a 5-(5-Indolil)propionil~Nle-ftsp(QBn)-Phe-NH7

Tratou-se uma solução de Nle-Asp-Phe-NH2- iFA [M. Rodriguez, et al., J. Med. Chem., 30, 1366 (1987)] (202 mg, 0,34 mmol) em 1 ml de THF, com DIEA (61 μ.1, 0,35 mmol), HOBt (cat.) e uma solução de 2,4,5-triclorofenol-(3-indolil)propionato (H, Gregory, J.S. Morley, J. Chem. Soe, (Cl. 1968, 910) (129 mg, 0,35 mmol) em 1 ml de THF a 02C. Agitou-se a solução resultante durante 24 h com aquecimento até ã temperatura ambiente sob uma atmosfera de azoto. Verteu-se a mistura reaccional numa solução rapidamente agitada de ácido cítrico a 10¾ frio, causando a formação de um precipitado branco. Recolheu-se o sólido por filtração e triturou-se com EtOAc quente para dar (185 mg, 83¾). MS(FA8+) m/e Ó54(M+H)+, í-H-KMNKDMSO-d^ 300 MHz) 6 0,82 (t, 3H), 1,20 (m, 4H), 1,40-1,60 (m, 2H), 2,50-2,65 (m, 4H), 2,81 (dd, 1H), 2,85-2,93 (m, 2H), 3,02 (dd, 1H), 4,18 (m, 1H), 4,36 (m, 1H), 4,59 (m, 1H), 5,08 (s, 2H), 6,99 (t, 1H), 7,05 (t, 1H), 7,08 (s, 1H), 7,15-7,40 (m, 13H), 7,50 (d, 1H), 7,83 (d, 1H), 8,10 (d, 1H), 8,34 (d, 1H), 10,77 (s, 1M).

Exemplo 36b 3-(3-Indolil )prQPionil-Nle-fisp-Phe-NHp

Tratou-se uma solução do composto do exemplo 36a (138 mg, 0,21 mmol) em 8 ml de MeOH e 6 ml de Df*íF, com Pd 5%/C (69 mg).

Agitou-se a mistura reaccional sob atmosfera de hidrogénio durante 30 min. A filtração do catalisador através de uma almofada cie celite, seguida de várias lavagens com MeOH, produziu um filtrado que, após concentração, se recristalizou a partir de EtOAc para dar o produto (70 mg» 59^). p.f. 213-2182C, /®4.725q = -41,42 (c=0,5, DMS0), MS(FAB+) m/e 564 (M+H)+, l-H-RMN (DMS0-d6, 300 MHz) S 0,81 (t, 3H), 1,1-1,25 (m, 4H), 1,35-1,60 (m, 2H), 2,40-2,66 (m, 4H), 2,80-2,95 (m, 3H), 3,05 (dd, 1H), 4,17 (m, 1H), 4,32 (m, 1H), 4,45 (m, 1H), 6,94 (t, 1H), 7,05 (t, 1H), 7,08

11-1), 8,11 (d, 1H), 8,30 (d, 1H), 10,78 (s, 1H). Anal, calc. para C30H37N5O6.H2O: C 61,93, H 6,77, N 12,04, encontrado: C 62,13, H 6,53, N 11,82,

Exemplo 57 8-rN-(t-Boc)aminol-2-í5-indolometil )-2-octenoíl-Leu-Asp-Phe-NH2

Exemplo 37a 8-TN-( t-butoxicarboniDaminol^-ÇS^-indoIilmetil ~)-2-octenoato de metilo

Adicionou-se uma solução de 6-(BQC-amino)hexanol (2,0 g, 9,20 mmol) em 5 ml de CH2CX2 anidro, a uma suspensão seca de peneiros moleculares em pó, 4$, (lOg) e PDC (16 g, 42,5 mmol) em CH2CI2 (100 ml) ã temperatura ambiente e agitou-se durante 1 h. A diluição da mistura reaccional com éter dietílico, a filtração por uma almofada de celifce e a evaporação produziram um óleo castanho, o qual se purificou por crornatografia flash sobre sílica gel usando EtOAc/hexano (1/2) como eluentes para dar o aldeído desejado (1,24 g, 62¾) que imediatamente se tratou com a-(3-indolometil)-a-(trifenilfosforanilidino)acetato de metilo (7,5 g, 16 mmol) em 50 ml de CH2CI2 e deixou-se em refluxo durante 4 dias, Reduziu-se o volume do solvente da reacção até 8 ml e crornatografou-se sobre sílica gel flash usando EtOAc/tolueno (1/7-1/4, v/v) como eluentes para produzir o produto (1,6 g, 43¾) na forma de um óleo amarelo pálido. ^H-RMN (CDCI3, 60 MHz) <S 1,37 (m, 6H), 1,47 (s, 9H), 2,30 (q, 2H), 3,06 (d largo, 2H), 3,71 (s, 3H), 3,81 (s, 2H), 4,50 (s largo, 1H), 6,72-7,77 (m, 6H), 8,33 (s largo, 1H).

Exemplo 57b

Acido Boc-8- amino-2-(3?indolilmetil)-2-octenóico

Aqueceu-se ao refluxo durante 4 h uma solução do composto do exemplo 37a (564 mg, 1,41 mmol) em NaOH 1,0 M/MeOH (32 ml),

Adicionou-se NaOH 1,0 M adicional (10 ml) e refluxou-se a mistura durante 3 h adicionais. Removeu-se o metanol sob pressão reduzida e acidificou-se a fase aquosa com HC1 2,0 N (20 ml) e extractou--se com três porções de EtOAc. Secaram-se os extractos combinados sobre Na2304 e concentraram-se para produzir um óleo cor- de-

71 183 4693.PQ.01 -laranja (rendimento não determinado). -H-RHN (CDCI3, 60 MHz) ô 1,32 (m, 6H)., 1,43 (s, 9H), 2,17-2,50 (m, 1H), 2,75-3,30 (m, 3H), 3,40 (s, 1H), 3,79 (s, 1H), 5,49 (s largo, 1H), 6,77-7,77 (m, 5H), 8,30 (d largo, 1H), 8,87 (s largo, 1H).

Exemplo 37c Éster 2.4,5-triclorofenólico do ácido 8-ΓΝ-(t-Boc)amino1-2-(5^--indolilnnetil)—2—octenóico

Tratou-se uma solução do ácido bruto do exemplo 37b em 7 ml de CH2CI2 com 2,4,5-triclorofenol (330 mg, 1,69 mmol) e EDCI (380 mg, 1,98 mmol) e deixou-se era agitação durante 5 dias à temperatura ambiente. Lavou-se a mistura com solução de ácido cítrico a 10¾ (2x), e depois com salmoura. Após secagem, evaporou-se. o solvente e purificou-se o resíduo resultante por crornatografia flash sobre sílica gel usando EtOAc/hexano (1/10-1/5, v/v) como eluentes para produzir urn óleo amarelo pálido (562 mg, 70¾ a partir do composto do exemplo 37a). MS (DCI) m/e 565 (M+H)+, ^-H-RMN (CDCI3, 300 MHz) Ô 1,3-1,4 (m, 4H), 1,45 (s, 9H), 1,47 (s, 2H), 2,0-2,1 (m, 1H), 2,42 (q, 1H), 3,0--3,15 (iíi, 3H), 3,90 (s, 1H), 4,47 (s largo, 1H), 6,95-7,0 (m, 1H), 7,05-7,30 (m, 4H), 7,23 (s, 1H), 7,38 (t, 1H), 7,51 (d, 1H), 7,63 (d, 1H).

Exemplo 57d β-ΓΝ-ft-Boc)aminol-2-(5J-indolilmetil)-2-octsnoil-Leu-Asp-Phe-NHo

Tratou—se uma solução de Leu—Asp—Phe—NH2 (86 mg, 0,22 mmol) em 1 ml de DMF anidro com DIEA (38 ul, 0,22 mmol), H08t (cat.) e uma solução do composto do exemplo 37c (125 mg, 0,22 mmol) em 1 ml de DMF anidro a 02C. Aqueceu-se a solução a 4Q2C sob atmosfera de azoto durante a noite. Após arrefecimento à temperatura ambiente, verteu-se a mistura numa solução rapidamente agitada de ácido cítrico a 10¾ frio causando a formação de um precipitado branco que se recolheu e recristalizou a partir de EfcOftc para dar o produto (94 mg, 56¾) na forma de um sólido branco. A HPLC analítica [filtrex Cjg: NH4OAC 50 mM, (pH 4,5)/gradiente linear ACN: 30¾ durante 5 min., então 30-45¾ durante 10 min,; caudal de 1,0 ml/min] revelou uma razão de isómeros de 1/1. p.f. 166-16920,

71 133 4693.PG,01 -88- MS (FAB+) m/s 761 (M+H)+. 1H-RHN (BHS0-d£, 300 MHz) a 0,63-0,83 (m, 6H), 1,10-1,46 (m, 9H), 1,36 (s, 9H), 2,60-2,76 (m, 2H), 2,76-2,93 (m, 3H), 2,96-3,07 (m, 2H), 3,6S (dt, 1H), 4,27-4,52 (m, 2H), 5,38-5,47 e 6,29 (m & t, 1H), 6,9-7,08 (rn, 3H), 7,11- -7,27 (ffl, 5H), 7,29 (d, 1H), 7,49 (d, 1H), 7,72 (d, 1H), 7,79 (d, 1H), 7,95 (dd, 1H), 10,74 (s largo, 1H). Anal. calc. para c41^56w6°8- ^,51^20- C 63,95, H 7,48, N 10,92, encontrado: C 63,81, H 7,58, N 10,77.

Exemplo 38 5-f5-Indolil)propionil-Leu-fisp-Phe-NHo

Exemplo 38a M-Metoxi-M~metil-3-í5-lndolil)propionamida

Tratou-se uma solução de ácido 3-(3-indolil)propiónico (950 mg, 5,0 mmol) em 50 ml de CH2CI2 com N,0-dimetil-hidroxilami-na.HCl (580 mg, 5,9 mmol), DIEA (1,03 ml, 5,9 mmol), DCC (1,44 g, 7,0 mmol) e DMAP (300 mg, 2,4 mmol) a 02C„ Permitiu-se ã mistura reaceional aquecer até à temperatura ambiente e agitou-se durante 4 h- Removeu-se a diciclo-hexil ureia precipitada por filtração. Lavou-se o filtrado com solução aquosa de ácido cítrico a 10¾ (2x), secou-se sobre Ma2S04 e concentrou-se para dar um óleo castanho. Purificou-se o produto bruto por crornatografia flash sobre silica gel usando EtOAc/hexano (1/15-1/2, v/v) como eluentes para dar a dimetil-hidroxiamida correspondente na forma de um óleo amarelo límpido (1,14 g, 98¾). ^H-RMN (CDCI3, 60 MHz) ô 2,70-3,33 (m, 4H), 3,18 (s, 3H), 3,58 (s, 3H), 6,93-7,80 (m, 5H), 8,25 (s largo, 1H).

Exemplo 38b 3-(5-Indolil)propionii-Leu-Asp(OBn)-Phe-NHo

Adicionou-se LAH (190 mg, 5,0 mmol) a uma solução de dimetil-hidroxiamida do exemplo 38a (580 mg, 2,5 mmol) em 20 ml de THF a -402C. Deixou-se a mistura reaceional em agitação, aquecendo a -209C durante 1 h tempo ao fim do qual o íic indicou a terminação. Parou-se a reacção com MeOH (3,5 ml) e depois solução de ácido cítrico a 10¾ (50 ml) e extractou-se com CHCI3 (3x). Secaram-se os extractos combinados sobre ^2804 e

J 71 183 4693.PS.01 -89 conesntratam-se para dar um óleo castanho. Purificou-se o produto bruto por cromatografia flash sobre sílica gel, eluindo com EtOAe/hexan© (1/1 , v/v), para produzir um óleo amarelo pálido (390 mg, 91¾) que se usou imediatamente para a reaeção seguinte. Tratou-se uma solução ds Leu-Asp( OBn)-Phs-WH2-TFA (1,24 g, 2,08 mmol) em 3 ml de EtOH absoluto com TEA (0,29 ml, 2,08 mrnol) e uma solução de 3-(3-indolil)propionaldeido (0,39 g, 2,25 mmol) em 4 ml de EtOH. Aqueceu-se cuidadosamente a mistura reaccional até que se obteve uma solução homogénea. Adicionou-se ácido acético (119 ul, 2,0.8 mmol) e deixou-se a solução em agitação à temperatura ambiente durante 10 min. Adicionou-se lentamente WaBH3CM (0,26 g, 4,14 mmol) numa porção e agitou-se durante a noite à temperatura ambiente. Removeu-se o solvente sob pressão reduzida e tratou-se o resíduo com NaOH 1,0 N (25 ml) a Q2C e extractou-se com EtOAc (4x). Lavaram-se os extractos com salmoura, secaram-se sobre Na2S04, e concentraram--se para dar uma espuma branca que se purificou pelo Chromatotron sobre sílica gel (Chranatatron) eluindo com EtOH 1~6Sí/CHG13 (v/v) sm porções de 225 mg, para produzir o produto na forma de um sólido amarelo pálido (484 mg, 31,5¾). MS (FAB+) m/e 640 (M+H)+, iH-RMM (CDCI3, 300 MHz) ô 0,81-1,0 (t, 6H), 1,20-1,35 (m, 2H), 1,40-1,71 (m, 5H), 1,78-1,91 (m, 2H), 2,28-2,56 (m, 2H), 2,71- -2,83 (m, 3H), 2,88-3,10 (m, 3H), 4,50 (q, 1H), 4,62-4,73 (m, 1H), 5,10 (s, 2H), 5,31 (s, 1H), 6,13 (s, 1H), 6,95 (s, 2H), 7,03-7,41 (m, 12H), 7,60 (d, 1H), 8,06 (s, 1H), 8,13 (d, 1H).

Exemplo 58c 3-(3-IndQlil)prQpionil-Leu-Asp-Phe-iN!Ho

Tratou-se uma solução do páptido do exemplo 38b (68 mg, 0,1 mmol) em 1 ml ds MeOH com Pd 10%/C (7 mg) e agitou-se a mistura resultante durante a noite sob hidrogénio a uma atmosfera. Removeu-se o catalisador por filtração e concentrou-se o filtrado sob pressão reduzida. Triturou-se o resíduo com EtOAc quente para dar o produto (55¾). p.f. 133-136QC [α]25ρ = -24,82 (c=0,025,

MeOH), MS (DCI) m/e 550 (M+H)+, ^-H-RMN (CD3OD, 300 MHz) <3 0,82- -0,99 (m, 6H), 1,29 (s, 1H), 1,50 (s largo, 2H), 1,67 (s largo, 2H), 2,05 (s largo, 2H), 2,57 (dd, 1H), 2,71-3,01 (m, 6H), 3,13- -90-

-90- J 71 183 4693.PG.01 -3,25 (rn, 1H), 3,63-3,72 (m, 1H), 6,97-7,36 (m, 11H), 7,44-7,59 ^30^39^5^5-1?5H20: C 62,47, H 7,36, 4,53 (dd, 19, 4,71 (t, 1M), (m, 2H). fiíial. calc. para N 12,14, encontrados C 62,41, H 6,87, N 11,91.

Exemplo 59

Boc-Gly- V rCH=CHl-Trp-Leu-Asp-Phe-NH2 Exemplo 39a 4-ΓΝ-Γ t-Soclaminol-5-hidroxi-l-buteno

C A uma suspensão de peneiros moleculares em pó e secos de 4A (18 g) e PDC (45 mg, 120 mmol) em 150 ml CM2CI2 adicionou-se uma solução de 2-[N-(t-butioxicarbonil)amino]etancO, (4,83 g, 30 mmol) em CH2CI2- Deixou-se a mistura em agitação à temperatura ambiente durante 1,5 h, diluiu-se então com éter (200 ml) e filtrou-se por uma almofada de sílica gel, enxaguando continuamente com éter. Concentrou-se o filtrado para produzir um óleo amarelo pálido límpido (3,46 g, 72¾). Usou-se o aldeído imediatamente para a reacção seguinte sem purificação. A uma solução arrefecida de Boc-glicinal recentemente preparado (410 mg, 2,6 mmol) em 8 ml de THF adicionou-se lentamente brometo de vinilmagnésio 1,0 M em THF (8 ml) por meio de uma seringa. Deixou-se a mistura reaccional em agitação durante 1 h com aquecimento a -102C. Parou-se a reacção com NH4CI sat. (20 ml) e extractou-se com CHCI3 (4x). Secaram-se os extractos e concentraram-se. Purificou-se o óleo bruto por cromatografia flash sobre sílca gel, eluíndo com EtOAc/hexano (1/5~1/1, v/v) para dar um óleo amarelo pálido límpido (380 mg, 78¾). MS (DCI) rn/e 205 (Μ+ΝΗ4)+. 1H-RMN (CDCI3, 300 MHz) <S 1,45 (s, 9H), 2,54 (s largo, 1H), 3,10 (dt, 1H), 3,30-3,43 (m, 1H), 4,24 (s largo, 1H), 4,92 (s largo, 1H), 5,21 (d, 1H), 5,35 (d, 1H), 5,86 (ddd, 1H), Anal. Calc. para C9H17NO3: C 57,72, H 9,17, N 7,48. Encontrado: C 57,85, H 9,19, N 7,42.

Exemplo 39b > 4-ΓΜ-ίt-Boc)amino1-3-acetoxi-l-buteno

Tratou-se uma solução do álcool alílico do exemplo 39a (1,94 g, 10,4 mmol) em anidrido acético (22 ml, 230 mmol) com piridina (2 ml) e DMAP (50 mg) a Q2C. Aqueceu-se a mistura reaccional até

J 71 183 4693.PG.01 à temperatura ambiente, agitou-se então durante a noite. Verteu--se a mistura numa solução aquosa fria de NaHC03 e extractou-se com CHCI3 (4x). Secaram-se os extractos sobre Na2S04 e eoneentrararn-se. Purificou-se o óleo bruto por cromatografia flash sobre sílica gel, eluindo com EtGAc/Hexano (1/10-1/3, v/v), para ciar o produto na forma de um óleo incolor (1,92 g, 81¾). MS (DCI) m/e 247 (M+NH4)+, ^-H-RMN (CDCI3, 300 MHz) Ô 1,45 (s, 9H), 2,10 (s, 3H), 3,28 (dt, 1H), 3,43 (dt, 1H), 4,72 (s largo, 1H), 5,26 (d, 1H), 5,32 (d, 1H), 5,78 (ddd, 1H).

Exemplo 39c 4-acetoxi-5-Γ N-(t-8oc)ami no1-2-(5-i ndolenometi1)-trans-2-penteno-ato de benzilo

Tratou-se uma solução do composto do exemplo 39b (1,15 g, 5,02 mmol) em 60 ml de acetona com OSO4 (5 ml de sol 2,5¾ em t--BuOH) e N-óxido de M-metilmorfolina (1,48 g, 10,9 mmol) à temperatura ambiente. Após agitação durante 5 min., adicionou-se uma solução de NaIQ4 (5,0 g, 23,4 mmol) em 37 ml de Η2° à mistura reaccional e deixou-se em agitação ã temperatura ambiente durante 3,5 h. Verteu-se a mistura em água (60 ml) e extractou-se com CHCI3 (4x). Secaram-se os extractos sobre Na2S04 e concentraram--se. Purificou-se o produto bruto por cromatografia flash sobre sílica gel, eluindo com EtOAc/hexano (1/3-2/1, v/v), para dar um óleo amarelo pálido (1,02 g, 88¾). Uma solução do aldeído recentemente preparado (1,02 g, 4,41 mmol) e fosforano do exemplo 32a (4,80 g, 8,9 mmol) em 22 ml de CH2Cl2 agitou-se à temperatura ambiente durante a noite. Evaporou-se o solvente e purificou-se o óleo bruto por cromatografia flash sobre sílica gel, eluindo com EtOfic/Hexano (1/10-1/3, v/v), para dar o produto na forma de um óleo amarelo pálido (1,74 g, 80¾). MS (DCI) m/e 510 (M+NH4)+, iH-RMM (CDCI3, 300 MHz) <5 1,40 (s, 9H), 2,04 (s, 3H), 3,32 (t, 2H), 3,94 (s, 2H), 4,66 (s largo, 1H), 5,12 (s, 2H), 5,72 (dt, 1H), 6,67 (d, 1H), 6,97 (s, 1H), 7,10 (t, 1H), 7,14-7,22 (m, 3H), 7,24-7,30 (m, 3H), 7,33 (d, 1H), 7,64 (d, 1H), 8,0 (s, 1H).

J 71 183 4693.PS,01

-92-

Exemplo 39d 4-hidraxi~5~FN-(t-Boc)amino1-2-(5-inàolenometill-trans-2--pentenoato de benzilo A uma solução do composto do exemplo 39c (1,51 g, 3,06 mmol) em 75 ml de MeOH adicionou-se Na2CQ3 (26,0 g) e agitou-se à temperatura ambiente durante 1 h. Removeu-se o Wa2C03 por filtração, enxaguando continuamente com CH2CI2- Verteu-se o filtrado em NH4CI aquoso saturado (100 ml), separaram-se as fases e extractou-se a fase aquosa adicionalmente com CHCI3 (3x). Secaram-se os extractos sobre Na2SC>4 e concentraram-se. Purificou-se o óleo bruto por cronatografia flash sobre sílica gel, eluindo com EtOAc/hexano ¢1/5-1/1, v/v), para dar o produto na forma de um óleo amarelo pálido (1,03 g, 75%). MS (FAB) m/e

Exemplo 39e 4-bromo-5-rN.-ít-Boc)aminol-2-(5-indolenometil )-trans~2-pentenoato de benzilo

Tratou-se uma solução de CBí-4 (5,50 g, 16,6 mmol) em 72 ml de THF com PPhj (4,12 g, 15,7 mmol) a 02C e deixou-ss em agitação durante 15 min. Adicionou-se uma solução do composto do exemplo 39d em 10 ml de THF ao complexo anterior por mexo de uma seringa. Agitou-se a mistura reaccional durante 2 h com aquecimento até à temperatura ambiente e então verteu-se numa solução fria de ácido cítrico a 10% (150 ml) e extractuou-se com CMGI3 (4x). Lavaram-se os extractos combinados com tiossulfato de sódio aquoso a 10% (2x). Tornou-se a extrair a fase aquosa do tiossulfato com CHCI3 (2x), combinaram-se os extractos, secaram-se sobre Na2304 e concentraram-se. Purificou-se o óleo bruto por cromatografia flash sobre sílica gel, eluindo com EtOAc/hexano (1/5-1/1, v/v), para dar o produto na forma de um óleo amarelo (0,75 g, 71%). MS (DCI) m/e 532.530 (M+H)+, ÍH-RMN (CDCI3, 300 MHz) Ô 1,42 (s, 9H), -93- 71 163 4693-PS-01

Exemplo 59f 4-br omo-5-ΓΜ-ί t-Boc )amino~|-2-(5-indolenometil l-trans-2-Dentenoato de benzilo

Tratou-se uma solução do composto do exemplo 39e (0,75 g, 1,46 mmol) em, 36 ml de ácido acético glacial com pó de zinco (3,8 g) e agitou-se à temperatura ambiente durante 50 min. Diluiu-se a mistura com Et20 (590 ml) e removeu-se o pó de zinco por filtração e enxaguou-se continuamente com Efc20- Lavou-se o filtrado com M2O (2x) s lavaram—se os sxtracfos aquosos novamente com Et20l·! (2x). Lavou—se a fase orgânica com salmoura, secou—se sobre Na2SG4 e concentrou-se. Purificou-se o óleo bruto por cromatografia flash sobre sílica gel, eluindo com EtOAc/hexano (l/5~l/3, v/v), para dar o produto na forma de um óleo incolor (0,61 g, 97¾). MS (DCI) m/e 452 (M-í-MH^)'5', m/e calculada para C26H3GN2°4: 435,2284, encontrado: 435,2280, 1h-RMN (CDCI3, 300 MHz) <3 1,44 (s, 9H), 2,99 (dd, 1H), 3,25 (dd, 1H), 3,48 (q, 1H), 3,68 (t largo, 2H), 4,40 (s largo, 1H), 5,05 (s, 2H), 5,51 (dt, J=6 e 15Hz, 1H), 5,73 (dd, J=8 e 15Μζ, 1H), 6,89 (s, 1H), 7,11 (t, 1H), 7,14-7,22 (m, 3H), 7,26-7,32 (m, 3H), 7,34 (d, IH), 7,56 (d, 1H), 7,96 (s, 1H).

Exemplo 39a

Boc-QlvΨ ΓCH=CH1-Trp-0H A um suspensão de Pd 10%/C (380 mg) em 1,4-ciclo-hexadieno (16,4 ml) adicionou-se uma solução do composto do exemplo 39f (380 mg, 0,87 mmol) em 17 ml de MeOH e agitou-se & temperatura ambiente durante 5 h. Removeu-se o catalisador por filtração e concentrou—se o filtrado sob pressão reduzida. Retomou-se o resíduo oleoso em Et20 (20 ml) e lavou-se com NaOlí 0,5 N (5 x 20 ml). Lavaram-se novamente as fases aquosas com Efc2Q (2 x 2b ml), Lavaram—se os extractos orgânicos combinados com salmoura, secaram-se sobre Nâ2S04, e concentraram-se para recuperar o

J 71 183 4693.PB,01 -94 substrato de partida não reagido (277 mg, 73¾). Acidificaram-se os extractos aquosos com HC1 2M frio (30 ml) até que se atingiu pH 2, então extractou-se com EtOfte (4 x 100 ml). Lavaram-se estes extractos com salmoura, secaram-se sobre Ν®2304 e concentraram-se para dar o produto na forma de um óleo amarelo (43 mg, 14¾). MS (FAB) m/e 345 (M+H)+, (CDCI3, 300 MH2) <31,44 (s, 954), 2,99 (dd, 1H), 3,26 (dd, 1H), 3,43 (t, 1H), 3,68 (s largo, 214), 4,48 (s largo, 1H), 5,54 (dt, J=5 e 15Hz, 114), 5,71 (dd, J=ll e 15l4z, 1H), 6,99 (s, 1H), 7,11 (t, 1H), 7,19 (t, 1H), 7,34 (d, 1H), 7,58 (d, íH), 8,07 (s, 1H).

Exemplo 59h Éster de Boc-SIy- VΓCH=CHl-Trp-2,4.5-triclorofenol

Utilizou-se o mesmo procedimento que se descreveu no exemplo 32d para obter o éster activo desejado com rendimento de 63¾ a partir do composto do exemplo 39. MS m/e 522, 524 (M+), (CDCI3, 300 MHz) <3 1,46 (s, 9H), 3,12 (dd, 1H), 3,40 (dd, 1H), 3,65-3,81 (m, 1H), 4,50 (s largo, 1H), 5,67 (dt, J=5 e 15Hz, 1H), 5,83 (dd, J=8 e 15Hz, 1H), 6,89 (s, 1H), 7,07 (s, 1H), 7,15 (t, 1H), 7,22 (t, 1H), 7,38 (d, 1H), 7,49 (s, 1H), 7,61 (d, 1H), 8,10 (s, 1H).

Exemplo 59i

Boc-Qly- y rCH=CH1-Trp-Lsu-Asp-Pfoe-Nfíl·?

Utilizou-se o mesmo procedimento que se descreveu no exemplo 34c para obter o produto com rendimento de 59¾ a partir do composto do exemplo 39h. p.f. 194-196ÔC, MS (DCI) m/e 719 (M+H)+, m/e calo, para C3QH5QM4OQ: 719,3768, encontrado: 719,3749, -H--RHN (CD3OD, 300 MHz) <3 0,62 (dd, 3H), 0,84 (dd, 3H), 1,15-1,23 (rn, 1H), 1,35-1,57 (m, 2H), 1,42 (d, 9H), 2,50-2,84 (m, 2H), 2,84-

-3,01 (m, 2H), 3,08-3,28 (m, 2H), 3,35-3,48 (m, 1H), 3,59 (dd, 2H), 4,18-4,29 (m, 1H), 4,48-4,59 (m, 214), 5,47-5,80 (m, 2S4), 6,94-7,03 (m, 2H), 7,06 (t, 114), 7,12-7,27 (m, 5H), 7,30 (d, 1H), 7,54 (d, 1H), Anal. Cale. para C38!45oM6Os. 1,5M2°“ C 71,17, H 7,18, N 11,27, encontrado: C 61,33, 54 7,05, N 11,18. 71 183 4693.PS.01 -95-

Exemplo 40

Boc-Trp-Leu-ftsp-Phs-QCH-^

Dissolveu-se Z-Leu-ftsp-Phe-OCHg [Agarwal, K. L. Kenner, G. W., and Sheppard, R.C. J- Chem. Soc. (C) 1968 1384-1391), (3 g, 5,5 mmol), em 30 ml de MeOH e 10 ml de HCO2H a 88¾, então adicionaram-se 0,5 g de Pd(0H) 20% húmido e 3 gotas de NH4OH concentrado. Após agitação durante 12 h à fcemp. ambiente, filtrou-se a mistura, lavou-se o filtrante com MeOH e H2O, e concentrou-se o filtrado sob pressão reduzida. Lavou-se o resíduo em 40 ml de H2O duas vezes com CH2CI2, uma vez com EtOAc, então ajustou-se a solução aquosa a pH 6 com NH4OH concentrado. Arrefeceu-se a solução sobre gelo, e recolheu-se o precipitado (0,72 g) e lavou-se com EtOH. A concentração das águas mães e a recristalização do resíduo a partir de EtOH produziram um adicional de 0,31 g de produto. Adicionou-se uma solução de 0,6 g (1,48 mmol) do tripéptido em 3 ml de DHF contendo 5 gotas de H2O a uma solução do anidrido misto preparado a partir de Boe-Trp-GH (450 mg, 1,48 mmol), cloroformato de isoòutilo (191 ul, 201 mg, 1,48 mmol), e M-metilmorfolina (163 μΐ, 150 mg, 1,48 mmol) em THF a -15ôc, seguido de Netg (205 p.1, 150 mg, 1,48 mmol). Permitiu-se à mistura aquecer até à temperatura ambiente e agitou-se durante 18 h, então concentrou-se a pressão reduzida. Submeteu—se o resíduo a partição entre EtOAc e KHSO4 aq. dil-, e extractou-se a fase aquosa separada com uma porção fresca de EtOAc,. Lavaram-se as fases orgânicas combinadas sucessivamente com H2O e salmoura, secaram-se então (MgSO^;) e concentraram-se. Cromatografou-se o resíduo sobre sílica gel, eluindo com CHCls/MeOH/HOAc (96=2:2, depois 94=3:3). Combinaram-se as fracções puras e concentraram--se, e cristalizou-se o resíduo a partir de Et20/hexano para produzir 390 mg do produto puro: p.f. 164-1672C (decomp.). 1h-RMN (DMS0-d6): <3 0,85 (t, J=6 Hz, 6H)s 1,30 (s, 9H ); 1,43 (m, 2H); 1,63 (m, 1H); 2,5 (m, 1Η)ϊ 2,65 (dd, J=4,5, 16 Hz, 1H); 2,85-3,0 (m, 3H); 3,08 (dd, J=4,5, 15 Hz, 1H); 3,56 (s, 3H); 4,21 (m, 1H); 4,30-4,48 (m, 2H); 4,57 (m, 1H); 6,82 (d, J=8 Hz, 1H); 6,96 (t, J=7,5 Hz); 7,05 (i, J=7,5 Hz, 1H); 7,31 (s, 1H); 7,16-7,35 (cm, 6H); 7,58 (d, J=7,5 Hz, 1H); 7,92 (d, J=7,5 Hz); 8,18 (m, 2H);

J 71 133 4693.PG.01 -96- 10,77 (s, 1H). MS (FAB4*): m/e 694 (M+H)+; 594 (M+H-Boc)+. Anal. cale. para C36H47W5O9,0,5 H2O: C 61,50; H 6,39; N 9,97, Encontrado; c 61,39; H 6,77; N 9,96.

Exemplo 41

Ctp-Ls u-Asp-Ph e-MHMHo

Exemplo 41a Boc—Fhe-NÍ-jHÍ-i—Z ft uma solução de Boc-Phe-OH (3,0 g, 11,2 mmol) e Z-NHNH2-HCI (Boeshagen, H. and Ullrich, J. Chem. Ber., 1959, 92, 1478-80) (2,3 g, 11,2 mmol) em 100 ml de DMF a G2C adicionaram-se diisopropiletilamina (1,95 ml, 1,45 g, 11,2 mmol) seguido de 2--etoxi-l-etoxicarbonil-l,2-di-hidroquinolina (2,77 9, 11,2 mmol). Removeu-se o banho de gelo e deixou-se a solução agitar durante 46 h. e então evaporou-se o solvente sob pressão reduzida. Retomou-se o resíduo em EtOAc e lavou-se sucessivamente com KHSO4 1M, H2O, NaHCOj aq. sat., e salmoura, secou-se (^2804) e evaporou-se para dar 4,0 g de uma espuma. A recristalização a partir de EtOAc/hexano produziu 3,2 g (86¾) de produto cristalino branco: p,f. 114-115,520. 5-H-RMM (DMSO): ô 1,27 (s, 9H), 2,76 (d largo, J=12 Hz, 1H), 2,97 (d largo, J=12 Hz, 1H), 4,18 (m, 1H), 5,09 (s largo, 2H), 7,01 £d largo, J=9 Hz, 1H), 7,15-7,40 (cm, 10H), 9,29 (s, 1H), 9,95 (s, 1H), MS (EI) m/e 413 (M+), 357 (í'i- —C4H8)+. Anal. calc. para C92H97M3O5: C 63,89; H 6,58; N 10,1/. Encontrado: C 63,86; H 6,54; N 9,99.

Exemplo 41b Boc-Aspí Bn)—Phe—ΜΗΝΗ—Z N-desprotegeu-se o produto do exemplo 41a (2,7 g, 13,0 mmol) com CF3CQ2H/CH2CI2 1=1 durante 1 h da maneira usual. Dissolveu-se o sal bruto, obtido a partir da evaporação dos componentes voláteis, em 20 ml de DMF, arrefeceu-se sobre gelo seco, e adicionou-se a uma solução do anidrido misto preparado da maneira usual a partir de Boc-Asp(Bn)—0H (1,96 g, 6,06 mmol), M— -metilmorfolina (667 μα, 0,61 g, 6,06 mmol) e cloroformato de isobutilo (786 u.1, 0,83 g, 6,06 mmol) em 40 ml de THF a -Í5QC. Após adição de diisopropiletilamina (1,06 ml, 0,78 g, 6,06 mmol). deixou-se a mistura aquecer até â temp. ambiente e agitar durante a noite. Concentrou-se a mistura reaccional sob pressão reduzida, e retomou-se o resíduo em EtOAc e lavou-se com KHSGu U, MJ - 3l

NaHC03 aq. sat., e salmoura, secou-se (Wa2S0^) e evaporou-se par dar 3,8 g de sólido amarelo claro, que se recristalizou a partir de EtOAc/hexano para produzir 3,0 g (80¾) de solido cristalino (FAB+) 1 ^ p.f. 140-1412C. 1-8—RI MN (DHSQ-dé)- Ô 1, 30 (s. 98), 2, / r· ÕO 1=4 ,5 82 , J2=15 8z, 18) , 2,82 (m, 18) 'SJ- Ϊ 02 (d largo, 3= 16 8), 4,33 (m, 18) 4 ,52 (m, 18), 5,08 (d, 3=5 8z , 28), f > 10 58) , 7,9 0 (d, 3= 7,5 8z, 18), 9,32 (s, 18) 1, 9,99 (s, í B 1 *». ríj, MS 1 - m / e 619 (M+H )+, 563 , 519, 429, 327. Anal» cale, para SN4O 8-h2° : C 62, 23; 8 6 ,01; N 8,80. E ncontrado: C 62, •7Λ » -^5 8 N 8 y p- y = (dd,

Exemolo 41c

Boc-Leu-AspfBn)-Phe-NHNH-Z N-desprotegeu-se o produto do exemplo 41b (430 mg, 0,69 mmol) com CF3CO2H/CH2CI2 1-1 durante 1 h. Após evaporação dos componentes voláteis, retomou-se o resíduo em Et20 e tratou-se com HC1 4N/dioxano para precipitar 246 mg do produto na forma do sal hidr©cloreto. Tratou-se uma solução de 203 mg (0,36 mmol) do sal anterior em 2 ml de DMF a 0QC com éster de Boe-Leu-M- -hidroxissuccinimida (148 mg, 0,47 mmol) e diisopropiletilamina (69 5.11, 51 mg, 0,40 mmol), então permitiu-se à mistura aquecer até à temperatura ambiente e agitar durante 12 h» Concentrou-se a solução, então diluiu-se com EtOAc e lavou-se com K8SG4 1M, 8p0,

Qar 27

NaHCOg aq. sat., e salmoura, secou-se (802804) e evaporou-se para mg de sólido amarelo» A trituração com Et20 produziu 191 ífiCi (73¾) de produto na forma de um sólido branco, p.f 122,5- ‘124,59c, 1h-RMW (DM80-<%): Ô 0,85 ( m, 6H), 1,3b (m, 118, inclui 1H ) s, 914), 1,57 (m, 1!4), 2,55 (rn, 18), 2,78 (m, 28), 3,0 (m, 14), 4,48 (m, 18), 4,65 (m, 18), 5,07 (s, 28), 5,08 .9 f l ffi.

Ojj ), 6,90 (d, J=9 8z, 18), 7,15-7,43 (cm, 15 8), 8,05 (rn, ^,32 (s, 18), 9,94 (s, 18). MS (FAB+): 754 (M+Na)+, 732 (M+H)+, 632, 566, 542, 510, 363, 319.

J 71 1S3 4693.PQ.01 -98-

Exemplo 41d Cfcp-Lsu-Asp-Phe-NHNHg A uma solução de HC1.H-l_eu-Asp(Bn)-Phe-WHMH-Z (100 mg, 0, mmol, obtido por desprotecção do produto do exemplo 41c com HCl/dioxano da maneira usual), Cfcp-QH (38 mg, 0,15 mmol), e N--metilmorfolina (20 m.1, 18 mg, 0,18 mmol) em 2 ml de DMF a Οχ**-' sob Np adicionou-se difenilfosforilazida (DPPA) (39 μ.1, 50 mg? 0,18 mmol). Permitiu-se à reacçao prosseguir durante 18 h a 02C e à temp. ambiente durante 2,5 dias. Adicionaram-se DPPA e NMM adicionais em alíquotas até que o consumo do componente amina se completou, depois do que se precipitou o produto por adição de HgO, e se recolheu por filtração para produzir 120 mg de pó de cor castanha amarelada. Cromatografou-se o produto bruto sobre sílica gel eluindo com MeGH/CHClg (3^97, depois 5:95) para produzir 75 mg (60¾) de produto. MS (FAB*): m/e 880 (N+Na)+, 858 (M+H)*. Agitou-se um total de 57 mg do material anterior em 2 ml de DMF com 25 mg de Pd 5¾ sobre BaS04 sob uma atmosfera de hidrogénio durante 1,5 h à temperatura ambiente, então filtrou-se & mistura e concentrou-se. Purificou-se o produto bruto por HPLC preparativa (Dynamax Cj_g, eluiçao com CH3CN/NH3 aq, a 0,05¾ num gradiente linear de 10¾ a 40% em CH3CM durante 30 min.). A combinação e liofilização das fracções consideradas puras por HPLC analítica produziram 11 mg do produto, p.f. ca. 2G52C (d). ^H-RMN (DMS0-d6): 6 0,85 (t, J=7 Hz, 6H), 1,45 (m, 2H), 1,62 (m, 1H), 2,4 (m, ocultado pelo solvente), 2,8 (dd, J=9 Hz e 15 Hz, 1H), 2,95 (m), 3,0-3,7 [ocultado pelo HDD, o espectro repetido em pre sença de DC1 mostra para esta região 2,7 (dd, J=ó e 18 Hz, 1H), 2,90 (m, IH), 2,98 (m, 1H), 3,25 (m, 1H), 3,37 (m, 1H)], 4,20 (m, 2H), 4,33 (m, 1H), 4,47 (m, 1H), 6,75 (d, J=7,5 Hz, 1H), 6,90- -7,05 (cm, 3H), 7,10-7,30 (cm, 8H), 8,05-8,30 (cm, 3H, inclui 8,04, d, J=7,5 Hz), 9,22 (s, 1H), 10,94 (s, 15-1). MS (FA8+)í m/e 634 (M 4- H)+, 602, 455, 340, 227.

Exemplo 42

Boc—Trp—Leu-Asp-Trp—NHo

Reuniu-se a resina de Boc-irp-Leu-Asp(fenacil)-Phe-0- 71 183 4693,PG.01 99-

-poliestireno utilizando um sintetizatíor de péptidos na fase sólida Sioseareh SAP! 2 automático, iniciando com 1,50 g de resina de Boc-Trp-0 (0,26 mmol/g, poliestireno 1% reticulado, 200-400 retículos) usando o seguinte protocolo: dois ciclos de desb1oqueamen to (CF3CO2H/CH2CI2/anisolo/fosfito di metilico, 50:45,5:2,5:2)? dois ciclos alternando lavagem com CH2CI2 e lavagem com DMF? dois ciclos de lavagem com base (diisopropileti-lamina a 10¾ em CH2OI7)? um único acoplamento de 1 h de Boc— -aminoácido (3,5 vezes em excesso, concentração de 0,4 M em CH2CI2), activado por mistura preparada com uma quantidade equimolar de diisopropilcarbodiimida 0,4 M em DMF; passo de terminação com acetilimidazolo 0,3 M em DMF. Todos os reagentes e materiais estavem comercialmente disponíveis excepto o Boc--ftsp(fenacil)-0H (Yang, C. C. and Merrifield, R, B, J. Org. Che, 1976, 41, 1032-1041). Rodou-se suavemente a resina do péptido bruto em presença de 10 ml de benzenosselenol 2 M em DMF durante 72 h sob M2, atmosfera de azoto, então filtrou-se a resina e lavou-se três vezes com porções frescas de DMF, três vezes com CH2CI2, secou-se então sob pressão reduzida. Utilizando um recipiente de pressão, partiu-se o péptido a partir da resina por âiDonólise à temperatura ambiente durante 72 h com 2,2,2-trifluo-roetanol saturado a -202C com amónia gasosa, para produzir 59 mg de péptido bruto. A resina recuperada sujeitou-se novamente ãs condições anteriores para proporcionar um adicional de 62 mg do péptido bruto. Purificaram-se as fracções combinadas do péptido bruto por HPLC preparativa (Dynamax C1g, eluição com CM3CN/MH3 aq. a 0,1%, gradiente de 10¾ a 40¾ de CH3CN durante 30 minutos), Combinaram-se as fracções puras e liofilizaram-se para produzir 69 mg de produto puro, p.f. 186-1912C. -H-RMN (DMS0-d&): ô 0,82

(m, 1H), 2,41 (dd, J=6Hz e 16 Hz, 1H), 2,56 (parcialmente ocultado pelo pico do solvente), 2,84-3,2 (cm, 6M), 4,21 (m, 1H),

i i

71 183 4693,FQ,01 -100- (s, 1H) , 10,92 (s, 1H). HS (FAB): rn/s 716 642, 586, 412, 341 - Análise dos aminoácidos (hidrólise em presença de ácido tioglieólieo): Leu, 1,0; Trp, 1,76; ftsp, 0,81.

Exemplo 45

Boc-T rp-Leu-Asp-Cha-NHg

Exemplo 45a HC1 fisp-Cha-HHg

Hidrogenou-se uma solução de CCKg* Asp-Phe-NH? (500 mg, 1,79 rnmol) em HOAc (83 ml) e MCI 2M (17 ml) sobre Pt preta (100 rng) durante 2,25 h à temp. ambiente e 4 atm. Filtrou-se a mistura e evaporou-se à secura para produzir 590 mg de produto, (DMS0-d6): <3 0,89 (m, 2H), 1,16 (m, 3H), 1,35 (m, lí-1), 1,50 (m, 2H), 1,65 (m, 5H), 2,75 (dd, J=S e 18 Hz, 1H), 2,91 (dd, J=4,5 e 5 Hz, 1H), 4,10 (m, 1H), 4,23 (m, 1H), 7,05 (s, 1H), 7,38 (s, 1H), 8,58 (d, J=*7,5 Hz, 1H). HS (FAB+): m/e 286 (M+H)+, 269, 241,

Exemplo 43b

Boc-Trp-Leu-Asp-Cha-NHo

Formou-se o anidro misto a partir de Boc-Trp-Leu-QH (372 mg, 0,89 mmol) e cloroformato ds isobutilo em 4 ml de THF a -1520 da maneira usual, então adicionou-se uma solução pré-arrefecida de HC1.H—Asp—Cha—NHg (286 mg, 0,89 mmol) e NEt^ (246 μ.1, 1,76 mmol) em 6 ml de DMF. Agitou-se a mistura a -152C durante 20 min., então removeu-se o banho de arrefecimento e continuou-se a agitação durante 90 min. adicionais. Concentrou-se a mistura reaccional, precipitou-se o produto por adição de H2O e KKSO4 aq. sat., recolheu-se por filtração, lavou-se com H2O, e secou-se eei vácuo sobre PgQg, p-f. 195-1972C. [ei]D= -44,2 (c=G,5, DMF). 1^- -RMN (DMSO-dé): d 0,85 (t, J=7 Hz, 6H), 1,05-1,75 (cm, 25 H, inclui 1,28 [s, Boc]), 2,50 (ÍH, mais o solvente), 2,75 (dd, j=g e 16 Hz, 1H), 2,90 (dd, J=8 e 15 Hz, 1H), 3,07 (dd, J=4 a 14 Hz, 1H), 4,19 (m, 2H), 4,35 (m, 1H), 4,53 (q, J=7 Hz, 1H), 6,81 (d3 J=8 Hz, 1H), 6,95 (t, J=7 Hz, 1H), 7,04 (m, 2H), 7,10 (s, 1H), 7,15 (s, 1H), 7,30 (d, J=3 Hz, 1H), 7,57 (d, J=8 Hz, 1H), 7,76 (d, J=9 Hz, 1H), 7,92 (d, J=8 Hz, 1H), 8,34 (d, J=7,5 Hz, 1H). MS (FAB+): m/e 685 585, 171= Cale. para C35H52N6O3: C 61,37;

J 71 183 4693.PG.01

-101- H 7,66; N 12,28. Encontrado: C 61,15; H 7,62; N! 12,15.

Exemplo 44

Boc-T r p-Leu-Asp~0-Nal-NHq

Exemplo 44a Boc-B-Nal-NHq

Preparou-se o produto com rendimento de 96¾ por reacção de anidrido misto do Boc-0-Nal-OH (682 mg, 2,17 mmol) com NH4OH conc. de acordo com o procedimento de Rzeszotarska, B., Makowski, M., and Kubica, Z. Qrg. Prep. Proc. Int. 1984, 16, 136-139. lf-i--RMN (CDCI3): 6 1,40 (s, 9H), 3,24 (m, 2H), 4,47 (m, 1H), 5,10 (s largo, 1H), 5,37 (s largo, 1H), 5,75 (s largo, 1H), 7,49 (dd, J=2 Hz e 9 Hz, 1H), 7,47 (m, 2H), 7,69 (s, 1H), 7,80 (m, 3H). MS (DCI): m/e 315 (M+H)+, 259, 215.

Exemplo 44b HCl.Asp(Bn)-B-Nal-NHo N-desprotegeu-se o produto do exemplo 44a (700 mg, 2,23 mmol) com HC1 4N/dioxano da maneira usual. Formou-se o anidrido misto a partir de Boc-Asp(Bn)-OH (720 mg, 2,23 mmol) e cloroformato de isobutilo a -152C em THF da maneira usual, então adicionou-se uma solução pré-arrefecida do sal da amina e uma quantidade equimolar de NEt3 em DMF. Agitou-se a mistura reaccional durante 30 min. a -1520, depois removeu-se o banho de arrefecimento e continuou-se a agitação. Após várias horas, concentrou-se a mistura reaccional, precipitou-se o produto bruto por adição de H2O e KHSO4 aq. sat. e recolheu-se por filtração, então secou-se sob vácuo para obter 900 mg de produto bruto que se N-desprotegeu com HC1 4N/dioxano da maneira usual. A trituração do sal bruto com Et20/hexano proporcionou o sal puro. iH-RMN (DMS0-d6): <3 2,83 (dd, J=9 e 17 Hz, 1H), 2,99 (m, 2H),

3H), 8,73 (d, J=9 Hz, 1H). MS (DCI): m/e 420 (M+H)+, 329, 312, 286, 260, 243, 217, 195, 178.

J 71 183 4693.PG.G1

-102-

Exemplo 44c

Boc-T rp-Leu-fisp( Bn)-£-Nal-NHo

Formou-se o anidrido misto a partir de Boc-Trp-Leu-OH (459 mg, 1,1 mmol) e cloroformato de isobutilo a -152C em THF da maneira usual, então adicionou-se uma solução pré-arrefecida do produto do exemplo 44b (500 mg, 1,1 mmol) e uma quantidade equimolar de NEt3 em DMF. Agitou-se a mistura reaccional durante 30 min. a -152C, então removeu-se o banho de arrefecimento e continuou-se a agitação durante 1 h. Concentrou-se a mistura reaccional, então submeteu-se a partição entre EtOAc e KHSO4 aq. dil. Extratou-se a fase aquosa separada com uma porção fresca de EtOAc, lavaram-se então os extractos orgânicos combinados com H2O, NaHC03 aq. sat., H2O e salmoura, então secaram-se (Na2S04>, filtraram-se e evaporaram-se para produzir 770 mg de produto bruto. A recristalização a partir de EtOH/SH^O produziu 660 mg (73¾) de produto puro, 1H-RMN (DMSO-d^): <5 0,81 (m, 6H), 1,12 (s largo), 1,29 (s, 9H), 1,39 (m, 2H), 1,60 (m, 1H), 2,62 (dd, J=8 e 17 Hz, 1H), 2,80 (dd, J=7 Hz e 16 Hz, 1H), 2,90 (dd, J=10 e 14 Hz, 1H), 3,05 (m, 2H), 3,17 (dd, J=4 e 17 Hz), 4,22 (m, 1H), 4,32 (m, 1H), 4,48 (m, 1H), 4,61 (m, 1H), 5,06 (s, 2H), 6,87 (d, J=8

(s, 1H). MS (FAB+): m/e 831, 819 (M+H)+, 803, 746, 719, 701, 505, 420, 375, 344, 300.

Exemplo 44d

Boc-T rp-Leu-Asp-g-Nal-NHp

Agitou-se o produto do exemplo 44c (300 mg, 0,37 mmol) em DMF sob uma atmosfera de H2 em presença de 75 mg de Pd 5%-C até o desaparecimento do material de partida se ter completado por TLC. Removeu-se o catalisador por filtração e concentrou-se o filtrado. Cromatografou-se o resíduo duas vezes sobre sílica gel, eluindo com EtOAc/S2 9:1 (S2=Me0H/H0ftc/H20 8:1:1), combinaram-se as fracções puras e concentraram-se a um volume pequeno de HOAc,

71 183 4693«Ρβ.01 então adicionou-se H2O para precipitar 105 mg do produto, p.f. 205ÇC (dec.). 1H-RMN (DMS0-d6): <5 0,80 (m, 6H), 1,23-1,50 (cm, 11H, inclui 1,30,, s, 9H), 1,57 (m, 1H), 2,50 (1H, ocultado pelo solvente), 2,67 (dd, J=7,5 e 13,5 Hz, 1H), 2,90 (m, 1H), 3,11 (m, 2H), 3,20 (dd, J=4 é 11,5 Hz, 1H), 4,21 (rn, 1H), 4,33 (m, 1H); 4,50 (m, 2H), 6,81 (d, J=2,5 Hz, 1H), 6,95 (t, J=6 Hz, 1H), 7,04 (t, J=ó Hz, 1H), 7,10 (s, 1H), 7,17 (s, 1H), 7,31 (m, 2H), 7,38 (d, J=7 Hz, 1H), 7,45 (m, 3H), 7,57 (d, J=7 Hz, 1H), 7,70 (s, 1H), 7,78 (d, J=7 Hz, 1H), 7,84 (m, 2H), 7,90 (m, 1H), 8,29 (m, 1H), 10,76 (s, 1H), 12,4 (s largo, 1H). MS (DCI): m/e 729 (M+H)+, 712, 685, 629, 611, 430. Anal. calc. para C39H48M6O8.0,3 HOAc: 0 63,61; H 6,64; N 11,23. Encontrado: C 63,95; H 6,77; H 10,90.

Exemplo 45

Boc-Trp-Leu-Asp-oc-Nal-NHo

Exemplo 45a Boc-ct-Nal-NHg

Da mesma maneira que se descreveu no exemplo 44a, preparou--se o composto do titulo a partir de Boc-(0-l~naftil)alanina (682 mg, 2,17 mmol) com rendimento de 98¾. ^H-RMN (CDCI3): Ô 1,40 (s, 9H), 3,52 (m, 2H), 4,52 (m, 1H), 5,20 (s largo, 1H), 5,26 (s largo, 1H), 5,46 (s largo, 1H), 7,38 (m, 2H), 7,55 (m, 2H), 7,28

(d, J=8 Hz, 1H), 7,38 (d, J=8 Hz, 1H), 8,20 (d, J=8 Hz, 1H). MS (DCI): 315 (M+H)+, 215.

Exemplo 45b CF3COOH-AspfBnl-a-Nal-NHo

Da mesma maneira que se descreveu no exemplo 44b, desprotegeu-se o produto do exemplo 45a (700 mg, 2,23 mmol) e acoplou-se ao 8oc-Asp(Bn)-0H para produzir 950 mg de dipéptido protegido bruto, o qual se N-desprotegeu com CF3COOH/CH2CI2 1=1 para fornecer o sal do título. ^H-RMN (DMSO-d^): 6 2,83 (dd, J=9 e 18 Hz, 1H), 3,03 (dd, J=4 e 17 Hz, 1H), 3,27 (dd, J=10 e 15 Hz, 1H), 3,53 (dd, J=6 e 14 Hz), 4,09 (dd, J=4 e 9 Hz, 1H), 4,61 (m, 1H), 5,16 (d, J=2 Hz, 2H), 7,22 (s, 1H), 7,40 (m, 6H), 7,55 (m, 3H), 7,82 (d, J=7,5 Hz, 1H), 7,93 (d, J=7,5 Hz, 1H), 8,15 (s largo, 3H), 8,29 (d, J=8 Hz, 1H), 8,82 (d, J=8 Hz, 1H). MS (DCI):

J 71 183 4693.PG.01

-104 m/e 420 (M+H)+, 329, 312, 286, 260, 243, 217, 195, 178.

Exemplo 45c

Boc-T rρ-Leu-Asp(Bnl-g-Nal-MHo

Da mesma maneira que se descreveu no exemplo 44c converteu--se o produto do exemplo 45b (1,1 mmol) no composto do título. Com tratamento da mistura reaccional concentrada com H2O e KHSO4 aq. sat., precipitou-se o produto na forma de um sólido (750 mg) e recristalizou-se para produzir 630 mg (70¾) do produto puro.

(s, 1H). MS (FAB+): m/e 831, 819 (M+H)+, 803, 746, 719, 701, 505, 420, 375, 344, 319, 300.

Exemplo 45d

Boc-T r p-Leu-Aso-ot-Mal -MH2

Hidrogenolizou-se o produto do exemplo 45c (100 mg, 0,12 mmol) como se descreveu no exemplo 44d> Purificou-se o produto bruto por cromatografia sobre sílica gel, eluindo com EtOfic/Sl 6=1 (SI = piridina/H0Ac/H20 20:11:6). Combinaram-se as fracções puras e concentraram-se a um volume pequeno, então adicionou—se H2O para precipitar 63 mg (71¾) do produto, p.f. 2132C (decomp.) 1H-RMN (DMSO—d^): ô 0,84 (m, 6H), 1,30 (m, 11H, inclui 1,30, s, 9H), 1,60 (m, 1H), 2,45 (1H, ocultado pelo solvente), 2,67 (dd, J=7 e 16,5 Hz, 1H): 2,90 (m, 1H), 3,08 (dd, J=4 e 14 Hz, 1H), 3,25 (m, parcialmente ocultado pela H2O), 3,59 (m, 1H), 4,20 (m,

8,27 (d, J=7,5 Hz, 1H), 10,77 (s, 1H). MS (FAB+): 729 (M+H)+, -105- -105-

71 183 4693.ΡΘ,01

713, 629, 611, 596. Anal., calc. para C39H4gN^0g.0,3 HOAc = C 63,61, H 6,64, N 11,23. Encontrado s C 63,90, H 6,76, W 11,18.

Exemplo 46

Boc-Trp-Pro-Asp~Phe-NH2

Exemplo 46a

Soc-Pro-Aspf Bn)-Phe-NHg

Acoplou-se o Boc-Pro-OH (189 mg, 0,85 mmol) a TFA.ftsp(Bn)--Phe-NH2 (425 mg, 0,88 mmol) utilizando o processo do DCC/HOBt ern THF da maneira usual para fornecer após elaboração, 469 mg do produto bruto. A recristalização a partir de EtOAc forneceu 326 mg (65¾) do produto na forma de um sólido branco. ^H-RMN (DMS0--d^) (2 confórmeros , 1,5 = 1): <$ 1,28 (s, 5,4, H), 1,38 (s, 3,6H), 1,71 (m, 3H), 2,0 (m, 1H), 2,58 (d, J=7,5 Hz, 0,4H), 2,63 (d, J=7,5 Hz, 0,6 H), 2,80 (m, 2H), 3,02 (m, 1H), 3,25 (1H, ocultado pela H20), 4,05 (m, 1H), 4,39 (m, 1H), 4,60 (m, 1H), 5,07 (s, 2H), 7,20 (m, 7H), 7,35 (m, 5H), 7,74 (d, J=8 Hz, 0,4 H), 7,86 (d, J=7,5 Hz, 0,6H), 8,14 (d, J=7,5 Hz. 0,6 H), 8,24 (d, J=7,5 Hz, 0,4H). MS (EI): m/e 566 (M+), 522, 465, 458, 402, 385, 358, 314.

Exemplo 46b

Boc-Trp-Pro-Asp-Phe-NHg N-desprotegeu-se o produto do exemplo 46a com HC1 4N/dioxano da maneira usual. Neutralizou-se o sal hidrocloreto resultante (177 mg, 0,35 mmol) em DMF a 02C com N-metilmorfolina (38 pl, 0,35 mmol), então tratou-se com uma solução do anidrido simétrico formado a partir de Boc-Trp-OH (322 mg, 1,06 mmol) e DCC (109 mg, 0,53 mmol) em CH2CI2- Após agitação a 02C durante 68 h, tratou-se a mistura com várias gotas de l-(2-aminoetil)piperazina, então concentrou-se. Submeteu-se o resíduo a partição entre EtOAc e KHSO4 aq. dil., e extractou-se a fase aquosa separada, duas vezes, com porções frescas de EtOAc, então lavaram-se os extractos orgânicos combinados com H20, NaHC03 aq. sat., H20 e salmoura, então secou-se (Na2S04), filtrou-se e evaporou-se para dar 330 mg de produto bruto. Cromatografia sobre sílica gel, eluindo com EtOAc/hexano/HOftc 83:17:2, depois EtOftc/HOfic 98:2,

71 183 4693.PQ.01 produziu 281 mg de produto puro que se hidrogenolizou em MeOH sobre 100 mg de Pd(0H)2 20%~C durante 0,5 h. Filtrou-se e concentrou-se a mistura, cromatografou-se o resíduo sobre sílica gel, eluindo com EtOAc/S2 85=15 (S2 = Me0H/H0Ac/H20 8=1=1).

Combinaram-se as fracções puras e concentraram-se a 240 mg, que se recristalizaram a partir de EtOM/H20 para fornecer 174 mg do produto na forma de um sólido branco, p.f. 155,5-1572C (decomp.). ^H-RMN (DMSO-d^) (2 confdrmerós , 4 = 1) conformeror maioritáriq.: <5 1,30 (s, 9H), 1,7-2,1 (cm, 4H), 2,48 (1H, ocultado pelo solvente), 2,67 (dd, J=6 e 16 Hz, 1H), 2,84-3,16 (cm, 4H), 3,55 (m, 2H), 4,27-4,51 (cm, 4H), 6,92-7,10 (m, 3H), 7,15-7,28 (m, 7H), 7,35 (d, J=7,5 Hz, 1H), 7,52 (d, J=7,5 Hz, 1H), 7,81 (d, J=8 Hz, 1H), 8,18 (d, J=7,5 Hz, 1H), 10,83 (s, 1H). MS (FA8+)= m/e 663 (M+H)+, 647, 563, 377. Anal. calc. para C34H42N6O8-0,5 H20= C 60,78, H 6,46, N 12,51. Encontrado: C 60,90, H 6,44, N 12,46.

Exemplo 47

Boc-Trp-Tpp-Asp-Phe-NH2 Exemplo 47a

Boc-Tpp-AspfBn)-Phe-NH2

Acoplou-se Boc-Tpp-0H (65 mg, 0,25 mmol) a TFA.Asp(Bn)-Phe--NH2 (244 mg, 0,5 mmol) pelo procedimento do DCC/HQBt em THF da maneira usual. Após terminação da reacção, tratou-se a mistura com várias gotas de KHSO4 aq. sat., filtrou-se, e diluiu-se o filtrado com EtOAc e lavou-se com KHSO4 aq. sat., H2O, NaHCQ3 aq. sat., H20, e salmoura, então secou-se (Wa2S04), filtrou-se e evaporou-se para fornecer 180 mg de produto bruto. Purificou-se o produto sobre sílica gel (chromatotron, prato de 1 mm) eluindo com MeOH 2%/CHCl3 para fornecer 105 mg (72¾) de produto puro. 1H-RMN (CDCI3): <S 0,93 (t, J=7 Hz, 3H), 1,24-1,6 (cm, 14H, inclui 1,45, s, 9H), 2,0 (m, 1H), 2,19 (m, 1H), 2,75 (dd, J=6 e 18 Hz, 1H), 2,94-3,21 (cm, 2H),. 3,37 (m, 1H), 3,47 (dd, J=4,5 e 15 Hz, 1H), 3,58 (m, 1H), 3,77 (d, J=7 Hz, 1H), 4,57 (m, 1H), 4,75 (m, 1H), 4,91 (d, J=12 Hz, 1H), 5,08 (d, J=12 Hz, 1H>, 5,30 (s largo, 1H), 6,70 (s largo, 1H), 7,12-7,43 (cm, 10 H), 7,50 (d, J=7 Hz, 1H), 7,58 (d, J=7,5 Hz, 1H). MS (DEI/DIP): m/e 609 (M+H)+, 507,

J 71 183 4693.PG.01

-107 464, 445, 400, 356, 212.

Exemplo 47b

Boc-Trp-Tpp-AspfBnVPhe-NHo N-desprotegeu-se o produto do exemplo 47a (101 mg, 0,17 mmol) com CF3CO2H/CH2CI2 1;1 da maneira usual. Tratou—se o sal resultante em 3 ml de DMF a 02C com uma solução de anidrido simétrico preparado a partir de Boc-Trp-0H (155 mg, 0,51 mmol) e DCC (53 mg, 0,26 mmol) em 5 ml de CH2CI2 a 02C, seguido por adição de NEti~Pr2 (78 m.1, 0,45 mmol). Removeu-se o solvente sob pressão reduzida (banho de ar) e agitou-se a solução durante 1 h a 02C, e então deixou-se aquecer até à temp. ambiente. Concentrou-se a solução, e dissolveu-se o resíduo em EtOftc, depois lavou-se com KHSO4 aq. sat., H2O, MaHC03 aq. sat_, H2O, e salmoura, então secou-se (Wa2S04), filtrou—se e evaporou—se. Cromatografou-se o produto bruto sobre sílica gel, eluindo com EtOAc/hexano (10=1, depois 7:1), depois EtOAc, para produzir 112 mg (83¾) de produto puro. ÍH-RíIN (CDCI3): Ô 0,89 (t, J=4,5 Hz, 3H), 1,15-1,35 (cm, 5H), 1,41 (s, 9H, ombro a 1,38), 1,83 (m, 1H), 1,98 (m, 1H), 2,64 (dd, J=5 e 3,5 Hz, 1H), 2,81 (dd, J=3 e 10 Hz, 1H), 2,98 (m, 1H), 3,15 (m, 3H), 3,44 (dd, J=2 e 9 Hz,

Exemplo 47c

Boc-Trp-Tpp-Asp-PheT-NHg

Agitou-se o produto do exemplo 47b (105 mg, 0,13 mmol) em 1,5 ml de MeOH sob uma atmosfera de H2 na presença de Pd 5%;/C durante 2,5 h, então filtrou-se a mistura através de celite e concentrou-se o filtrado, Cromatografou-se o resíduo sobre sílica gel, eluindo com EtOAc/S2 9:1 (S2 = Me0H/H0ftc/H20 8:1:1) para produzir 63 mg de produto, p.f. 145-1472C. [a]25jj= -30,12 (c=0,5, DMF), iH-RMN (DMS0-d6): <5 0,85 (m, 3H), 1,05-1,40 (cm, 14 H,

J 71 183

4693.PG.01 -108-

Hz, 1H), 10,87 (s largo, 1H). MS (FAB+): m/e 727 (M+Na)+ 705 (M+H)+, 689, 605, 587, 419. Anal. calo. para 037843^08-0,5 82O: C 62,24; H 6,92; N 11,77. Encontrado: C 62,37; H 6,83; N 11,52.

Exemplo 48 Ctp-Tpp-Asp-Phe-NIHp

Exemplo 48a

Ctp-Tpp-Asp(BnVPhe-NHo N-desprotegeu-ss o produto do exemplo 47a (68 mg, 0,11 mmol) como se descreveu no exemplo 47a. Dissolveram—se o sal resultante e Ctp-OH (0,12 mmol) em CH2CI2/DMF 1:1 e tratou-se a 02C com diisopropiletilamina (57 ul, 0,33 mmol) e B0P-C1 (31 mg, 0,12 mmol). Manteve-se a solução a 42C durante 69 h, adicionou-se mais Βορ-Cl, e deixou-se continuar a reacção à mesma temperatura durante 48 h adicionais, então concentrou-se a mistura. Dissolveu-se o resíduo em EtQftc, lavou-se com KHSO4 aq. sat., H2O, NaHCOj aq. sat., H2O, e salmoura, depois secou-se (^2804), filtrou-se e evaporou-se o filtrado para produzir 66 mg de produto bruto. Purificou-se este material por cromatografia sobre sílica gel, eluindo com CHCl3/MeQH (98:2, depois 90:10), para produzir 38 mg (47¾) de produto puro. HRMS Cale. para (M+H)+= C41H47N6O7: m/e 735,3506. Encontrado: 735,3507.

Exemplo 48b Ctp-Tpp-Asp-Phe-NHo

Agitou-se o produto do exemplo 48a (36 mg, 0,049 mmol) em MeOH sob uma atmosfera de H2 em presença de Pd 5%/BaS04 durante 0,5 h, após o que o TLC mostrou o consumo completo do material de partida. Filtrou-se a mistura através de celite, concentrou-se o filtrado, e cromatografou-se o resíduo sobre sílica gel, eluindo com EtOAc/Sl 3:1 (SI = piridina/H^O/HOftc 20:11=6) para produzir 29 mg de produto puro, p.f. 1922C (dec). ^H-RMN (DMS0-d^): 6 0,88

71 183 4693.PG.01 -109- (m, 3H), 1,25 (m, 4H), 1,55 (largo, 1H), 2,05 (m, 2H), 2,22 (m, 2H), 2,80 (dd, 3=10 e 14 Hz, 1H), 3,12 (dd, J=4 e 14 Hz, 1H), 3,20-3,72 (cm, 5H), 3,87 (m, 1H), 3,93 (d, J=4 Hz, 1H), 4,08 (m, 1H), 4,22 (m, 1H), 4,58 (m, 1H), 6,77 (m, 1H), 6,95 (m, 3H), 7,10-7,25 (cm, 7H), 11,0 (s largo, 1H). HRHS: Cale. para (M+H)+= C34H41N6O7: 645,3037. Encontrado: 645,3036.

Exemplo 49

Boc-oc-Mal-Leu-Asp-Phe-MHo

Acoplou-se Boc-cc-Nal-GH (200 mg, 0,63 mmol) a TFft.Leu--ftsp(Bn)-Phe-NH2 (376 mg, 0,63 mmol) pelo processo do anidrido misto da maneira normal utilizando cloroformato de isobutilo como agente activante. Após a terminação da reacção, concentrou-se a mistura, e fez-se precipitar o produto bruto (390 mg) por adição de KHSO4 aq. dil.. Agitou-se uma solução de 150 mg deste produto em DMF sob uma atmosfera de H2 em presença de Pd 5%-C até que se completou por TLC, o consumo do material de partida. Filtrou-se a mistura, concentrou-se o filtrado, e cromatografou-se o residuo sobre sílica gel, eluindo com EtOAc/SÍ 6=1» Combinaram-se as fraeções puras e concentraram-se a um volume pequeno, então adicionou-se água e recolheu-se o produto precipitado (120 mg) por filtração e secou-se em vácuo, p.f. 231SC (dec). ^H-RMN (DMS0-d6): <S 0,87 (m, 6H), 1,24 (s, 9H), 1,44 (m, 2H), 1,65 (m, 1H), 2,48 (1H, ocultado pelo solvente), 2,70 (dd, 3=6 e 20 Hz, 1H), 2,85 (dd, 3=9 e 14 Hz, 1H), 3,05 (dd, 3=4,5 e 14 Hz, 1H), 3,15 (dd, 3=10 e 14 Hz, 1H), 3,53 (dd, 3=4 e 14 Hz, 1H), 4,35 (m, 3H), 4,52 (m, 1H), 7,05 (d, J=9 Hz, 1H), 7,15-7,32 (cm, 7H), 7,40 (m, 2H), 7,53 (m, 2H), 7,77 (m, 1H), 7,90 (m, 3H), 8,15 (d, J=8

Hz, 1H), 8,30 (d, J=7,5 Hz, 1H). MS (FAB+): m/e 690 (M+H)+, 674,

590, 307. Cale. para C37H47N5O3.0,5 H2O: C 63,57, H 6,93, N 10,03. Encontrado: c 63,64; H 6,70; N 9,69.

Exemplo 50

Boc-B—Hal-Leu-Asp-Phe-NH?

Com um procedimento análogo ao descrito no exemplo 49, acoplou-se Boc-B-Mal-0H (200 mg, 0,63 mmol) a TFA.Leu-Asp(Bn)-~Phe-NH2 para produzir 430 mg do tetrapéptido protegido bruto na

71 183 4693.PG.01

-110- forma de um sólido. A hidrogenólise de ISO mg deste produto seguida de elaboração e purificação como no exemplo 49 produziu 73 mg do composto do titulo, p.f. 2042C (dec). ^H-RMN (DMSO-d^):

(FAB+): m/e 690 (M+H)+, 674, 590, 575, 307. Anal. calc. para C37H47N5O8.H2O: C 62,77; H 6,98; N 9,90. Encontrado: C 62,40; H 6,55; N 9,58,

Exemplo 51

Boc-T r ρ-Le u-Asp-5(S)-benzil-2-oxo-4-piperazina

Exemplo 51a Z-Phe-alilamida

Sob uma atmosfera de azoto, dissolveu-se Z-Phe-OH (1,00 g, 3,35 mmol) em 10 ml de cloreto de metileno anidro contendo mono--hidrato de l-hidroxibenzotriazolo (0,57 g, 3,69 mmol) e hidrocloreto de l-(3-dimetilaminopropil)-etilcarbodiimida (0,71 g, 3,69 mmol) e agitou-se à temperatura de um banho de gelo durante 1,5 h. Adicionou-se alilamina (0,19 g, 3,35 mmol) e agitou-se a solução a 02C durante 5 h e então deixou-se aquecer até à temperatura ambiente durante a noite. Evaporou-se o solvente, e dissolveu-se o residuo em acetato de etilo e lavou-se com KHSO4 aq. sat., H2O, NaHC03 aq. sat., H2O, e salmoura, anteriormente a secagem e evaporação, fi recristalização a partir de acetato de etilo/hexano produziu 0,56 g (50¾) do produto sólido branco: ^-H—RMN (CDCI3): <3 3,03 (dd, J=15 e 7,5 Hz, 1H), 3,14 (dd, J=15 e 7,5Hz, 1H), 3,76-3,82 (m, 2H), 4,33-4,42 (m, 1H), 4,96- -5,08 (m, 2H), 5,10 (s, 2H), 5,33 (s largo, 1H), 5,59-5,74 (m, 2H), 7,15-7,40 (m, 10H), MS (DCI) m/e 356 (M+NH4)+, 339 (M+H)+.

Exemplo 51b 3(S)-Benzil-4-benziloxicarbonil-5-hidroxi-2-oxo-4-piperazina A uma solução agitada do produto do exemplo 51a (376 mg, 1,1

J 71 183 4693.Ρ6.01

-111-mmol) em 27 ml de CH3CN/H2O (2^1) à temperatura ambiente adicionou-se N-óxido de 4-metilmorfolina (180 mg, 1,3 mmol) e tetróxido de ósrnio (2,5¾ em t-butanol, 2,9 mg, 0,01 mmol). Após 5 min., adicionou-se periodato de sódio (949 mg, 4,4 mmol) e agitou-se a mistura à temperatura ambiente durante 3,5 h. Removeu-se o acetonitrilo em vácuo e a solução aquosa resultante extraiu-se com acetato de etilo. Lavou-se a fase orgânica separada com KHSO4 aq. sat-, H2O, NaHC03 aq. sat., H2O, e salmoura anteriormente a secagem. Após evaporação do solvente, purificou-se o material bruto por cromatografia flash sobre sílica gel, eluindo com metanol 2%/clorofórmio para produzir 212 mg (56¾) do lacto!: ^-H-RMN (CDCI3): <3 3,02-3,17 (m, 2H), 4,06--4,19 (m, 2H), 4,43-4,55 (m, 1H), 5,09 (s, 2H), 5,30 (s largo, 1H), 6,47 (s largo, 1H), 7,16-7,39 (m, 10H), MS (DCI): m/e 358 (M+NH4)+, 341 (M+H)+, 316, 299.

Exemplo 51c 5/S)-Benzil-2-oxopiperazina

Agitou-se o produto do exemplo 51b (183 mg, 0,54 mmol) em MeOH sob uma atmosfera de H2 (4 atm) na presença de paládio a 10¾ em carvão activado (183 mg) à temperatura ambiente durante a noite. A remoção do catalisador por filtração seguida da evaporação do solvente deu 77 mg (75¾) de produto bruto, A purificação por cromatografia flash sobre silica gel eluindo com MeOH 3VCHC13 produziu 26 mg (25¾) da piperazina: iH-RMM (DMS0-

7,13-7,32 (m, 5H), 7,64 (s largo, 1H). MS (DCI): m/e 208 (M+NH4)+, 191 (M+H)+.

Exemplo 51d

Boc~Aspf Bn)-5fS)-benzil-2-oxo-4--piperazina

Arrefeceu-se à temperatura dum banho de gelo uma solução de Boc-Asp(Bn)-0H (476 mg, 1,47 mmol) em 4 ml de CH2CI2 anidro sob uma atmosfera de azoto e adicionou-se hidrocloreto de l-(3--dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (142 mg, 0,74 mmol). Após 40 min adicionou-se a solução directamente a uma solução pré--arrefecida do produto do exemplo 51c (128 mg, 0,67 mmol) em 2 ml

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de dimetilformamida anidra à temperatura do banho de gelo. Agitou-se a mistura reaccional a 02C durante 3 h e à temperatura ambiente durante 48 h. Removeram-se os solventes em vácuo, então dissolveu-se o resíduo em acetato de etilo e lavou-se com KHSO4 aq. sat., H2O. NaHCOs aq. sat., H2O, e salmoura. Após secagem e evaporação do solvente, purificou-se o material bruto por cromatografia flash sobre sílica gel eluindo com acetona 43%/hexano produzindo-se 213 mg (64¾) de produto: 1h-RMN (CDCI3) 3,02-3,17 (m, 2H), 4,06-4,19 (m, 2H), 4,43-4,55 (m, 1H), 5,09 (s, 2H), 5,30 (s largo, 1H), 6,47 (s largo, 1H), 7,16-7,39 (m, 10H). MS (DCI): m/e 358 (M+NH4)+, 341 (M+H)+, 316, 299.

Exemplo 51e

Boc-Leu-AspfBnV3(S)-benzil-2-oxo-4-piperazina

Tratou-se o produto do exemplo 51d (182 mg, 0,37 mmol) com uma solução de HC1 4,5 M/dioxano (3 ml) durante 1 h à temperatura ambiente após o que se removeu o solvente em vácuo para dar um resíduo espumoso, ftdicionou-se repetidamente éter dietílico ao resíduo e evaporou-se, deixando o dipéptido desprotegido na forma de um sólido castanho amarelado que então se empregou no subsequente passo de acoplamento sem purificação. Arrefeceu-se uma solução de mono-hidrato de Boc-Leu-OH (203 mg, 0,81 mmol) em 3 ml de DMF/CH2CI2 anidro 1:10 sob uma atmosfera de azoto, num banho de gelo e adicionou-se EDCI. Após 40 min adicionou-se a solução directamente a uma solução pré-arrefecida do sal de HC1 anterior (160 mg, 0,37 mmol) em 1 ml de DMF anidro â temperatura do banho de gelo. Adicionou-se então trietilamina (0,052 ml, 0,37 mmol) e agitou-se a reacção durante 3 h a 02C e deixou-se aquecer até à temperatura ambiente durante a noite. Removeram-se os solventes em vácuo e dissolveu-se o resíduo em acetato de etilo e lavou-se com KHSO4 aq. sat., H2O, NaHCO^ aq. sat., H2O e salmoura. Após secagem e evaporação do solvente purificou-se o material bruto por cromatografia flash sobre sílica gel eluindo com MeQH 3SÍ/CHCI3 para produzir 195 mg (86¾) do tripéptido protegido: ^H-RMN (CDCI3): <5 0,85-1,00 (m, 6H), 1,46 (s, 9H),

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10H). MS (DCI): m/e 626 (M+NH4)+, 609 (M+H)+, 509, 419, 381, 231, 131.

Exemplo 51f

Boc-Tr p-L.eu-Asp(Bn1-5(S1-benzil-2-oxo-4-piperazi na

Dssprotegeu-se o produto do exemplo 51e (173 mg, 0,28 mmol) com HC1 4N/dioxano da maneira usual. A uma solução agitada do sal resultante (152 mg, 0,28 mmol) em 1,8 ml de DMF anidro sob atmosfera de azoto à temperatura ambiente adicionou-se N,N--diisopropiletilamina (0,049 ml, 0,28 mmol) e éster de

Boc-Trp-N-hidroxissuccinimida (124 mg, 0,31 mmol). Agitou-se a mistura durante 48 h, então evaporou-se o solvente e dissolveu—se o resíduo em acetato de etilo e lavou-se com solução saturada de hidrogenossulfato de potássio, água, solução saturada de bicarbonato de sódio, e salmoura. Após secagem e evaporação do solvente, purificou-se o material bruto por cromatografia flash sobre sílica gel eluindo com ácido acético/acetato de etilo/hexano (3=25:72, depois 3=50=47) para produzir 188 mg (84¾) do tetra péptido: ^H-RMN (CDCI3) <5 0,74-0,89 (m, 6H), 1,45 (s,

(m, 1H), 8,67-8,80 (m, 1H). MS (FAB+)= m/e, 795 (M+H)+, 779, 695, 678, 605, 505, 489, 396.

Exemplo 51g

Boc-Trp-Leu~fisp-5(S)-benziI-2-oxo-4—piperazina A uma suspensão agitada de Pd 10Ss-C (32 mg) à temperatura ambiente em 3 ml de ácido fórmico IQ^metanol sob atmosfera de azoto adicionou-se o produto do exemplo 51f (76 mg, 0,096 mmol). Após 24 h, filtrou-se a mistura utilizando metanol para enxaguar. Sujeitou-se o material bruto a cromatografia flash (eluição com EtOAc/Sl 9=1) seguida de purificação RP-HPLC (caudal: 14 ml/min, gradiente linear de 20 a 55¾ de CH3CN/H2O durante 40 min). Combinaram-se as fracções puras e liofilizaram-se duas vezes, rendendo 13 mg (19¾) de produto puro isolado na forma do tri-

71 183 4693„PG.01 ί> -114- -hidrato. iH-RMN (DMS0-d6): <5 0,78-0,95 (m, 6H), 1,12-1,72 (m, 3H), 2,19-3,30 (m, 10H), 3,79-3,90 (m, 1H), 4,12-4,52 (m, 3H), 4,69-4,76 (m, 1H), 4,86-5,05 (m, 1H), 6,72 (s largo, 1H), 6,92- -7,34 (m, 8H), 7,53-7,62 (m, 1H), 7,88-7,98 (m, 1H), 8,08 (s largo, 1H), 8,47-8,62 (m, 1H), 10,82-10,97 (m, 1H). MS (FAB+): rn/e 705 (M+l)+, 605, 185, 130, 93. Anal, calo, para C37H48N6O3.3 H20: C 58,52; H 7,17; H 11,07. Encontrado: C 58,49; H 6,52; N 10,90; [0^24^5= +8,372 (c=0,105 , MeOH).

Exemplo 52

Ctp-Tpp-Asp-C MMe)Phe-NHp Exemplo 52a l-Acetil-5-hidroxi-5-n-propilpirrolidina~2,2-dicarboxiIato_de dietilo

Dissolveu-se sódio (3,48 g, 0,15 mol) numa solução agitada de acetamidomalonato de dietilo (201,6 g, 0,93 mol) em etanol anidro (1200 ml) à temperatura ambiente sob azoto. Arrefeceu-se a mistura reaccional a 02C e então adicionou-se trans-2-hexenal (100,0 g, 1,02 mol) gota a gota. Deixou-se a mistura resultante aquecer até à temperatura ambiente. Após agitação durante 3 h a 232C, parou-se a reacção com 24 ml de ácido acético. Concentrou--se a solução em vácuo e retomou-se o resíduo resultante em EtOAc e lavou-se com NaHC03 aquoso saturado (2x) e salmoura. Secou-se sobre MgS04, a concentração e recristalização do resíduo a partir de EtOAc/hexano deram 271,4 g (93¾) do produto na forma de agulhas finas, p.f. 105-10Ó2C. TLC, Rf= 0,43 (9:1 CHCl3/MeOH). MS (Cl) m/e 316 (M+l)+, 298 (MH-H20)+. l-H-RMN (CD3OD, 300 MHz) <5 0,94 (t, J=7,2 Hz. 3H), 1,47-1,11 (m, 9H), 1,90-1,78 (m, 1H), 1,94 (dd, J=12,8, 5,2 Hz, 1H), 2,08 (dd, J=12,8, 6,4 Hz, 1H), 2,21 (s, 3H), 2,83 (m, 1H), 4,10-4,26 (m, 4H), 5,64 (d, J=5,2 Hz, 1H). IV (CDCI3) 3460, 1750, 1665 cm-^- Anal. calc. para C15H25N06: c 57,13; H 7,99; N 4,44. Encontrado: C 57,28; H 8,08; N 4,42.

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Exemplo 52b l-Acetil-5-n~propilpirrolidina-2,2-dicarboxilato de dietilo A uma solução de l-acetil~5-hidroxi-3-propilpirrolitíina-2,2~ -dicarboxilato de dietilo (271,0 g, 0,86 mol) e trietilsilano (206 ml, 1,29 mol) em CH2C12 (3 1) adicionou-se ácido trifluoroacético (663 ml, 8,6 mol) gota a gota com agitação enquanto sé controlava a temperatura interna a 25—309C por meio de um banho de gelo. Após agitação durante 3 h a 232c, concentrou-se a solução em vácuo e diluiu-se o resíduo com CH2C12 © lavou—se com solução aquosa saturada de NaHC03 até que todo o TFA se neutralise. Secou-se a fase orgânica (Na2S04) e concentrou-se para dar 350 g de óleo. 0 produto oleoso contendo impurezas de silício usou-se directamente no passo subsequente. Obteve-se uma amostra analiticamente pura na forma de um óleo após crornatografia flash (1:2 -> 1:1 EtOAc/hexano). TLC, Rf= 0,55 (9:1 CHCl3/MeOH). MS(CI) m/e 300 (M+H)+. IV (CDCI3) 1745, 1655 cm-1. !h-RMN (CDCI3, 300 MHz) <5 0,89-93 (t, J=7,0 Hz, 3H), 1,15-1,42

(m, 9H), 1,70-1,85 (m, 2H), 2,01-2,16 (m, 4H), 2,40-2,51 (m, 1H), 3,57 (ddd, J=10,7, 9,6, 6,2 Hz, 1H), 3,76 (’dts, J=9,6, 1,1 Hz, 1H), 4,17-4,28 (m, 4H). Anal. calc. para C15H25N05: C 60,18; H 8,42; N 4,68. Encontrado: C 59,90; H 8,34; N 4,65.

Exemplo 52c

Hidrocloretos de trans- s cis-5-n-propilprolina

Suspendeu-se o éster bruto do exemplo 52b (350 g) em HC1 6 N (2 1) e ácido acético (500 ml) e aqueceu-se ao refluxo durante 17 h. Extractou-se a mistura reaccional com EtOAc (2x) e concentrou--se a fase aquosa num evaporador rotatório. Triturou-se então o resíduo com éter para cristalizar o produto. Recolheu-se o sólido por filtração, lavou-se com éter e secou-se num forno a vácuo para dar 152,3 g do sal hidrocloreto. Obteve-se uma amostra analiticamente pura por recristalização a partir de acetona/éter. p.f. 131-1332C. TLC, Rf= 0,26 (10=4:1 CHCl3/Me0H/NH40H). IV (KBr) 3420, 1735 cm-1. MS(CI) m/e 158 (base livre MH+). 1H-RMN (D20, 300 MHz) isómero maioritário: <S 0,91 (t, J=7,2 Hz, 3H), 1,18-1,50 (m, 3H), 1,68-1,90 (m, 2H), 2,16-2,32 (m, 1H), 2,43-2,50 (m, 1H), 3,29-3,58 (m, 2H), 3,93 (d, J=7,4 Hz, 1H); isómero minoritário: <5

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J=8,l Hz. 1H). Anal. calc. para C8H16N02C1: C 49,61; H 8,33; N 7,23. Encontrado: C 49,35; H 8,17; N 7,18.

Exemplo 52d

Meti1-N-terc-butoxicarboni1-3-n-propilproli na

Dissolveu-se ó sal hidrocloreto do exemplo 52c (152,3 g) em MeOH (1,5 1) e carregou-se a solução com HC1 gasoso até esta ficar saturada. Após agitação durante a noite, concentrou-se a mistura reaccional para dar um óleo. Este retomou-se em HC1 1 N e extractou-se com EtOfic (2x). Basificou-se cuidadosamente a fase aquosa com K2CO3 e extractou-se exaustivmente com CHCI3. Secaram-se as fases orgânicas combinadas (MgS04), filtraram-se e concentraram-se para dar 122 g de óleo. TLC, Rf~ 0,70 CHCl3/Me0H/NH40H 90:10:0,1). MS (Cl) m/e 272 (M+H)+. iH-RMN parcial (CDCI3, 300 MHz) Isómero maioritârio : <S 3,36 (d, J=6,3 Hz, 1H), 3,74 (s, 3H). Isómero minoritário: ô 3,72 (s, 3H), 3,83 (d, J=8,l Hz, 1H). Retomou-se o óleo (122 g) em MeOH (1 1) e então adicionaram-se lentamente NaHC03 (180 g) e dicarbonato de di-t-butilo (171,4 g, 0,79 mol). Após agitação durante a noite a 232C, filtrou-se a mistura e concentrou-se o filtrado. Triturou--se o residuo com EtOAc, filtrou-se novamente e concentrou-se para dar 186,1 g de óleo na forma de uma mistura dos isómeros cis e trans. TLC, Rf= 0,31 (EtOAc/hexano 1:6). IV (CDCI3) 1700, 1745 cm-1. MS (Cl) m/e 272 (M+H)+. iH-RMN parcial (CDCI3, 300 MHz) isómero Cis (2 confórnuerosi): <5 0,91 (t, J=7,0 Hz, 3H), 3,71 (s, 1,8H), 3,72 (s, 1,2H), 4,23 (d, J=8,5 Hz, 0,6H), 4,32 (d, J=8,l Hz, 0,4H), Isómero trans (2 confórmeróSd ) = <S 0,92 (t, J=7,0 Hz, 3H), 1,06-1,78 (m, 14H), 1,92-2,03 (m, 1H), 2,13-2,25 (m, 1H),

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Exemplo 52e N-t-Boc-trans~3-n-propiIprolina e Metil-„N-t-Boc-cis-3-n-propil~ prolina A uma solução dos ésteres do exemplo 52d (186,0 g, 0,685 mol), em MeOH (685 ml) adicionou-se NaOH 1 N (685 ml) a 232C. Após agitação durante 20 h, concentrou-se a solução para remover o MeOH e então èxtractou-se com EtOAc (3x). Secaram-se os extractos (MgS04), filtraram-se e concentraram-se para dar 71,4 g (38¾) do éster cij^TLC, Rf= 0,54 (EtOAc/hexano 1:4). IV (CDCI3) 1745, 1700 cm-1./ alta resolução (Cl) m/e 272,1869 ((M+H)+, para C14H20NO4, calc. 272,1862). ^H-RMN (CDCI3, 300 MHz) isómero Cis (2 confórmerõs -)“ <5 0,91 (t, J=7,0 Hz, 3H), 1,07-1,20 (m, 1H), 1,23-1,45 (m, 12H), 1,64-1,78 (m, 1H), 1,90-2,12 (m, 1H), 2,25-2,41 (m, 1H), 3,25-3,34 (m, 1H), 3,56-3,68 (m, 1H), 3,71 (s, 1,8H), 3,72 (s, 1,2H), 4,23 (d, J=8,5Hz. 0,6H), 4,32 (d, J=8,l

Hz. 0,4H). Acidificou-se a fase aquosa com ácido cítrico sólido e extractou-se duas vezes com EtOAc. Lavou-se o extracto combinado com H2O e salmoura, secou-se (MgS04), filtrou-se e concentrou-se a 94,2 g (53¾) do ácido trans. TLC, Rf= 0,45 (CHCl3/MeOH 9:1). IV

(CDCI3) 3050, 1720, 1690 cr1. MS (Cl) m/e 258 (M+H)+. 1H-RMN (CDCI3, 300 MHz) 2 conformeros:: Ó 0,93 (m, 3H), 1,28-1,69 (m, 14H), 1,97-2,12 (m, 1H), 2,30 (m, G,4H), 2,50 (m, 0,6H), 3,34--3,64 (m, 2H), 3,84 (d largo, J=6,2 Hz. 0,4H), 3,98 (d largo, J=4,4 Hz, 0,6H). Anal calc. para C13H23NO4: C 60,68; H 9,01; N 5,44. Encontrado: c 60,66; H 8,91; N 5,44.

Exemplo 52f {S)-metilbenzilamidas de N-terc-butoxicarbonil-trans-3-n-propil-prolina A uma solução do ácido trans do exemplo 52e (94,2 g, 0,37 mol), (S)-(-)metilbenzilamina (44,8 g, 0,37 mol) e hidrato de 1--hidroxibenzotriazolo (54,4 g, 0,40 mol) em CH2CI2 (1 1) adicionou-se l-etil-3-(3-dimetilamino - propil)-carbodiimida.HCl (76,9 g, 0,40 mol) sob azoto a G2C, Após agitação durante a noite a 232C, diluiu-se a mistura reaccional com EtOAc, lavou-se com ácido cítrico aquoso a 10¾, NaHCQ3 aquoso saturado e salmoura,

J 71 183 4693.P601 então secou-se sobre MgS04, filtrou-se e concentrou-se. Dissolveu-se o resíduo numa quantidade mínima de éter e o isómero S (em relação à prolina), cristalizou preferencialmente após repouso (34,0 g, 90¾ do isómero S). Concentraram-se as águas mães e cromatografou-se o resíduo resultante sobre sílica gel usando EtOftc 35%/hexano como eluente para dar 46,5 g do isómero R (35%, contém <5% de isómero S), 6,9 g de mistura e 16,3 g de isómero S (90% isómero S). Combinaram-se os 34,0 g de isómero S 90% puro, os 6,9 g de mistura e os 16,3 g de isómero S 90% puro e recristalizaram-se três vezes a partir de éter/hexano para dar um total de 40,2 g (30%) de isómero S (99% + puro). Alternativamente, a mistura pode também ser separada por HPLC com recuperação de cerca de 80%. Isómeros S: p.f. 112-114QC (Et20/hexano). TLC, Rf=0,39 (EtOAc:hexano=l:2). [α]23ρ= -56,32 (c=0,75, MeOH). iH-RMN (300 MHz, DMSQ-d6, 1382C) Ô 0,88 (t largo, J=7,0 Hz, 3H), 1,40 (s, 9H), 1,43 (d, J=7,1Hz, 3H), 1,25-1,55 (m, 5H), 1,97 (m, 1H), 2,14 (m, 1H), 3,30-3,55 (m, 2H), 3,77 (d, J=5,l Hz, 1H), 4,99 (q, J=7,lHz, 1H), 7,65-7,15 (m, 5H). MS (Cl) m/e 361 (MH+, base),

305, 261, 112. Anal. Cale. para C21H32N2O3: C 69,97; H 8,95; N 7,77*, encontrado: C 69,99; H 9,05; N 7,73. isómero R: p.f. 104-1052C (Et20/Hexano). TLC Rf=0,45 (EtOAc:Hexano=l: 2 ) ). [a]D=-65,82 (c=0,76, MeOH). Í-H-RMN (300 MHz, DMS0-d6, 1382C) Ô 0,91 (t largo, J=7,0 Hz, 3H), 1,36 (s, 9H), 1,28-1,42 (m, 3H), 1,43 (d, J=7,l

Hz, 3H), 1,45-1,58 (m, 2H), 2,00 (m, 1H), 2,18 (rn, 1H), 3,33-3,51 (m, 2H), 3,79 (d, J=4,9 Hz, 1H), 4,98 (q, J=7,l Hz, 1H), 7,60- -7,17 (m, 5H). MS (Cl) m/e 361 (MH+, base), 305, 261, 112. Anal.

Cale. para 021^32^2^3: C 69,97;. H 8,95; M 7,77. Encontrado: C 70,27; H 9,25; N 7,73.

Exemplo 52g N~t~Boc-trans-5-n-propil-fL)-prolina

Aqueceu-se ao refluxo durante a noite uma solução do isómero S do exemplo 52f (40,2 g, 0,11 mol) em HC1 8 M (870 ml) e ácido acético glacial (220 ml)* Concentrou-se a solução num evaporador rotatório e retomou-se o resíduo em H2O e extractou-se com éter. Concentrou-se a fase aquosa e formou-se um azeótropo 3x com tolueno para dar 43,0 g de hidrocloretos de

J 71 183 4693.PQ01

-119- trans-3-n-propil-(L)-prolina e de (S)-metilbenzilamina. Retomaram-se os sais em dioxano/H20 (1:1, 400 ml) e então trataram-se cuidadosamente com N,N-diisopropiletilamina (35,5 g, 0,275 mol) e dicarbonato de di-t-butilo (60,0 g, 0,275 mol) sequencialmente a 02C. Após agitação durante a noite a 232C, diluiu-se a mistura com EtOAc e separaram-se as duas fases. Extractou-se a fase orgânica com NaOH 0,5 N (2x). Extractou-se a fase aquosa combinada com EtOAc uma vez e novamente o último extracto de EtOAc lavou-se com NaOH 0,5 N. Arrefeceu-se a fase básica combinada de H2O a 020-520 e acidificou-se a pH 1,0 com HC1 4 N frio e extractou-se imediatamente com EtOAc (2x). Lavou-se o extracto combinado de EtOAc com salmoura, secou-se (MgS04) e concentrou-se. Secou-se o resíduo num exsicador de vácuo sobre p2°5 dar 26,1 (92¾) do produto desejado na forma de um sólido branco. p.f. 88-892C (Hexano). TLC, Rf=0,15 (CHCl3:MeOH=9:l), [«]24d= -38,32 (C=1,0, CHCI3)5 [a]25D= -42,52 (c 0,095, CHCI3). 1H-RMN (360 MHz, DMS0-d6, 1002C) Ó 0,90 (t,

258 (HH)+, 219 (base), 202, 158. Anal. Cale. para C13H23NO4- 0, 60,68; H 9,01; N 5,44J encontrado: C 60,85; H 8,97; N 5,44. O isómero ( + ) obteve-se similarmente: p.f. 90-922C (Hexano).

[g£]24d= +43,22 (c 1,0, CHCI3).

Exemplo 52h

Ctp-T pp-Asp- ( NHe ) Ph e-jvM-b A uma solução do sal hidrocloreto de Tpp-Asp(0Bn)-N-Me-Ph--NH2 (18,2 mg, 0,032 mmol), preparado como nos exemplos 25a-25b, ácido Ctp (8,7 mg, 0,035 mmol) e B0P-C1 (10 mg, 0,039 mmol) em dimetilformamida (0,5 ml) e cloreto de metileno (1,5 ml) adicionou-se diisopropiletilamina (10,1 mg, 0,078 mmol) a 02C sob azoto. Agitou-se a mistura durante a noite a 02C e então verteu--se sobre ácido cítrico a 3¾ e extractou-se com EtOAc (2x). Lavou-se os orgânicos combinados com solução aquosa saturada de NaHCQ3 e salmoura. Após secagem com Na2S04, removeu—se o solvente em vácuo e sujeitou-se o resíduo a cromatografia flash (2,5¾ a 10¾ de MeOH/CHCl3) para dar 14 mg (57¾) de Ctp-Tpp-Asp(OBn)-

J 71 183 4693.PGQ1 -120-

—(NMe)Phe~NH2 na forma de um sólido. Retomou-se este material em MeOH (2 ml) e hidrogenou-se sob hidrogénio,a uma atmosfera, em presença de Pd 5%/BaS04 (20 mg) durante 1,5 h à temperatura ambiente. Após filtração da mistura reaccional por celite e concentração do filtrado, cromatografou-se o resíduo resultante por HPLC preparativa de fase inversã·.- usando TF A aquoso 3 1¾ e acetonitrilo como eluentes. Liofilizou-se o produto para dar 12 mg de pó fioculento cor de rosa. p.f. 185-1902C (dec). MS (Cl) m/e 659 (M+H)+, 691 (MH+CH30H)+. ii-i-RMN (DMS0-d6, 360 MHz) Ô 0,90

calc. para 0,3CH30H 0,9CF3CQ2H: C 57,80, H 5,77, N 10,90; Encontrado: C 57,71, H 6,09, N 11,24.

Exemplo 55

Ctp-Cpp-Asp-Phe-NHb (Isómero A)

Exemplo 55a

Cpp-Asp(0Bn)-Phe-NHo.H01 A uma solução de N-8oc-cis-3-n-propil-prolina (61 mg, 0,23 mmol) (preparada a partir do éster metílico correspondente (exemplo 52e) por meio de hidrólise ácida (HC1 6 N/1002C/6 h) e tratamento do aminoácido resultante com Boc~0NM e diisopropiletilamina em dioxano aquoso), TFA.Asp(0Bn)-Phe-i\lH2 (141 mg, 0,29 mmol), hidrato de 1-hidroxibenzotriazolo (44 mg, 0,29 mmol) e diisopropiletilamina (37 mg, 0,29 mmol) em THF (3 ml) adicionou-se hidrocloreto de l-(3-dimetilaminopropil)-3--etilcarbodiimida (EDCI) (55 mg, 0,29 mmol) a 02C, sob azoto. Após agitação durante 4 dias ã temperatura ambiente, submeteu-se a mistura a partição entre uma solução aquosa de ácido cítrico a 10¾ e EtOAc. Lavou-se adicionalmente a fase orgânica com uma solução aquosa saturada de NaHC03 e salmoura e secou-se (Na2S04). A concentração em vácuo deu 167 mg de Boc-(L)-Cpp-ftsp(0Bn)-Phe-NH2 e Boc-(D)-Cpp-Asp(OBn)-Phe-NH2 brutos: MS (Cl) m/e. 609 -121- 71 133 4693.Ρ601 (M+H)+. Tratou-se então este produto bruto com 10 ml de HC1 1,5 N/HOftc (preparado a partir de 12,5 ml de HC1 conc. diluído a 100 ml com AcOH) durante 1 h à temperatura ambiente. Removeram-se os solventes em vácuo e lavou-se o resíduo sólido com éter e filtrou-se. Liofilizou-se o produto para dar 126 mg (97¾) do sal hidrocloreto de amino-tripéptido livre na forma de um sólido branco. MS (Cl) m/e 509 (M+H)+.

Exemplo 53b

Ctp-Cpp-Asp-Phe-jNH-lg (isómero A) A uma solução do sal hidrocloreto de tripéptido do exemplo 53a (124 m'g, 0,22 mmol) e B0P-C1 (69 mg, 0,27 mmol) em cloreto de metileno (2 ml) adicionou-se uma solução de Ctp-OH (61 mg, 0,25 mmol) em cloreto de metileno (1 ml)/DMF (2 ml) e diisopropiletilamina (71 mg, 0,55 mmol) a 02C sob azoto. Após agitação durante a noite à temperatura ambiente, adicionaram-se 0,4 equivalentes de B0P-C1 e 0,4 equivalentes de diisopropiletilamina e deixou-se agitar durante 24 h. Diluiu-se a mistura reaccional com EtOAc, lavou-se com ácido cítrico aquoso a 10^ solução aquosa saturada de NaHC03 e salmoura, e secou-se (Ma2S04). A purificação por cromatografia flash (¾¾ —> 10¾ de MeOH em CHCI3) deu 43 mg do diastereómero de eluição mais rápida, puro, 16 mg de mistura e 36 mg do diastereómero de eluição mais lenta, puro. Hidrogenou-se o diastereómero de eluição mais rápida (43 mg, 0,059 mmol), sob hidrogénio,a uma atmosfera,à temperatura ambiente durante 6 h usando Pd 10%/C (15 mg) em MeOH (5 ml). Filtrou-se a mistura reaccional através de celite e removeu-se o solvente em vácuo. Liofilizou-se o poduto para dar 37 mg de sólido branco, p.f. 175-18020. MS (FAB+) m/e 645 (M+H)+, 667 (M+Na)+. !h-RMN (DMS0-d6, 300 MHz) <5 0,81 (m, 3H), 1,0 (m, 1H), 1,45-1,15 (m, 4H), 1,85-1,50 (m, 1H), 2,12-1,85 (m, 1H), 2,50- -2,12 (m, 1H), 3,00-2,55 (m, 6H), 3,07 (m, 1H), 3,50-3,30 (m, 2H), 3,78-3,58 (m, 2H), 3,85 (m, 1H), 4,63-4,10(m, SH), 6,78 (d, 3=7,2 HZ, XH), 6,96 (t, 3=8,4 Hz, 1H), 7,30-7,10 (m, 9H). Anal. calc. para C34H40N6O7 0,6CF3C02H= 0 59,07, H 5,74, N 11,79; encontrado: C 59,07, H 6,02, M 12,13.

71 183 4693.ΡΘ01

Exemplo 54

Boc-Trρ-Τpp-fisp-Trρ-ΝΗρ

Exemplo 54a

Tpp-AspfOBn)~Trp-NHc,TFA A uma solução de N-Boc-trans-3-n-propil~(L)-prolina (61 mg, 0,23 mmol), TF A. Asp (QBn )-Ph e-NFfj (149 mg, 0,28 mmol ), hidrato de l-hidroxibenzotriazolo (44 mg, 0,28 mmol) e 1-(3--dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (EDCI) (55 mg, 0,28 mmol) em THF (2,5 ml) adicionou-se diisopropiletilamina (37 mg, 0,28 mmol) a 0QC sob azoto. Após agitação durante 2 dias à temperatura ambiente, submeteu-se a mistura a partição entre solução aquosa de ácido cítrico a 10¾ e EtOAc. Lavou-se adicionalmente a fase orgânica com solução saturada de NaHOOj e salmoura. Após secagem com Na2S04, removeu-se o solvente em vácuo e retomou-se o resíduo em cloreto de metileno (5 ml) e tratou-se com TFA (5 ml) durante 35 nin à temperatura ambiente. Concentrou-se a mistura reaccional e cromatografou-se o resíduo resultante por cromatografía flash (MsOK 10%/CHCl3) para dar 50 mg do produto desejado na forma de um pó amarelo após liofolização.

Exemplo 54b

Boc-Trp-Tpp-Asp-Trp-NHo A uma solução de Boc-Trp-OH (25 mg, 0,083 mmol), TFA- Tpp— -Asp(ÓBn)-Trp-NH2 (50 mg, 0,076 mmol), EDCT (18 mg, 0,091 mmol) e HOBt hidratado (14 mg, 0,091 mmol) em cloreto de metileno (1 ml) adicionou-se diisopropiletilamina (12 mg, 0,091 mmol) a 02C. Após agitação durante a noite, diluiu-se a mistura reaccional com EtOAc e lavou-se com ácido cítrico aquoso a 10%, NaHC03 aquoso saturado e salmoura, secou-se então com Na2S04 e concentrou-se em vácuo para. dar 70 mg de sólido amarelo. Retomou-se este material em HeOH (15 ml) e hidrogenou-se com hidrogénio a uma atmosfera na presença de Pd 5%/BaS04 à temperatura ambiente durante 2 h. Após filtração da mistura reaccional através de celite e concentração do filtrado, cromatografou-se o resíduo resultante numa HPLC preparativa de fase i nversa usando TFA aquoso a 0,1% e acetonitrilo como eluentes. Liofilizou-se o produto para dar 21

J 71 183 4693.ΡΘ01

-123- rng de pós branco, p.f. 195-2002C (decomp.). MS (FAB+) m/e 744 (M+H))+. 1h-RMN (DMS0-d6, 300 MHz) <5 0,81 (m, 3H), 1,10-1,50 (m,

(dd, J=13,5 ε 7,5 Hz, 1H), 6,90-7,00 (m, 3H, 1H D20 permutável), 7,01-7,10 (m, 3H), 1H D20 permutável), 7,10-7,20 (m, 3H, 1H, D20 permutável), 7,31 (d, J=8,4 Hz, 2H), 7,44-7,60 (m, 2H), 7,78 (d

J=8,7 Hz, 1H, D20, permutável), 8,32 (d, J=7,5 Hz, 1H, D2G permutável), 10,81 (m, 2H, D20 permutável), ftnal. calc. para C39H48N7°8 CF3C02H: C 57,40, H 5,87, N 11,43; Encontrado: C 57,75, H 6,03, H 11,72.

Exemplo 55

Boc-fl-Nal-T pp-Asp-a-Nal-MHp Exemplo 55a

Tpp-Asp(PBnj-«-Nal-NHp.TFA

Fizeram-se reagir o sal TFA de Asp(OBn)-oHNal-NH2 (151 mg, 0,28 mmol), W-Boc-trans-3-n-propil-(L)-prolina (61 mg, 0,24 mmol), hidrato de 1-hidroxibenzotriazolo (44 mg, 0,28 mmol), de l-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (EDCI) (55 mg, 0,28 mm) e diisopropiletilamina (37 mg, 0,28 mmol) em cloreto de metileno (3 ml), sob condições similares às descritas no exemplo 4. Desprotegeu-se o produto com TFA e isolou-se de uma maneira similar à do exemplo 54a para dar o produto desejado na forma de um sólido branco.

Exemplo 55b

Boc-B-Nal-Tpp-Asp-cHNial-SvIH'?

Fizeram-se reagir Boc-JS-Nal-QH (25 mg, 0,08 mmol), TFA *Tpp— -Asp(0Bn)-α-Na1-NH2 (54 mg, 0,08 mmol), hidrato de 1--hidroxibenzotriazolo (15 mg, 0,096 mmol), hidrocloreto de l-(3--dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (EDCI) (19 mg, 0,096 mmol), diisopropiletilamina (13 mg, 0,096 mmol) e cloreto de metileno (2 ml), sob condições similares às descritas no exemplo 54b. Hidrogenou-se o produto e purificou-se de uma maneira similar à descrita no exemplo 54b para dar 35 mg do produto -124- -124- 71 183 4693.PG01 JL· desejado na forma de um sólido branco, p.f. 190-2002C (dec). MS (FAB+) m/e 766 (M+H)+, 788 (M+Na)+, 666 (MH+-Boc). ÍH-RMN (DMSO--d6 300 MHz) Ô 0,80 (m, 3H), 1,10-1,35 (m, 12H), 1,45 (m, 1H), 1,56 (m, 1H), 2,33 (m, 2H), 2,55 (m, 1H), 2,72 (m, 1H), 2,90 (m, 1H)), 3,11 (m, 1H), 3,30 (m, 1H), 3,55-3,70 (m, 2H), 3,80-3,95 (m, 2H), 4,45-4,60 (m, 3H), 7,05-7,60 (m, 10H, 4H D20

permutável), 7,70-8,40 (m, 9H, 1H D20 permutável), 12,50 (s largo, 1H, D20 permutável). Anal. calc. para C43H53N5O8 0,3CF3CO2H: C 65,45, H 6,46, N 8,75; Encontrado: C 65,37, H 6,42, N 8,72.

Exempolo 56

Boc-g-Nal-TPP-Asp-β—Mal-NH2 Exemplo 56a

Tpp-Aspf OBn^-Nal-B-NHo.TFA

Fizeram-se reagir sal TFA de ftsp(OBn)-J3-Nal-NH2 (151 mg, 0,28 mmol), N-Boc-trans-3-n-propil-(L)-prolina (61 mg, 0,24 mmol), hidrato de 1-hidroxibenzotriazolo (44 mg, 0,28 mmol), hidrocloreto de l-(3-dimetilaminopropil)-3-etílcarbodiimida (EDCI) (55 mg, 0,28 mmol) e diisopropiletilamina (37 mg, 0,28 mmol) em cloreto de metileno (3 ml), sob condições similares às descritas no exemplo 54â. Desprotegeu-se o produto com TFA e isolou-se de maneira similar à do exemplo 54a para dar o produto desejado na forma de um sólido branco.

Exemplo 56b

Boc-B-Nal-Tpp-Asp-g-Nal-MH2

Fizeram-se reagir Boc-B-Mal-OH (25 mg, 0,08 mmol), TFA.Tpp--Asp(08n)-8-Nal-NH2 (54 mg, 0,08 mmol), hidrato de 1--hidroxibenzotriazolo (15 mg, 0,096 mmol), hidrocloreto de 1-(3--dimetilaminopropil)—3-etilcarbodiimida (EDCI) (19 mg, 0,096 mmol), diisopropiletilamina (13 mg, 0,096 mmol) e cloreto de metileno (2 ml), sob condições similares às descritas no exemplo 54a. Hidrogenou-se o produto e purificou-se duma maneira similar à descrita no exemplo 54b para dar 34 mg do produto desejado na forma de um sólido branco, p.f. 190-2002C (dec). MS (FAB+) m/e 766 (H+H))+, 788 (M+Na)+, 666 (MH+-Boc). 1h-RMN (D20, 300 MHz) <5 0,78 (m, 3H), 1,00-1,32 (m, 12H), 1,39 (m, 1H), 1,52 (m, 1H),

J 71 183 4693.PG01

-125-

-4,60 (m, 3H), 7,10-7,55 (m, 8H, 2H D20, permutável), 7,65-8,10 (m, 10H, 2H D20, - permutável), 8,36 (d, J=7,2 Hz, 1H D20, permutável), 12,44 (s largo, 1H, D20 permutável). Anal. calc. para C43H5JN5OQ 0,8CF3C02H: C 62,50, H 6,09, N 8,17; Encontrado: C 62,30, H 6,01, N 8,40.

Exemplo 57

Ctp-Tpp-Asp-a-Nal-NHg ft uma mistura de Ctp-0H (24 mg, 0,10 mmol). TFA.Tpp--Asp(OBn)-cHMal-NH2 (67 mg, 0,10 mmol) e Sop-Cl (31 mg, 0,12 mmol) em cloreto de metileno (2 ml)/DMF (0,5 ml) adicionou-se diisopropiletilamina (31 mg, 0,24 mmol) a 0QC sob azoto. Após agitação durante a noite à temperatura ambiente, trabalhou-se a mistura reaccional de maneira similar à descrita no exemplo 54b. Hidrogenou-se o produto e purificou-se de maneira similar à descrita no exemplo 54b para dar 32 mg do produto desejado na forma de um sólido branco, p.f. 185-1902C (dec), MS (FAB+) m/e 695 (M+H)+, 713 (ΜΗ+Η20)+Ϊ^5%3 resolução (Cl) m/e 695,3198 ((M+H) +, para C38H43N0O7, calc. 695,3193). 1h-RMN (DiiSO-d^, 300 MHz) <$ 0,81 (m, 3H), 1,27 (m, 3H), 1,36-1,65 (m, 2H), 2,05 (m,

6,96 (t, J=7,5 Hz, 1H), 6,97 (d, 3=6,0 Hz, 1H, D20 permutável), 7,15 (2H, 1H D20 permutável), 7,20-7,40 (m, 5H, 2H D20 permutá—

(d, 3=8,4 Hz, 1H, D2Q permutável), 3,17 (m, 1H), 8,44 (m, 1H, D2° permutável), 10,95 (m, 1H, D20 permutável), 12,50 ( s largo, 1H, D20 permutável). Anal. calc. para C38H42N6O7 2CF3C02H 1HC0N(CH3)2 1H20: C 53,31, H 5,27, N 9,67; Encontrado: C 53,42, H 4,95, N 9,67.

Exemplo 58

Ctp-Tpp-Asp-B—Nal-NH2 A uma mistura de Ctp-OH (24 mg, 0,10 mmol), TFA.Tpp-

71 183 4693.PS01 -126- -Asp(08n)-B-Nal-NI-l2(67 mg, 0,10 mmol) e Bop-Cl (31 mg, 0,12 mmol) em cloreto de metileno (2 ml)/DMF (0,5 ml) adicionou-se diisopropiletilamina (31 mg, 0,24 mmol) a 0£>C sob azoto. Após agitação durante a noite à temperatura ambiente, trabalhou-se a mistura reaccional de maneira semelhante à descrita no exemplo 54b. Hidrogenou—se o produto e purificou—se de uma maneira similar à descrita no exemplo 54b para dar 23 mg do produto desejado na forma de um sólido branco, p.f. 185-19020 (dec). MS (FAB+) m/e 695 (M-J-H)+ m/e 695 (M+H)+, 717 (M+Na)+- 1H-RMN (DMS0--d6, 300 MHz) <S 0,80 (m, 3H), 1,19 (m, 3H), 1,32-1,62 (m, 2H),

1,98 (m, 2H), 2,50-2,75 (m, 3H), 3,03 (m, 2H), 3,20-3,45 (m, 2H>, 3,50-3,70 (m, 3H), 3,82 (m, 1H), 3,91 (m, 1H), 4,12 (m, 1H), 4,40 (m, 2H), 4,52 (m, 1H), 6,77 (d, 3=7,2 Hz, 1H), 6,95 (t, 3=7,2 Hz. 1H), 6,96 (m, 1H, D2O permutável), 7,17 (m, 2H, 1H D2O

permutável), 7,22 (d, 3=8,1 Hz, 1H), 7,30-7,55 (m, 4H, 1H D2O

permutável), 7,65-7,89 (m, permutável), 7,93 (m, 1H, D2O permutável), 8,47-8,52 (m, 1H, D2O permutável), 10,9-11,0 (m,v 1H, D2O permutável). Anal. calc. para 038^42^6^7 0,9ÇF3C02H: C 59,95, H 5,42, N 10,54; Encontrado: C 59,59, H 5,75, N 10,86.

Exemplo 59 Ctp-Tpp-Asp-Cha-NHo

Exemplo 59a

Tpp-fispfOBnVCha-NHo.TFA

Fizeram-se reagir o sal TFfi de Asp(0Bn)-Cha-NH2 (95 mg, 0,19 mmol), N-Boc-trans-3-n-propil-(L)-prolina (50 mg, 0,19 mmol), hidrato de 1-hidroxibenzotriazolo (45 mg, 0,23 mmol), hidrocloreto de l-(3—dimetilaminopropil)—3—etilcarbodiimida (EDCI) (45 mg, 0,23 mmol) e diisopropiletilamina (30 mg, 0,23 mmol) em cloreto de metileno (7 ml), sob condições similares às descritas no exemplo 54a. Desprotegeu-se o produto com TFA e isolou-se de uma maneira similar ã do exemplo 54a para dar 66 mg de produto na forma de um sólido branco.

Exemplo 59b Ctp-Tρρ-Asp-Cha-NHp A uma mistura de Ctp-OH (27 mg, 0,11 mmol), TFA.Tpp—

J 71 183 4693.PG01 -127

—ftsp(QBn)-Cha-NH2 (66 mg, 0,10 mmol) e Bop-Cl (32 mg, 0,13 mmol) em cloreto de metileno (5 ml)/DMF (1,5 ml) adicionou-se diisopropiletilamina (33 mg, 0,25 mmol) a 02C sob azoto. Após agitação durante a noite à temperatura ambiente, trabalhou-se a mistura reaccional de uma maneira similar à descrita no exemplo 54b. Hidrogenou-se o produto e purificou-se de uma maneira similar à descrita no exemplo 54b para dar 22 mg do produto desejado na forma de um sólido branco, p.f. 145-1502C (dec). MS (FAB+) m/e 651 (M+H)+. 1H-RMM (CD30D, 300 MHz) <5 0,91 (m, 3H), 1,25-1,65 (m, 17H), 1,96-2,20 (m, 2H), 2,70-3,10 (m, 2H), 3,25

2H), 7,28-7,39 (m, 5H). Anal. calc. para 034Η46Ν607 1,5CF3C02H

Exemplo 60

Ctp-1.4-tiazano-5-carbonil-Asp-Fhe-iv!Ho

Exemplo 60a Ácido L - BQC-1,4-tiazano-3-carboxí1ico

Agitou-se rapidamente uma suspensão heterogénea de ácido tiazano-3-carboxilico (J. F. Carson, F. F. Wong, J. Org, Chem., 29, 2203 (1964)) (0,28 g, 1,88 mrnol) e B0C-0N[2-(terc--butoxicarboniloxiimino)-2-fenilacetonitrilo] (0,70 g, 2,84 mmol) e TEA (0,29 g, 2,87 mmol) em acetona (5 ml) e água (5 ml), ã temperatura ambiente. Diluiu-se a mistura com água, lavou-se várias vezes com éter, então acidificou-se com HC1 1 M e extractou-se várias vezes com cloreto de metileno. Lavou-se a fase orgânica com salmoura e secou-se sobre sulfato de sódio. A evaporação do solvente em vácuo rendeu 0,39 g (84¾) de um sólido branco. MS (EI) m/e 247 M+. -^H-RMN! (300 MHz, CDCI3) 6 1,47 (s largo, 9H), 2,46 (t largo, 1H), 2,72 (t largo, 1H), 2,92 (dd, J=14Hz, 5Hz, 1H), 3,05-3,37 (m, 2H), 4,19-4,42 (m, 1H), 5,10, 5,32 (s, 1H).

J 71 183 4693.PG01 -128-

Exemplo 60b BDC-1,4-tiazano-3~carbonil-fisp(0Bn VPhe-MHg A uma solução do composto do exemplo 60a (0,13 g, 0,27 mmol) em cloreto de metileno (5 ml) adicionou-se N-metilmorfolina (30 mg, 0,29 mmol), hidrocloreto de Asp(0Bn)-PheNH2 (50 mg, 0,20 mmol) e H0BT (30 mg, 0,22 mmol). Arrefeceu-se a solução a 02C e adicionou-se DCC (45 mg, 0,22 mmol) para formar uma suspensão leitosa. Deixou-se o banho expirar e deixou-se a reacção repousar à temperatura ambiente durante 18 h. Diluiu-se. a mistura com acetato de etilo, filtrou-se e lavou-se a solução com HC1 1 M, solução saturada de bicarbonato e salmoura. Após secagem sobre sulfato de sódio, removeu-se o solvente em vácuo e cromatografou-se o resíduo (sílica gel, acetato de etilo:hexano) para dar 104 mg (87¾) de um sólido branco. MS (FAB) m/e 599 (M+H)+. iH-RMN (DMSO—d6, 300 MHz) <5 1,49 (s, 9H), 2,34-2,45 (rn,

1H),. 6,98 (d largo, 1H), 7,08-7,42 (m, 9H).

Exemplo 60c

Hidrocloreto de 1,4-Tiazano~3-carbonil-Asp(QBn)~Pha-NHp

Agitou-se uma solução do composto do exemplo 60b (450 mg, 0,75 mmol) em HC1 em ácido acético (20 ml), à temperatura ambiente durante 4 h. A adição de éter precipitou o sal que se recolheu, lavou com éter fresco e secou para dar 390 mg (100¾) de um sólido branco. MS (FAB+) m/e 499 (M+H)+. ^H-RMN (DMSQ-dg, 300

Exemplo 60d

Ctp-1,4-tiazano-3-carbonil-fisp(QBn)-Phe-Ntl·? A uma solução homogénea de Ctp-OH (66 mg, 0,27 mmol) em DMF (1 ml) e cloreto de metileno (7 ml) arrefecida a 02C adicionou—se composto do exemplo 60c (173 mg, 0,32 mmol), diisopropiletilamina (119 mg, 0,92 mmol) e B0P-C1 (76 mg, 0,29 mmol). Possibilitou-se a reacção repousar a 0QC durante 18 h, então diluiu-se com isopropanol a 25¾ em clorofórmio, lavou-se com HC1 1 M, solução

71 183 4693 = PQ01

-129-saturada de bicarbonato e salmoura. Após secagem sobre sulfato de sódio, removeu-se o solvente em vácuo para dar uma lama que se cromatografou sobre silica (Chromatatron) usando metanol em clorofórmio para dar um sólido branco. MS (FAB+) m/e 725 (M+H)+. (DMSO-dé, 300 MHz, espectro parcial devido à interferência da H20) <S 2,57-2,90 (ra, 3H), 2,90-3,07 (m, 4H), 3,70-3,87 (m, 2H), 3,96-4,05 (m, 1H), 4,12-4,20 (m, 1H), 4,36-4,44 (m, 1H), 4,65-4,84 (m, 3H), 4,96-5,09 (m, 2H), 6,39 (d, 1H), 6,97 (t, J=7Hz, 1H), 7,04 (d, 1H), 7,07-7,42 (m, ca.l2H), 7,85 (d, 1H), 8,18 (d, 1H).

Exemplo 60e

Ctp-1,4-tiazano~3-carboniI-ftsp-Phe-NHg

Tratou-se o composto do exemplo 6Gd (55 mg) com Pd 10%-C (50 mg) em metanol (5 ml) em presença de ciclo-hexadieno (0,15 ml). Agitou-se a suspensão à temperatura ambiente durante 24 h, tempo ao fim do qual se adicionaram uma quantidade adicional de catalisador (50 mg) e de ciclo-hexadieno (0,15 ml). Após uma agitação adicional de 24 h, filtrou-se o catalisador, removeu-se o solvente em vácuo e crornatografou-se o resíduo por HPLC de fase inversa -. usando acetonitrilo e TFA a 0,1¾. Recolheram-se as fracções e 1 iofolizararn-se para dar um sólido branco, floculento. MS (FAB-) m/e 633 (M-H)_. Anal. calc. para C31H34N6Q7S.3CF3CQ2H: C 45,50, H 3,82, N 8,60? Encontrado: C 45,46, H 3,02, N 9,17.

Exemplo 61 Ctp-Pip-fisp-Phe-NH2

Exemplo 61a

Cbz-Asp(Q-t-Bu)-Phe-MjHg A uma solução a -102C de Cbz-Asp(O-t-Bu) (2,5 g, 4,95 mmol) em THF (40 ml) adicionaram-se N-metilmorfolina (0,52 g, 5,18 mmol) seguida de cloroformato de isobutilo (0,705 g, 5,16 mmol) para formar um precipitado branco. Agitou-se a suspensão durante 4 min. e adicionaram-se uma solução de Phe-NHg (0,81 . g, 4,94 mmol) em DMF (10 ml) e água (5 ml). Agitou-se a solução a -152C durante 10 min adicionais, então deixou-se aquecer até à temperatura ambiente. Após 6 h, diluiu-se a solução com acetato

J 71 183 4693.PG01 -130-

de etilo, lavou-se com HC1 1 M, solução saturada de bicarbonato e salmoura. Após secagem sobre sulfato de sódio, removeu-se o solvente em vácuo para dar 2,07 g (89¾) de um sólido branco que se recristalizou a partir de acetato de etilo. MS (FAB+) m/e 470 (M+H+). iH-RMN (300 MHz, CDC13) ô 1,41 (s, 9H), 2,67 (dd, J=6 e 15Hz, 1H), 2,80 (dd, 1H), 3,03-3,22 (m, 2H), 4,42 (m, 2H), 4,64 (m, 2H), 5,17 (dd, 2H), 7,15-7,40 (rn, 10H)

Exemplo 61b

Acetato de Asp(0-t-Bu)-Phe-is!Hl2

Agitou-se uma mistura do composto do exemplo 61a (1,20 g, 2,56 mmol) e 0,60 g de Pd lOSs-C em metanol (60 ml), sob uma atmosfera de hidrogénio gasoso durante uma hora. Filtrou-se o catalisador, lavou-se com metanol fresco seguido de ácido acético, então evaporou-se com um rendimento de 0,89 g (100¾) de sólido branco. MS (FAB+) m/e 336 (M+H)+. ^-Η-ΡΜΝ (300 MHz, DMSO-d^)

Exemplo 61c Cbz-Pip A uma suspensão a 02C de ácido pipecólico (0,15 g, 1,16 mmol) e carbonato de potássio (4,64 mmol) em água (5 ml) e THF (5 ml) adicionou-se cloroformato de benzilo (0,24 g, 1,41 mmol). Agitou-se rapidamente a mistura durante uma hora, então deixou-se aquecer até à temperatura ambiente. Após 6 h, diluiu-se a reacção com água e lavou-se com éter. Acidificou-se a fase aquosa e extractou-se com cloreto de metileno. Lavou-se a fase orgânica com salmoura depois secou-se sobre sulfato de sódio. Evaporou-se o solvente e recristalizou-se o resíduo a partir de hexano--acetato de etilo para dar 0,23 g (75¾) de um sólido branco. MS (Cl) m/e 264 (M+H)+. iH-RMN (300 MHz, CDCI3) <5 1,24-1,80 (m, 5H), 2,26 (t largo, 1H), 2,93-3,14 (m, 1H), 4,00-4,19 (m, 1H), 4,87 -5,05 (m, 1H), 5,15 (s largo, 2H), 7,27-7,41 (m, 5H).

J 71 183 4693.PQ01 -131-

Exemplo 61d

Cbz-Pip-Aspf tBiQ-Phe-NH'? A uma solução de Cbz-Pip (0,18 g, 0,68 mmol) em THF (20 rnl) a -1020 adicionaram-se N-metilmorfolina (73 mg, 0,72 mmol), seguida de cloroformato de isobutilo (98 mg, 0,72 mmol) para formar uma suspensão branca que se agitou durante 3 min. Λ suspensão adicionou-se uma solução do composto do exemplo 61b (284 mg, 0,72 mmol) e N-metilmorfolina (73 mg) em THF (3 ml) e DMF (2 ml). Agitou-se a solução a -1020 durante 15 min, então deixou-se aquecer até à temperatura ambiente. Após 4 h, remóveu--se o THF em vácuo e diluiu-se o resíduo com acetato de etilo, lavou-se com HC1 1 M, solução saturada de bicarbonato e salmoura. Secou-se o solvente sobre sulfato de sódio, depois evaporou-se. Cromatografou-se o sólido resultante (sílica, metanol--clorofórmio) para dar 400 mg de um sólido branco. MS (FAB+) m/e 581 (M+H)+. iH-RMN (300 MHz, CDC13) ô 1,25-1,70 (m, 6H), 1,40 (s, 9H), 2,13 (d largo, 1H), 2,62-2,73 (m, 2H), 3,13 (s largo, 2H), 4,57-4,68 (m largo, 3H), 5,16 (s, 2H), 7,16-7,40 (m, 5H).

Exemplo 61e

Acetato de Pip-Aspf t-BuVPhe-NHo

Hidrogenou-se sob hidrogénio, a uma atmosfera, uma mistura de composto do exemplo 61d (400 mg) e Pd 10%-C (200 mg) em metanol (15 ml). Após uma hora, filtrou-se o catalisador, enxaguou-se com metanol e ácido acético frescos e evaporou-se em vácuo para dar 328 mg de um sólido branco. MS (Cl) m/e 447 (M+H)+. iH-RMN (300 MHz, DMS0-d6) <3 1,20-1,58 (m, 2H), 1,34 (s, 9H), 1,63-1,73 (m, 2H), 2,39-2,62 (m, 2H), 2,77-3,11 (rn, 4H), 4,31-4,41 (m, 1H), 4,49-4,58 (m, 1H), 7,08-7,42 (m, 4H), 7,81- -7,93 (m, 1H).

Exemplo 61f

Ctp-Pip-Asp(O-t-Bu)-Phe-NHo ftgitou-se a 02C durante 36 h uma solução de Ctp (50 mg, 0,21 mmol), composto do exemplo 61e (115 mg, 0,23 mmol), diisopropiletilamina (89 mg, 0,69 mmol), e B0P-C1 (58 mg, 0,23 mmol) em cloreto de metileno (6 ml) e DMF (2 ml). Diluiu-se a

71 183 4693.PG01 mistura com acetato de etilo, lavou-se com HC1 1 M, solução saturada de bicarbonato de sódio e salmoura. Secou-se o solvente sobre sulfato de sódio e então evaporou-se em vácuo. Cromatografou—se o resíduo (sílica, metanol-clorofórmio) para dar 72 mg (52¾) de um sólido branco. MS (FAB—) m/e 671 (M-H)-. (300 MHz, CDCI3) <5 1,35-1,76 (m, 6H), 1,43 (s, 9H), 2,12 (d largo, 1H), 2,66 (dd, 1H), 2,87 (dd, 1H), 3,04-3,22 (m, 2H), 3,25-3,49 (m, 2H), 3,50 (dd, 1H), 3,71-3,85 (m, 3H), 4,22 (d, 1H), 4,60- -4,70 (m, 2H), 5,04 (s largo, 1H), 6,89 (d, 1H), 7,03-7,34 (m, 9H), 8,25 (s largo, 1H),

Exemplo 61g Ctp-Pip-Asp-Phe-NHo

Numa solução do composto do exemplo 61f (37 mg) em ácido acético (5 ml) borbulhou-se uma corrente de MCI gasoso durante 30 min. Removeu-se o ácido acético em vácuo, dissolveu-se em água e acetona e liofolizou-se. Cromatografou-se o sólido resultante (silica gel, ácido acético-água-piridina-acetato de etilo) para dar 28 mg de um sólido branco floculsnto após liofolização. MS (FAB+) m/e 617 (M+H)+. 1H-RMN (300 MHz, DMS0-d6) <S 1,23-1,67 (m, 6H), 2,14 (d largo, 1H), 2,65 (dd, 1H), 2,77-2,90 (m, 2H), 3,06 (dd, 1H), 3,24-3,40 (m, 2H), 3,75-4,05 (m, 2H), 4,31-4,40 (m largo, 1H), 4,50-4,86 (m, 3H), 5,08 (s largo, 1H), 6,83 (d, 1H), 7,00 (t, J=7Hz, 1H), 7,18-7,32 (m, 8H). Anal. calc. para C32H36N607.1,5H20: C 59,71, H 6,11, N 13,06; Encontrado: C 59,62, H 5,76, N 12,90.

Exemplo 62 BOC-Trp-fN-l,4-tiazepinil-2-carbonil)-Asp-Phe-NHo S- ( 3-hidroxipFõpil) -Cys (Exemplo 6 2a) Preparou-se o composto ae uma maneira similar à descrita por F. Carson, et. al., J. Org. Chem., 29, 2203 (1964). A uma solução de sódio (6,44 g, 0,281 mol) em amónia liquida (300 ml) adicionou-se Cys (15,0 g, 62,5 mmol) durante um período de 30 min até descarga permanente de azul. Adicionou-se bromopropanol (15,8 ml, 0,175 mol), gota a gota durante 1 h. Deixou-se a amónia evaporar e dissolveu-se o sólido resultante em HC1 1 M e passou~ -se através de uma coluna de Dowex 50 (H+) (5x30 cm) eluindo com -133- Λ— 71 183 4693.PGOl hidróxido de amónio 1 N. ft liofolização rendeu 21,3 g de um sólido branco. MS (Cl) m/e 180 (M+H)+. 1h-RMN (DMS0~d6, 300 MHz) <5 1,70-2,00 (m, 3H), 2,70 (t, J=7,5Hz, 2H), 3,00-3,21 (m, 3H), 3,58-3,84 (m, 3H), 3,93 (dd, 1H).

Exemplo 62b Ãcido BQC-1,4-tiazepina-5-carboxilico

Dissolveu-se o composto do exemplo 62a (5,0 g, 27,9 mmol) em HC1 concentrado (400 ml) e aqueceu-se a 9020 durante 16 h. Evaporou-se a mistura a um sólido branco ao qual se adicionou uma solução de bicarbonato de sódio (5,8 g, 70 mmol) em etanol:água 1=1 (200 ml), então refluxou-se durante 17 h. Adicionou-se dicarbonato de di-t-butilo (9,6 ml, 42 mmol) à solução arrefecida e deixou-se repousar durante 16 h. Reduziu-se então o volume da reacção a 100 ml, acidificou-se com H3PO4 1 M e extractou-se com isopropanol 25%-clorofórmioo. Lavou-se a fase orgânica combinada com salmoura, secou-se sobre sulfato de sódio e evaporou-se a um resíduo, o qual se cromatografou (sílica, metanol-clorofórmio) para dar 0,91 g de um sólido branco. MS (Cl) m/e 262 (M+H)+, ^H— -RMN (DMS0-d6, 300 MHz) ô 1,46-1,51 (s, 9H), 1,78-2,05 (m, 2H), 2,50-2,62 (m, 2H), 2,68-2,78 (m, 1H), 2,80-3,00 (m, 1H), 3,20- -3,25 (m, 1H), 3,75-3,80 (m, 1H), 4,68-4,85 (m, 1H).

Exemplo 62c

Boc~l ,4-tiazepina-3-carbonil-ftsp-f OBnVPhe-lvSBo

Preparou-se o composto de uma maneira similar à descrita para o exemplo 60b. MS (Cl) m/e 613 (M+H)+. ^-H-RMN (DMSO-d^, 300 MHz) <S 1,34-1,45 (m, 9H), 1,62-1,80 (m, 1H), 1,88-1,96 (m, 1H), 2,40-2,52 (m, 2H), 2,58-2,65 (m, 3H), 2,78-3,18 (m, 3H), 3,42- -3,47 (m, 1H), 3,63-3,84 (m, 1H), 4,31-4,45 (m, 1H), 4,48-4,50 (m, 1H), 4,58-4,66 (m, 1H), 5,07 (s, 2H), 7,13-7,38 (m, 10H), 7,78-7,84 (dd, 1H), 8,15 (d, 1H), 8,54-8,65 (dd, 1H).

Exemplo 62d B0C-Trp-(N-l.4-tiazepinil-2-carbonil)-Asp(QBn)-Phe-NH2

Tratou-se o péptido do exemplo 62c (120 mg, 0,20 mmol) com uma solução de HC1 em ácido acético (3 ml) durante 1 h. Gelou-se 71 183 4693.Ρ601

-134- então a solução e liofolizou-se para dar 108 mg de um sólido branco que se deixou a reagir de uma maneira similar à descrita para o exemplo 60d. A cromatografia (sílica gel, metanol--clorofórmio) rendeu 58 mg de um sólido branco. MS (FAB+) m/e 799 (M+H)+. 1H-RMN (DMS0-d6, 300 MHz) <S 1,14 (s, 2H), 1,26- -1,34 (s, 9H), 1,71-2,12 (m, 3H), 2,45-3,27 (m, 8H), 3,41-3,50 (m, 1H), 4,32-4,70 (m, 3H), 4,90-5,18 (m,. 3H), 6,95-7,40 (m, 15H), 7,50 (d, 1H), 7,90 (t, 1H), 8,15 (d, 1H), 10,83 (m, 1H).

Exemplo 62e BOC-Trp-fM-l,4-tiazépiniI-2-carbonil)-Asp-Phe-NHo

Agitou-se a 5GQC durante 24 h uma solução do péptido do exemplo 31 (50 mg, 0,063 mmol), paládio a 10¾ em sulfato de bário (80 mg) e 1,4-ciclo-hexadieno (2 ml) em metanol )3 ml). Filtrou-—se o catalisador, lavou—se com metanol fresco e evaporou—se o filtrado em vácuo a um resíduo, fí cromatografia (sílica gel, piridina-ácido acético-água-acetato de etiio) seguida de liofolização do resíduo com evaporação rendeu 21 mg de um sólido branco. MS (FAB+) m/e 704 (M+H)+. ^-H-RMN (DMSO-d^, 300 MHz) <5 1,30 (s, 9H), 1,80-2,10 (m, 3H), 2,39-3,30 (m, 10H), 3,62-3,75 (m, 1H), 3,98-4,50 (m, 2H), 4,65-4,80 (m, 1H), 4,90-5,00 (m, 1H), 6,05-6,13 (m, 1H), 6,75-7,25 (m, 9H), 7,35 (d, 1H), 7,55 (d, XH), 7,80-7,96 (m, 1H), 10,55-10,61 (m, 1H). Anal. calc. para c35h44n6°85·1»5 H2O: C 57,12, H 6,44, N 11,42; Encontrado: C 56,92, H 6,12, H 11,05. • Exemplo 63 B0C-Trp-Cha-Asp-Phe-MH2 Exemplo 65a 30C-Cha-Asp(QBnl-Phe-NHo

Preparou—se o composto de uma maneira similar ã descrita para o exemplo 60b. MS (FAB+) m/e 623 (M+H)+. (DMSO-dg, 300 MHz) <5 0,74-0,94 (m, 2H), 1,05-1,39 (m, 2H), 1,37 (s, 10H), 1,56-1,78 (m, 6H), 2,40-2,67 (m, 2H), 2,77-2,86 (m, 2H), 2,98--3,07 (m, 1H), 3,41 (m, 1H), 3,96-4,04 (m, 1H), 4,28-4,36 (m, 1H), 4,41-4,50 (m, 1H), 5,05 (s, 2H), 6,88 (d, 1H), 7,13-7,40 (m, 10H), 7,94 (d, 1H), 8,05 (d, 1H). -135- 71 183 '4693. PG01

Exemplo 65b SOC-Trp-Cha-fisp(OBn )-Phe~NHo

Fez-se reagir o composto do exemplo 63a (112 mg, 0,02 mmol) com HC1 em ácido acético durante 1 h, então gelou-se e liofolizou-se para dar um sólido branco que se fez reagir de maneira similar à descrita para o exemplo 60d. MS (FAB+) m/e 809 (M+H)+. 1H-RMN (DMS0~d6, 300 MHz) <5 0,75-0,95 (m, 2H), 1,05-1,19 (m, 2H), 1,25-1,45 (m, 11H), 1,54-1,80 (m, 5H), 2,37-2,65 (m, 2H), 2,80-2,96 (m, 2H), 3,00-3,24 (m, 4H), 4,08 (m, 1H), 4,24 (m, 1H), 4,34 (m, 1H), 4,50 (m, 1H), 5,08 (s, 2H), 6,80 (d, 1H), 6,91-7,45 (m, 15H), 7,58 (d, 1H), 7,92-8,04 (m, 2H), 8,26 (d, 2H).

Exemplo 63c 8QC-Trp-Cha-Asp-Asp-Phe-MH2

Agitou-se o composto do exemplo 63b (200 mg, 0,25 mmol) e Pd 10%-C em metanol (8 ml), ã tempertura ambiente sob um balão de hidrogén^o^^urante 2 h. Filtrou-se o catalisador, lavou-se com metanol fresco e cromatografou-se o resíduo, após remoção do solvente, sobre silica (acetato de etilo:água;ácido acético;piridina). Removeram-se os solventes em vácuo e recristalizou-se o resíduo a partir de etanol=água. MS (FAB+) m/e 719 (M+H)+. iH-RMN (DMS0-dé, 300 MHz) <5 0,75-0,95 (m, 2H), 1,05-1,47 (m, 12H), 1,55-1,81 (m, 6H), 2,40-3,20 (m, 8H), 4,15- -4,53 (m, 4H), 6,81-6,85 (d, 1H), 6,94-7,36 (m, 11H), 7,60 (m, 1H), 7,87-7,97 (m, 2H), 8,22-8,31 (m, 1H). Anal. calc. para C38H50N6°8-2H20-0*5 Et0H= C 60,29, H 7,26, H 10,82* Encontrado; C 60,41? Η 6,95ϊ N 10,57.

Exemplo 64 2-Γ 3-(Indolo-2-meti1)dicetopiperazi ni11valer i1-Asp-Phe-MHo

Exemplo 64a Éster benzilico de Nva-N-(carbometoximetilo) A uma solução de hidrocloreto de éster benzilico de norvalina (1,00 g, 4,11 mmol) em acetonitrilo (30 ml) adicionaram-se diisopropiletilamina (55 g, 4 mmol), carbonato de -136- 71 1S3 4693.PG01 potássio (1,6 g) e bromoacetato de metilo (0,71 g, 4,65 mmol). Agitou-ss a mistura heterogénea à temperatura ambiente durante 18 h, tempo ao fim do qual se adicionou uma porção adicional de bromoacetato (0,32 g, 2,11 mmol) e iodeto de sódio (63 mg). Deixou-se mistura repousar 18 h adicionais à temperatura ambiente, diluiu-se então com acetato de etilo e lavou-se com água e salmoura. Após secagem sobre sulfato de sódio, removeu-se o solvente em vácuo e cromatografou-se o resíduo oleoso (sílica gel, hexano-acetato de etilo) para dar 0,91 g (84¾) de um óleo límpido, incolor. MS (Cl) m/e 280 (M+H)+. l-H-RMN (300 MHz, CDC13) <5 0,90 (t, J=7Hz, 3H), 1,32-1,45 (m, 2H), 1,57-1,76 (m, 2H), 3,31-3,48 (m, 3H), 3,70 (s, 3H), 5,16 (s, 2H), 7,32-7,40 (m, 5H).

Exemplo 64b Éster benzilico de Cbz-D-Trp-Nva-N-fcarbometoximetilo)

Deixou-se repousar a 0°C durante três dias, uma solução do composto do exemplo 64a (0,70 g, 2,51 mmol), Cbz-D-Trp (1,27 g, 3,75 mmol), di-isopropiletilamina (1,06 g, 8,2 mmol) e BOP-C1 (1,15 g, 4,52 mmol) em cloreto de metileno (40 ml) e DMF (5 ml). Diluiu-se a mistura com acetato de etilo, lavou-se com solução saturada de bicarbonato e secou—se sobre sulfato de sódio. Removeu-se o solvente em vácuo e cromatografou-se o resíduo (sílica gel, acetato .de etilo-hexano) para dar 0,17 g de um óleo límpido, incolor. MS (FAB+) m/e 600 (M+H)+. ÍH-RMN (300 MHz, CDC13) ô 0,78-0.,92 (m, 3H), 1,19-1,45 (m, 2H), 1,55-1,85 (m, 4H), 3,08-3,85 (m, 3H), 3,55, 3,70 (s, 3H), 4,02 (dd, 1H), 4,94-5,12 (m, 4H), 6,98-7,68 (m, 1ÓH).

Exemplo 64c Ácido 2-Γ3-Γindolo-2-metil)dicetopiperazininvalérico

Hidrogenou-se uma solução contendo o composto do exemplo 64b (0,16 g) e Pd 10%-C (80 mg) em metanol (25 ml), sob um balão de hidrogéríPoj?soApós 3 h, filtrou-se o catalisador, lavou-se com metanol fresco e evaporou-se a um sólido vidrado que se cromatografou (sílica gel, piridina-ácido acético-água-acetato de etilo) para dar 75 mg de um sólido branco floculento, após liofilização. -137- 71 183 4693,PG01

Exemolo 64c 2-Γ5-ίIndolo-2-mgtil)dicetopiperazinillvaleril-ftspfQSn^-Phs-NHo

Agitou-se à temperatura ambiente durante 18 h uma solução dp ácido do exemplo 64b (60 mg, 0,17 mmol), TFA-Asp(0Bn)-Phe-NH2 (110 mg, 0,18 mmol), diisopropiletilamina (24 mg, 0,19 mmol), H08T (47 mg, 0,35 mmol) e EDCI (35 mg, 0,18 mmol) em cloreto de metileno (20 ml) e DMF (5 ml). Diluiu-se a mistura com acetato de etilo e lavou-se com ácido fosfórico 111, solução saturada de bicarbonato de sódio e salmoura. Secou-se o solvente sobre sulfato de sódio e evaporou-se a um residuo que se cromatografou (silica gel, metanol-clorofórmio) para dar 114 mg de um sólido branco. MS (FAB+) m/e 695 (M+H)+. 1H-RMN (300 MHz, DMS0-d6) <S 0,75-0,90 (m, 3H), 0,96-1,19 (m, 2H), 1,41-1,70 (m, 2H), 2,38- -2,66 (m, 2H), 2,74-3,20 (m, 4H), 3,28-3,58 (m, 2H), 4,10 (s largo, 1H), 4,25-4,85 (m, 4H), 5,07 (s largo, 1H), 5,72 (m largo, 2H), 6,90-7,55 (m, 16H).

Exemplo 64d 2-r3-(Indolo-2-metil)dicetopiperazinillvaleril-Asp-Phe-NH2

Hidrogenou-se uma solução do péptido do exemplo 64c (101 mg, 0,15 mmol) e Pd 10%-C (50 mg) em metanol (15 ml), sob um balão de h idr ogéfloxyf ° Após 2 h , filtrou-se o catalisador, lavou-se com metanol fresco e evaporou-se a um resíduo que se purificou por HPLC preparativa de fase inversá ti (C-18, acetonitrilo-água) e se liofolizou para dar 40 mg de um produto branco, floculento. MS (FAB+) m/e 605 (M+H)+. 1H-RMN (DMS0-d6, 500 MHz) Ó 0,79 (t, J=7Hz, 3H), 1,03 (q largo, 2H), 1,42-1,51 (m, 1H), 1,53-1,62 (m, 1H), 2,42-2,52 (m, 2H), 2,65 (dd, J=ÓHz, J=16Hz, 1H), 2,82-2,88 (m, 1H), 3,03 (dd, 1H), 3,11 (d, 2H), 4,08-4,13 (m, 1H), 4,33- -4,40 (m, 1H), 4,45-4,51 (m, 1H), 4,64-4,71 (m, 1H>, 6,95 (t, J=7Hz, 1H), 7,04 (t, 1H), 7,08-7,36 (m, ca. 10H), 7,51 (d, 1H), 7,78 (d, 1H), 8,23 (d, 1H). Anal. calc, para C318358^07.1,5H2Q: C 58,94, H 6,22, N 13,30; encontrado C 59,66, H 5,36, N 13,08.

J 71 183 4693.PG01 -138-Exemplo 65 2-Γ 3-(Indolo-2-metil)dicetopiperaz i ni11isocaproi1-fisp-Phe-NHp

Exemplo 65a Éster benzilico de Leú-N-carbometoximetilo

Preparou-se o composto de uma maneira similar à descrita no exemplo 64a. MS (Cl) m/e 294 (M+H)+. ^-H-RMN (300 MHz, CDCI3) <5 0,82-0,90 (m, 3H), 1,23-1,34 (m, 4H), 1,59-1,66 (m, 2H), 3,29- -3,37 (m, 1H), 3,35 (d, J=17Hz, 1H), 3,45 (d, 1H), 3,71 (s, 3H), 5,17 (d, 2H), 7,32-7,42 (m, 5H).

Exemplo 65b Éster benzilico de Cbz—D-Trp-Leu-N—carbometoximetilo

Preparou-se o composto de uma maneira similar à descrita no exemplo 64b. MS (Cl) m/e 614 (M+H)+. 1h-RMN (300 MHz, CDCI3) <S 0,78-0,89 (m, 6H), 1,03-1,35 (m, 3H), 3,05-3,40 (m, 2H), 3,55, 3,70 (s, 3H), 4,00-4,25 (m, 2H), 4,55 (t‘largo, 1H), 4,72-5,15 (m, 6H), 5,46-5,56 (m, 1H), 6,98-7,40 (m, 16H).

Exemplo 65c Ácido 2-r3-(Indolo-2-metil)dicetopiperazinillisocapróico

Preparou-se o composto de uma maneira similar à descrita no exemplo 64c. MS (Cl) m/e 358 (M+H)+. !h-RMN (300 MHz, DMSO-d^) <S 0,78-0,86 (m, 3H), 0,93-1,29 (m, 4H), 1,52-1,67 (m, 1H>, 1,74- -1,87 (m, 1H), 3,13 (d, 2H), 3,60 (s largo, 2H), 4,12 (t largo, 1H), 4,52-4,60 (m, 1H), 6,90-7,16 (m, 3H), 7,32 (d, 1H), 7,52 (d, 1H).

Exemplo 65d 2-E3-(Indolo-2-metil)dicetopiperazinillisocaproil-Asp(0Bn)-Phe- =m2

Preparou-se o composto de uma maneira similar à descrita no exemplo 64d. MS (FAB+) m/e 708 (M+H)+. Í-H-RMN (300 MHz, DMS0-d6) <S 0,76-1,28 (m, 8H), 1,40-1,70 (m, 2H), 2,52-2,63 (dd, 1H), 2,74-3,15 (m, 5H), 4,10 (t largo, 1H), 4,34-4,42 (m, 1H), 4,52--4,62 (m, 2H), 5,08 (s, 2H), 6,93 (t, J=7Hz, 1H), 7,02 (t, 1H), 7,08-7,39 (m, 13H), 7,50 (d, 1H), 7,80 (d, 1H), 8,18-8,32 (m, -139-

-139- J 71 183 4693.PG01 2H).

Exemplo 65e 2-r3-(Indolo-2-metil )dicetopiperazininisocaproil-Asp-Fhe-NH'?

Preparou-se o composto de uma maneira similar à descrita para o exemplo Ó4e. MS (FAB+) m/e 691 (M+H)+. ^H-RMN (DMS0-d6, 300 MHz) <3 0,77-0,88 (m, 3H), 0,94-1,06 (m, 2H), 1,14-1,31 (m, 3H), 1,41-1,52 (m, 1H), 1,55-1,69 (m, 1H), 2,52-2,69 (m, 1H), 2,80-2,96 (m, 1H), 2,99-3,18 (m, 3H>, 4,08-4,18 (m, 1H), 4,31- -4,41 (m, 1H), 4,43-4,53 (m, 1H), 4,65-4,75 (m, 1H), 6,89-7,58 (m, ca. 12H), 8,15-8,36 (m, 3H). Anal. calc. para 032833^507 H2O: C 60,37, H 6,33, N 13,20; encontrado- C 60,54, H 5,87, N 12,96.

Exemplo 66 2-[5-fIndolo-2-metil)dicetopiperazinincaproil-fisp-Phe-NH?

Exemplo 66a Éster benzilico de Nle-N-carbometoximetilo

Preparou—se o composto de uma maneira similar à descrita para o exemplo 64a. MS (Cl) m/e 294 (M+H)+. ^-H-RMN (300 MHz, CDCI3) Ô 0,86 (t, 3H), 1,23-1,35 (m, 4H), 1,61-1,77 (m, 2H), 3,30-3,48 (m, 3H), 3,71 (s, 3H), 5,17 (dd^ 2H), 7,32-7,40 (m, 5H).

Exemplo 66b Éster benzilico de Cbz-D-Trp-Nle-N-carbometoximetilo

Preparou-se o composto de uma maneira similar ã descrita para o exemplo 64b. MS (Cl) m/e 614 (M+H)+. 1h-RMN (300 MHz, CDCI3) <5 0,78-0,81 (m, 3H), 1,04-1,36 (m, 4H), 1,57-1,90 (m, 2H), 3,07-3,41 (m, 4H), 3,69 (s, 3H), 3,75 (d, J=18Hz, 1H), 4,20 (d, 1H), 4,55 (t largo, 1H), 4,86 (d, J=13Hz, 1H), 4,95-5,14 (m, 4H), 5,46-5,60 (m, 1H), 6,95-7,40 (m, 14H), 7,57-7,70 (m, 2H), 7,82 (s largo, 1H), 7,95 (s largo, 1H).

Exemplo 66c Ácido 2—85—(Indolo—2—metilIdicetopiperazinilIcapróico

Preparou-se o composto de uma maneira similar à descrita para o exemplo 64c. MS (Cl) m/e 358 (M+H)+. ^H-RMN (300 MHz, -140- 4693.Ρ801 DMS0~d6) <$ 0,72-0,89 (m, 3H), 0,95-1,31 (m, 4H), 1,53-1,68 (m, 1H), 1,72-1,86 (m, 1H), 3,12-3,18 (m, 2H), 3,58 (d, 2H), 4,13 (t largo, 1H), 4,53-4,64 (m, 1H), 6,96 (1, J=7Hz, 1H), 7,05 (t, 1H), 7,12 (s, 1H), 7,32 (d, J=7Hz, 1H), 7,52 (d, 1H), 8,18 (s largo, 1H).

Exemplo 66d 2-r2-CIndolo-2-metindicetopiperazinil"lcaproil-fisp(OBn)-Phe-NH2

Preparou-se o composto de uma maneira similar à descrita para o exemplo 64d. MS (Cl) m/e 709 (M+H)+. 1h-RMN (300 MHz, CDC13) ô 0,88 (t, J=7Hz, 3H), 1,00-1,13 (m, 2H), 1,13-1,36 (m, 3H), 2,74 (dd, J=16 e 6Hz, 1H), 2,85 (dd, 1H), 3,08-3,27 (m, 3H), 3,37 (dd, J=18 e 5Hz, 1H), 3,57 (d, J=17Hz, 1H), 3,86 (d, 1H), 4,17 (t largo, 1H), 4,25-4,31 (m, 1H), 4,53 (q, 1H), 4,64 (q, 1H), 5,04 (d, J=12Hz, 1H), 5,09 (d, 1H), 7,00-7,41 (m, 16Hz), 7,59 (d, J=8Hz, 1H).

Exemplo 66e 2-r5-fXndolo-2-metil)dicetopiperazinincaproil-Asp-Phe-NH2

Preparou-se o composto de uma maneira similar à descrita para o exemplo 64e. MS (FAB+) m/e 691 (M+H)+. ^H-RMN (300 MHz, DMS0-d6) <5 0,81 (t, H-7Hz, 3H), 0,92-1,06 (m, 2H), 1,13-1,28 (m, 2H), 1,39-1,51 (m, 1H), 1,52-1,67 (m, 1H), 2,38-2,65 (m, 2H), 2,80-2,90 (m, 1H), 3,02-3,15 (m, 2H), 3,42-3,57 (m, 2H), 4,07-

4,15 (m, 1H), 4,19-4,29 (m, 1H), 4,41-4,51 (m, 1H), 4,66-4,74 (m, 1H), 6,91-7,53 (m, 12H). final. calc. para C32H38N6Q7.H2O: C 60,36, H 6,33, N 13,20; encontrado: C 60,29, H 6,41, N 12,82.

Exemplo 67 2-r3-(Nlaf til-2-metil)dicetopiperazinillisocaproil-fisp-Phe-iMH2

Exemplo 67a Éster benzílico de Cbz-D-Trp-S-Nal-Ni-carbometoximetilo

Preparou-se o composto de uma maneira similar ã descrita para o exemplo 64a. MS (Cl) m/e 625 (M+H)+. ^H-RMN (CDCI3, 300 MHz) <3 0,71-0,96 (m, 8H), 1,24-1,38 (m, 1H), 2,95-3,38 (m, 2H), 3,62-3,80 (m, 5H), 4,80-5,18 (m, 4H), 5,25-5,48 (m, 2H), 7,18- -7,82 (m, 18H).

71 183 4693.ΡΘ01

-141-

Exemplo 67b Ãcido 2-f3-fNaftil-2-metil)dicetopiperazinil1isocapróico

Preparou-se o composto de uma maneira similar à descrita para o composto do exemplo 64b. MS (Cl) m/e 369 (M+H)+. Ipi-RMM

2f5-f Naf til-2-metil ^icetopiperazininisocaproil-AspfQbn^-Phe-NHl·? Exemplo 67c A uma solução de OÔC contendo o composto do exemplo 67b (37 mg, 0,102 mmol) em cloreto de metileno (10 ml) adicionou-se TFA.Asp(OBn)-Phe-NH2 (67 mg, 0,112 mmol), HOBT (33 mg, 0,21 mmol), EDCI (21 mg, 0,12 mmol) e N-metilmorfolina (25 ul, 0,22 mmol). Agitou-se a mistura reaccional a 02C durante 1 h, aqueceu-se à temperatura ambiente e agitou-se durante 16 h adicionais. Após diluição com cloreto de metileno (100 ml), lavou-se a mistura reaccional com H3PO4 1 M (3x), solução saturada de bicarbonato de sódio (3x) e salmoura. Após secagem sobre sulfato de sódio, evaporou-se o. solvente em vácuo e cromatografou-se o resíduo sobre sílica gel (metanol:clorofórmio) para dar 61 mg de um sólido branco. MS (FAB+) m/e 720 (M+H)+. 1H-RMN (DMS0-d6, 300 MHz) <S 0,81-0,92 (m, 6H), 1,24-1,65 (m, 4H), 2,40-2,64 (m, 2H), 2,79-3,61 (m, 4H), 4,21-4,44 (m, 3H), 4,50 (d, 1H), 4,61-4,71 (m,lH), 4,96-5,14 (m, 3H) 7,15-7,47 (m, 16H), 7,65 (s largo, 1H), 7,75-7,85 (m, 3H), 8,26-8,40 (m, 1H), 8,84 (m, 1H).

Exemplo 67d 2-f3-(Naftil-2-metil)dicetopiperazinillisocaproil-Asp-Phe-NHo A uma solução contendo paládio 5¾ em carbono (20 mg) e 1,4— -ciclo-hexadieno (1 ml) em metanol (2 ml) adicionou-se o composto do exemplo 67c (30 mg, 0,042 mmol). Agitou-se a mistura reaccional 17 h, tempo ao fim do qual se retirou o catalisador por filtração e se evaporou o solvente em vácuo. Cromatografou-se o resíduo sobre sílica gel (acetato de etilo;água:piridina:ácido acético) para dar, após liofolização, 15 mg de um sólido branco 71 183 4693.PG01 -142-

floculento. MS (FAB+) m/e 630 (M+H)+. 1H-RMN (DMS0-d6, 300 MHz) <3

12,00 (s largo, 1H). Anal. calc. para C34H39N5O7.H2O : C 63,04, H 6,38, N 10,81; encontrado; C 62,78; H 6,16, N 10,64.

Exemplo 68

Preparação alternativa do 4-carboxi-6-oxo-5 -.4.5,6-tetra-hidro--lH,5H-azooinr4.5,6-c~|indolo (Ctp-QH)

Exemplo 68a g-(hidroxiimino)-fí~f4-(4-carbòetoximetil )indoI-3-il )-propanoato de etilo

A uma solução de 4-(carboetoximeti1)indolo (830 mg, 4,12 mmol) e 2-oxima bromopiruvato de etilo (866 mg, 4,12 mmol) em cloreto de metileno (40 ml) adicionou-se Na2C03 anidro (2,40 g, 22,66 mmol) à temperatura ambiente. Após agitação à temperatura ambiente durante 16 horas, filtrou-se a mistura e concentrou-se à secura. Cromatografou-se em flash o resíduo ((MeOH 10%/CHC13):Hexano=l:1 2:1) para dar 0,98 g do produto desejado. TLC Rf=0,61 MeOH 10ss/CHC13). mS (Cl) m/e 333 )M+H)+. -RMN (CDCI3, 300 MHz) <5 8,17 (s largo, -MH), 8,03 (s largo, -0H),

Exemplo 68b oc-( amino)-B-f 4-(etoxicarbonilmetil )indol-5-il )-propanoato_de etilo

Amalgamaram-se tiras de alumínio (797 mg, 29,5 mmol) por imersão numa solução de HgCl2 (216 mg, 0,80 mmol) em H2O (80 ml) durante 15 segundos, enxaguou-se então sucessivamente em EtOH e em éter, e adicionou-se a uma solução do produto do exemplo 68a (0,98 g, 2,95 mmol) em THF/H2O (10:1, 49,5 ml). Após agitação durante 3 horas, secou-se a mistura com Ma2SQ4 e filtrou-se 71 183 4693.Ρ601

-143- através de celite. Concentrou-se o filtrado em vácuo para dar 0,82 g de óleo amarelo. TLC Rf =0,45 (MeOH IOVCHCI3). MS (Cl) m/e 319 (M+H)+. iH-RMN (CDCI3, 300 MHz) Ó 8,12 (m largo, indolo -NH), 7,30 (dd, J=8,l, 0,9 Hz, 1H), 7,14 (t, J=8,l Hz, 1H), 7,09 (d largo, J=2,2 Hz, 2H), 4,03 (d, J=15,5 Hz, 1H), 3,50 (ddd, J=14,7, 4,8, 0,7 Hz, 1H), 3,25 (m, 1H), 3,00 (ddd, J=14,7, 8,5, 0,7 Hz, 1H), 1,25 (t, J=7,2 Hz, 3H), 1,26 (t, J=7,2 Hz, 3H).

Exemplo 68c 4-carboetoxi-6-oxo-3.4.5.6-tetra-hidro-lH-5H-azo-cin Γ 4,5,6-cl--indolo

Aqueceu-se uma solução do produto do exemplo 68b (794 mg, 2,94 mmol) em o-xileno (50 ml), a 1452C durante 3 dias sob azoto. Filtrou-se a mistura reaccional através de uma camada fina de sílica (60 pm) e lavou-se o bolo filtrado com MeOH a 5¾ em CHCI3. Concentrou-se o filtrado e retomou-se o resíduo em MeOH/CHCI3/tolueno para precipitar o produto. As duas primeiras colheitas forneceram-se 353 mg do produto desejado na forma de um sólido amarelo. TLC Rf=0,50 (MeOH IOVCHCI3). p.f. 229-2302C. MS (Cl) m/e 273 (M+H)+. 1h-RMN (CDCI3, 300 MHz) ó 7,24 (d, J=7,6 Hz, 1H), 7,12 (s, 1H), 7,01 (t, 1H), 6,87 (d, 1H), 4,47 (dd, J=9,9, 7,7 Hz, 1H), 4,28 (q, J=7,0 Hz, 2H), 4,20 Cd, J=12,7 Hz, 1H), 3,76 (d, J=12,7 Hz, 1H), 3,55-3,65 (m, 2H), 1,34 (t, J=7,0 Hz, 3H). Anal. Cale. para C15Hi6N203. 1/5 H20: C 65,30; H 5,99; N 10,15; Encontrado: C 65,35; H 5,89; N 10,09.

Exemplo 68d 4-Carboxi-6-oxoT3.4.5.6-tetra-hidro-lH.SH-azocin-f 4.5,6-clindolo (Ctp-OH) A uma solução do produto do exemplo 68c (40 mg, 0,147 mmol) em MeOH (1,5 ml) adicionou-se solução de NaOH 2 N (981 pl, 0,162 mmol) à temperatura ambiente. Após agitação durante 2 horas, concentrou-se a mistura e retomou-se o resíduo resultante em solução de NaHC03 saturada e extractou-se com CHCI3 (2x). Acidificou-se a fase aquosa cuidadosamente com HC1 4N a pH 2 e então extractou-se com EtOAc (lOx). Os extractos EtOAc secaram-se sobre Na2SQ4 e concentraram-se em vácuo para dar 31 mg do produto

J 71 183 4693,PG01

-144- desejado na forma de um sólido branco, TLC Rf = 0,14 (Cpiridina/H20/H0Ac=20 = 11:6):EtOAc=l: 3 ). p.f. 278-280QC (dec.). MS (DCI/NH3 m/e 245 (M+H)*, 262 (M+NH4)+. Anal. Cale. para ^13^12*^2^3' 1/10 EtOAc - C 63,60; H 5,10; N 11,07j Encontrado1 C, 54,00; H 5,41; N 10,77.

Exemplo 69 4-Carboetoxi-5,4,5,6-tetra-hidro-lH,5H-azocin-j~4,5,6-c1-indolo A uma solução do produto do exemplo 68c (53 mg, 0,19 mmol) em THF (6 ml) adicionou-se reagente de Lawesson (118 mg, 0,29 mmol), â temperatura ambiente. Após agitação durante 25 minutos, concentrou-se a mistura reaccional e purificou-se o resíduo resultante por cromatografia flah (EtOAc*Hexano=2:3) para dar 33 mg da correspondente tiol lactarna. (TLC Rf=0,40 (Et0Ac:Hexano=l:l)). A uma solução da tiol lactama (33 mg, 0,11 mmol) em cloreto de metileno (2 ml) adicionou-se uma solução 1 M de tetrafluoroborato de trietiloxónio em cloreto de metileno (130 U.1, 0,13 mmol) a 0ÔC sob azoto. Após agitação durante a noite ã temperatura ambiente, evaporou-se o solvente e adicionou-se ao resíduo resultante EtOH (92 ml) e Na8H4 (5 mg, 0,13 mmol) e deixou-se agitar durante 2 horas. Lavou-se a mistura reaccional com solução aquosa saturada de NaHC03 e extractou-se com EtOAc várias vezes. Secou-se a fase orgânica (Na2S04), concentrou-se e purificou-se o resíduo resultante por cromatografia flash (MeOH 10%/CHCl3) para dar 12 mg do produto desejado na forma de um óleo Viscoso. TLC Rf=0,38 (MeOH 10%/CHC13). MS (ci) m/e 259 (M+H)+. iH-RMN (CDCI3, 300 MHz) <3 8,07 (largo, indolo NH), 7,25 (m, 1H)

Os compostos de fórmula I são ligandos de CCK selectivos para o receptor tipo—B, o qual se encontra, predominantemente, no cérebro, e são úteis no tratamento e prevenção de perturbações relacionadas com o CCK, no Homem ou noutros mamíferos. Os compostos do invento são úteis no tratamento ou prèvenção de

71 183 4693.Ρ601 -145- perturbações relacionadas com o CCK, dos sistemas nervoso central e gastrintestinal. Como agonistas do CCK no receptor tipo B, os compostos do invento copiam os efeitos do CCK nos receptores tipo B de CCK. Os compostos do invento são úteis no tratamento de abuso de substâncias, incluindo a dependência do álcool e da nicotina e incluindo, também, o abuso de drogas tais como cocaína, anfetaminas, heroina, canabinóides (THC e similares), fenciclideno (PCP) e similares. Os compostos do invento são, também, úteis no tratamento de perturbações de memória e cognição, e tratamento do- choque- è :áà'' insuf iciência respiratória e cardiocirculatória. Os compostos do invento são, também, úteis no tratamento de perturbações alimentares relacionadas com o controlo do apetite. A capacidade dos compostos do invento interactuarem com receptores CCK e de actuarem como agonistas de CCK pode ser demonstrada in vitro usando os seguintes protocolos:

Protocolo para experiências de ligação de radioligandos em preparações de membrana pancreática e cortical cerebral de cobaias

Adquiriram-se CCK 8 (Asp-Tyr(S03H)-Met-Gly-Trp~Met-Asp-Phe--NH2), bestatina e fosformidon na Peptide International (Louisville, KY). Adquiriram-se ΕΘΤΑ, HEPES, BSA na Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Obteve-se [125i}_B0it0n_Hunter CCK8 (BH-CCK8) (actividade específica, 2200 Ci, mmol) na New England Nuclear (Boston, MA). Obtiveram-se porquinhos da Índia machos, de 250 a 325 g, no Scientific Small Animal Laboratory and Farm (Arlington Heights, IL). Adquiriu-se cõiagenase* código CLSPA, no Worthington (Frehold, NJ).

Prepararam-se as membranas pancreática; e cortical, como se descreveu em (Lin and Miller; J. Pharmacol. Exp. Ther. 232, 775--780, 19S5). Em resumo, removeram-se o pâncreas e o córtex, e enxaguaram-se com solução salina gelada. Removeram-se a gordura e os tecidos 'coqectivos visíveis do pâncreas. Pesaram-se os tecidos e homogeneizaram-se em aproximadamente 25 ml de tampão Tris-HCl 50 mM gelado, pH 7,4 a 42C com um Brinkman Polytron

71 183 4693.PG01 -146- durante 30 seg, posição 7. Centrifugaram-se os homogeneizados durante 10 min a 1075 xg e rejeitou-se a pelota. 6uardaram-se os sobrenadantes e centrifugaram-se a 38730 xg durante 20 min. As pelotas resultantes homogeneizaram-se novamente em 25 . ml de tampão Tris-HCl 50 mM com um homogeneizadòr Teflon-vidro, 15 impulsos para cima e para baixo. Centrifugaram-se os homogeneizados, novamente, a 38730 xg durante 20 min. Suspenderam-se, novamente, as pelotas em HEPES 20 mM, contendo EGTA 1 mM, NaCl 118 mM, K21 4,7 mM, MgCl2 5 mM, bestatina 100 uM, fosforamidon 3 μΜ, pH 7,4 a 222C com um homogeneizador Teflon— -vidro, 15 impulsos para cima e para baixo. 0 volume da ressus-pensão usado para o córtex era 15 ml por g de peso húmido original e 60 ml por g para o pâncreas.

Condições de Incubação 'Diluiram-se [125jj Boiton-Hunter CCKS e os compostos de teste, com tampão HEPES-EGTA-sal (ver acima) contendo albumina de soro bovino (BSA) 0,5¾. A tubos de poliestireno Skatron de 1 ml adicionaram-se 25 μΐ dos compostos de teste, 25 μΐ de [125-jbh--CGK8 e 200 μΐ de suspensão de membrana. A concentração final de BSA era 0,1¾. Incubaram-se os tecidos corticais a 3Q2C durante 150 min, e incubaram-se os tecidos pancreáticos a 372C durante 150 min. Terminaram-se as incubações por filtração, usando filtros de entrelaçados de microfibras Skatron Cell Harvester e SS32. A ligação especifica do [125j] BH-CCK8, definido como a diferença entre a ligação na ausência e na presença de CCK8 1 μΜ, era de 85-90¾ da ligação total no córtex e 90-95¾ no pâncreas. Determinaram-se os IC50 por análise Hill. Os resultados destes ensaios de ligação são mostrados na tabela 1. 4693.PÊ01 -147-Tabela 1

Composto do Exemplo IC50 (nM) IC50 (uM) córtex pâncreas 1 2,5 2,7 2 37 19 9 13 >1 15 5 1 19 54 1,8 23 16 >10 42 13 3,8 43 170 11 45 12 1,7 47 1,2 89 48 0,7 3,5 50 27 5 52 2,6 3,5 54 5 3,7 57 0,4 1,4 58 1,9 11 59 0,9 4,3 60 8,4 1,3 67 33 >10 Estes resultados indicam * que os compostos do invento possuem afinidade e selectividade para o receptor CCK cortical. Protocolo para a medição das variações da rCa++]i nas linhas celulares NCI-H345 e H209 As condições de cultura foram como se descreveu em (D.G. Yoder, T. W. Moody, Peptides, 8, 103 (1987}, excépto que se modificou o meio para RPiil 1640 com soro bovino fetal 2,5¾ (inactivado por calor), selenite de sódio 5 W.g/1, transferrina humana 5 mg/1 , insulina 5 mg/1, penicilina (100 U/l) e estreptomicina (100 ug/1). Para medir o Ca2+ intracelular, carregaram-se as células com 1 uM. de indo-1, AM, durante 60 min a -148- 4693,PG01 372C. Centrifugaram—se as células a 750 x g durante 5 min e re~ -suspenderam-se em 40 ml de Tampão F (solução salina tamponizada cora fosfato, da Dulbecco, contendo 0,1¾ de glucose, pH 7,4), Contaram-se as células, lavaram-se, então, duas vezes por centrifugação. Re-suspendeu-se a pelota final (aproximadamente 1x10^ células/ml) em tampão F. Equilibraram-se as células, termicamente, numa cuveta termostatizada (372C) durante 2 min antes da medição da linha de base da fluorescência. As medições de fluorescência realizaram-se com um espectrofluorímetro SLM 3000C equipado com um micro-agitador magnético e filtros polarizadores. As medições com células carregadas de indo-1 obtiveram-se ao comprimento de onda de excitação de 350 nrn e ao comprimento de onda de emissão de 480 nm e 405 nm e o intervalo de tempo para as medições foi de 0,5 seg. Testaram-se os compostos teste a uma única concentração (10“5j*|) 8 compararam-se ã resposta induzida pelo CCK-8 a 10~^M, para determinar a % de resposta máxima. As calibrações da [Ca++]i realizaram-se como descrito em (0. Grynkiewicz, M. Poenie, R, Y, Tsien, J. Biol. Chem., 260, 3440 (1985)): [Ga]i = Kd(R-Rmin)/(Rmax-R) onde Rmin e Rmax sram as razões (480/405) obtidas na presença de excesso de EGTA (10 mM) e digitonina (50 wM), respectivamente. Assume-se que Kd é 240 nm, e R é a razão na presença e na ausência de CCK. Os níveis basais"1 e cálcio eram de 147 ± 3 (N=3) e os níveis máximos de cálcio estimulado com 100 nM de CCK-8 eram de 357 ± 30 (N=3).

Tabela 2

Composto do exemplo Actividade intrínseca

Relativa ao CCK-8 6 96¾ 44 104 48 103 52 100 57 109 58 100

Boc-CCK-4 ' 105 CCK-8 (DS) 53 -149- -149-

71 183 4693.PG01

Os resultados indicam que os compostos deste invento se comportam como agonistas na estimulação da mobilização de cálcio em receptores CCK-8 -.em linhas de células do cancro do pulmão células pequenas.

Embora não pretendendo ser limitada por quaisquer mecanismos teóricos, a capacidade dos compostos do presente invento para tratar o abuso de substâncias, pensa-se resultar da capacidade dos compostos do presente invento intensificarem a resposta dos neurónios no cérebro (especificamente na área tegumental ventral de Tsai (VTA)) ao abuso de substâncias tais como o etanol, nicotina e outros. Tanto o etanol (Giessa, et. al., Brain

Research, 548, 201 (1985), Brodie, et. al., Brain Research, 508, 65 (1990)) comoa nicotina (liereu, et. al., Eur. J. Pharmacol., 141, 395 (1987), Brodie and Mueller, Soe. Neurosci. Abstr., 14, 1327 (1988) afectam os neurónios VTA, aumentando a sua velocidade de descarga. Por intensificação da excitação destes neurónios, 0 que é induzida pela substância em abuso, pequenas quantidades da substância viciadora serão necessárias em presença dos agonistas de CCK do presente invento, para produzir os mesmos efeitos compensadores que na sua ausência. Isto permitirá a um indivíduo viciado ingerir quantidades reduzidas da substância em abuso para conseguir a sensação compensadora habitual, ao mesmo tempo que são aliviados os efeitos laterais nocivos associados doses maiores destas drogas.- ' A capacidade dos compostos do invento potenciarem a resposta dos neurónios VTA ao etanol pode ser demonstrada utilizando o método descrito seguidamente.

Protocolo

Prepararam-se fatias de cérebro de ratazanas Sprague-Dawley (100-200 gm) contendo a área tegumental ventral como previamente descrito (Brodie and Dunwiddie, Brain Research. 425, 106 (1987)). Os animais usados neste estudo trataram-se em estrita concordância com o NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animais. Cortaram-se secções coronais (400 qm de espessura) e colocou-se o tecido directamente na câmara registadora.

71 183 4693,ΡβΟΙ -150-

Colocaram-se pequenos pesos de platina na fatia para aumentar a estabilidade dos registos, Cobriu-se a fatia com meio e um sistema de perfusão, manteve-se, então, o fluxo de meio a 2 ml/min; a temperatura na câmara registadora manteve-se a 352C. ft composição do fluido cerebroespinal artificial ( aCSF) nestas experiências foi (em mH): NaCl 125, KOI 2,5, NaH2P04 1,25, HgS04 2, NaHC03 25, glucose 11, CaCl2 2; Saturou-se o aCSF com 95¾ 02/5¾ C02- 0 caudal monitorizou-se continuamente com um medidor de caudal e usaram-se válvulas ajustáveis para manter a velocidade constante. A câmara de pequeno volume (cerca de 300 microlitros) usada neste estudo permitiu a infusão e a purga rápidas das soluções da droga. ftdicionaram-se etanol e composto agonista de CCK ao aCSF, na tubagem de distribuição do fluido por meio de uma bomba de infusão calibrada, das soluções stock de 100 a 1000 vezes as concentrações finais desejadas. As concentrações finais calcularam-se a partir do caudal de aCSF, da velocidade da bomba de infusão e da concentração da solução stock de droga. A infusão das soluções da droga nunca excederam 2¾ do caudal do aCSF e, normalmente, manteve-se abaixo de 1¾. Todas as drogas se dissolveram em água destilada desgaseifiçada; para concentrações acima de .30 mH, usou-se EtOH a 95¾ na bomba. Devido a que a gama farmacologicamente activa para o etanol no sangue, em ratazanas^se estende de 10-20 mH, para déficites motores moderados, a 200 mM (letal), estes estudos foram, geralmente, limitados a uma aplicação de etanol na gama de 20 a 200 mH, Ha prática, a gama de concentrações de etanol testada com o composto do exemplo 48 foi de 80 a 160 mH. Dentro desta gama, a percentagem de aumento na potência do etanol, produzida pelo agonista de CCK, não foi significantemente dependente da concentração de etanol.

Fizeram-se eléctrodos extracelulares registadores a partir de tubos de vidro de 1,5 mm de diâmetro; a resistência da ponta dos microeléctrodos variou entre 6~10 HOhm. Esperou,-se , pelo menos, uma hora após · a' preparação da fatia para equilíbrio. Após este periodo, baixou-se o eléctrodo no VIA sob direcção visual. Q VTA é claramente visível em tecido fresco como uma área

I

I

71 183 4693.PG01 -151- cinzenta no meio da substância negra. A frequência da descarga determinou-se usando um discriminador de janela e velocímetro, estando a saida deste a alimenta·!;- - um registador de carta. Adicionalmente, utilizou-se um sistema de aquisição de dados baseado num IBM-PC para calcular, apresentar e armazenar a frequência da descarga durante intervalos de 5 s e 1 minuto. 0 Protocolo para administração de etanol e do agonista de CCK foi o seguinte: adicionou-se etanol ao superfundido por meio de uma bomba de infusão calibrada e mediu-se a grandeza da excitação induzida pelo etanol. Deteve-se a infusão de etanol e deixou-se a velocidade de descarga das células voltar aos níveis pré-etanol. Adicionou-se, então, o composto agonista do CCK do exemplo 48, ao meio de superfusão por meio de uma bomba de infusão calibrada. Pelo menos, 10 min. após a iniciação da infusão do agonista de. CCK, fez-se infusão de etanol ã mesma velocidade (de maneira a atingir a mesma concentração) que antes da infusão do agonista de CCK. Os aumentos da velocidade de descarga (como percentagem de velocidade de descarga pré-etanol) induzidos pelo etanol antes e depois da infusão do agonista de CCK são comparados para dar os números da tabela 3. A tabela seguinte sumariza os resultados das experiências em que o composto do exemplo 48 foi testado para avaliar a sua capacidade de alterar a potência do etanol1

Tabela 5 Número de células Células testadas

Composto do Exemplo 48 Concentração

% Aumento na potência do Et OH

50 nm 100-250 nM 400-500 nM 6,812,6 24 5 5 3

Estes dados demonstram que o composto do exemplo 48 aumenta o efeito excitatório do etanol nos neurónios VTA. -152- 4693.PG01

Os compostos do presente invento podem ser usados na forma de sais derivados de ácidos inorgânicos ou orgânicos. Estes sais incluem, mas não lhe estão limitados, os seguintes: acetato, adipato, alginato, citrato, aspartato, benzoato, benzenosulfona- to, bissulfato, butirato, camforato, camforsulfonato, digluconato, ciclopentanopropionato, dodecilsulfato, etanossulfo-nato, gluco-heptonato, glicerofosfato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, fumarato, hidrocloreto, hidrobrometo, hidroiodeto, 2--hidroxi-etanossulfonato, lactato, maleato, metanossulfonato, nicotinato, 2-naftalenossulfonato, oxalato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, picrato, pivalato, propionato, succinato, tartrato, tiocianato, tosilato, e undecanoato. Também, os grupos básicos contendo azoto podem ser quaternizados com agentes, tais como, halogenetòs de alquilo inferior, tais como cloretos, brometos e iodetos de metilo, etilo, propilo, e butilo; sulfatos de dialquilo como sulfatos de dimetilo, dietilo, dibutilo, e diamilo, halogenetos de cadeias longas tal como cloretos, brometos e iodetos de decilo, laurilo, miristilo e estearilo, halogenetos de aralquilo como brometos de benzilo e fenetilo, e outros. Obtêm-se assim produtos solúveis ou dispersíveis em água ou óleo.

Qs sais farmaceuticamente aceitáveis do presente invento podem ser sintetizados a partir dos compostos de fórmula I, que contêm uma porção básica ou acídica, por processos quimicos convencionais. Geralmente, preparam-se os sais fazendo reagir a base ou o ácido livres com quantidades estequiométricas ou com um

orgânico ou inorgânico formadores do sal desejado, num solvente ou várias combinações de solventes adequados.

Exemplos de ácidos que podem ser empregues para formar sais de adição de ácido, farmaceuticamente aceitáveis, incluem ácidos inorgânicos tais como ácido cloridrico, ácido sulfúrico e ácido fosfórico e ácidos orgânicos tais como ácido oxálico, ácido maleico, ácido succinico e ácido cítrico. Outros sais incluem sais com metais alcalinos ou com metais alcalino-terrosos, tais como sódio, potássio, cálcio ou magnésio ou com bases orgânicas.

I 71 183 4693.PG01 -153-

Os sais farmaceuticamente aceitáveis dos ácidos de fórmula I preparam-se, também, prontamente por procedimentos convencionais tal como, o tratamento de um ácido de fórmula I com uma quantidade apropriada de uma base, tal como um hidróxido de metal alcalino ou de metal alcalino-terroso, p.ex., de sódio, de potássio, de litio, de cálcio, ou de magnésio, ou uma base orgânica tal como uma amina, p.ex., dibenziletilenodiamina, ciclo-hexilamina, diciclo-hexilamina, t'~trámetilaminà, piperidina, pirrolidina, benzilamina e similares, ou um hidróxido de amónio quaternário tal como hidróxido de tetrametilamónio e similares.

Quando um composto de fórmula I é usado como um agonista de CCK ou de gastrina num sujeito humano, a dose diária total, administrada em doses individuais ou divididas, pode ser em quantidades, por exemplo, de 0,001 a 1000 mg por dia e mais usualmente de la 100 mg. As composições de dosagem unitária podem conter quantidades suas submúltiplas para completar a dose diária. A quantidade de ingrediente activo que pode ser combinada com materiais transportadores para produzir uma forma de dosagem unitária, variará dependendo do hospedeiro tratado, do tratamento particular e do modo de administração particular.

Deve ser entendido, no entanto, que o nivel específico da dose para qualquer paciente particular dependerá de uma variedade de factores, incluindo a actividade do composto específico empregue, da idade, do peso, da saúde geral, do sexo, da dieta, do tempo de administração, da velocidade de excreção, da combinação de drogas, e da severidade da doença particular a submeter a terapia.

Os compostos do presente invento podem ser administrados oralmente, parentericamente, por aerossol de inalação, rectalmente, ou topicamente em formulação de dosagem unitária contendo transportadores, adjuvantes e veículos convencionais não tóxicos, farmaceuticamente aceitáveis, como desejado. Q termo parenteral, quando usado no presente invento, inclui injecção subcutânea, intravenosa, intramuscular, intra-esternal, ou

71 183 4693.PG01 técnicas de infusão.

As preparações injectáveis, por exemplo, suspensões aquosas ou ole osas injectáveis estéreis, podem ser formuladas de acordo com a arte conhecida usando agentes dispersantes ou molhantes adequados e agentes de suspensão. A preparação injectável estéril pode também ser uma solução ou suspensão injeçtável estéril, num diluente ou solvente não tóxico, parentericamente aceitável, por exemplo, uma solução em 1,3--butanodiol. Entre os veículos e solventes aceitáveis, que podem ser empregues, estão a água, a solução de Ringer, e solução de cloreto de sódio isotónica. Adicionalmente, empregam-se convencionalmente óleos ccmbinadosjêstéreis como meio solvente ou de suspensão. Para este propósito qualquer óleooaribinado brando pode ser empregue incluindo mono- ou ddglicéridos sintéticos. Adicionalmente, ácidos gordos tais como o ácido oleíco, encontram uso na preparação de injectáveis.

Os supositórios para administração rectal da droga podem ser preparados misturando a droga com um excipiente não-irritante adequado tal como, manteiga de cacau e polietilenoglicóis que são sólidos às temperaturas normais mas líquidos à temperatura rectal e irão, portanto, derreter no recto e libertar a droga.

As formas de dosagem sólida para administração oral podem incluir cápsulas, comprimido^ pílulas, pós e grânulos. Em tais formas de dosagem sólida, o composto activo pode ser misturado com, pelo menos, um diluente inerte tal como sacarose, lactose ou amido. Tais formas de dosagem podem, também, compreender, como é prática normal, substâncias adicionais além dos diluentes inertes, p. ex., agentes lubrificantes tais como estearato de magnésio. No caso de cápsulas, comprimidos, e pílulas, as formas de dosagem podem também compreender agentes tamponantes. Os comprimidos e as pílulas podem, adicionalmente, ser preparados com revestimentos entéricos.

As formas de dosagem líquidas para administração oral podem incluir emulsões, soluções, suspensões, xaropes e elixires farmaceuticamente aceitáveis, contendo diluentes inertes

71 183 4693,ΡΘ01

-155-comummente usados na arte, tal como água. Tais composições podem também compreender adjuvantes, tais como agentes molhantes, emulsionantes, e agentes de suspensão, e agentes edulcorantes, aromatizantes e perfumantes.

Os agentes presentes podem, também, ser administrados na forma de liposomas. Como é conhecido na arte, os liposomas são geralmente derivados a partir de fosfolípidos de outras substâncias lípidas. Os liposomas formam-se por cristais líquidos mono- ou multi-hidr±ados lamelares que se dispersam num meio aquoso. Qualquer lípido não tóxico, fisiologicamente aceitável e metabolizável capaz de formar liposomas pode ser utilizado, fts composições presentes na forma liposómica podem conter, em adição ao tetrapéptido do presente invento, estabilizantes, conservantes, excipientes e similares. Os lípidos preferidos são os fosfolípidos e as cfdsfatilGóliiias· ‘ J(lecitinas), tanto naturais como sintéticos.

Os processos para formar os liposomas são conhecidos na arte. Ver, por exemplo, Prescott, Ed., Methods in Cell Siologv. Volume XIV, Academic Press, New York, NY (1976), p. 33. et. seq. 0 precedente é meramente ilustrativo do invento e não pretende limitar o invento aos compostos descritos. Variações e mudanças qué são óbvias aos peritos na arte pretendem-se incluídas dentro do âmbito e natureza do invento que estão definidos nas reivindicações anexas.

Claims (5)

1. -156- -156-

   71 183 4693.PS.01 R E I V INDICAÇÕES 1 - Processo de preparação de um composto de fórmula: ft-B-C-D na qual A é acetilo funcionalizado ou R9-C(0)—, na qual Rg é um heterotricíclico ou um carbotriciclico; B é um resíduo 2-aminopropionilo funcionalizado; ou A-B tomados em conjunto são piperazinadionilo funcionalizado ou 5-amino-3-aza-4-ceto-hexanoílo funcionalizado; C é

   na qual r2G é hidrogénio ou alquilo inferior e R21 é carboxi ou tetrazolilo; ou B-C tomados em conjunto são um resíduo Ala-Asp com ponte ou um resíduo Ala-(tetrazolil)Ala com ponte; e D é etilamino funcionalizado, tetra-hidro-isoquinolilo funcionalizado, piperazinon-l-ilo funcionalizado, desidro-Phe--amida ou um análogo de desidro-Phe; ou C-D tomados em conjunto são succinimidilo funcionalizado, ou de um seu sal farmaceuticamente aceitável, caracterizado por compreender = a) o acoplamento em passos dos aminoácidos adequadamente protegidos ou de análogos de aminoácidos representados por A, A--B, B, 0, C-D e D, como aqui definidos, seguido· por remoção dos grupos pròtectores; ou b) acoplamento dos fragmentos adequadamente protegidos de comprimento dipéptido ou maior, compreendendo, os referidos

   71 183 4693.PS.01 -157- fragmentos, os aminoãcidos ou análogos de aminoácidos, representados pelas fórmulas A, A-B, B, C, C-D e D como definidas aqui, seguido por remoção dos grupos protectores.
2. 2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por, no composto preparado, A ser BDC-Trp ou Ctp; B ser Met, Leu, Nle, Tpp ou 1,4-tiazano-3-carPonilo e D ser Phe-NH23 Tiq-NH2, (deSidro)Phe-NH2, (NMe)Phe-NH2, «-Nal-NH2i) ou B-Nal-NH2.
3. 3 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o composto preparado ser um composto seleccionado do grupo consistindo em: Ctp-Leu-Asp-Phe-NH2 ϊ BOC-T rp-Leu-ftsp-Ti q-NH2* Ctp-Leu-Asp-N-Me-Phe-NH2 * Ctp-Leu-Asp-(desidro)Phe-NH2ΐ BOC-Trp-Tpp-Asp-Phe-NH2l Ctp-Tpp-Asp-(NMe)Phe-NH2í Ctp-Tpp-Asp~«-Nal-NSH2 j Ctp-Tpp-fisp-í5-Nal-NH2; e Ctp-1,4-tiazano-3-carboni1-Asp-Phe-NH2-
4. 4 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o composto preparado ser Ctp-Tpp~ftsp-Phe-NH2
5. 5 - Processo de preparação de uma composição agonista dos receptores do. tipo B de CCK, caracterizado por compreender a associação de um veículo farmacêutico com uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto preparado de acordo com a reivindicação 1. Lisboa, 29. Jll 1990 Por ABBOTT LABORATORIES