JPH0870891A - 臨床標本における大腸菌の酵素捕獲検定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 臨床標本から酵素捕獲検定法により大腸菌を
検出する方法に関する。 【構成】 ある臨床標本から迅速的に大腸菌を検出する
方法であり、その原理としては、大腸菌のマーカー酵素
のβ−Ｄ−グルクロニダーゼと結合する抗体を固定化
し、それを大腸菌が存在すると思われる臨床標本と接触
させ、抗体により捕獲された酵素の活性を発けい光性基
質の存在下で測定することにより間接的に大腸菌を検出
することである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、臨床標本から酵素捕獲
検定法（ＥＣＡ法）により大腸菌を検出する方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】臨床標本から所要の微生物を単離するこ
とに、臨床医による慎重な評価の他、迅速な作業も必要
である。病院の統計により、菌血症と真菌血症を有する
病人は全体の３．４−２８／１，０００を占めており、
アメリカでの平均は１０／１，０００（１％）である
（Wcinstcin,M.P.,J.R.Murphy,L.B.Reller,and K.A.Lic
htenstein.1983. The clinical significance of posit
ive blood cultures: a comprehensive analysis of 50
0 episodes of bacteremia and fungemia in adults. I
I. Clinical observations, with special reference t
o factors influencing prognosis. Rev. Infect. Dis.
5:54-70.)。血液標本から最もよく単離されている菌種
は、大腸菌（Escherichia coli) 、黄色ブドウ球菌（St
aphylococcusaureus)、肺炎双球菌（Streptococcus pne
umoniae）、肺炎クレブシラ菌（Klebsiella pneumonia
e)と緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）(Brauner,A.,B.
Kaijser,B.Wretlind,and I.Khn.1991.Characterization
of Escherichia coli isolated in blood,urine and f
aeces from bacteremic patients and possible spread
of infection. Acta Pathol.Microbiol.Immunol.Scand.
99:381-386.) の五種類である。その中で、大腸菌は臨
床微生物研究室において最も重要なグラム陰性菌であ
る。大腸菌は純粋培養又は混合培養の一部として、菌血
標本からよく単離されている（Brauner,A.,B.Kaijser,
B.Wretlind,and I.Khn.1991.Characterization of Esch
erichia coli isolated in blood,urine and faeces fr
om bacteremicpatients and possible spread of infec
tion.Acta Pathol.Microbiol.Immunol.Scand.99:381-38
6.、Filice,G.A.,L.L.Van Etta,C.P.Darby,and D.W.Fra
ser.1986.Bacteremia in Charleston County,South Car
olina.Am.J.Epdemiol.123:128-136.、Ljungman,P.,A.S.
Malmborg,B.Nystrm,and A.Tillegrd.1984.Bacteremia i
n a Swedish university hospital: a one-year prospe
ctive study in 1981 and a comparison with 1975-76.
Infection 12:243-247. 、McGowan,J.E.1985.Changing
etiology of nosocomial bacteremia and fungemia and
other hospitalacquired infections.Rev.Infect.Dis.
7:S357-S370. 、Roberts,F.J.1980.A review of positi
ve blood cultures: identification and source of mi
croorganisms and patterns of sensitivity to antibi
otics.Rev.Infec.Dis.2:329-339.)。その菌血標本から
の発見率は４０％にも及ぶ。発明者の一人が所属する病
院（国立成功大学附属病院、台南、台湾）では、１９９
１−１９９２年の間に、細菌由来の血行感染の中に、大
腸菌の感染は２１．７％を占めている（資料未公開）。
他の報文（Chianq,T.M.,and T.Y.Chanq.1991.Pediatric
bacteremia strainsgrow in blood culture media.Chi
n.Med.J.(Taipei) 47:39-44.)により、小児科部門の菌
血症ケースの中に、大腸菌による感染は２８．４％であ
る。その高い感染率と死亡率（Brauner,A.,B.Kaijser,
B.Wretlind,and I.Khn.1991.Characterization of Esch
erichia coli isolated in blood,urine and faeces fr
om bacteremic patients and possible spread of infe
ction.Acta Pathol.Microbiol.Immunol.Scand.99:381-3
36.) から、血液標本における大腸菌の快速同定法は、
臨床上非常に重要である。

【０００３】病院で一般に使われている血液標本の大腸
菌同定法は、先ず標本を培養し、１２時間から２週間の
培養期間の間に断続的に抽出して次代培養を行う方法で
ある。また、培養期間にグラム染色結果が陽性反応を呈
し、あるいは明らかな細菌繁殖現象（濁度の変化、気体
の生成や溶血現象など）が現れても、次代培養して同定
する。しかしながら、この次代培養と同定の手順は、少
なくとも２４時間を費やす。そこで、すでに述べたよう
な高い発生率と死亡率のみならず、従来の検定方法の煩
雑さからも、より簡便な大腸菌検定方法の開発が要求さ
れている。一旦グラム陰性菌の繁殖が発見された場合、
血液標本から従来の方法より迅速に大腸菌を検出できる
ならば、従来の検出手段より早期に大腸菌菌血患者に治
療を与えることができる。

【０００４】１９７６年に、大腸菌（Escherichia)、赤
痢菌（Shigella）とサルモネラ（Salmonella）などに属
する限られた菌種におけるβ−Ｄ−グルクロニダーゼ
（ＧＵＤ）活性はKilianとBulow により報告されている
（Kilian,M.,and P.Bulow.1976.Rapid diagnosis of En
terobacteriaceae.I.Detection of bacterial glycosid
ases.Acta Pathol.Microbiol.Scand.Sect.B,84:245-25
1.)。この性質は、食品と臨床微生物実験室で、大腸菌
の検出に広く応用されている（Delisle,G.J.,and ALey.
1989.Rapid detection of Escherichia coli in urine
samples by a newchromogenic β-glucuronidase assa
y.J.Clin.Microbiol.27:778-779. 、Feng,P.C.S.,and
P.A.Hartman.1982.Fluorogenic assays for immediate
confirmationof Escherichia coli.Appl.Environ.Micro
biol.43:1320-1329. 、Heizmann,W.,P.C.Dller,B.Gutbr
od,and H.Wemer,1988.Rapid identification of Escher
ichiacoli by Fluorocult media and positive indole
reaction.J.Clin.Microbiol.26:2682-2684. 、Kaspar,
C.W.,P.A.Hartman,and A.K.Benson.1987.Coagglutinati
on and enzyme capture tests for detection of Esche
richia coli β-galactosidase, β-glucuronidase, a
nd glutamate decarboxylase.Appl.Environ.Microbiol.
53:1073-1077.、Trepeta,R.W.,and S.C.Edberg.1984.Me
thylumbelliferyl-β-D-glucuronide-based medium for
rapid isolation and identification of Escherichia
coli.J.Clin.Microbiol.19:172-174.)。殆どの報告
に、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニ
ダーゼ（ＭＵＧ）は発けい光性ＧＵＤ基質として培地に
導入されている。いくらかの他の菌種（Yersinia,Flavo
bacterium,staphylococci とstreptococci）もこの酵素
に陽性反応を示し（Holt,S.M.,P.A.Hartman,and C.W.Ka
spar.1989.Enzyme-capture assay for rapid detection
of Escherichia coli in oysters.Appl.Environ.Microb
iol.55:229-232.、Moberg,L.H.1985.Fluorogenic assay
for rapid detection of Escherichia coli infood.Ap
pl.Enyiron.Microbiol.50:1383-1387.、Robison.B.J.19
84.Evaluationof a fluorogenic assay for detection
of Escherichia coli in foods.Appl.Environ.Microbio
l.48:285-288.) 、たまには、この酵素を含む動物組織
が反陽性反応を示す。そのため、オイスターから大腸菌
を検出する酵素捕獲検定法（ＥＣＡ）が開発された（Ho
lt,S.M.,P.A.Hartman,and C.W.Kaspar.1989.Enzyme-cap
ture assay for rapid detection of Escherichia coli
in oysters.Appl.Environ.Microbiol.55:229-232.) 。
それは、ミクロタイタープレートに被覆された抗ＧＵＤ
抗体を用いて、食品標本に存在する大腸菌が生成した酵
素を捕獲し、発けい光性や発色性基質を加えることによ
り、ＧＵＤ活性を検出する方法である。ここで、交差反
応は、腸内細菌科（Enterobacteriaceae) に属するのい
くらかの菌種のみにより起こる。

【０００５】標本から大腸菌を検出するために、直接、
培地に発けい光性ＧＵＤ基質を導入することが便利で快
速であるが、暗赤色の血液標本の場合、けい光が血液に
より遮られるので、酵素捕獲検定法が好まれる。

【０００６】最近、Hussonら（Husson,M.O.,C.Miclcarc
k,D.Izard,and H.Leclcrc.1989.Alkaline phosphatase
capture test for the rapid identification of Esche
richia coli and 赤痢菌 species based on a specific
momoclonal antibody.J.Clin.Microbiol.27:1518-152
1.)は、アルカリフォスファターゼ（alkaline phosphat
ase）捕獲テスト法により、血液と尿液標本から大腸菌
及び赤痢菌を検出する方法を開発した。その方法は、尿
液標本から大腸菌を検出する場合に特異性が高い（９
６．８％）が、血液標本の場合はその特異性が相当に低
い（９１％）。

【０００７】したがって、臨床標本から高い感度及び高
い特異性で大腸菌を快速に検出する方法は、早期に微生
物感染に対する治療を始めるために求まれる。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、酵素
捕獲検定法（ＥＣＡ）により、十分な感度と特異性で臨
床標本から大腸菌を検出する法を提供することである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明の目的は、大腸菌
のマーカー酵素としてβ−Ｄ−グルクロニダーゼを利用
した酵素捕獲検定法により達成できる。

【００１０】つまり、本発明の方法は、大腸菌が存在す
ると思われる臨床標本を抗ＧＵＤ抗体と接触し、捕獲さ
れた酵素を発けい光性基質により検出する方法である。
具体的に、もしグラム陰性菌の増殖現象が現れる血液標
本に大腸菌が存在すれば、抗ＧＵＤ抗体が大腸菌が産生
したＧＵＤを捕獲し、後に酵素が発けい光性基質を加水
分解させ、けい光を発生させる。そのけい光を測定する
ことにより間接的に大腸菌を検出することができる。

【００１１】したがって、本発明は、標本を培養し、培
養した標本から細胞ライゼートを作成し、前記ライゼー
トを大腸菌のβ−Ｄ−グルクロニダーゼに対する固定化
抗体に接触させることにより大腸菌のβ−Ｄ−グルクロ
ニダーゼを前記ライゼートにおいて結合させ、β−Ｄ−
グルクロニダーゼ基質を用いて前記固定化抗体と結合し
たいかなるβ−Ｄ−グルクロニダーゼを検出し、そして
前記基質の転換により標本における大腸菌を検出するこ
とを特徴とする標本から大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）を検出
する方法を提供する。

【００１２】本発明の方法を実施するのに必要な時間は
ただ４時間である。したがって、従来の次代培養そして
同定する方法と比べて２４時間も早く適切な抗微生物治
療を始められるので、大腸菌由来の菌血症による死亡率
を低減させることができる。

【００１３】本発明に使われる抗体は、臨床標本におけ
る大腸菌が製造するβ−Ｄ−グルクロニダーゼを特定し
て捕獲するのに十分な特異性を有するものでさえあれ
ば、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でも用
いられる。特異性の高い抗体の調製法は当業者によりよ
く知られている。例えば、分取ゲル電気泳動法そして活
性染色法により市販の粗製酵素を精製し（Delisle,G.
J.,and A Ley.1989.Rapiddetection of Escherichia co
li in urine samples by a new chromogenic β-glucur
onidase assay.J.Clin.Microbiol.27:778-779.)、得ら
れた精製のＧＵＤをそのまま動物の体内に導入し、最後
にＧＵＤに対する特異性のある抗体を得ることができ
る。このように、高純度のＧＵＤが得て、２日間内にウ
サギに注入することができる。ＧＵＤ含有ポリアクリル
アミドゲルで動物体内に免疫反応を起こらせるもう一つ
の利点は、報告されているようにそのゲル自身が促進剤
になることである（Weintraub,M.,and S.Raymond.1963.
Antiserums prepared with acrylamide gel used asadj
uvant.Science 142:1677-1678.) 。そこで、電気泳動ゲ
ル上の活性染色技術（zymogram) は、抗体を得るための
簡便で迅速な酵素精製法である。

【００１４】本発明の一つの実施態様に、分取ゲル電気
泳動そして活性染色法が大腸菌Ｋ−１２由来の粗製ＧＵ
Ｄを精製するために用いられた。ＧＵＤを示す青いバン
ド（インドリル−β−Ｄ−グルクロニドがＧＵＤにより
切断され、不溶性のインジコが沈着した結果）を電気泳
動ゲルから切取り、研磨した後、ニュージランド白兎に
注入した。

【００１５】プライミングに続いて四つのブースターイ
ンジェクションを終えた後、酵素連結免疫吸着法で兎の
抗血清のタイターを測定した結果、約１０⁷ の数値が示
された。この抗血清はＧＵＤに対する特異性を持ち、本
発明の方法に利用することができる。

【００１６】本発明に使用できる基質は様々であり、発
けい光性を有する４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ
−グルクロニドＭＵＧ）はその一つである。発けい光性
基質ＭＵＧを使った本発明の一つの実施態様において、
検出限界は０．１ng／ml（３Ｘ１０^-13 Ｍ）まで及び、
それは、おおよそ１０⁶ ＣＦＵ／mlの大腸菌の細胞濃度
に相当する。

【００１７】赤痢菌とサルモネラのいくらかの菌株がＧ
ＵＤを産生すると報告された（Kiiian,M.,and P.Buiow.
1976.Rapid diagnosis of Enterobacteriaceae.I.Detec
tionof bacterial glycosidases.Acta Pathol.Microbio
l.Scand.Sect.B,84:245-251. 、Holt,S.M.,P.A.Hartma
n,and C.W.Kaspar.1989.Enzyme-capture assay for rap
id detection of Escherichia coli in oysters.Appl.E
nviron.Microbiol.55:229-232.) が、サルモネラによる
血行感染が少なく、赤痢菌由来の菌血症も稀である（We
instein,M.P.,J.R.Murphy,L.B.Reller,and K.A.Lichten
stein.1983.Theclinical significance of positive bl
ood culturs: a comprehensive analysis of 500 episo
des of bacteremia and fungemia in adults.II.Clinic
al observations,with special reference to factors
influencing prognosis.Rev.Infect.Dis.5:54-70.、Fil
ice,G.A.,L.L.Van Etta,C.P.Darby,and D.W.Fraser.198
6.Bacteremia in Charleston County,South Carolina.A
m.J.Epdemiol.123:128-136.、Ljungman,P.,A.S.Malmbor
g,B.Nystrm,and A.Tillegrd.1984.Bacteremia ina Swed
ish university hospital: a one-year prospective st
udy in 1981 anda comparison with 1975-76.Infection
12:243-247. 、Roberts,F.J.1980.A review of positi
ve blood cultures:identification and source of mic
roorganissms and patterns of sensitivity to antibi
otics.Rev.Infec.Dis.2:329-339.、Speer,C.P.,D.Haupt
mann,P.Stubbe,and M.Gahr.1985.Neonatal septicemia
and meningitis in Goettingen,West Germany.Pediatr.
Infect.Dis.4:36-41.)。本発明による研究で陽性反応を
示した２１２個の血液標本の中に、サルモネラによる感
染がわずかに五つ（３％）であり、その中にただ一個が
ＥＣＡ−陽性反応を示した。しかも、２１２個の陽性血
液標本の中に、赤痢菌が検出されなかった。そこで、血
液標本につき、サルモネラと赤痢菌による仮陽性反応は
きわめて低いことが分かった。

【００１８】一方、ＧＵＤは誘導性酵素としても知られ
ている（Novel,G.,M.L.Didier-Fichet,and F.Stoeber.1
974.Inducibility of β-glucuronidase in wild-type
andhexuronate-negative mutants of Escherichia coli
K-12.J.Bacteriol.120:89-95.)。競合微生物や残留抗
生物質の存在下での仮陰性反応の発生は、臨床培地にＧ
ＵＤ誘導物質を添加し、大腸菌のＧＵＤ生産を促進する
ことにより抑えられる。本発明の方法に適する誘導物質
はβ−Ｄ−グルクロニド誘導体であるが、以下の化合物
やその混合物が特に好ましい：５−ブロム−４−クロロ
−３−インドリル−β−グルクロニド（ＢＣＩＧ）、メ
チル−β−Ｄ−グルクロニド（ＭＧ）、４−メチルウン
ベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド（ＭＵＧ）とｐ−
ニトロフェニル−β−Ｄ−グルクロニド（ＰＮＰＧ）。
その中に、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルクロニド
（ＰＮＰＧ）が特に好ましい。５０μｇ／mlのｐ−ニト
ロフェニル−β−Ｄ−グルクロニドを使用した本発明の
一つの実施態様に、大腸菌の検出感度を一桁高い（１０
⁵ ＣＦＵ／ml）。

【００１９】分析に使う臨床標本は伝統的な方法を用い
て収集した。臨床標本の定義は明確であり、例えば、血
液標本と尿液標本が含まれている。

【００２０】最後に、本発明の方法の利用法は様々であ
る。例えば、酵素を捕獲するための抗ＧＵＤ抗体をミク
ロタイタープレート、ミクロビーズや細粒にコートする
こともできる。自動化するために、ミクロタイタープレ
ートが好まれる。そこで、本発明のある好ましい実施態
様では、抗ＧＵＤ抗体がミクロタイタープレートにコー
トされた。

【００２１】

【実施例】

菌株と培養条件 ＧＵＤの産生をＥＣＡ法でテストするに用いられる１０
８個大腸菌ストック菌株の中に、１０２個は臨床的に単
離されたものであり（三軍総医院、台北、台湾）、残っ
た六つの大腸菌菌株と他の腸内細菌科に属する菌株は菌
種保存センター（ＣＣＲＣ、新竹、台湾）からのもので
ある。すべての大腸菌標本はさらにＭｉｃｒｏ−ＩＤ診
断キット(Organon Teknika Corp.,Durham,NC,USA) で再
確認した。ＧＵＤの産生能をテストするため、各々の菌
株をトリプチックソイアガー培地で一晩培養して得られ
たシングルコロニーを０．５mlの滅菌生理食塩水に懸濁
した。細菌の懸濁液をシリンジで BACTEC NR6A(Becton
Dickinson,Sparks,MD,USA)好気性菌用血液培養バイルに
いれ、健康なドーナーからの３mlの血液をさらに培養瓶
に添加した。目的は、一般的な血液培養条件と似た増殖
環境での、異なった細菌のＧＵＤ産生能をテストするこ
とである。ＥＣＡテストを行う前に血液培養瓶を３５℃
で２４時間培養した。

【００２２】ＥＣＡ法により、１０８個大腸菌株の中
に、１０４個（９６．３％）がＧＵＤ産生能を持つこと
が確認された（表１）。四分の一（２５％）の赤痢菌菌
株と２株（７％）の Samonella菌株がＥＣＡ陽性反応を
示す。他の２４個の腸内細菌科菌株はＥＣＡ陰性反応で
ある。

【００２３】

【表１】

【００２４】ＧＵＤの精製：大腸菌Ｋ−１２から部分精
製したＧＵＤ（Bochringer Mannheim,Germany)をさらに
垂直円盤ポリアクリルゲル電気泳動（１０％、厚さ３−
mm、Modcl V16,Bethesda Research Laboratory,Bethesd
a,MD,USA) で精製した。粗製酵素（１．２ml）はコーム
なしで円盤状ゲルの上端に載せ、４℃下で電気泳動し
た。した後に、０．２Ｍの燐酸緩衝液（pH６．５）に溶
かした発色基質の５−ブロム−４−クロロ−３−インド
リル−β−Ｄ−グルクロニド（Sigma,St.Louis,MO, US
A；50μｇ／ml）により、ゲルを活性染色した。室温下
で１０から１５分間インキュベーションした後、ＧＵＤ
活性を示す青いバンド（１０）が現れた。バンドを挟み
で切り取り、抗体の調製に使う。

【００２５】抗体の調製と精製：精製ＧＵＤが含まれた
ゲルのストリップを細かく切って、さらに手動のホモゲ
ナイザーで粉砕した。約０．３mgのＧＵＤを含有したゲ
ル断片を３mlのFreund氏不完全アジュバントと乳化し、
ニュージランド白兎の背中のいくらかの部位に皮下注入
した。後に、３週間おきにブスター注射を４回行い、最
後の投与を終えてからの７日目に耳静脈から採血した。
抗血清の特異性はオクテロニー氏双拡散法（Ouchterlon
y O.1949.Antigen antibody reactions in gels.Acta P
athol.Microbiol.Scand.26:507-515.)でテストし、その
タイターは、ＧＵＤ（１０μｇ／ml）をコートしたミク
ロタイタープレートを用いた酵素連結免疫吸着法で測定
した。希釈した抗血清を加えた直後に、ｏ−フェニレン
ジアミンと蛋白Ａ−西洋わさびパルオキシダーゼ共役体
は、抗原抗体反応の検出に用いられた（Chang,T.C.,C.
H.Chcng,and H.C.Chen.1994.A latex agglutination te
stfor the rapid identification of Vibrio parahaemo
lyticus.J.Food Prot. 57:31-36.) 。酵素連結免疫吸着
検定法により、プライミングとブスターインジェクショ
ンした後の兎抗血清タイターは１０７ぐらいであると示
め、オクターロニー氏双拡散法により得られた単一沈降
ラインは、そのＧＵＤに対する特異性を示す（図１）。

【００２６】抗血清中の免疫球蛋白Ｇ（ＩｇＧ）画分は
ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）イオン交換クロマト
グラフィー（Linn,T.G.,A.L.Greenleaf,R.G.Shorcnstei
n,and R.Losick.1973.Loss of the sigma activity of
RNA polymerase of Bacillussubtilis during sporulat
ion.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.70:1865-1869.)そしてア
フィニティークロマトグラフィーで精製した。アフィニ
ティークロマトグラフィーによる抗ＧＵＤ精製過程にお
いては、前述方法で調製した部分精製ＧＵＤ（Hudson,
L.,and F.C.Hay.1989.Affinity techniques for molecu
les and cells.p. 332-329.In Practical immunology.3
rd ed.Blackwell Scientific Publications.London.)
とカップルしたセファロース４Ｂゲル（Pharmacia LKB
Biotecnology,Uppsala,Sweden)を１Ｘ１２cmのカラムに
充填し、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィーで精製
したＩｇＧをそこに通すことにより行った。この特異性
のある抗ＧＵＤ抗体は、０．１Ｍのグリシン−ＨＣｌ緩
衝液（pH２．６）で溶離した直後に１Ｍのトリス−ＨＣ
ｌ緩衝液（pH８．５）で中和した。

【００２７】酵素捕獲検定：ミクロタイタープレート
（MicroFluor,Dynatech,Alexandria,VA,USA)のウェルに
０．１mlのアフィニティー精製抗ＧＵＤ（１０μｇ／ml
０．１Ｍ炭酸緩衝液，pH９．６）を３７℃２時間コー
トした。プレートは、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含
んだ１０mMの燐酸緩衝液生理食塩水（pH７．２）（ＰＢ
ＳＴ）で５回洗浄し、そして１％の牛血清アルビュミン
で室温下に１時間ブロックした。ＰＢＳＴ洗浄後に、細
胞溶解液やＧＵＤ希釈液（０−１００ng／ml）をウェル
に加え、３７℃で１．５時間インキュベーションした。
プレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、０．１mlのＭＵＧ溶
液（２００μｇ／mlＰＢＳ）をウェルに添加した。それ
を３７℃で１．５時間インキュベーションし、酵素反応
は０．１mlの０．２ＮＮａＯＨの添加によりストップし
た。コントロルには、ＧＵＤの代わりに０．１mlのＰＢ
Ｓをウェルに添加して同様な条件でインキュベーション
した。結果はMicroFluor Reader(Dynatech,Alexandria,
VA,USA) を用い、波長３６５nmで読み取った。けい光強
度の値がコトロールの相対けい光強度より標準偏差の３
倍も高いケースが陽性反応として認められる。

【００２８】純粋株あるいはグラム陰性反応を呈する血
液標本をＢＥＣＴＥＣＮＲバイルで２４時間培養した
後、０．５mlの培地を無菌的に微遠心チューブに移し、
５，０００ｇＸ１０min 遠心した。ペレットを０．５ml
の８％（Ｗ／Ｖ）シュクロース、２５mMＥＤＴＡ、０．
０５TritonＸ−１００とリソザイム（Sigma,１．２mg／
ml）が含まれた燐酸緩衝液（pH７．０）に３５℃２０分
間溶解させた。この溶解物はＥＣＡに使われる。

【００２９】ＧＵＤの誘導：ＧＵＤは誘導性酵素である
ため、四種類のβ−Ｄ−グルクロニドが大腸菌（０５−
８とＣＣＲＣ１０３１６）に対する酵素誘導効果を調べ
た。そのため、０．５mlの細菌懸濁液と３ml血液をＢＡ
ＣＴＥＣＮＲ６Ａバイルに入れた後、０．１mlの誘導物
質（Sigma から購入）である５−ブロム−４−クロロ−
３−インドリル−β−グルクロニド（ＢＣＩＧ）、メチ
ル−β−Ｄ−グルクロニド（ＭＧ）、４−メチルウンベ
リフェリル−β−Ｄ−グルクロニド（ＭＵＧ）やｐ−ニ
トロフェニル−β−Ｄ−グルクロニド（ＰＮＰＧ）原液
（１６．５mg／ml）を追加した（最終濃度５０μｇ／m
l）。ＥＣＡ測定を行う前に、この培養バイルを３５℃
２４時間インキュベーションした。

【００３０】ＢＡＣＴＥＣバイルで大部分の大腸菌はＧ
ＵＤを産生するが、異なった誘導物質の存在下で、ＧＵ
Ｄの活性は５−６４も上回ることになる（図３）。使わ
れた２株の大腸菌（０５−８とＣＣＲＣ１０３１６）に
対する各々の誘導物質の効果が類似である。四つの化合
物の中でも、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルクロニ
ドが最も効果的と分かった。それを使うことにより、捕
獲された酵素の活性は大腸菌ＣＣＲＣ１０３１６と０５
−８それぞれに対し、４５と６４倍を高くなった。その
次の強力的誘導物質はメチル−β−Ｄ−グルクロニドで
ある。

【００３１】大腸菌の検出限界：ＥＣＡ検出所要の菌数
の下限を調べるため、３mlの血液と０．１mlの希釈した
細菌（大腸菌０５−０８とＣＣＲＣ１０３１６）懸濁液
をＢＡＣＴＥＣＮＲ６Ａバイルに注入し、接種レベルを
約１０ CFU／mlにした（誘導物質のｐ−ニトロフェニル
−β−Ｄ−グルクロニドが５０μｇ／ml添加もしくは無
添加）。バイルを３５℃で培養し、断続的にサンプルし
て、ＥＣＡ法でＧＵＤ活性をテストした。アフィニティ
ー−精製をした抗ＧＵＤをコートしたプレートを用いれ
ば、ＥＣＡによるＧＵＤの検出限界は約０．１ng／ml
（ＧＵＤ分子量を２９６，０００にしたら３Ｘ１０−１
３Ｍに相当する）（Blanco,C.,and G.Nemoz.1987.One s
tep purification of Escherichia coliβ-glucuronida
se.Biochimie 69:157-161.) この酵素濃度は、誘導物質
無添加での大腸菌濃度の約１０６ CFU／mlに相当する。
検出下限は誘導物質ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グル
クロニドの使用（５０μｇ／ml）により１オーダー下が
る（１０５ CFU／ml）ことができる。もし、プレートコ
ーチングの時に、アフィニティー−精製抗ＧＵＤ抗体の
代わりにイオン交換−精製をした抗ＧＵＤ抗体を採用す
れば、検出感度は５−１０倍ぐらい下がることになる。

【００３２】臨床標本：血液標本は台湾の国立成功大学
附属病院で収集した。患者から３−５mlの血液をＢＡＣ
ＴＥＣＮＲ６Ａバイル（好気培養）とＢＡＣＴＥＣＮＲ
７Ａバイル（厭気培養）に接種し、それをＢＡＣＴＥＣ
ＮＲ６６０装置（Johnson Laboratory Inc.,Towson,MD,
USA)にインサートし、３５℃で培養した。この装置は、
二酸化炭素のヘッドスペース濃度を感知し、あるシキ値
を超えたら、バイルが陽性と判断される（２５−３０が
増殖値であり、連続読み取った値の差が１０−１５以上
であったら増殖の変化に示す）。時には、バイルでの増
殖が肉眼で観察される（例えば、濁度、気体産生や溶血
現象）。陽性バイルをグラム染色し、MacConkey, choco
late, blood agarプレートに次代培養した。全ての単離
菌株は、伝統的微生物学方法で同定そして種分化され
た。グラム陰性菌の成長を呈したバイルのみ上述したＥ
ＣＡ法でテストした。

【００３３】感度と特異性：感度（McClure,F.D.1990.D
esign and analysis of quantitative collaborative s
tudies:minimum collaborative Program.J.Assoc.Off.A
nal.Chem.73:953-960.) はＥＣＡ法で真の陽性に判断さ
れた数を伝統的方法により単離された大腸菌の血液カル
チャー総数で割った値である。特異性はＥＣＡ法で真の
陰性に判断された数を伝統的方法により単離された大腸
菌以外の菌種の血液カルチャー総数で割った値である。

【００３４】２１２個グラム陰性を呈した血液カルチャ
ーの中に、７７個が従来の方法により大腸菌の存在を発
見し、７３個がＥＣＡ陽性である（表２）。酵素捕獲検
定法は四つの仮陰性結果を得た（表２）。この四つの中
に三つが多種類の微生物による感染であり、単離された
大腸菌が従来の方法によりＧＵＤプラスと判断された
（Feng,P.C.S.,and P.A.Hartman.1982.Fluorogenic ass
ays for immediate confirmation of Escherichia col
i.Appl.Environ.Microbiol.43:1320-1329.)。もう一つ
は、大腸菌のみの感染であるが、それから単離した大腸
菌はＧＵＤマイナスと分かった。大腸菌が単離されてい
ない１３５個血液標本の中に、一つのＥＣＡ仮陽性反応
が起こったが、それは Salmonella enterititis による
ものである。そこで、ＥＣＡ法で血液標本から大腸菌の
検出感度は９４．８％（７３／７７）であり、特異性は
９９．３％（１３４／１３５）である。従来の培養法と
ＥＣＡ法の一致する程度は９７．６％（２０７／２１
２）である。

【００３５】

【表２】 ^a従来の培養法と比べ、ＥＣＡ法は９４．８％（７３／
７７）の感度と９９．３％（１３４／１３５）の特異性
を示す。

【００３６】上述した内容と実例は本発明の範囲と意義
を表明したが、それと相関や類似した方法は本発明の範
囲内に属すべきである。そこで、本発明の範囲は、クレ
ームに述べられたもののみ制限される。

【図面の簡単な説明】

【図１】オクタロニー双拡散法（Ouchterlony double d
iffusion test)によりβ−Ｄ−グルクロニダーゼ（ＧＵ
Ｄ）抗血清の特異性を示す図である。図の中央の穴にい
れたのはＧＵＤ（１mg／ml）である。それぞれ１倍、２
倍、４倍、１６倍希釈した抗血清は２号穴から６号穴ま
で右周りの順で周囲の穴にいれられた。１号穴に正常の
ウサギの血清が入れられた。

【図２】β−Ｄ−グルクロニダーゼ（ＧＵＤ）の酵素捕
獲分析における用量と反応の関係を示す図である。ミク
ロタイタープレートは、アフィニティー精製抗ＧＵＤで
コートされ、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グ
ルクロニダーゼ（ＭＵＧ）は酵素の発けい光基質として
使われた。それぞれの点は二回実験結果の平均値であ
り、コントロールの相対けい光強度は１５単位である。

【図３】大腸菌ＣＣＲＣ１０３１６と０５−８における
５−ブロム−４−クロロ−３−インドオリル−β−グル
クロニダーゼ（ＢＣＩＧ）、メチル−β−Ｄ−グルクロ
ニド（ＭＧ）、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−
グルクロニド（ＭＵＧ）とｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ
−グルクロニド（ＰＮＰＧ）によるβ−Ｄ−グルクロニ
ダーゼの誘導過程を示す図である。ＢＡＣＴＥＣＮＲ６
Ａ血液培養瓶に異なった誘導物質を最後の濃度が５０μ
ｇ／mlになるように添加した後、大腸菌を導入し、３５
℃で２４時間インキュベーションした。培養液を酵素捕
獲検定法でβ−Ｄ−グルクロニダーゼ活性を測定した。
誘導物質を添加しない状態で、大腸菌ＣＣＲＣ１０３１
６と０５−８の相対けい光強度は、それぞれ２，６００
と１，７００単位である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ウ ジュン ジョン 台湾，タイナン，ターシュエ ルー，１ハ ウ (72)発明者 チャン ツン チェイン 台湾，タオユアン，ユン−メイ，ツ−リ チェ，93シャン，５ハウ

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 標本を培養し、前記培養した標本から細
   胞ライゼートを作成し、前記ライゼートを大腸菌のβ−
   Ｄ−グルクロニダーゼに対する固定化抗体に接触させる
   ことにより前記ライゼートにおいて大腸菌のβ−Ｄ−グ
   ルクロニダーゼを前記固定化抗体と結合させ、β−Ｄ−
   グルクロニダーゼ基質を用いて前記固定化抗体と結合し
   たいずれかのβ−Ｄ−グルクロニダーゼを検出し、そし
   て前記基質の転換により標本における大腸菌を検出する
   ことを特徴とする標本から大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）を検
   出する方法。
2. 【請求項２】 前記基質がβ−Ｄ−グルクロニド又はそ
   の誘導体である請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 前記基質が４−メチルウンベリフェリル
   −β−Ｄ−グルクロニドである請求項２記載の方法。
4. 【請求項４】 前記抗体が固相に被覆される請求項１記
   載の方法。
5. 【請求項５】 前記抗体がミクロタイタープレートに被
   覆される請求項４の方法。
6. 【請求項６】 前記基質がβ−Ｄ−グルクロニド又はそ
   の誘導体である請求項４記載の方法。
7. 【請求項７】 前記基質が４−メチルウンベリフェリル
   −β−Ｄ−グルクロニドである請求項６記載の方法。
8. 【請求項８】 前記基質がβ−Ｄ−グルクロニド又はそ
   の誘導体である請求項５記載の方法。
9. 【請求項９】 前記基質が４−メチルウンベリフェリル
   −β−Ｄ−グルクロニドである請求項８記載の方法。
10. 【請求項１０】 前記大腸菌のβ−Ｄ−グルクロニダー
    ゼの酵素誘導物質が培養工程において前記標本を含む培
    地に添加される請求項１の方法。
11. 【請求項１１】 前記酵素誘導物質がβ−Ｄ−グルクロ
    ニドの誘導体である請求項１０記載の方法。
12. 【請求項１２】 前記酵素誘導体が５−ブロム−４−ク
    ロル−３−インドリル−β−グルクロニド、メチル−β
    −Ｄ−グルクロニド、４−メチルウンベリフェリル−β
    −Ｄ−グルクロニド及びｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−
    グルクロニドによりなる群の中から選ばれた化合物であ
    る請求項１１の方法。
13. 【請求項１３】 前記酵素誘導体がｐ−ニトロフェニル
    −β−Ｄ−グルクロニドである請求項１２の方法。
14. 【請求項１４】 前記大腸菌のβ−Ｄ−グルクロニダー
    ゼの酵素誘導物質が培養工程において前記標本を含む培
    地に添加される請求項２の方法。
15. 【請求項１５】 前記酵素誘導体が５−ブロム−４−ク
    ロル−３−インドリル−β−グルクロニド、メチル−β
    −Ｄ−グルクロニド、４−メチルウンベリフェリル−β
    −Ｄ−グルクロニド及びｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−
    グルクロニドによりなる群の中から選ばれた化合物であ
    る請求項１４の方法。
16. 【請求項１６】 前記酵素誘導体がｐ−ニトロフェニル
    −β−Ｄ−グルクロニドである請求項１５の方法。
17. 【請求項１７】 前記大腸菌のβ−Ｄ−グルクロニダー
    ゼの酵素誘導物質が培養工程において前記標本を含む培
    地に添加される請求項３の方法。
18. 【請求項１８】 前記酵素誘導体が５−ブロム−４−ク
    ロル−３−インドリル−β−グルクロニド、メチル−β
    −Ｄ−グルクロニド、４−メチルウンベリフェリル−β
    −Ｄ−グルクロニド及びｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−
    グルクロニドによりなる群の中から選ばれた化合物であ
    る請求項１７の方法。
19. 【請求項１９】 前記酵素誘導体がｐ−ニトロフェニル
    −β−Ｄ−グルクロニドである請求項１８の方法。
20. 【請求項２０】 前記酵素誘導体が５−ブロム−４−ク
    ロル−３−インドリル−β−グルクロニド、メチル−β
    −Ｄ−グルクロニド、４−メチルウンベリフェリル−β
    −Ｄ−グルクロニド及びｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−
    グルクロニドによりなる群の中から選ばれた化合物であ
    る請求項４の方法。