PT88887B

PT88887B - Metodo para a deteccao de beta-lactamase de origem microbiana

Info

Publication number: PT88887B
Application number: PT88887A
Authority: PT
Inventors: Kirk C S Chen
Original assignee: Washington Res Found
Priority date: 1987-10-29
Filing date: 1988-10-28
Publication date: 1993-08-31
Also published as: GR880100730A; WO1989003889A1; US4965193A; AU2715688A; ES2009362A6; PT88887A

Description

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MÉTODO PARA A DETECÇÃO DE BETA-LACTAMASE DE

ORIGEM MICROBIANA

A invenção que aqui se descreve foi realizada no decurso do trabalho do Public Health Service Research Program Project Grant Al-12192 dos Na ti ona1 Institutes of Health.

Referências Relacionadas com o Presente Pedido de Patente de Invenção

Este ê uma continuação em parte do pedido de patente de invenção norte americana ηθ 638.01 2, requerida em 6 de Agosto de 1 984.

Campo Técnico:

A presente invenção refere-se a um método que foi desenvolvido para melhorar a detecção específica da presença da beta-lactamase de origens microbianas e a um método de diferenciação da actividade de penici1inase , da actividade da cefalosporinase e de distinção da actividade da lactamase da actividade da aci1 ase .

Antecedentes

As beta-1actamases hidrolizam as ligações amida do anel beta-1actâmico de penicilinas e cefal osporinas sensíveis e são largamente distribuídas entre os microrganismos e desempenha:

-2um papel importante na resistência microbiana aos antibióticos beta-1actâmicos. Tem sido desenvolvidos diversos métodos para a detecçao de beta-1actamase microbiana. Por exemplo, métodos químicos para a detecçao da hidrólise enzimãtica do anel beta- 1actâmi co i ncluem:

a) o método acidimétrico , que utiliza um indicador de cor pH para detectar a diminuição do pH resultante da formação de um novo grupo carboxilo;

b) método iodométrico que se baseia na descoloração de um complexo iodo-amino pelos produtos finais da hidrólise da beta-1actamase que actua como agente de redução para reduzir o iodo nesse complexo; e

c) método de cefalosporina cromogénico que se baseia na mudança de cor a seguir à hidrólise de um substracto de cefalosporina cromogênica. (R. B. Sykes and K.

Bush, Phisiology, Biochemistry and Inactivation of Beta-1actamase, Chemistry and Biology of Beta-Lactan A n t i b i o t i c s _3» 1 55-207 ( 1 982) R. B. Morlin and

M. Gorman (eds), Academic Press, New York.

Uma alternativa aos métodos químicos ê um método de ensaio microbiologico que e fundamentado na perda da actividade anti-bacteriana a seguir ã hidrólise do anel da beta-lactama.

Variadíssimos microrganismos também produzem acilases microbianas que eliminam as cadeias laterais acilo de penicilinas ou cefalosporinas susceptTveis. A cisão das cadeias laterais acilo dos antibióticos beta-1actâmicos resultam frequentemente numa diminuição do pH e na redução da actividade do anti-

biotico. Os métodos acidimetricos e microbiolõgicos podem não diferenciar a actividade da beta-1actamase da actividade da acj_ lase. Ainda que as beta-1actamases microbianas não actuem excl£ sivamente sobre as penicilinas ou sobre as cefalosporinas, muitas exibem uma actividade predominantemente de penicilase ou de cefalospori nase.

Assim, os métodos químico ou microbio 1ógico que utilizam um único substracto de beta-lactama não podem diferenciar a actj_ vidade de penicilinase da actividade de cefalosporinase e frequentemente fornecem um falso resultado negativo para actividade da beta-1actamase.

Existe uma necessidade de se encontrar um método que diferencie a actividade da penicilinase da actividade da cefalosp^ rinase e que distinga a actividade da beta-1actmase da actividade da acilase.

já referido pedido de patente de invenção co-pendente norte-americano descreve e reivindica um método para a detecção da presença da actividade de beta-1actamase de origem microbiana utilizando-se um ensaio de fluorescência. É desejável proporcionar um meio para reforçar o sinal fluorescente obtido através do re ferido ensaio a fim de aumentar a sua sensibilidade. Além disso, também é desejável proporcionar metodologias melhoradas para diminuir o tempo de duração do ensaio. A técnica anterior descreve a utilização de uma solução tamponada contendo formaldeído a fim de reforçar o desenvolvimento da fluorescência no referido ensaio Zíaylor, D. N., K. C. S. Chem. K. Panikabutra, C. Wongba, A. Chitwarakern, P. Echeverria, and K. K. Holmes, Lancet ii:625-626

(1985)7- Esta utilização de uma solução de formaldeído como desenvolvente de fluorescência, foi descrita num artigo subsequente por K. C. S. Chen and K. K. Holmes /~J . C1 i n. Mi c rob. 23: 539-544 ( 1986)7.

Apesar do aumento conseguido da sensibilidade pela solução desenvolvente de formaldeído, existe a necessidade de aumentar a sensibilidade a fim de alargar a aplicabilidade do ensaio. A presente invenção preenche esta necessidade.

Descrição da presente invenção

De um modo resumido a presente invenção consiste num mê todo para aumentar a sensibilidade de um ensaio para a detecção da presença de beta-1actamase de origem microbiana. Especificamente, são descritos agentes que proporcinam, relativamente ao formaldeído, uma maior intensidade da fluorescência desenvolvida pelos produtos finais provenientes da hidrólise provocada pela beta-1actamase sobre os compostos que contêm beta-1actamas.

método inclui os passos de contacto de um substracto contendo o anel beta-1actâmico, substancia 1 mente não fluorescente, com um organismo que se pensa produzir beta-1actamase, ou com uma preparação isenta de células que se julga conter beta-la£ tamase; subsequentemente faz-se contactar a mistura reaccional formada deste modo, com uma solução que desenvolve a fluorescência constituída por um agente de oxidação num tampão para formar um produto reaccional; determina-se se o produto reaccional exibe fluorescência. De preferência, a solução que promove a fluorescência também contêm formaldeído. A fluorescência ê o indicador da presença de beta-1actamase.

Um substracto substancialmente não fluorescente pode incluir um antibiótico beta-1actâmico com uma cadeia lateral acilo contendo um grupo alfa-amínico e um grupo alfa-fení1ico ou os seus derivados, tais como ciclo-hexilo ou ciclo-hexeni1 o . Por exemplo, a cadeia lateral acilo do antibiótico beta-lactâmico po de conter um grupo D(-)-^-feni1g1ici1 o, tal como ampicilina, cefalexina, ou cefaloglicina (grupo fenilo não substituído), ou um grupo D(-)para-hidroxifeni1glici1 o , tal como a amoxicina ou cefradoxil (grupo fenilo com substituição do grupo hidroxilo). 0 substracto também pode ser um composto com uma estrutura de anel beta-lactãma com grupos <V-ami na ou^í-fenilo comparáveis, tais co mo hetaci1i na.

Alternativamente, o substracto pode incluir um composto que contêm uma beta-lactama que nao exibe propriedades antibióticas. Estes compostos necessitam apenas da presença de uma cadeia lateral acilo contendo um grupo alfa-amina ou um grupo a 1 fa-fenilo ou seus derivados.

Tal como aqui se utiliza, a designação substancia 1 mente não fluorescente ê utilizada para indicar a categoria dos substractos referidos, que podem possuir uma fluorescência de ba. se de baixo nível, mas que ainda são susceptíveis de serem uti 1 zados na presente invenção devido ao nível de fluorescência não interferir com o ensaio de f1uorescência.

De preferência, agentes de oxidação são escolhidos no grjj

-r + + + — — po constituído por Ag , Hg , Η£θ₂, , 10^ , persulfato , + + - Pd , benzoato de p-hidroxi-mercurio, e suas misturas. Alem disto, estes agentes de oxidação são misturados com formaldeído.

-6ζ.

Tampões preferidos são os sais de ácidos escolhidos no grupo constituído pelo ácido cítrico, ácido tartárico, ácido mj lico, ácido succínico, ácido glutárico, ácido ftãlico e ácido láctico. Os sais de ãcidosmais preferidos são os sais de sÕdio e de potássio.

De preferência, o método é realizado a um pH que varia entre cerca de 3,5 e crca de 5,5 e a uma temperatura compreendida entre cerca de 22°C e cerca de 50°C.

Breve Descrição dos Desenhos

A figura 1 representa em diagrama a hidrólise de penicilinas por acilase e beta-lactamase.

A Figura 2 representa o diagrama da hidrólise da cefalos^ porina por acção da acilase e beta-lactamase.

A Figura 3 representa a análise por e1ectroforese de alta voltagem dos produtos finais do anel beta-1actãmico aberto.

A Figura 4 é um resumo do ensaio de manchas fluorescentes para a detecção de beta-lactamases microbianas sem se utilizar um desenvolvente de f1uorescência .

A Figura 5 representa a actividade da beta-lactamase na

E . Col i , E . cl oa cae , C . f reundi i , B . cereus e B_. 1 i cheni formi s como determinado pelo ensaio de mancha (A) e por electroforese de alta voltagem (B) observados sob luz produzida por uma lâmpada de ultra-violeta de grande comprimento de onda (UV).

A Figura 6 representa a actividade da beta-lactamase cjo mo representada na figura 5 apõs colocação com acetato de cadmio-n i ni dri na .

A Figura 7 refere os resultados da comparação da detecção da actividade da beta-lactamase utilizando o desenvolvente melhorado da presente invenção e comparando-os com o desenvolvejn te descrito por Chen, K. C. S., e K. K. Holmes, J. Cli n. Mi crob. 23:539-544, 1986. APC=ampici1ina: CEX = cefalexina.

A Figura 8 representa a comparação dos resultados da detecção da actividade beta-lactamase utilizando o desenvolvente descrito anteriormente na figura 7 e comparando-os com o desenvolvente de fluorescência sem um desenvolvente.

A Figura 9 constitui um resumo dos passos do ensaio de mancha fluorescente para a detecção de beta-1 actamases microbia^ nas utilizando-se o desenvol vente de f 1 uores cên ci a melhorado co_ mo descrito na presente invenção.

A Figura 10 descreve a actividade da pe ni ci linase em esti_r pe PPNG utilizando-se o desenvolvente de fluorescência me lhorado para desenvolver a f1uorescência.

A Figura 11 representa os resultados comparativos da fluorescência para 1 mM de ampicilina e 10 mM de cefalexina hidrolisados por uma estirpe, de N e i s s e r i a gonorrhoeae (PPNG) que produz penici1inase.

A Figura 12 representa os resultados da comparação do efeito da temperatura de incubação sobre a actividade de beta-lactamase na PPNG.

Melhor Forma de Realizar a Presente Invenção

A presente invenção proporciona um método para aumentar a sensibilidade de um ensaio para a detecção de beta-1actamases

microbianas mediante a utilização de um desenvolvente melhorado que consiste num agente de oxidação moderado que proporeiona uma maior intensidade de desenvolvimento de f1uorescência do que o obtido utilizando-se apenas formaldeído. De preferência o desen volvente melhorado (também designado por desenvolvente II), também contém formaldeído. Esta sensibilidade aumentada permite a detecção directa de beta-1 actamases em culturas e em espe^zcimes clínicos. 0 último grupo inclui líquidos corporais infectados, tais como soro, exudado da uretra, fluidos vaginais, cervicais, pus de fluido cérebro-espinal. Por exemplo, na técnica anterior a solução de desenvolvimento de formaldeído foi utilizada para a detecção da Neisseria gonorrhoeae produtora de penicilinase (PPNG) nos fluidos cervicais, com obtenção de uma grande quantidade de resultados fa 1so-negativos, indicando que a solução desenvolvente não era suficientemente sensível. Pelo contrãrio , os desenvolventes da presente invenção oferecem relativamente poucos resultados fa 1so-negati vos . A presente invenção proporciona um método mais sensível e menos dispendioso para a detecção de beta-lactamases microbianas que não distingue apenas a actividade de penicilinase da cefa 1 osporinase, mas que também po de diferenciar actividade da beta-1actamase da actividade da acj_ lase. Algumas penicilinas e cefalosporinas, tais como a ampici1ina e cefalexina, proporcionam produtos finais fluorescentes após a hidrólise pela beta-1actamase. Além disso, estes produtos finais fluorescentes podem ser detectados sobre um papel de filtro à luz ultra-violeta de grande comprimento de onda após um ligeiro aquecimento.

Consistente com estes dados, o ensaio do pedido de pate£ te de invenção copendente referido antes para a detecção de beta-9-lactamases microbianas com uma predominância de actividade, quer de penicilinase quer de cefalosporinase, pode ser iniciado por:

a) incubação de uma quantidade de uma solução de um anti biõtico beta-lactâmico, tal como ampicilina ou cefale xina ou outra beta-lactama contendo uma cadeia lateral com um grupo alfa-amino ou um grupo alfa-fenilo com eventuais diversas substituições, com um mi cr organis. mo de ensaio que se pense produzir beta -1 actamase ou com uma preparação de beta-1actamase isenta de células;

b) colocação de uma gota daquela solução numa superfície tal como um papel de filtro;

c) ligeiro aquecimento do papel de filtro; e

d) exposição do papel de filtro ã luz u11ra-vi o 1eta.

Podem ser utilizadas outras beta-1actamas nas quais se incluem a amoxicilina, cefaloglicina e cefadroxil.

Superfícies apropriadas com baixos níveis de fluorescêji cia diferentes do papel de filtro, podem ser toalhas de papel , folhas de ni trocei ul ose, acetato de celulose, gel de silica e pjo 1 i a m i d a .

Este método pode ser utilizado para detectar a actividade de penicilinase predominante (p. ex. utilizando-se como substrajc to a ampicilina ou amoxicilina) ou a actividade de cefal ospori na^ se, p. ex., utilizando-se cefalexina, cefadroxil ou cefaloglicina como substracto. A actividade de beta-1 actamase sobre a ampj. cilina e cefalexina proporciona produtos finais (ácido D-fenilgli ci1penici1oi co e acido D-feni1glici1desecetoxicefalosporoíco ) ,

10que podem ser desenvolvidos em espécies fluorescentes por meio deste método. A actividade de acilase, contudo, produz produtos finais não f 1 uorescentes . (áci do 0(-)°6-ami nofeni lacético e ãcido 6-aminopenicilânico ou ãcido 7-aminodesacetoxicefalosporã nico) que não podem ser desenvolvidos em espécies fluorescentes por meio deste método. Assim, como se mostra nas figuras 1, 2, 5 e 6, a actividade beta-1 actamase pode ser distinguida da acti_ vi dade da acilase.

A presença da acilase na mistura de reacção não interfere com a detecção da beta-1actamase quando se utiliza este método fluorescente. Utilizando-se substractos beta-1actãmicos que re presentam os antibióticos penicilina e cefa1osporina, pode ser determinada a especificidade das beta-1actamases de diferentes espécies de organismos gram-positi vos e gram-negati vos.

Também foi desenvolvido um método alternativo que utiliza uma sobrecamada que tenha sido impregnada como substracto, feita contactar com a bactéria na superfície do meio de cultura, e que a seguir é incubada e visualizada sob uma luz ultra viole ta de grande comprimento de onda para a detecção da fluorescência, permitindo a detecção e a diferenciação de produtos finais de fluorescência natural das bactérias, sem necessidade de retj rar as bactérias do meio através de centrifugação, enquanto que permite a detecção da actividade enzimatica para muitas colónias individuais sobre uma placa.

A presente invenção esclarece que a fluorescência prodjj zida pelos produtos finais provenientes da hidrólise de beta-lac tamase pode ser reforçada mediante a utilização de uma solução desenyolvente que contem o agente de oxidação escolhido entre o grupo constituído por Ag ⁺ , Hg⁺⁺ , , I₃”, 104”, persulfato + + Pd , benzoato de p-hidroxi-mercurio e suas misturas. De preferência, a solução de desenvolvente também contêm forma1deído..

A ampicilina, cefaloglicina e cefalexina têm em comum uma cadeia lateral de acilo, ácido D( - )°4-ami no-fen i 1 a céti co e os núcleos de beta-lactama intactos, respectivamente do ácido 6-aminjo penici1ânico , acido 7-aminocefalosporânico e ácido 7-aminodesac^ toxy-cefa1osporânico. A amoxicilina e cefadroxil têm uma cadeia lateral acilo comum, D(-)-p-hi droxi 1 feni 1 gl i ci na e os núcleos de beta-lactama intactos respectivamente, ácido 6-aminopenici1ânico e ácido 7-aminodesacetoxycefalosporânico. Neste ensaio os produtos finais da actividade de acilase sobre ampicilina, cefaloglicina , cefalexina, amoxicilina e cefadroxil não são fluorescentes após reacção com o desenvolvente da fluorescência melhorado co mo descrito nesta invenção, sendo apenas fluorescentes os produtos finais da beta-lactamase. Portanto, a presente invenção, pro porciona não sõ a detecção e a distinção entre a actividade de penicilinase e a actividade de cefa 1osporinase de beta-lactamase mas pode também diferenciar a actividade da beta-lactamase da actividade da acilase.

A fluorescência pode ser revelada aspergindo a mistura reaccional sobre um papel de filtro e depois visualizada com luz ultra-violeta com grande comp ri mento de onda. Alternativamente, pode observar-se directamente a fluorescência na solução ou me. dir f1uorimetricamente utilizando comprimentos de onda de emissão e excitação apropriadas , p. ex., 350 nm como comprimento de onde de excitação e 425 nm como comprimento de onda de emissão.

Alternativamente os agentes de oxidação anteriormente re feridos podem ser misturados com formaldeído. A concentração de formaldeído no desenvolvente de fluorescência melhorada pode variar desde aproximadamente 0,22 M até aproximadamente 2,2 Μ. A concentração de um agente de oxidação moderada no desenvolvente de fluorescência melhorado pode variar desde aproximadamente 0,22 mM até 0,2 mM. Quando se utiliza iões Hg⁺⁺ para melhorar o desenvol vente de fluorescência da presente invenção, podem inte_r ferir com o ensaio os compostos que contêm grupos sulfidri1 o.Alêm disso, quando se utiliza iões Ag⁺ a presença de grupos sulfidrilo e de iões cloreto pode também interferir. Portanto a concentração destes catiões tem que ser aumentada adequadamente.

A sensibilidade de um ensaio da beta-lactama pode ser r£ forçada aproximadamente entre 40 e 100 vezes, respectivamente , para substractos de ampicilina e cefalexina de acordo com a técnica anterior permitindo deste modo a realização de ensaios mais sensíveis. Por exemplo, a detecção de Neisseria gonorrhoeae (PPNG) produtora de penicilase nos líquidos, cervicais pode coji seguir-se utilizando-se o sistema de detecção que utiliza o desenvolvente melhorado da presente invenção.

São utilizados dois tubos no ensaio de PPNG. 0 primeiro tubo contem o substracto de ampicilina; o segundo tubo contêm am picilina, mais meticilina. A actividade de beta-1actamase de PPNG ê inibida completamente pela meticilina, enquanto que a a£ tividade de beta-1actamase proveniente de flora vaginal e cervical, tais como bacteroi des bi vi us , não ê inibida pela meticilina Portanto, se sem ambos os tubos se tem uma prova positiva para a actividade beta-1actamase, e possível um resultado falsamente positivo. Contudo, se apenas positiva a ampicilina e no sé-J

-13.Cf

gundo tubo

, que contêm ampicilina mais metici-

lina a prova e negativa, então confirma-se o resultado positivo para PPNG. As metodologias de técnica anterior não possuíam seji sibilidades suficientes para realizar um diagnóstico destes.

Serã bem considerado pelos especialistas nesta matéria, através das referências aos exmplos que se seguem, que variações ligeiras deste ensaio aqui descrito, poderão existir dependendo p. ex., da actividade da enzima e da amostra a ser submetida a ensaio.

Por exemplo, a mistura reaccional composta de uma fonte de beta-lactamase suspensa apenas num substracto de ampicilina pode ser examinada muito brevemente após mistura do plasmídeo pa ra produzir fluorescência induzida por beta-lactamase (p. ex., penicilase produzida por Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus inf1uenzae) , ou pode ser incubada com ampicilina ou cefalexina djj rante um período mais longo antes da determinação da fluorescêji cia produzida por beta-1actamases induzíveis ou fluorescência produzida por produtores de beta-lactamase fracos. Além disso , quando se utiliza o desenvolvente de f1uorescência existe alguma flexibilidade na escolha do tempo e da temperatura para a hidrólise.

Para resumir os exemplos que se seguem:

exemplo I é para a detecção dos produtos finais do núcleo beta-lactama aberto realizado utilizando-se um método de d£ tecção rápida ou um ensaio de mancha da aplicação original, que confirma os resultados do ensaio de mancha com um ensaio de ele£ troforese de alta voltagem (HVE) e também a confirmação do ensaio de mancha pelo ensaio de nitrocefina.

Exemplo II compara a fluorescência do ensaio técnico anterior com o ensaio que utiliza o desenvolvente melhorado da presente invenção.

Os resultados obtidos através da utilização destes processos, revelaram que (1) a beta -1 actamase pode ser detectada através da identificação dos produtos finais f1uorescentes utilizando-se o ensaio de mancha sem a necessidade de separação elec troforêtica dos substractos dos produtos finais; (2) o ensaio de mancha demonstrou ser mais sensível do que o ensaio de nitrocefj_ na, especia 1 mente para microrganismos gram-positi vos; (3) o método de detecção rãpido ou ensaio de mancha pode ser utilizado para diferenciar as actividades da penicilinase das da cefalosporinase assim como fazer a diferenciação de actividades de beta-lactamase das actividades de acilase; (4) o ensaio de mancha proporciona um meio de determinação semiquantitativa da quantidade de actividade de beta-1 actamase proveniente de uma fonte microbiana; e (5) o ensaio de mancha pode ser utilizado para deter minar a especificidade de beta-lactamase de diversas espécies de bactérias gram-positivas e gram-negativas.

Os exemplos seguintes são descritos por via de esclarecimento e não por via de limitação.

Exemplo I

Produtos químicos

Foram obtidos da Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri os compostos químicos, sob a forma ácida, relacionados com os a_n tibiõticos beta-1actãmicos que incluem cadeias laterais acilo e núcleos de beta-1actama · e dissolvidos separadamente em tampão

de fosfato de sódio 0,04 M, de pH 7,5 para uma concentração final de 0,02 M, excepto para a amoxicilina (0,01 M, preparada em tampão de fosfato de sódio 0,02 M) e ácido D( - )°C-ami nofeni 1 acético (0,005M, preparado em tampão de fosfato de sódio 0,01M). A nitrocefina foi obtida da Glaxo Research Ltd., Greenford, Middle sex, England e foi preparada e utilizada na concentração de 50 y /ml (Sykes, R. B. e K. Bush, Physiology, Biochemistry and Inactivation of Betaiactamases, Chemistry and Biology of Beta-lactam Anti bi oti cs , 3: 1 55-207, R. B. Morin and M. Gorman (eds), Academic Press, New York, 1982).

MÉTODOS

Preparação de inóculos para detecção de beta-1actamase

Desenvo1veu-se Haemophilus ducreyi e H. i nf1uenzae em ba se de agar GC (BBL Microbiology Systems, Cockeysvi 11e, Maryland) com suplementos, como descrito por Totten, P. A. Η. H. Handsfield, D. Peters, K. K. Holmes, and S. Falkow ( Characteri zati on of Ampici11in-Resistant Plasmids from Haemophilus ducreyi, An ti mi c rob. Agents Chemother. 21: 622-627 (1982). Desenvolveu-se Bacteroides spp. anaerobicamente em base de agar Columbia (BBL) com suplementos, como descrito por Williams, B. L. K-A. Osterberg, and J. Jorgensen, Subgingival Microflora of Periodontal Pateints on Tetracicline Therapy, J ._Cl i n . Peri odonta 1 , 6:210-221 ( 1 979).

Microrganismos provenientes das pesquisas descritas anteriormente por K. C. S. Chen, N. J. Culbertson, J. S. Knapp, G. F. Kenny e K. K. Holmes em Rapid Method for Si muitaneous Detection of the Arginine Dihydralose System and Amino Acid Decarboxilases in Microrganisms, J. Clin. Microbiol. 16: 909-918

(1982), desenvolveram-se por via aerobica básica GC (Difco Laboratories, Detroit, Michigan) contendo um suplemento definido a

1% (White, L. A. and D. S. Kellog Jr. , Neisseria gonorrhoeae I denti f i cati on in Direct Smears by a Fluorescent Antibody Coun_t terstain Method, Appl . Mi crobi ol . 1_3: 1 71-1 74 ( 1 965 ) à tempera, tura de 37°C durante a noite, excepto para Neisseria gonorrhoeae, que se desenvolveu num incubador sob atmosfera de anidrido carbó nico Z3T°^tten» Ρ· A. , Η. H. Handsfield, D. Peters, K . K. Holmes e S. Falkow, Charetirization of Ampicillin - Resistant Plasmids from Haemophilus ducreyi , Antimicrob. Agents Chemother. 21 , 622-627 (1982)7.

Colocaram-se separadamente aliquotas de 50 γ1 de cada antibiótico beta-1 actami co num tubo de mi crocentríf uga ( 200 ^1; Stockwell Scientific, Monterey Park, Califórnia).

Re ti rou-se aproximadamente metade de uma ansa de 2mm de diâ^ metro, de cada estirpe desenvolvida nas placas de agar e dispersou-se em cada substracto por uma agitação rápida por vortex.

A mistura em seguida foi incubada durante 5 e 15 minutos ã temperatura ambiente para o ensaio de mancha rápido. Os contro los de substracto não inoculado foram preparados pelo mesmo nw do.

Normalmente, a mistura da estirpe com cada substracto foi incubada durante uma hora ã temperatura de 37°C. Os controlos de substracto não inoculados foram também preparados do mesmo modo. Após incubação, os tubos (excepto o controlo de substracto não inoculado e os tubos para o ensaio de mancha rápido) foram centrifugados numa mjcrocentrífuga (modelo 152; da Beckmàn

-17-,

Instruments, Inc. Fullerton, Califórnia) durante um minuto.

Detecção de produtos finais de anel de beta-1actama aberto por meio de um método de detecção rãpi da

Apos uma hora de incubação ã temperatura de 37°C, aplicou-se separadamente uma fracção de 5 yjl volume de sobrenadante de cada tubo, incluindo o tubo de controlo, com o substracto não inoculado, num papel Whateman 3 MM e aquecida ã temperatura de 1 20°C numa estufa durante cinco minutos. A intensidade da fluorescência de cada mancha de ensaio foi em seguida comparada com a mancha do controlo do seu respectivo substracto não inoculado sob a luz ultra violeta de longo comprimento de onda e classificado como negativo, fracamente positivo ou positivo.

Para o ensaio de mancha rápida aplicaram-se 5 ^j1 de sus^ pensão bacteriana não centri f ugada, proveniente de cada tubo i n c) culado, após incubação à temperatura ambiente, · durante cinco a quinze minutos e 5 1 proveniente de cada tubo de controlo de substracto não inoculado sobre o papel que se aqueceu ã temperara de 120°C durante cinco minutos. Para os microrganismos que exibiram autof 1 uorescénci a forte (p. ex. , pseudomonas spp) aplicou-se a extremidade de um pipetador de Eppendorf contendo 5 de suspensão no papel de filtro, permitindo que o líquido se espalhasse desde a extremidade por capi1aridade. Assim, forçou-se a bactéria a permanecer concentrada no ponto de aplicação de tal modo que a autof1uorescência bacteriana central, se diferenciasse da f1uorescência periférica dos produtos finais. A intensidade de f1uorescéncia do ensaio de mancha rapida foi classifica

da como descrito para o ensaio de mancha de umahora.

Detecçao de produtos finais do anel de beta-lactama aberto por eiectroforese de alta voltagem

5jul de sobrenadante proveniente de cada tubo após incubação durante uma hora, foram aplicados separadamente sobre um papel Whateman 3 MM que se submeteu a el ectroforese de alta voj_ tagem (HVE) a pH 2,1 a 8 V/cm. durante trinta minutos. £Chen ,

K. C. S. and R. M. Krause, A Peptide Mapping Technique A Three-Map System, Anal. Bi ochem. 69; 1 80-1 86 (1975)J. 0 papel foi seco ã temperatura de 90°C durante quinze minutos e visualizado sob luz ultra-violeta de longo comprimento de onda. A intensidade de fluorescência de cada ensaio foi comparada com a prove niente do substracto de não inoculado que constituía o controlo e classificado como negativo, fracamente positivo ou positivo.

papel foi em seguida, corado com ninidrina-acetato de cádmio ^ieilmann, J., J. Barrollier, and E. Watzke, Beitrag zur Amino saurebestimung auf Papeir Chromatogrammen, Hoppe-Seyler¹s Z.

Ph i s i o 1 . Chem . 309; 219-220 ( 1 9 7 5 )J7 para revelar o substracto não hidrolizado. As intensidades de coloração dos produtos finais foram ainda classificadas como negativas ou como fracamente, moderadamente ou fortemente positivas.

Detecção de beta-lactamase pelo ensaio de nitrocefina ensaio com nitrocefina /0'Col1aghan, C. H.» A. Morris, S. M. Kirby, and A. H. S. Shingler, Novel Method for Detection

-19of beta-1actamases by Using a Chromogenic Cepha1osporin Substra te, Anti mi crob. Agents Chemoter-r _1_ 283-288 ( 1 972 )_7 consiste num ensaio rápido específico disponível para a detecção de beta-lactamase e que é realizado frequentemente com o método de detecção rápido ou com o ensaio de mancha descrito antes, a fim de proporcionar meios para a avaliação da exactidão do ensaio de mancha.

ensaio de nitrocefina foi realizado sob as mesmas condições do ensaio de mancha. Aproximadamente metade de uma ansa de cada organismo desenvolvido foi dispersa em 50^1 de nitroce^ fina (50 yjg/ml) sobre uma cavidade de uma placa microtituladora (Linbro Division, FlowLaboratories , Inc., Hamden, Connecticut ), e incubada durante uma hora ã temperatura de 37°C ou durante cijn co a quinze minutos ã temperatura ambiente para o ensaio rápido.

Detecção de beta-lactamase por identificação de produtos finais fluorescentes

Nos estudos iniciais, as penicilinas (ampicilina e amoxj[ cilina) e cefa 1 ospori nas ( ce f a 1 os po ri na C, cef a 1 og 1 i c ina , cefalj? xina e cefadroxil) contendo um grupo amina primária na cadeia la_ teral acilo foram incubadas separadamente com Ci troba cte r freund i i, durante uma hora, à temperatura de 37°C. 0 sobrenadante de cada mistura reaccional foi separado por electroforese de aj_ ta voltagem (HVE) a pH 2,1 £(^Chen» K. θ· S., e R. M. Krause, A Peptide Mapping Techique --A Three-Map System, Anal. Bi ochem. 69: 1 80-1 86 ( 1 975 ),7. 0 produto e o substracto não hidrolisado foram revelados com o corante de ninidrina-acetato de cádmio

-20-/ ζ’ t $ /Lleilmann, J., J. Barrolier, and E. Watzke, Beitrag zur Aminosaurebestimung auf Papeir Chromatogrammen, Hoppe Sey1e r¹s Z. Physi ol . Chem. 309: 21 9-220 ( 1 975).7 após secagem ã temperatura de 90°C durante quinze minutos. A coloração com ninidrina-acetato de cádmio apresentou manchas distintas do produto final e do sub£ tracto não hidrolisado para todos os antibióticos beta-lactãmicos ensaiados excepto para cefaloglicina e cefalosporina C (produtos finais dirigidos para o cátodo).

Estudos subsequentes indicaram que antes da coloração com ninidrina-acetato de cádmio, cada produto final principal (como detectado posteriormente pela coloração de ninidrina-cádmio; a cefaloglicina nãp produziu produto final principal distinto) e alguns produtos finais menores, excepto os provenientes da cefalosporina C, apresentaram elevada fluorescência ã luz ultra-vi£ leta de longo comprimento de onda, enquanto que os substractos não hidrolisados não eram fluorescentes como estã representado na figura 3. 0 esquema da f 1 uorescência produzida pela C. freundi i para cada substracto verificou-se idêntica ao esquema produzido pela beta-1actamase purificada de Enterobacter cloacae ou de Baci11us cereus (Sigma; 100 nanomoles de cada substracto incubados com 1 de cada enzima durante uma hora ã temperatura de 37°C.).

Os vestígios das quantidades de f 1 uorescênci a proveniejn tes de formas de anel de beta-lactama aberto de ampicilina, amo xicilina e cefadroxil, detectados no controlo constituído por substracto não inoculado foram atribuíveis ã hidrólise expontânea durante a incubação e contaminação com as próprias formas de anel aberto das fontes comerciais e esta fluorescência acumulada foi facilmente distinguida da quantidade de produto final fluo-21 χ

rescente produzido pelas beta-1actamases microbianas. Os prod£ tos finais fluorescentes menores de cefalexina e cefadroxil , apõs incubação foram possivelmente devidos ã degradação de ácido de cada produto final principal durante a el ectrof orese de aj_ ta voltagem a pH 2,1, uma vez que o melhor arrefecimento do papel durante a HVE reduziu a sua formação. Portanto, os cinco s]j bstractos de beta-lactama que produziram produtos finais fluore^ centes (formas do anel beta-lactama aberto) durante a incubação com beta-1actamases conhecidas poderão ser utilizados para a detecção de beta-1actamases microbianas.

Além disso, também se verificou que o produto final de cada substracto beta-1actâmico , representado na figura 3, pode ser detectado no papel de filtro sem a subsequente separação por electroforese apõs um ligeiro aquecimento ã temperatura de 120°C durante 15 minutos. Portanto, o ensaio de mancha simples descrj_ to antes, pode ser utilizado para a detecção de beta-1actamases microbianas.

Selecção de substractos beta-lactâmicos para a diferenciação entre actividades de penicilinase e cefalosporinase de beta-lactamase pelo ensaio de mancha

A fim de se detectar beta-1actamases com uma predominância de actividades de penicilinase ou de cefalosporinase, e para se detectar produtos de beta-lactamase fracos utilizando o ensaio de mancha, foram escolhidos dois substractos que produziam uma base de fluorescência mínima (devida ã hidrólise enzimãtica durante a incubação e ã presença de contaminantes de produtos finais de fontes comerciais). A ampicilina produziu menos base fluo

-22rescente do que a amoxicilina e foi escolhida como substracto pa_ ra penicilinase apesar da sua forma de anel beta-1 actâmico aberto ser menos fluorescente do que a amoxicilina como se mostra na figura 3. Identicamente, foi escolhida cefalexina como s ubs t ra_c to para cefalosporinase. Na figura 4 apresenta resumidamente o método de ensaio de mancha fluorescente.

Diferenciação de actividade de beta-1actamase e actividade acilase pelo ensaio de mancha e HVE

A fim de se determinar se o método do ensaio de mancha permitiria distinguir a actividade beta-1 actamase da actividade de acilase, os produtos finais da acilase (100 nanomoles cada , a cadeia lateral comum, ácido D( - )9(-ami nofenilãctico, e os núcleos beta-lactãmicos intactos, ácidos 6-amínopenicilânico e ácj do 7-aminodesacetoxicefalosporânico) foram aplicados separadamente sobre papel Whatman 3MM. Nenhum dos produtos finais de acilase exibiu fluorescência quer pelo método do ensaio de mancha, quer pelo método de electroforese de alta voltagem, como se representa na figura 5. Contudo, todos produziram coloração após a acção do corante ninidrina-acetato de cádmio, como se mostra na figura 6. Portanto, quer o método do ensaio de mancha, quer o método de HVE permitem a distinção da actividade de beta-lacta_ mase da actividade da acilase.

Semiquantificação da actividade beta-lactamase resultado do ensaio de mancha para a actividade beta-lactamase utilizando-se um substracto foi classificado como fra^ camente positivo (W) quando a intensidade de fluorescência da

-23/ f

__/ j mancha era ténue mas mais evidente do que a do substracto não inoculado de conrotlo; e como positiva (+) quando se observava uma fluorescência verde-azulada brilhante.

resultado do teste HVE para a actividade beta-lactamase, utilizando-se um dado substracto foi classificado como fra_ camente positivo (W) quando uma ligeira f 1 uorescênci a se observa_ va na posição que correspondia ã do produto final apôs HVE e a ib tensidade da cor da mancha do produto final, após a coloração com ninidrina-acetato de cádmio, era ligeira mas mais evidente do que a do produto final no substracto não inoculado de controlo (produzida por hidrólise não enzimática expontânea durante a incubação e de contaminação do produto final de fontes comerciais)~ como n_o meadamenteositivo (M) quando se observava uma fluorescência verde-azulada brilhante na posição que correspondia ã do produto fj_ nal, mas a intensidade da cor da mancha do produto final após coloração com ni ni dri na-acetato de cádmio era menor do que a da maji cha do substracto remanescente; e como fortemente positiva (S) quando a f1uorescência verde-azulada brilhante era observada na posição que correspondia à da mancha do produto final e a intensidade da cor da maneha do produto final após a coloração com ninidrina-acetato de cádmio era superior ã da mancha do substracto remanescente .

Distribuição de actividades de beta-1actamase entre os microrganismos representa ti vos método do ensaio de mancha foi utilizado para adetecçao de beta-1actamase produzida por cada uma das estirpes de Es cheri chi a

-24c ο 1 i , Ε . cl oacae , C. freundi i , B . cereus e B . 1i cheni formi s ut_i_ lizando-se ampicilina ( para actividade de penicilinase) e cefalexina (para actividade de cefalosporinase) como substractos .

Os resultados do ensaio de mancha mostram-se na figura 5A e foram confirmados por HVE visualizada por luz ultravioleta , como se mostra na Figura 5B e com coloração de ninidrina-acetato de cádmio, como se mostra na Figura 6.

A fluorescência que foi produzida por £. coli durante a incubação com a ampicilina durante uma hora ã temperatura de 37°C (Figura 5A) e o produto final (ácido D-feni1g1ici1penici1 oico) foi detectado ã luz ultravioleta (Figura 5B) e pósteriormente confirmado com a coloração de ninidrina-acetato de cádmio (Figura 6). A actividade de penicilinase desta estirpe de £, coli foi determinada como fracamente positiva pelo ensaio de maji cha e pelo método de HVE, utilizando-se os critérios referidos antes, enquanto que nenhum dos métodos detectou activ_i_ dade de cefalosporinase. 0 produto fluorescente foi produzido por E_. c 1 oacae durante a incubação com cefalexina durante uma hora ã temperatura de 37°C (Figura 5A). Este produto final foi visualizado com luz ultravioleta após HVE (Figura 5B) e posteriormente confirmado com o corante de ninidrina-ac£ tato de cádmio (Figura 6).

A actividade de cefalosporina de E. c1oacae foi classificada co

-25mo positiva ao ensaio de mancha e moderadamente positiva ao meto do de HVE, utilizando-se os critérios antes descritos. Não foi detectada por qualquer dos métodos de actividade de penicinilaMediante a utilização do ensaio de mancha e dos critérios referidos antes, as actividades de penicilinase e cefa1osporinase C· freundi i e B. 1i cheni formi s foram classificadas ambas como positivas, enquanto que no EL cereus , a actividade de penicilinase era positiva e a actividade de cef a 1 os pori nase negatj va (figura 5A) . Pelo método de electroforese de alta voltagem (HVE) e aplicando os cri té ri os antes descritos, as actividades de penicilinase e cefalosporinase de jC. freundii e B. 1 i cheni f ormi s foram ambas classificadas como fortemente positivas; a actividade penicilinase e actividade cefalosporinase de B_. cereus foram classificadas como moderadamente positivas e negativas, respectivamente. (figura 5B e figura 6A).

As actividades de beta-lactamases em 21 estirpes de esp£ cies gram-positivas e 77 estirpes de 29 espécies gram-negativas de bactérias, foram determinadas, pelo ensaio de mancha no ensaio de electroforese de alta voltagem (HVE) e pelo ensaio de nitrocefina apõs incubação durante uma hora a temperatura de 37°C (Quadro I).

-²⁶- /

Quadro 1 - Actividades de ^-1actamases de microrganismos repre sentativos, determinados pelo teste de mancha, Teste HVE e teste de nitrccefina após incubação durante 1 hora ã temperatura de 37°C

Micro rgan i smo	Actividade deJl-lactamase
Teste P-ase	de mancha C-ase	Teste HVE P-ase C-ase	Teste Ni trocef
GRAM-NEGATIVO ENTERICO Citrobacter freundii NRL 5329	+	+	S	s
A JC 10787	-	4-	-	M	-4·
Enterobacter aerogenes NRL9817, ATCCI3048	-	+	-	M	-V
Enterobacter agglomerans NRL9819; ATCC29915	+	-	s	-	+
Enterobacter cloacae NRL5335, 9818; ATCCI3047	-	+	-	M	+
Escherichia coli ATCC21986,27549,31027	w	+	w	-	+
Klebsiella oxytoca NRL9979	+	-	s	-	+
Klebsiella pneumoniae NRL9976; ATCC1383, 27799	+	-	s	-	+
Morganella morganii NRL5334; ATCC25830	w	w	w	w	+
Proteus m i ra b i 1 is ATCCT4273, 29855	w	w	w	M
Proteus vulgaris ATÇC13315	w	+	w	M

Quadro 1 -(Cont.)

Microrgani smo

Actividade de JJ-lactamase

Teste de mancha Teste HVE Teste

P-ase C-ase P-ase C-ase Nitrocefina

GRAM-NEGATIVO ENTERICO

Providencia rettgeri

ATCC9250,31052	-	-	-	-	-
Salmonella typhimurium
ATCC13311	-	-	-	-	-
Serratia marcescens
ATCC8100, 17991	-	+	-	s	+
Serratia rubidaea
ATCC181	W	+	w	s	+
Shieela dysenteriae ATCC13313	-	w	-	w	Λ·
Shigella sonnei
ATCC11060 GRAM NEGATIVO NAO ENTÉRICO	-	+	-	M	+
Branhamella catarrhalis
NRL32674, 32681, 32763	+	+	s	S	+
NRL 30069, 30071 , 32589	-	-	-	-	-
Eikennella corrodens
ATCC1073, 32834	-	-	-	-	-
Haemophilus ducreyi V-1157, 1158, 1169	+	+	S	M	+
V-1152, 1168

Quadro 1 -(Cont.)

-28Microrganismo

Actividade de JJ-lactamase

Teste de mancha Teste HVE Teste

P-ase C-ase P-ase C-ase Nitrocefina

Haemophilus influenzae

AS1115, 902

AS1117,Ela; ATCC19418

Neisseria gonorrhoeae

NRL33044, 33047, 33050

NRL8327, 30483, F62

Pseudomonas ae.ruginosa

SM31302-31311

Pseudomonas cepaciae

BM1, 2

Pseudomonas fluorescens

BM3;ATCC2589

Pseudomonas maltophilia

BM4, 5; ATCC 13637

Pseudomonas putida

BM6,7; ATCC25571

GRAM-NEGATIVO ANAEROBICO

Bacteroides bivius

ATCC29303

Bacteroides capillosus

ATCC29799

+	+	s	s	+
-	-	-	-	-
+	+	s	s	+
-	-	-	-	-
w	w	w	w	-V
+	+	s	s	+
-	+	-	s	+
+	+	s	s	+
-	+	—	s	+
+	+	s	M	+

Quadro 1 -(Cont.)

Microrganismo

Actividade deJB-lactamase

Teste de mancha Teste HVE Teste

P-ase C-ase C-ase Nitrocefina

Bacteroides frágil is	w	W	+
ATCC23745,25285	W	+
GRAM-POSITIVO Bacilus cercus ATCC13061	+		s		+
ATCC27348,14579	+	-	M	-	-
Bacillus circulans ATCC4513	+	-	S	-	-
Bacillus licheniformis ATCC9789, 14409	+	w	S	w	+
ATCC 25972	+	+	S	s	+

Bacillus sbutilis
ATCC9799, 14410, 14415 W	W	-	-
ATCC14807 +	S	-	-
Staphylococcus aureus ATCC12598, 25923
BM U17, Su3 +	s	-	+
BM Mel 9 +	s	-	-
Staphylococcus epidermidis ATCC12228, 14990 +	s	-	+
Streptococcus faecalis
ATCC11420, 19433,2984		-	—
^a) Os números das estirpes são os	da American	Type	Culture

-30Collection (ATCC), a Neisseria Reference Laboratory (NRL) , Stephen A Morse (SM), Barbara H. Minshew (BM), and Arnold

L. Smith (AS). As estirpes de Haemophilus ducreyi foram de£ critas anteriormente (19). As condições de desenvolvimento para cada microorganismo foram as descritas sob a rubrica Materiais e Métodos.

b^As actividades de penicilinase (P-ase) e cefalosporinase (C-ase) determinadas para cada organismo pelo ensaio de mancha ou por o ensaio HVE foram registadas como se segue. 0 resultado de_s ta mancha para actividade beta-1actamase utilizando-se um dado substracto foi classificado como fracamente positivo (W) quando a intensidade de fluorescência da mancha era tênue mas mais evidente do que a do substracto não inoculado de contr£ lo; e como positivo (+) quando se observou uma fluorescência verde-azulada brilhante. 0 resultado do ensaio HVE para a actividade de beta-1actamase utilizando-se um dado substra£ to foi classificado como fracamente positivo (W) quando se observou ou uma leve fluorescência na posição que correspondia ã do produto final apos HVE, e a intensidade da cor da mancha do produto final após coloração com ninidrina-acetato de cádmio era ligeiramente superior ã observada no produto final no substracto não inoculado do controlo (produzida por hidrólise não enzimãtica expontânea e por contaminação); com o moderadamente positiva (M) quando se observava uma fluore£ cia verde-azulada brilhante na posição que correspondia ã da mancha do produto final, mas a intensidade da cor da mancha do produto final após coloração com ni ni dri na-acetato de ca'dmio era inferior ã de mancha do substracto remanescente; co mo fortemente positiva (S) quando se observava uma fluorescência verde-azulada brilhante na posição que correspondia ã mancha do produto final e ã intensidade da cor da mancha do produto final após a acção do corante ninidrina-acetato de cádmio era superior ã da mancha do substracto remanescente .

-32Os resultados do teste de nitrocefina concordavam bem com os obtidos com o ensaio de mancha confirmado pelo ensaio de HVE. Algumas beta-1actamases que actuam predominantemente sobre ampicilina, tal como algumas espécies de bactérias gram-positivas não foram detectadas pelo teste de nitrocefina. Portanto, o método fluorescente aqui descrito foi mais sensível do que o método de cefa 1osporina cromogénica (nitrocefina). As actividades de beta-1actamases em produtores de beta-1actamases escolhidos enumerados no Quadro 1 foram posteriormente avaliadas pelo ensaio de mancha rápido e o ensaio de nitrocefina após incubação durante 5 a 1 5 minutos ã temperatura ambiente. Os resultados representam-se no Quadro 2.

.-33Quadro 2 - Actividades de £-1actamases de microrganismos escolhidos determinadas pelo ensaio de mancha rápido e pelo ensaio de nitrocefina apõs incubação durante 5 e 15 minutos ã temperatura ambiente.

Actividade deJ3-Iactamase

Microorganismo

Teste

Tempo

Min

P-ase C-ase de de mancha rápido incubação

Min

P-ase C-ase

Teste de nitrocefina

Tempo de incubação ·· 5 mi η 15 mi n

GRAM-NEGATIVO ENTÉRICO

Citrobacter freundii

NRL5329

ATCC 10787

4Enterobacter aerogenes

NRL9817, ATCC13048

Enterobacter agglomerans

NRL9819; ATCC29915+

Enterobacter cloacae

NRL5335,9818;ATCC13047 Klebsiella oxytoca

NRL9979 + -+

Klebsiella pneumoniae

NRL9976;ATCC13883 + -+

Serratia marcescens

ATCC8100,17991

Serratia rubidaea

ATCC181

Shigella sonnei

ATCC11060 /

( -34'----/

Quadro 2 -(Cont.)

Actividade de JB-lactamase

Teste de mancha

Mi croorganismo

Tempo de incubação

Min 15 Min

P-ase C-ase P-ase C-ase

Teste de nitrocefina

Tempo de incubação min 15 min

GRAM-NEGATIVO NONENTERICO

Branhamella catarrhalis

NRL32674,32681,32763 +	- + -	+	+
Haemophilus ducreyi V-1157, 1158, 1169 +	-	+	-	+	+
Haemophi1 us ’ i nf1ueazan
AS1115, 902 +	-	+	-	+	+
Neisseria gonorrhoeae
NRL33044, 33047, 33050 +	-	+	-	+	+
Pseudomonas cepaciae
BM1, 2	-	-	+	-	+
Pseudomonas fluorescens
BM3;ATCC25289	-	-	+	-	+
Pseudomonas maltophilia
BM4, 5 +	+	+	+	+	+
Pseudomonas putida BM6,7; ATCC25571	-	-	+	-	+
GRAM-POSITIVO
Bacillus cereus
ATCC13061 +	-	+	-	+	+
ATCC27348,14579	-	+	-	-	-

-35Quadro 2 -(cont.)

Actividade deJJ-lactamase

Teste de mancha

Microrganismo

Tempo de incubação

Min 15 Min

P-ase C-ase P-ase C-ase

Teste de nitrocefina

Tempo de incubação min 15 min

GRAM-POSITIVO

Bacillus circulans

ATCC4513	W	-	-	-
Bacillus licheniformis
ATCC9789, 14409	+	w	-	+
ATCC25972 +	+	+	+	+
Bacillus subtilis
ATCC14807	+	-	-	-
Staphylococcus aureus BM U17, Su3	+			+
BM Mel 9 - -	+	-	-	-
Staphylococcus epidermidis ATCC14990 +	+	-	+	+
ATCC1228	+			+

a)

Os números da estirpe são os da American Type Collection (ATCC), a Neisseria Reference Laboratory (NRL), Barbara H. Minshew (BM) and Arnold L. Smith (AS). As estirpes de Haemophilus ducreyi foram descritas previamente (19). As condições de desenvolvimento para cada organismo foram descrj_ tas na rubrica Materiais e Métodos.

As actividades de penicilase (P-ase) e cefalosporinase (C-ase) para cada microrganismo determinadas pelo ensaio de mancha foram registadas como se segue:

o resultado desta mancha para a actividade ^-lactamase uti lizando-se um dado substracto foi classificado como fracamente positivo (W) quando a intensidade de fluorescência de mancha era ténue mas mais perceptTvel do que a do substracto nào inoculado do controlo; e como positiva quando se observava uma fluorescência verde-azulada brilhante.

tempo de incubação necessário para uma reacção positiva no ensaio de mancha fluorescente apresenta-se como sendo mais ou menos o mesmo ou menor do que o necessário para o ensaio de nitro cefi na .

Alguns microrganismos clinicamente importantes, tais como gonorrhoeae e H. influenzae, produzem beta-1 actmases que podem ser detectadas por um ensaio de mancha rápido imedatamente apôs a suspensão dos microrganismos numa solução com substracto de ampicilina sem posterior incubação. 0 método de detecção pelo ensaio de mancha crescente, descrito antes, da beta-1actmase da actividade da acilase, mas também pode detectar e diferenciar a actividade da penicilase da actividade da cefalosporinase. 0 ensaio de mancha fluorescente pode requerer 5 minutos de aquecimento ã temperatura de 120°C para maximizar o potencial fluorescente dos produtos finais ainda que o mecanismo pelo qual o aquecimento reforça a fluorescência não esteja completamente eslcrecido.

As soluções de substracto de antibióticos beta lactâmicos (formas ácidas) foram preparadas em tampão de fosfato de sódio 0,04 M de pH 7,5.

Estas soluções tinham o pH de 7,0. 0 pH das soluções baixou para 6,5 /com níveis de pH óptimos de beta-1actamases microbianas (Sykes, R. B., and M. Mathew, Detection, Assay and Immuno^ logy of Beta-1actamases, Beta-1actamases, 17-49(L979) , J. M. Hamilton-Mi 11 er and J. T. Smith (eds), Academic Press, New York)/ apôs hidrólise completa por C. freundi i e puderam ser conservadas ã temperatura de 4θ0 durante cinco dias ou ã temperatura de-20°C durante vários meses sem aumentos detectáveis na base fluorescen-

te como se verificou pelo ensaio de mancha.

Alguns organismos apresentam ligeira fluorescência sobre o papel mas esta fluorescência esta confinada ao centro da mancha aplicada e pode ser distinguida facilmente da fluorescência dos produtos finais que difunde radialmente por acção da capilaridade no papel desde o centro de aplicação. Portanto o ensaio de ma_n cha pode ser realizado sem eliminação prévia de organismos por ceji tri fugação.

A menos que a beta-1actamase tenda a mostrar ausência de especificidade de substracto, os substractos de ampicilina e de cefaloxina devem ser incubados separadamente com o organismo. Quajn do os substractos de penicilina e cefalosporina são misturados coji juntamente, o substracto que não ê hidrolizado pode actuar como um inibidor competitivo de outros substractos. Por exemplo, S·. marcescens (ATCC 8100 e 1 7991 ) exibe somente actividade de cefalosporinase como detectado pelo ensaio de mancha e pelo ensaio de HVE, quando a ampicilina e cefaloxina foram incubadas separadamejn te com o organismo. Contudo, a actividade da cefalosporinase não foi detectada em qualquer organismo pelo ensaio de mancha ou pelo ensaio de HVE quando ambas as estirpes foram incubadas com uma mistura de volumes iguais de solução de substractos de ampicilina e cefalexina durante uma hora a temperatura de 37°C.

método de detecção, ou ensaio de mancha, descrito antes, utilizando ampicilina e cefalexina como substractos, proporciona um método rápido e economico para a detecção específica de beta-lactamase mi crobiana,, medi ante detecção da presença de produtos finais fluorescentes. Este método de detecção pode ter diversas aplicações. Por exemplo, a incubação com soro humano pode resultar numa alteração de coloração da nitrocefina. Portanto, a ni-39Ύ .

trocefina não é apropriada para a detecção de beta-1actamase na presença de certos líquidos corporais. Verificou-se que oito so ros humanos conferiram ã nitrocefina uma coloração vermelha após 20 minutos de incubação ã temperatura de 37°C, mas não produziam fluorescência apôs incubação com ampicilina e cefalexina, durante uma hora ã temperatura de 37°C. Inversamente, os métodos descritos antes possuem o potencial para a detecção directa de beta-la£ tamases microbianas em especimens clínicas.

A detecção de produtos finais fluorescentes utiliza o método descrito antes, também, oferece uma alternativa económica p£ ra os laboratórios clínicos que investigam as beta-1actamases para grande número de microrganismos. Por exemplo, os ensaios de beta-1actamase de rotina sobre isolados estafi1ocócicos que utilizam nitrocefina requerem uma concentração não inibidora de uma penicilina semi-sintética como um indutor para a enzima. No presente método do ensaio de mancha fluorescente, com o tempo de incubação suficiente (p. ex., ^15 minutos), a ampicilina pode ser, utilizada não somente como um substracto, mas também como um ind_u tor para estas bactérias gram-negativas de importância clínica.

/ -40Quadro 3 - Actividades deJJ-lactamases de microrganismos escolhidos, determinadas pelo ensaio de mancha fluorescente com desenvolvente de fluorescência após incubação durante cinco minutos ã temperatura de 50°C, e quinze minutos ã temperatura de 37°C.

Actividade deJl-1actamase

Teste de mancha florescente com incubação de:

Microrganismos min a 50°C min a 37°C

Penici- Cefaloslinase porinase

Bactérias gram-negativas entéri cas

Citrobacter freundii

NRL 5329	+	+	+	+
ATCC 10787	-	+	-	+
Enterobacter cloacae
NRL 5335	-	+	-	+
ATCC 13047	-	+	-	+
Klebsiella oxytoca
NRL 9979	+	-		-
Klebsiella pneumoniae
NRL 9976	+	-	+	-
ATCC 13883	+	-	·+	-
Serratia marcescens
ATCC 8100	-	+	-	+
ATCC 17991	-	+	-	+
Shigella sonnei
ATCC 11060	-	+	-	+
Bactérias gram-negativas	não
entéri cas
Haemophilus ducreyi
V-1157	+	+	+	+
V-1158	+	+	+	+

Quadro 3 -(Cont.)

Actividade de^β-lactamase

Mi crorgani smos

Teste de mancha florescente com incubação de:

min a 50°C

Penici- Cefaloslinase porinase

-41-..

min a 37°C

Penici- Cefaloslinase porinase

Bactérias gram-negativas não entéri cas

Haemophilus influenzae

AS1115	+	:· +	+	+
AS902	+	+	+	+
Neisseria gonorrhoeae
NRL 33044,33047,33050	+	+	+	+
NRL F62, 33, Mel	-	-	-	-
Pseudomonas cepaciae
BM1	+	+	+	+
BM2	+	+	+	+
Pseudomonas maltophilia
BM4	+	+	+	+
BM5	+	+	+	+
Bactérias gram-positivas
Bacillus cereus
ATCC 13061	+	+	-V	+
ATCC 14579	+	-	+	-
Bacillus licheniformis
ATCC 9789	W	-	+	+
ATCC 25972	+	+	+	+
Bacillus subtil lis
ATCC 14807	w	-	+	-
Staphilococcus aureus
BMSu3	+	+	+	+
BMMel9	+	-	+	-

Os números das estirpes são os da American Type Culture Collection (ATCC), a Neisseria Reference Laboratory (NRL), Barbara H. Minshew (BM) e Arnold L. Smith (A.S.). As estirpes de H. ducreyi e condições de desenvolvimento para cada microrgani£ mo foram as previamente descritas na patente de invenção copendente.

As actividades de penicilinase e cefal ospori nase para ca. da microrganismo como determinadas pelo ensaio de mancha de fliw rescéncia, foram classificadas como se segue:

- o resultado do ensaio de mancha para actividade da J3-la£ tamase utilizando-se um dado substracto, foi classificado como fra. camente positivo (W) quando a intensidade fluorescente da mancha foi discreta mas visivelmente mais brilhante que a do substrácto não inocu lado de controlo; o resultado foi classificado como positivo qua£ do se observou uma mancha fluorescente verde-azulada brilhante; quer a ampicilina, para a actividade penicilinase, quer a cefalexina, para a actividade de cefa 1osporina se , foram utilizadas com uma concentração de 1 mM e 10 mM, respectivamente por mililitro, como descrito em Materiais e Métodos.

Tj

-43 Exemplo II

Substâncias químicas

As substâncias e reagentes químicos utilizados neste exem pio foram obtidos como descrito no Exemplo I. As soluções de antibióticos beta-lactãmicos, as suas cadeias laterais e núcleos be ta-lactãmicos foram preparados como anteriormente descrito no exem pio I, excepto o tampão, uma vez que todos os substractos de antji bióticos beta-lactãmicos, foram preparados em tampão de fosfato de sódio 20 mM de pH 7,3, para uma concentração final de 1 mM ou para 10 mM (pH foi corrigido para 7,0).

Métodos

Hidrólise de antibióticos beta-lactãmicos por beta-lactamase purificada

Substractos de penicilina (ampicilina e amoxicilina) foram hidrolizados por beta-lactamase proveniente de Bac i11us cereus (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri). Incubou-se 100 n mol de cada substracto com 0,25 ^ig de beta-lactamase durante uma hora ã temperatura de 37°C. Os substractos de cefalosporina (cefalogli cina, cefalexina e cefadroxil) foram hidrolizados com beta-lactama_ se proveniente de Enterobacter cloacae (Sigma Chemical, Co.). Foram incubados 100 nmol de cada substracto com 8 yjg de beta-lactamase durante uma hora ã temperatura de 37°C. A extensão da hidrólise foi controlada por cromatografia em camada fina bidimensional em placas de poliamida após introdução do grupo dansilo da mistura reaccional como descrito em (Chen, K. C. S., Two-dimensiona1 thin-layer chromatography for simultaneous detection of microbial JS-lactama acylases and 1 actama ses , Antimi crob. Agen ts Chemother .

30: 536-541 , 1 986 ).

Preparação de soluçoes desenvolventes melhoradas desenvolvente I foi preprado mediante adição de nitrato de prata a tampão de citrato de sódio com uma concentração final de 1,1 mM de Ag+. Adicionou-se aldeído fõrmico ã solução de tam pão de citrato de sódio para uma concentração final de 1,1 M. 0 pH do tampão de citrato de sódio (1,1 M) foi ajustado para 4,0 após a adição de nitrato de prata e do formaldeldo, 0 desenvolvente II foi preparado por adição do cloreto mercurico ao tampão de citrato de sódio para uma concentração final de 1,1 M.

Adicionou-se formaldeldo a solução do tampão de nitrato de sódio com uma concentração final de 1,1 M. 0 tampão de extracto de sódio, 1,1 M , foi ajustado para um pH de 4,0. Para o desenvolvimento de fluorescência utilizou-se a adição de um volume de desenvolvente I ou desenvolvente II até 10 volumes de solução de substracto de antibiótico beta-1actãmico incubado com organismos que produzem beta-1actamase.

Preparação de inÓculos para a detecção de

Beta-1actamase

As condições de desenvolvimento para cada microrganismo utilizadas neste exemplo, foram as mesmas que se utilizaram no Exemplo 1. Uma porção de 200 ml de cada solução de substracto de antibiótico beta-1actãmico foi colocada separadamente num tubo de cultura descartável de 10 x 75 mm, Colocou-se um tampão de algodão que continha aproximadamente metade de uma ansa (diâmetro de 2 mm) de cada estirpe desenvolvida retirada de uma placa de agar que se misturou em cada tubo do substracto e se incubou durante 5 minutos a temperatura de 50°C ou durante 15 minutos ã temperatura de 37°C. Do mesmo modo, prepararam-se controlo com substracto não inoculado.

Ensaio de mancha fluorescente para a detecção de beta-1actamases microbianas utilizando-se desenvolvente de fluorescência melhorada

Após cinco minutos de incubação ã temperatura de 50°C ou minutos ã temperatura de 37°C, adicionou-se em cada tubo 20 jj 1 de uma solução desenvolvente de fluorescência, incluindo cada t£ bo de controlo substracto não inoculado. A mistura reaccional foi misturada rapidamente com o aplicador e posteriormente incubada em banho de água ã temperatura de 50°C, durante 5 minutos. Após a incubação, o aplicador de cada tubo, incluindo os tubos de con trolo com substracto não inoculado, foram separadamente contacta dos com papel de filtro whatman a 3 MM para formarem uma mancha com um diâmetro de cerca de 8 mm. A intensidade de fluorescência de cada mancha foi então comparada com a correspondente man cha do controlo do substracto não inoculado ã luz ultra violeta de grande comprimento de onda e classificada como negativa, fra camente positiva ou positiva.

Comparação de níveis hidrolíticos de substractos de ampicilina e cefalexina para um dado organismo ã temperatura de 37°C

Para comparação'dos níveis.de hidrólise de substractos de ajnplcilina e

-46cefalexina por determinados organismos colocou-se separadamente uma alíquota de 100 jjI de cada solução de substracto Beta-lact£ mico num tubo de cultura de silicato de boro 10 x 75 ml descar tável. Uma ansa de 2 mm de diâmetro com cada uma das estirpes desenvolvida, foi retirada da placa de agar que continha o organismo a ser ensaiado. Estas amostras foram suspensas em 20 0 de solução normal de cloreto de sódio mediante agitação num vo£ tex. Adicionou-se separadamente 10 jj 1 de cada diluição de duas vezes da suspensão bacteriana em solução normal de cloreto de só· dio a cada solução de substracto. Após incubação ã temperatura de 37°C durante 30 minutos, adicionou-se 11 jal da solução de d_e senvolvente de fluorescência. A mistura reaccional foi incubada ainda ã temperatura de 50°C em banho de ãgua durante cinco mj_ nutos. A mistura reaccional foi transferida separadamente para uma placa de 96 cavidades num Imune Plate II (Scientific Resourse Associates, Bellevue, Washington). Estas amostras foram diluídas em série duas vezes com ãgua, por meio de uma pipeta de 12 canais (Flow Laboratories, Inc., Inglewood, Califórnia). Cem esta pipeta foram colocadas em papel de filtro Watman 3 MM amos_ tras de 5ja 1 provenientes de cada cavidade e visualizadas com uma lâmpada de ultra violeta de longo comprimento de onda.

Comparação de níveis hidrolíticos de substracto de ampicilina ou de cefalexina por um dado organismo ã temperatura de 37°C e de 50°C processo para a comparação dos níveis de hidrólise de ampicilina e cefalexina ãs temperaturas de 37°C e 50°C realizadapa por um dado organismo, foram determinados como descrito ajn tes, com a diferença de se ter utilizado uma solução com um uni co substracto e de se fazerem as incubações separadamente ã tem peratura de 37°C e ã temperatura de 50°C.

Desenvolvimento de fluorescência de produtos finais provenientes de hidrólise de beta-1actamase mediante a utilização de soluções de desenvolvente de fluorescência melhoradas

Soluções de substracto de penicilinas (ampicilina e amox£ cilina) e de cefalosporinas (cefa 1og1icína , cefalexina e cefadro xil) não se apresentam fluorescentes ã luz ultra-violeta. As s£ luções dos produtos finais do anel de beta-lactama berto correspondente, resultantes da hidrólise de ^-lactamase também não se apresentaram fluorescentes ã luz ultra-violeta. Após a adição do desenvolvente de fluorescência melhorado da presente invenção, aos substractos intactos e aos produtos finais do grupo beta-lactânn co aberto correspondente seguida por aquecimento de cada mistura reaccional ã temperatura de 50°C durante 5 minutos. Tornaram-se fluorescentes apenas os produtos finais,. Por exemplo, como se mostra na figura 7, após a adição do desenvolvente II de f 1 uore£ cência e aquecimento ã temperatura de 50°C durante 5 minutos, sõ se desenvolveu fluorescência para os produtos finais de ampicilina ou cef a 1 ex i na após a hidrólise de 1 actama se .

desenvolvente I proporeionouresultados idênticos.

Melhoramento de desenvolvimento de f1uorescência com desenvolvente .: de fluorescência melhorado

A intensidade fluorescente de produtos finais produzida por B-lactamase com o desenvolvimento descrito por y. Cli n. Mi crob.

23: 539-544 , 1 986 , foi cerca de quatro vezes e 16 vezes superio res para substractos de ampicilina e cefalexina, respectivamente, da intensidade da fluorescência da da fluorescência do ensaio da mancha fluorescente sem a presença de um desenvolvente de fluorescência (ver figura 8), A intensidade de fluorescência de produtos finais produzidos pela J3-lactamase com o desenvolvente de fluorescência melhorado, (desenvolvente II), como descrito na presente invenção, foi de cerca de 10 e 6 vezes superior para os substractos de ampicilina e cefalexina respectivamente, ã intensidade de fluorescência do ensaio de mancha fluorescente com um desenvolvimento descrito em 2· C1i n · Mi crob . 23: 538:544, 1986, Portanto, a intensidade da fluorescência tjo tal dos produtos finais produzidos pela Ji-1actamase com o desen volvente fluorescente melhorado descrito nesta invenção foi apro ximadamente 40 e 96 vezes superior para substractos de ampicilina e cefalexina respectivamente, da intensidade de fluorescência obtida sem o desenvolvente de fluorescência como descrito no exem pio I .

Diferenciação das actividades de^-1actamase e acilase e entre actividades de penicilinase e cefa 1 os porina se de ^-lactamase pelo teste de mancha fluorescente com o desenvolvente de fluorescência melhorado

Determinuo-se se o teste de mancha fluorescente que utiliza o desenvolvente de fluorescência melhorada da presente invenção, podia distinguir a actividade de beta-lactamase da actividade da acilase. Soluções de produtos finais da actividade de acila^ se sobre ampicilina, cefa 1oglicina e cefalexina (cadeia lateral de acilo comum, ãcido D(-)-<\(,-amino fenilacético e ácido 6-amino-

-49f penicilãnico e acido 7-aminocefalosporãnico, com núcleos beta-lactâmicos intactos e ácido 7-aminodesacetoxicefalosporãnico , respectivamente) e sobre amoxicilina e cefadroxil (cadeia lateral acilo comum D(-)-p-hidroxi-feni1g1icina e núcleos beta-lactámicos intactos de ácido 6-aminopenicilánico e ácido 7-aminodesacetoxicefalosporânico, respectivamente) não evidenciaram fluorescência após adição do desenvolvente de fluorescência m£ lhorado e aquecimento ã temperatura de 50°C durante 5 minutos . Portanto, quando se utilizou ampicilina, amoxicilina, cefaloglj_ cina, cefalexina ou cefadroxil como substracto para actividade de beta-1actamases, o ensaio de mancha fluorescente ou o desenvolvente fluorescente melhorado da presente invenção pôde diferenciar a actividade beta-1actamase da actividade acilase. Esc£ lheu-se ampicilina para detectar a actividade de penicilinase porque esta produz menos f1uorescência residual do que a amoxicilina e escolheu-se cefalexina para detectar actividade cefalos porinase porque esta produz menos fluorescência residual do que cefa 1og1icina e cefadroxil. As fases do ensaio de mancha fluorescente para a detecção de beta-lactamases microbianas com o desenvolvente de fluorescência melhorada estão resumidas na figura 9,

Detecção de^β-lactamases entre microrgani smos; seleccionados .0 resultado do ensaio de mancha para a actividade de be-ta-1actamase com um dado substracto foi classificado como fracamente positivo qundo a intensidade fluorescente da mancha era ténue mas visivelmente mais brilhante do que a do substracto não inoculado de controlo e como positiva quandó se observou uma

fluorescência verde-azulada luminosa. 0 teste de mancha com o desenvolvente fluorescente melhorado (desenvolvente II) foi utj[ lizado para a detecção de beta-1actamases produzidas por 24 estirpes de 11 espécies gram-negativas e 7 estirpes de 4 espécies gram-positivas com ampicilina para a actividade penicilinase e com cefalexina para a actividade de cefalosporinase como substra£ to após incubação durante 5 minutos ã temperatura de 50°C ou durante 15 minutos ã temperatura de 37°C, Com as bactérias gram-negativas, a sensibilidade do ensaio de mancha fluorescente obtida ã temperatura de 5Q°C durante 5 minutos foi essenci al meja te a mesma do que o teste conduzido ã temperatura de 37°C, durajn te 15 minutos. Para algumas bactérias gram-positivas , o ensaio foi mais sensível quando conduzido ã temperatura de 37°C durante 15 minutos. Provavelmente, ê necessária a estes organismos a indução do substracto. (Quadro 3).

Para a detecção de beta-1actamase em organismos conhecidos, o substracto óptimo e a temperatura de incubação óptima, po de ser pré-seieccionada como descrito a seguir. A figura 10 mostra a ac tividade penicilinase em estirpes PPNG após incubação com ampicilina durante um minuto ã temperatura de 50°C, uti1izando-se desenvolvente fluorescente melhorado (desenvolvente II) para desenvolvimento de fluorescência dos produtos finais.

Quantificação visual de produtos finais resultantes da hidrólise de beta-lactamase

Fundamentado no facto das intensidades de fluorescência das manchas dos produtos finais com concentrações superiores a 200 uM se tornarem indistintas quando se utiliza o desenvolven5Τte melhorado para desenvolvimento de fluorescência (figura 7), foi delineada a quantificação visual dos produtos finais mediajn te comparação das intensidades de fluorescência das manchas de misturas reaccionais diluídas em série duas vezes.

Os resultados apresentam-se no Quadro 4.

Quadro 4

Quantificação visual de produtos finais resultantes da hidrólise de beta-lactamase de ampicilina e cefalexina

Percentagem em substracto beta-lactãmico hidrolizado pela beta-1actamase

Comparação de intensidade de fluorescência das manchas de misturas reaccionais diluídas em série duas vezes

APC 1 mM CEX 10 mM

2 4 8 1 2 4 8

CEX >16

APC b>80; CEX > 8 < APC < 80 ; 4< CEX < 8

APC < 40; CEX <4

Escolha de um substracto óptimo para a detecção de beta-lactamase microbiana de origem conhecida

A utilização do desenvolvente melhorado da presente invenção e a selecção de um substracto óptimo para beta-lactamase exibindo uma actividade predominante de peniclinase ou de cefalosporinase são relativamente fáceis, Contudo, a selecção

-52do substracto óptimo para beta-1actamase em que a actividade da penicilinase e a actividade da cefalosporinase são comparáveis, ê difícil. Neste caso, o ensaio de mancha fluorescente que utj_ liza metodologias de técnicas anteriores resulta em intensidades não diferenciáveis de fluorescência, Susupensões bacterianas diluídas em serie duas vezes, provenientes de um organismo com substracto de ampicilina e cefalexina foram incubadas separadamente e tratadas com desenvolvimento. A fluorescência dos produtos finais resultou da hidrólise de beta-1actamase, aue oõde ser visualmente quantificada após duplas diluições das mist£ ras reaccionais como se mostrou no Quadro 4, As suspensões bac terianas diluídas em série duas vezes, provenientes de um esti_r pe de Neisseria gonorrhoeae (PPNG) foram incubadas separadamente com 1 mM de ampicilina e 10 mM de cefalexina. A f1uorescê_n cia dos produtos finais foi quantificada visualmente por diluições duas vezes da mistura reaccional como se mostra na figura 11 .

As intensidades de fluorescência das manchas das misturas reaccionais não diluídas, diluídas duas vezes e diluídas 4 vezes, após incubações de suspensões bacterianas não diluídas e diluídas duas vezes, quatro vezes, oito vezes e dezasseis vezes com 1 mM de substracto de ampicilina, foram praticamente indistinguíveis, o que indica que mais de 80% de cada solução de substracto de ampicilina fora hidrolizada por cada suspensão bacteriana (Quadro 4).

As intensidades de fluorescência das manchas provenientes de misturas reaccionais não diluídas e diluídas duas vezes quatro e oito vezes foram diminuindo sucessivamente com as diluições aumentadas após incubação das suspensões bacterianas

-53não diluídas e de todas as suspensões bacterianas diluídas em S£ rie duas vezes, com 10 mM de substracto de cefaloxina o que indj[ ca menos de 4% de cada solução de substracto ter sido hidroliza_ da por cada suspensão bacteriana. (Quadro 4). Portanto, o substracto preferido é a ampicilina para a detecção de beta-lactamase na PPNG.·

Deste modo, a utilização do desenvolvente melhorado da presente invenção, permite a determinação do substracto óptimo para PPNG utilizando-se a análise visual da mancha de fluorescêji cia. Este facto é especia 1mente válido quando são comparáveis as actividades de penicilinase e cefalosporinase.

Selecção da temperatura de incubação para detecção de beta-lactamases bacterianas

A escolha da temperatura óptima para a incubação de um substracto escolhido para um organismo é importante para a detecção rápida de beta-lactamases microbianas. Por exemplo, es colheu-se a ampicilina para detecção de actividade de beta-la£ tamase numa estirpe de PPNG como descrito antes. As intensida^ des de fluorescência das manchas, de misturas reaccionais não diluídas e diluídas duas vezes, quatro vezes e oito vezes, apõs incubações de suspensões bacterianas diluídas quatro vezes, oi to vezes, dezasseis vezes e trinta e duas vezes em 1 mM de subs^ tracto de ampicilina foram significativamente superiores ãs obti das quando as incubações foram realizadas ã temperatura de 50°C durante 5 minutos do que as obtidas com temperaturas de 37°C d£ rante cinco minutos (Figura 12). Portanto, a temperatura p r e f _e rida para a detecção da actividade beta-lactamase nas mesmas es tirpes de PPNG foi determinada como sendo a 50°C,

Da descrição anterior, devera ser concluído que os aspec tos específicos da presente invenção foram aqui descritos com o fim de esclarecimento e que diversas modificações podem estar não desviadas do espírito e do âmbito da presente invenção. De_s te modo, esta menção é limitada senão pelas reivindicações apen sas .

Claims

Reivindicações

-551Método para a detecção da presença de beta-lactamase de origem microbiana que utiliza um substrato que contém um núcleo beta-lactãmico cuja ligação amida é hidrolisada na presença de beta-lactamase, caracterizado pelo facto:

a) de se fazer contactar um substrato substancialmente não fluorescente que inclui um núcleo beta-lactãmico com uma cadeia lateral acilo comportando um grupo alfa-amínico e um grupo alfa-fenílico ou os seus derivados, com um organismo gue se julgue produzir beta-lactamase ou com uma preparação isenta de células que se julgue conter beta-lactamase, para se obter uma mistura reaccional;

b) de se fazer contactar a referida mistura reaccional com uma solução promotora do desenvolvimento de fluorescência constituída por um agente de oxidação em um

-56tampão; e

c) de se determinar se o produto da reacção entre o referido substrato, o referido agente de oxidação e o referido organismo ou preparação exibe fluorescência como resultado da hidrólise da beta-lactamase existente no referido substrato.
2. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se escolher o agente de oxidação contido na solução entre iões Ag⁺, Hg⁺⁺, I^- , 10^-, ^pã⁺⁺ persulfato, peróxido de hidrogénio ou benzoato de p-hidroxi-mercúrio.
3. - Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de a solução que contém o agente de oxidação comportar adicionalmente, formaldeído em uma concentração molar compreendida entre cerca de 0,22 e cerca de 2,2 moles.
4. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o agente tampão incorporar o sal de ácido cítrico, ácido tartárico, ácido málico, ácido succínico, ácido glutárico, ácido láctico ou ácido ftálico.
5. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o pH da solução que promove o desenvolvimento de fluorescência estar compreendido entre cerca de 3,5 e 5,5.
6. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se escolher o substrato substancialmente não fluorescente no grupo constituído por ampicilina, amoxicilina, cefaloglicina, cefalexina, hetacilina e cefadroxil.
7. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se realizar a fase (b) a uma temperatura compreendi-, da entre 22°C e 50°C.