PT91942A - Processo para a preparacao de um novo derivado cumarinico e para a deteccao de actividade enzimatica madiante a utilizacao deste derivado - Google Patents

Processo para a preparacao de um novo derivado cumarinico e para a deteccao de actividade enzimatica madiante a utilizacao deste derivado Download PDF

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Description

.. ιί -è. f p.r* % i{2_
Descrição da patente de invenção de H0BCHS5? AlSIENGSSSLXiS-Gtf&FS, alemã* industrial e comercial* com sede em p-6230 Frankfurt am Main 80, Republica Federal Alemã, (inventores*
Dr. Werner Aretz e Dr. THo Hedtmann, residentes na Alemanha Ocidental), para «PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE tM RDVQ DERIVADO COMftRÍNIOO E JEM^A,l^aSÇ:lQ..a^ggiy|D^§ JMZIM&rlCA MEDIANTE A UTIUZA-CÃO DESTE DERIVADO”.
PesS£igâ9
Os antibióticos de β-lactama do grupo das cefalosporinas utilizadas em terapia são exclusivamente de natureza semi-sintética e contém um núcleo de ácido 7-amino-cefalosporânico (7AC&), obtido a partir de cefalosporina C (CPC). A cisão da GFC I realizada quer por via química quer por via enzimãtica. Para esta última via utiliza-se uma combinação enzimática de oxidase de ácidos aminados D e de |f -glu-tamil-transpeptldase (SP 275 901) ou uma actividade de CPC--amidase (D3 37 43.323), GSP * R.3. Walton £Developments in Industrial Microbiology, 5, 341-353, (1964)_7 descreveu um processo de - 1 -
selecção para a descoberta de rnicroorganistnos que produzem amidas de cefalosporina C (GPC), no qual é utilizado como substrato N-adipinil-p-nitroanilida e se determina a p-ni-troanilina formada com base na sua cor amarela. Este processo tem o inconveniente de ser pouco especifico e de a cor amarela poder ser mascarada por componentes do meio de cultura·
Surpreendentemente verificou-se que é possível evitar que a cor amarela seja mascarada pelos componentes do meio de c altura por intermédio de um novo substrato, a 7-( Y"-(D-a-aminoadipinil)-amido)-4-metileumarina, a qual após hidrólise liberta uma substância fortemente fluorescente, a 7-amino-4-metilcumarina*
As X-glutamil-transpeptidase (seguidamente designadas por X-GTP) desempenham um papel importante nos tecidos animais e nos microorganismos no metabolismo dos ácidos aminados e no ciclo do glutatiâo /"ííeth, Enzymol* 77, 237 (1981) Estas ázimas sSo responsáveis pelo transporte de diferentes ácidos aminados sob a forma dos seus derivados de -glutamilo, pela formação de ácido poliglutâmico em bacilos bem como pela destruição do glutatilo { -glutamil--cisteinil-glicina) *
Una selecção baseada na produção de X -glufcamil-transpeptidases permitiu isolar muitas estirpes positivas, das quais algumas possuem a capacidade de cindir o glutaril-7ACA por meio da referida enzima (P 37 01 221.5)· Una estirpe de Baeillus subtilis «natto" possuia mesmo a capacidade de cindir a D-α-aminoadipi1-p-nitroanilida, um composto análogo â GPC com respeito à cadeia lateral, A cisão da GPC com esta -glutamil-transpeptidase tem igualmente lugar (P 37 43 3 23.7)· A partir destas investigaçSes concluiu-se que existem pelo menos três X-glutamil-transpeptidase dife-. rentes* - 2 -
- as çue não cindem nem o glutaril-7ACA nem o a-amino-adiplnil-7AC&, mas apenas separam os resíduos glu-tarilo como por exemplo na ^-glutamil-p-nitroanilidaj - as que cindem o glutaril-7ACA e separam os resíduos glutarilo; - as que cindem tanto o glutaril-7ACA e o a-aminoadi-pin±l-7ACA tomo também resíduos glutarilo* A presente invenção refere-se por conseguinte a: 1* um procssso para a preparação de 7- ( £ - (D-G-aminoadipinil) -amido) -4-metilcumarina da formula X,
na qual, independentemente um do outro, R1 significa hidro-génio ou um grupo acilo e R significa hiidrogénio ou um grupo alquilo ou arilo, podendo qualquer dos grupos proteeto-res ser substituído, bem como dos seus sais de adição de ácido ou sais alealinos ou de amónio, caracterisado por se fazerem reagir entre si um ácido α-aminoadípico e 7-amino-4-metilcumarina e eventualmente X 2 * se eliminarem os grupos protectores R e R por hidrólise ou por hidrogenólise. 2. Um processo para a detecção de actividade de a-adi- pinilamidase earacterizado por se utilizar o com- 1 2 posto da fórmula X no qual R e R significam hidro- - 3 -
génio ou um seu sal de adição ou sal alcalino ou de amónio. A presente invenção é em seguida descrita em pormenor, especialmente nas suas formas preferidas de concretização, Para além disso, a invenção é definida nas reivindicações.
Para a preparação dos compostos da 0 2. 2 formula X em que R e R significam hidrogénio, utilizam-se como componentes de partida ácido D-e-aminoadípico e 7-amino--4-metilcumacina* 0 acido D-G-aminoadípico contém os grupos proteotores e que podem ser eliminados em condições suaves por métodos habituais, conforme descrito por exemplo por J. S. Baldi/in, S,R. Hevchen, F.H* Singh, Biochenw J. 186, 881 (1980). ·» 2 ~ •Panto R" como R sao grupos protectores normalmente utilizados na sintese de peptídeos. Para RA podem usar-se grupos acilo, com resíduos alquilo ou arilo que podem ser eliminados em condições ácidas fracas* Os grupos utilizados de preferência são o grupo terc-butoxicarbonilo ou grupos aromáticos da fórmula geral III*
o em que R pode ser nitro ou hidrogénio. Este grupo protec-tor aromático pode ser eliminado com brometo de hidrogénio ou por hidrogenação catalítica, 2 0 grupo protector R pode ser um grupo alquilo ou arilo, podendo qualquer destes ser substituido.
De preferência utiliza-se um grupo protector aromático da (XV)
fórmula XV
4 em que, independentemente um do outro, R pode ser nitro ou
C hidrogénio e E pocie ser fenilo ou hidrogénio. 0 acoplamento do ácido B-g-aminoadípico protegido com a 7-araino-4-metil-curaarina é efectuado por procedimentos haoitualmente usados na química dos peptídeos * 1. Activação do componente ácido carboxílico com éste res de ácido clorofórmico (G*P* Dom, ti* Zimmermann, Biochem. J. 183, 555 (1979))? h reacção de condensação é levada a efeito activando em priraeiro lugar o grupo carboxílico livre a uma temperatura de -50 a 20°G, de preferência c!e -20 a -5°G, por adição simultânea do ácido α-aminoadípieo e de um éster de ácido clorofórmico, de preferencia de cloroformiato de isobutilo, num solvente orgânico, de preferência um éter cíclico como o tetra-hidrofurano (TrlF), hidro-carbonetos saturados, como diclorometano ou clorofórmio, ou amidas, como diraetilformamida (DEF)*
Por adição de uma quantidade equimolar de 7-amino-4--mstil-cumarina à mistura reaccional anterior consegue-· -se a uma temperatura de reacção de o a 40°G, de preferência de 20 a 25°c, a formação do produto pretendido num período de reacção de 2 a 10 horas, de preferência de 3 a 5 horas* O produto obtido deste modo é dissolvido num solvente orgAnico não miscivel com água, como clorofórmio, diclorometano, acetato de etilo, acetato de butilo ou metilisobutilcetona, com ou sem eliminação por destilação do solvente da reac- - 5 -
ção. Lava-se a solução com água alcalinizada ou acidificada e eliraina-se o solvente para isolamento do produto. Ouando ê necessário uma purificação# re-cristalisa-se a partir de um solvente apropriado e purifica-se por cromatografia em coluna de gel de si-lica ou de alumina activa. 2. Utilização de um reagente de condensação; A reacç-ío de acoplamento S realizada na presença de um reagente de condensação como a Π, H*-diciclo-hexil-earbodiimida (DCCD) (J. C. Sheekan, G. P. Hess, J.
Am. Chem. Soc, 77, 1067 (1955)) ou o 2-etoxi-l, 2--di-bidroquÍnolina-1-carfooxilato de etilo (SEDQ) (B. Belleau# G, iíalek, J. Am. Chem. Soc. 90, 1651 (1963)) ou reagentes comparáveis (ver uma revisão; V* S. Klausner, M. Bodansky, Synthesis 197 2. 453) por adição simultânea dos componentes a acoplar em quantidades eguiraolares e do reagente num solvente orgânico, de preferencia numa amina, como piridina, numa amida, como mw, em hidrocarbonetos clorados, como diclorometano ou clorofórmio, ou em éteres cíclicos, como rHF. O processo reaccional pode ser seguido por cromatografia em camada fina em gel de sílica e pode ser interrompido após o desaparecimento do produto de partida. O processamento final do produto reaccional assim obtido pode ser realizado conforme anteriormente descrito.
Activação dos componentes amino (S. Khamraungkhune, G* Sigler, Synthesis 1980, 614); sao agentes d® activação preferidos esteres de dial-quilo do ácido fosforoso, espeeialmente fosfito cie die tilo, o qual é aquecido em excesso num solvente orgânico inerte, de preferência utilizando no entanto em fosfito de dietilo como solvente, com 7-amino-4-me — 6 —
tilcumarina durante 10 a 50 rain a uma temperatura da 80 a 130°C, de preferência a uma temperatura de 105 a 115°C. 0 acoplamento ê levado a efeito por adiçSo do ácido <7,- aminoadípico protegido e aquecimento da mistura reaccional a uma temperatura de 80 a 130°C, de preferência a uma temperatura de 105 a 115°C, durante 1 a 6 horas. O isolamento do produto de reac-ç3o é realizado por destilação do solvente e cristali-zaçSo ou purificaçto por cromatografia em coluna.
Quando pretendido# e possível transformar a aminoamida livre num sal inorgânico# como o clori-drato, sulfato ou fosfato, ou num sal orgânico, como o acetato, propionato, citrato ou oxalato, ou num carboxilato, como o sal de sodio ou de amonio, apos eliminação dos grupos protectores por hidrogenólise com hidrogénio sobre um catalisador de Pd, Para a purificaçSo do composto da formula I usam-se métodos habituais, por exemplo a recristalização dos sais.
Ha utilização do composto da formula I como substrato de selecçlo de microorganismos que produzem γ' -glutami 1-transpeptidase dá bom resultado o seguinte procedimento:
Realizam-se culturas por exemplo de amostras de solo ou também de microorganismos isolados e investiga-se apos o crescimento nos caldos de cultura, nas células e no filtrado da cultura a capacidade para a hidrólise de 7-(£ - (D-a-aminoadipinil) -amido) -4-metilcucnarina.
Para este fim incuba-se o material a investigar cora este reagente a uma temperatura de 25 a 5õ°C numa gama de pH de 6 a 9 em tampões de enzima apropriados, sendo preferidos os tampões de fosfato ou de tris/HCl. 0 produto reaccional obtido, a 7-amino-4-meti 1-cumarina, pode ser cletecfcada por fluorime-tria apos separação a partir da mistura reaccional por cromatografia em camada fina» - 7
Os exemplos que se seguem destinam-se a elucidar a presente invenção raais em pormenor# sem de qualquer modo limitar o seu âmbito·
Exemplo 1 a) Preparação de 7-(^- (a-benzil-H-earbobenzoxi-D-a- -aminoadipinil)-amido)-4-mstilcumarina: A uma suspensão de 7-amino-4-metilcumarina (525 mg) em fosfito de dietilo (3 ml) e trlbutilamina (0,7 ml) adiciona-se a 110°G uma solução de pentó-xido de fósforo (0,97 g) era fosfito de dietilo (3 ml). Após 20 minutos adiciona-se ácido a-benzil-N- - carbobensox i-D-o-aminoad ípi co (1,15 g) em. fosfito de dietilo (3 ml) e ácido fosfórico a 85% (0,34 g)· Após 2 horas de agitação a 110°C concentra-se a mistura reaccional sob vácuo à secura, tritura-se com água, filtra-se e seca-se sob vácuo· Dissolve-se o produto bruto em clorofórnio/metanol 1 ; 1 a quente, filtra-se e concentra-se ate início da cristalização· Após 15 h a 4°c filtra-se, lava-se com he-xano e seca-se.
Rendimentos
Fonto de fusãos 0,96 g (62 %) 180 - 181°G (decomposição)
Poder rotatório £β-?20 ® + 14,2° (c a 1,0, DKP)
Análise elementars Galc.C 68,õ2,a 5,57,H 5· 16
Determ. G 68, 82,K 5*56, íí 5*28 G3Aoij2C7 b) Preparação de 7- (y-c-aminoadipinilamino) -4-metilcu- marina ixata-se uma solução da amida preparada de acordo com a) (0,5 g) em ácido acético a 70 % com paládio
Jt
sobre carvão (10%, 0, 25 g) e agita-se durante 4 h em atmosfera de hidrogénio* Filtra-se a mistura reac-cional, concentra-se à secura e recristaliza-se o resíduo a partir de metanol/agua.
Rendimentos 0,17 g (56%)
Ponto de fusãos 240°C (decomposição)
Poder rotatórios jT&JT^ * -25,2° (c * 0,1, KíagSO^ O, 2 3/bHSO = 5:1) Análise elementar s cx6Ki8K2°5
Calc. Q 60,37 U 5,70 N 3,30
Doterm. C 59.92 Π 5,80 Έ 8.71
Exemplo 2
SeterminaoESes de Actividade a) Ensaio padrão fotometrico para jf -glutainil-trans- peptidasess ilisturam-se entre si 600 jal cie L- -glut arai 1- p-nitroanilida (166 uil) 300 jil âe tampão de fosfato de potássio, p:I 7,5, (50 nti) e o 100 /il de meio de cultura e incubam-se a 37 C« £ 405 “ K ·*· í-íol x cm h) Snsaio fluorimltrico da cisão de 7-(D-a-amino-adi- pinilaraido)-4-mstilcumarina (AAA-AMC) s 400 μΐ de MA-AKG (500 /iM) 100 jal de amostra
1500 ytl de tampão de fosfato de potássio, pH 7,5, (50 mM
Excitação a 355 nm
Emissão a 450 nm - 9 -
c)
Ensaio de GCP sobre a cisão de 2 μΐ de uma amostra da mistura reaccional de b) são depositados sobre placas de H3FTLC (gel de silica 60F254),
Fase móvel : acetato de etilo/hexano (2 ; 1) DGtecgãos a) lâmpada de W a 366 ntn b) densitómetro de GC?: Excitação a 354 nm c) Valor de Rf í 0,7
Exemplo 3 A fim de diferenciar entre diferentes -glutamil-transpeptidases ( -gãt) cultivaram-se diferentes microorganismos (Quadro 1) no meio com a composição dada seguidamente e experimentaram-se para determinar a res-pectiva actividade de hidrólise com relação a jf-glutamil--p-nitroanilida { -61u-pwA, substrato geral para as (fa -glu.camil-p-nitroanilida na presença de ácido 7-ar.íinocsfalosporânico (7&CA) (as if-GT-P^s que cindem glutaril--7ACA são inibidas pelo 7AG&) e a 7-C 6 - (B-G-aminoadipinil) -—amido)-4-metilcumarina. A actividade de hidrólise foi medi-" da de acordo cora o Exemplo 2, - 10 * *Hidrólise Inibição da hidrólise Hidrólise
«< § t" go.Êf i r-1 0 1 g A 0 1y φ Ό
W r) S 0» *4 O8 O *rt X w M (0 Cn -tf H <0to o» 3 > » O 3 U οι y 4* <8 Cm i—l €0 © W © β X i ao Ό Ή 3 tn Φ ® 03 M & Ή W ΙΛ •rt C4 Η O Ή r0ã S » H 03 8 3 O Η Ή ií O <0 10 G 13 = ε & u 8
Φ G U »* <0 D 0 O © O ÍO Ό ««. 0 © rd P β 0 o »4 q « H O +) M r-í l> rG a -P O o (0 íAí •=4* a Γ3 a a CM
m 33 3 U Φ *σo *H Φ X (0 tí 3 4j H 3 O Φ *5 oj Φ 10 O» •H •σ c 11

Claims (1)

  1. Exemplo 4 Incuharam-se as ^ -glufcamll-transpepti-daae concentradas dos microorganismos referidos no Exemplo 3 com desacetil-cefalosporina C* Apenas a enzima de Baclllue aubtilis, que também cinde AAA-AIIC, apresenta actividade de hidrólise de desacetil-cefalosporina Q e cefaloaporin* C dando acido D-a-arainoadípico e desacetil-7\CA (18 % de rendimento e 7&SA (3 % de rendimento) re&pectlvamente)· 13 - Processo para a pro£ oro^So de ?-( <5> - Cd-*c-aminoadipinil}~âmido)-4~metilcttmariaa #3 fêrmula X,
    R* significa hidrogénio ou um grupa acilo e 2 R significa hidrogénio ou mt grupo alquilo ou arilo, po dendo qualquer dos grupos protectores ser substituído» bem como dos seus sais âe aáiçSUo de acido ou sais alcalinos ou de amónio» caraeterizado por se fazerem reagir entre si um acido a -ami-noadípico da fórmula XX * msr « r%oc-cií- im2i 3,qdoh (n) - 12 ψ * I na qual significa um grupo acilo e R2 significa um grupo alquilo ou arilo, podendo qualquer dos grupos protectores ser substituído, e 7-amino-4-metilcumarina e eventualmente se eliminarem os grupos protectores por hidrólise ou por hidrogenolise* - 23 - Processo para a detecçSlo de actividade de adipinilamidase caracterizado por se utilizar como composto modelo de substrato de hidrólise enzimática o composto da fórmula I obtido de acordo com a reivindicação 1 no qual R1 2 e R significam hidrogénio ou um seu sal de adição ou sal alcalino ou de amónio* A requerente reivindica a prioridade do pedido alemã apresentado em 11 de Outubro de 1938, sob o N2« 1? 33 34 597,8* Lisboa, 10 de Outubro de 1989 ® Amsm wimm, ®a ipispiesbaie] misgsmiL
    - 13 -
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