PT88075B

PT88075B - Metodo de isolamento de inibidor do factor de tecido

Info

Publication number: PT88075B
Application number: PT88075A
Authority: PT
Inventors: George John Broze Jr
Original assignee: Wasington University
Priority date: 1987-07-23
Filing date: 1988-07-22
Publication date: 1995-06-30
Also published as: DK413588A; FI97298B; DK413588D0; US6806360B2; FI97298C; NZ225534A; AU604138B2; JP2781391B2; PT88075A; FI883477A; IL87172A; ZA885370B; NO174776C; AU1928688A; US20030166194A1; EP0300988A3; DK174522B1; US20040265981A1; KR890001581A; BR1100464A

Description

Fundamento do Invento

Este invento está relacionado com um inibidor da coagulação conhecido como inibidor do factor de tecido (TFI).

A cascata de coagulação que ocorre no sangue dos mamíferos compreende dois sistemas distintos - os chamados sistemas intrínseco e extrínseco. Este último sistema é activado por exposição do sangue à tromboplastina de tecido (Factor III), daqui em diante referido como factor de tecido (TF). 0 factor de tecido é uma lipoproteina que surge na membrana plasmática de muitos tipos de células e em que o cérebro e o pulmão são particularmente ricos. Quando em contacto com TF, o Factor VII do plasma ou a sua forma activada, Factor VII , forma um complexo dependente de cálcio com TF e depois activa proteolíticamente o Factor X para Factor X e o Factor IX para Factor IX .

Estudos iniciais respeitantes á regulação da coagulação iniciada com TF mostraram que a incubação de TF (nas preparações brutas de tromboplastina de tecido) com soro inibe a sua actividade in vitro e evita o seu efeito letal quando infundido em ratinhos. Estudos exaustivos realizados por Hjort , Scand. J. Clin. Lab. Invest. 9, Supl.

27, 76-97 (1957) confirmaram e aumentaram os trabalhos anteriores na área e levaram à conclusão de que uma porção inibitória do soro reconhecia o complexo Factor VII-TF. Consistente com esta hipótese são os factos de a inibição de TF que ocorre no plasma requerer a presença de Ca²⁺ (que também é necessário para a ligação do Factor VII/VII a TF) e que a 3 inibição pode ser evitada e/ou revestida por quelação dos catiões divalentes com EDTA. Investigações mais recentes realizadas pelo presente invento e outros mostraram que não só o Factor VII mas também o Factor X cataliticamente activo a a e um factor adicional são necessários para ocorrer inibição do TF no plasma ou soro. Ver Broze e Miletich, Blood 69 , 150-4-

-155 (1987) e Sanders et al. , Ibid. , 66 , 204-212 (1985 ). Este factor adicional, aque definido como inibidor do factor de tecido (TFI), está presente em plasma adsorvido a básico e parece estar associado com lipoproteína, uma vez que a actividade funcional de TFI segrega com a fracção lipoproteíca que flutua quando o soro é centrifugado a uma densidade de 3

1,21 g/cm . De acordo com Broze e Miletich, supra, células HepG2 (uma linha de células de hepatoma humano) segregam uma porção inibidora com as mesmas características do TFI presentes no plasma.

Breve descrição do invento

De acordo com o presente invento, é proporcionado um novo inibidor do factor de tecido (TFI) que tem as seguintes caracteristicas:

existe em duas formas, TFI^ que migra de 37-40.000 daltons e TFI₂ a cerca de -26.000 daltons, conforme determinado troforese em gel de dodecilsulfato de poliacrilamida (SDS-PAGE), a cerca

25por elecsódio e

B. tem uma sequência de aminoácidos N-terminal parcial como se segue:

15

X-X-Glu-Glu-Asp-Glu-Glu-His-Tre-Ile-Ile-Tre-Asp-Tre-Glu16 27

Leu-Pro-Pro-Leu-Lis-Leu-Met-His-Ser-Fen-(Fen)-Ala em que X-X não foi determinado e

C. apresenta actividade inibidora do Factor X .

a

O novo TFI deste invento foi isolado em formas altamente purificadas nas quais não existe na célula e em fontes tipo tecido a partir dos quais tem sido obtido. Ou

seja , foi preparado nas formas purificadas que estão essêncialmente livres de outras proteínas e livres de outros componentes celulares e matéria tecidular.

O novo TFI apresenta actividade biológica que sugere a sua importância para a ciência médica no estudo da cascata de coagulação. Em particular, o novo TFI deste invento tem utilidade terapêutica como inibidor da coagulação e como agente anti-trombótico.

Numa execução preferida, o novo TFI deste invento foi secretado por células HepG2 crescidas em meio de cultura nutritivo e depois isolado a partir do meio condicionado. 0 isolamento é de preferência efectuado segundo um método com essêncialmente três passos como se segue:

A. precipitação com CdCl₂ ,

B. Cromatografia de afinidade em Factor X_a Affi-Gel 15 do precipitado novamente solubilizado e

C. Filtração em gel Superose 12 das fracções da cromatografia de afinidade contendo actividade TFI.

Num método de isolamento alternativo, o Factor X no passo B é inactivado pela ligação a diisopropilfosfato (iPr₂P), usa-se Sephadex G-75 como material de filtração em gel no Passo C e um quarto passo D é efectuado como se segue:

D. Cromatografia de permuta iónica em Mono Q das fracções da filtração em gel contendo actividade de TFI.

Nos métodos precedentes, HepG2 é uma linha celular de hepatoma humano bem conhecida e facilmente adquirida cujo estabelecimento e característica estão descritos na Patente U.S. 4.393.133. Amostras desta linha celular também estão disponíveis na colecção permanente da American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, com o número de acesso ATCC HB 8065.

Outras fontes celulares de TFI adequadas são, por exemplo, células SK-HEP-1 (ATCC HTB52), células Chang Liver (ATCC CCL 13), células endoteliais e soro do sangue de mamíferos.

As células HepG2 podem ser cultivadas a cerca de 37°C em meio de cultura nutritivo convencional para expressarem TFI. Um meio preferido é o meio essêncial de Earle modificado (EMEM) que pode ser adquirido comercialmente Outros meios adequados comercialmente disponíveis estão descritos, por exemplo, por Helen J. Morton, In Vitro 6 (2), 89-108 (1970). Estes meios de cultura nutritivos contem aminoácidos , minerais, açúcares, vitaminas e não frequentemente complementados com soros de mamífero, e.g. soro fetal bovino ou soro de vitela e vários factores de crescimento. De acordo como aqui são usadas as células HepG2 são de preferência cultivadas em meio com soro e depois transferidas para meio sem soro suplementado com quantidades estimuladoras do crescimento de transferrina , selénio, insulina, factor de crescimento das células do fígado e hidrolisato de lactalbumina.

precipitado de CdC^ formado no passo A, acima, é de preferência diluido com um volume igual de uma solução tampão antes da aplicação na coluna de cromatografia de afinidade no passo B. A solução tampão deve compreender uma solução aquosa de um material tamponante biologicamente aceitável ajustado a um pH de cerca de 7,5. Como exemplo pode referir-se 0,05M Tris-HCl. Um tampão essêncialmente semelhante pode então ser usado para equilibrar a coluna de cromatografia de afinidade.

-Ί-

Ο Affi-Gel^lõ usado no passo B é um suporte de afinidade activado, comercial preparado como éster de N-hidroxi-succinimida de um gel de agarose interligado e derivatizado.

A Superos^^ passo C de filtração em gel são g por esferas e preparados fazendo -hidrina. Os graus superfinos pr ordem de cerca de 20-50 yuM.

e Sephadex^ G-75 usadas no éis comerciais constituídos ligação cruzada de epicloroeferidos têm um diâmetro da

Antes da aplicação na coluna de filtração em gel, as fracções da cromatografia de afinidade contendo actividade TFI no passo B são de preferência concentradas, por exemplo por ultrafiltração, para reduzir a quantidade de solução de trabalho e a coluna pode ser equilibrada com 1M NaSCN , tamponado para pH de cerca de 7,5.

No método de isolamento alternativo, após o passo C de filtração em gel, as fracções contendo a actividade TFI são preferêncialmente precipitadas com acetona e o precipitado é então redissolvido para aplicação na coluna Mono Q. Esta última coluna pode ser equilibrada com ureia 6M , tamponada para pH de aproximadamente 8,3.

A Mono Q usada no passo D é uma resina de permuta aniónica forte, comercial, baseada num polímero hidrofilico na forma de esfera, diâmetro de cerca de 10 ^jM, com grupos carregados amino quaternários.

Se bem que aqui sejam descritos métodos particulares de isolamento de TFI, compreende-se que o novo TFI não está limitado a qualquer método de preparação específico. Assim, a proteína TFI pode ser feita por tecnologia convencional de DNA recombinante. Avanços recentes em bioquímica e em tecnologia de DNA recombinante tornaram possível sintetizar proteínas específicas, por exemplo, enzimas, em

condições controladas independente do organismo a partir do qual são normalmente isoladas. Estes métodos de síntese bioquímica empregam enzimas e componentes subcelulares dos sistemas de síntese proteica das células vivas, quer in vitro em sistemas acelulares quer in vivo em microorganismos. Em ambos os casos o principal elemento é um ácido desoxirribonucleico (DNA) de sequência específica contendo a informação necessária para especificar a sequência de aminoácidos pretendida. Tal sequência especifica de DNA é designada gene.

código usado para uma sequência de desoxirribonucleotídeos especificar a sequência de aminoácidos de uma proteína é bem conhecido e funciona segundo uma série de princípios fundamentais. Ver, por exemplo, Watson, Molecular Biology of the Gene, 3â ed. , Benjamin-Cummings, Menlo, Calif., 1976 .

Um gene clonado pode ser usado para especificar a sequência de aminoácidos de proteínas sintetizadas por sistemas in vitro. Os sistemas de síntese proteica dirigida por RNA estão já bem estabelecidos. DNA de cadeia dupla pode ser induzido a dar origem a RNA mensageiro (mRNA) in vitro com subsequente alta fidelidade de tradução da sequência de RNA em proteína.

É agora possível isolar genes específicos ou porções deles a partir de organismos superiores , como seja o homem e animais ,e transferir os genes ou fragmentos para microorganismos tais como bactérias ou leveduras. O gene transferido é replicado e propagado à medida que o microorganjgno transformado se replica. Consequentemente, o microorganismo transformado é dotado da capacidade para fazer a proteína pretendida ou gene que a codifica, por exemplo, uma enzima, e depois passa esta capacidade para a sua progénie. Ver, por exemplo, Cohen e Boyer, Pats. U.S. 4.237.224 e 4.468.464.

Descrição detalhada do Invento

Ainda que a especificação termine com reivindicações que apontam e reivindicam distintamente o presente tema encarado como constituindo o presente invento, pensa-se que o invento será melhor compreendido a partir da descrição que se segue relativa às execuções preferidas tomadas em conjunto com os desenhos juntos em que resumidamente :

FIG. 1 é uma representação gráfica que mostra o perfil de eluição da cromatografia de afinidade em iPr_P- Factor X Affi-Gel de uma preparação de TFI concentraz a do isolado a partir de células HepG2 numa execução do invento .

FIG. 2 é uma representação gráfica que mostra o perfil de eluição da filtração em gel Sephadex G-75 de uma amostra concentrada das fracções activas de TFI da FIG. 1.

FIG. 3 é uma representação gráfica que mostra o perfil de eluição da cromatografia de permuta iónica em Mono Q de uma amostra concentrada das fracções activas de TFI da FIG.2.

FIG. 4 mostra o SDS-PAGE de uma amostra de TFI purificado da FIG. 3.

FIG. 5 é uma representação gráfica que mostra uma comparação de TFI purificado da FIG. 3 e soro humano normal num ensaio de TFI.

FIG. 6 é uma representação gráfica que mostra o efeito inibidor do TFI purificado da FIG. 3 sobre o Factor Χθ comparado com a ausência de efeito na trombina.

FIG. 7 é uma representação que mostra a inibição rápida da actividade de TFI pelo TFI purificado da

FIG. 3 na presença do Factor VII , Factor X e Ca⁺⁺.

3

FIG. 8 é uma representação gráfica que mostra o perfil de eluição da filtração em gel de Superose 12 de uma amostra concentrada das fracções activas de TFI da FIG. 8.

FIG. 9 é uma representação gráfica que mostra o perfil de eluição da filtração em gel de Superose 12 de uma amostra concentrada das fracções activas de TFI da FIG. 8.

de	TFI	purificado	da	FIG. FIG.	10 mostra o SDS-PAGE 9 e reduzido.	de uma	amostra
				FIG.	11 mostra o SDS-PAGE	de uma	amostra
de	TFI	pur if içado	da	FIG.	9 e não reduzido.

FIG. 12(A ) mostra o SDS-PAGE de TFI isolado a partir de células Chang Liver (calha 2), SK-HEP-l(calhas 3 e 4) e células HepG2 (calhas 5 e 6) por cromatografia de imunoafinidade noutras execuções do invento com marcadores de pesos moleculares apresentados na calha 1.

FIG. 12(B) mostra a Transferência Western (transferência electroforética) em papel de nitrocelulo125 se e coloraçao com I-X seguido de autorradiografia das 3 proteínas separadas electroforéticamente correspondendo às calhas 2, 3, 4 e 6 da FIG. 12(A) nas calhas 1, 2, 3 e 4, respectivamente.

Para ilustrar mais detalhadamente execuções especificas preferidas do invento, foi efectuado como exemplificação o trabalho laboratonal preparativo que se segue. No Exemplo 1 isolou-se TFI pelo método dos quatro pas-

sos e no Exemplo 2 pelo método dos três passos a partir de meio condicionado de células HepG2 como aqui definido anteriormente. No Exemplo 3 isolou-se TFI a partir de várias fontes celulares por cromatografia de imunoafinidade.

EXEMPLO 1

Materiais. Affi-Gel 15 e padrões de baixos pesos moleculares para electroforese em gel de poli125 acnlamida foram adquiridos a Bio-Red Laboratories. Na I (sem veiculo) foi adquirido à New England Nuclear, e Iodo-Gen foi adquirido à Pierce Chemical Co. Sephadex G-75 superfina e uma coluna Mono Q foram obtidas da Pharmacia Inc. Meio essencial modificador de Earle (EMEM) e soros bovino fetal e de vitela foram obtidos da KC Biological , Inc. (Lenexa, KS) e o factor de crescimento de células do fígado foi obtido da Miles Laboratories. Albumina do soro bovina, fluoreto de fenilmetilsulfonilo , fluorofosfato de diisopropilo (iP^P-F), acrilamida, metilenobis(acrilamida), cefalina de cérebro de coelho, transferrina , selénio, insulina hidrosilato de lactalbumina, HEPES ácido (Ν-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanossulfénico), MOPS (ácido 3-/ N-morfolino7propanossulfénico) e base Trizma / Tris(hidroximetil)aminoetano7 foram fornecidos pela Sigma Chemical Co. Todos os outros químicos foram de grau reagente ou melhores e vieram da Fisher Scientific Co. ou da Sigma. 0 plasma humano deficiente em Factor X foi adquirido à George King Biomedical (Overland Park, KS) . Amostras de soro de dadores de sangue saudáveis foram fornecidas pela American Red Cross (St. Louis, MO). As células HepG2 foram adquiridas à American Type Culture Collection.

Proteínas. Uma preparação bruta de TF foi preparada e lavada extensivamente com EDTA / Broze e Miletich , Blood 6 9, 150-155 (1987); Broze e Majerus , J. Biol. Chem. 255, 1242-1247 (1980) 7 - A proteína coagulante do Fac-

tor X do veneno de víbora de Russell (XCP), antitrombina III a '

Factor VII , e Factor X humano foram purificados como descri3 to por Broze e Miletich, supra; Broze et al., J. Biol Chem.

260, 10917 (1985); Peterson e Blackburn, J. Biol Chem. 260 , 610-615 (1985); e Miletich, Broze e Majerus, Methods Enzymol. 80, 221-228 (1981). O Factor X foi produzido a partir de Factor X purificado por incubação com proteína coagulante X insolubilizada e inactivado com iP^P-F /Broze e Miletich, supra; Bajaj et al., Prep. Biochem. 11, 397-412 (1981) 7iPr„P-Factor X foi ligado a Affi-Gel 15 numa concentração final de 2 mg/ml de gel empacotado, usando as instruções fornecidas pelo fabricante (tampão MOPS, pH 7,5).

Ensaio. Durante o processo de purificação usou-se um ensaio de três fases para a inibição de TF, abaixo / Broze e Miletich, supra 7 · Na primeira fase, 10 ^il de Factor VII (1 ^g/ml), 10 ^il de Factor X (10 ^ig/ml), 10 pl de CaCl₂ (40 mM ) , 10 ^il de antitrombina ΙΙΙ-γ (650 pg/ml), ^ul da amostra a ser testada, diluído em tampão TBSA (0,lM CaCl/0,05M Tris-HCl , pH 7,5, contendo albumina do soro bovina a 1 mg/ml) e 10 ^ul de TF bruto lavado com EDTA (10% vol/vol) foram incubados à temperatura ambiente. Após 30 min diluiu-se 100 vezes uma amostra de 10 jil usando tampão TBSA com 5 mM CaCl₂. Cinguenta microlitros desta amostra diluida, 50 jií de Factor VII^ (1 ug/ml), 50 ^jl de CaCl₂ (25 mM) e 50 ^il de Factor X (10 yug/ml) foram então incubados a 37°C. Após 1 min. adicionou-se 50 ul de uma mistura contendo 10 partes de plasma deficiente em Factor X e 1 parte de reagente stock de cefalina de cérebro de coelho (preparado como descrito por Bell e Altone, Nature 174, 880 (1954) e reconstituído de acordo com as instruções publicadas pelo fornecedor, Sigma) e o tempo da formação de coagulo foi determinado com um fibrómetro (Baltimore Biological Laboratory, Cockeysville, MD).

Misturas em TBSA , em vez da amostra , foram incubadas nas primeira fase e serviram como testemunhas.

A concentração do TF bruto no ensaio foi escolhida para pro-

duzir tempos de coagulação testemunha de 35-40 seg. Antitrombina IIIo( foi incluído no ensaio para diminuir o efeito do Factor formado durante a incubação da primeira fase quando do tempo de coagulação derivado na terceira fase do ensaio. A actividade relativa de TFI foi calculada a partir de uma curva padrão construída pondo, em papel log-log , o prolongamento em segundos do tempo de coagulação para lá do valor testemunha vs. a concentração final do soro normal (50 dadores) na primeira fase do ensaio. Esta curva padrão produziu uma resposta linear a concentrações de soro de 1-10% (vol/vol). Uma unidade da actividade de TFI foi definida como a contida em 1 ml de soro normal de um conjunto de dadores.

Os resultados dos ensaios das fracções de cromatografia são expressos como tempo de coagulação e não foram convertidos em unidades/ml.

Na DodSO^/PAGE foi efectuado em géis de 15% (gel concentração de 4%) pelo método de Laemmli, Nature (London ) 2 2 7, 680-685 (1970). As amostras reduzidas foram aquecidas a 100°C durante 5 min. na presença de 10% de 2-mercaptoetanol antes da electroforese. O TFI foi extraído após NaDodSO^/PAGE cortando a tira de gel, deixando-a embebida em 0,lM NaCl/0,05M Tris-HCl pH 7,5, durante 30 min., cortando-a em secções de 2 mm e incubando cada fatia durante a noite em 100 ^jl de 1M NaSCN/0,05M Tris-HCl, pH 7,5/0,025 Lubrol PX (um detergente biológico não iónico consistindo num condensado de óxido de etileno de álcool gordo) contendo albumina do soro bovina a 0,5 mg/ml. Uma diluição a 1:50 em TBSA do material extraído foi então testada como descrito acima para a inibição de TF. Fez-se transferência Western como descrito por Broze, Hickman e Miletich , J. Clin. Invest. 76, 937-946 125 (1985) usando Factor X marcado com I como sonda. A coma posição em aminoácidos do TFI purificado (110 pmoles) foi determinada, após 24 h de hidrólise em 6M HC1 a 110°C, num autoanalisador Beckmann 6300 com derivatização com ninidrina pós-coluna.

Cultura de células. Células HepG2 foram cultivadas em frascos roller de plástico ou vidro (850 cm ). Apos sementeira inicial, as células foram cultivadas em EMEM com aminoácidos não essênciais e penicilina (10^ unidades/ml), estreptomicina (100 ^ig/ml), anfotericina (250 ng/ /ml), piruvato de sódio (100 mM ) , L-glutamina (200 mH) e 5% de soro fetal bovino e 5% de soro fetal com troca de meio duas vezes na semana. Após 2 semanas, o meio contendo soro foi removido e as células foram lavadas suavemente com EMEM e depois cultivadas em meio sem soro constituído nos mesmos ingredientes descritos atrás mais transferrina (5 ^jg/ml), selénio (5 ng/ml), insulina (5yug/ml), factor de crescimento de células do figado (20 pg/ml), hidrolisato de lactalbumina (5 mg/ml) e HEPES (25 mM). O meio condicionado foi removido e substituido por meio fresco sem soro duas vezes por semana. As células HepG2 podem sermantidas nestas condições durante meses .

Determinação da sequência de aminoácidos N-terminal. Usou-se a química de degradação de Edman automática para determinar a sequência proteica Nt^-terminal do TFI purificado. Nas degradações empregou-se um sequênciador de fase gasosa Applied Biosystems, Inc., modelo 470A (Foster City , CA ) , Hunkapiller et al. , Methods Enzymol 91, 399-413 (1 Os respectivos derivados de PTH-aminoácidos foram identificados por análise de RP-HPLC segundo processos conhecidos empregando um analisador Applied Biosystems, Inc., Modelo 120A PTH a que se adaptou uma coluna Brownler PTH-C^g D.I. 2,1, mm A tecnologia de electrotransferência foi aplicada àamostra para sequênciar as bandas isoladas directamente de SDS-PAGE. Os métodos empregues foram os descritos por Aebersold et al., J. Biol. Chem. 261, 4229-4238 (1986). Usando estes métodos de seguênciação não se conseguiu estabelecer os dois aminoácidos N-terminais , mas os aminoácidos 3-27 foram determinados como se segue:

15

X-X-Glu-Glu-Asp-Glu-Glu-His-Tre-Ile-Tre-Asp-Tre-Glu

Leu-Pro-Pro-Leu-Lis-Met-His-Ser-Fen-(Fen)-Ala

Purificação de TFI. Excepto se foi de outro modo indicado, o processo de purificação foi efectuado à temperatura ambiente. 0 método de purificação está resumido num esquema de 4 passos na Tabela 1, abaixo.

ο I-1	Ο ο ο
II		ο
ε υ		γΗ
ί—1 ι—1		Μ
ω		Σ
φ		'Φ
Ό ε		+-> Φ
C		φ Ό
ο		Φ
00		Ό
Γ4		•Η 1—1
Φ		•Η Λ
0	W	Φ
ίΠ3	Η	Φ
Ο		ε
C	Ο	Ρ
•Η	ίΦ	φ
+J	α	CX
X	ε
Φ	Φ	ε
	-μ	ο
Φ		υ
Ό	α)
	Μ	0
Φ	-Ρ	Ή
+J	C	φ
C	Ο	ε
Φ	ο
•rd		0
υ	ο	Ό
Ή	τ)
4-1	Φ	Φ
Φ	Φ	Φ
Ο	•Η	•Η
U	I—1	τ—1
	Φ	'Φ
ε	Ή	•Η
3	Ό	Ό
0	Φ	Φ
τ>	-Ρ	C
C	C
•Η	φ	Φ
ε	ε	0
3	Π3	Ό
φ	>	Φ
φ	-Η	Φ
Φ	Φ	Φ
	C	Φ
ο	Φ	η
Ό	•Ρ
Φ	X	φ
r~H	φ	φ
3		Ρ
U	0	0
I-1	•Η	r—1
Φ	Φ	Π3
U	S	>
*	+	+ 1

O processo de purificação detalhada foi como se segue:

A. Precipitação com cloreto de cádmio. Meio condicionado sem soro de células HepG2 (4 litros), após adição de fluoreto de fenilmetilsulfonilo (concentração final 0,1 mM) e NaN^ (concentração final 0,05% p/vol) foi centrifugado a 2500 xg durante 30 minutos para remover os detritos maiores. Adicionou-se então CdCl^ (l,0M) para uma concentração final de 5 mM e a mistura foi agitada durante 15 min. O precipitado que continha a actividade TFI, foi colhido por centrifugação (2500 xg durante 30 min.) e o sobrenadante decantado. O sedimento foi dissolvido com 40 ml de 0,5M EDTA/ /5 mM iP^P-F, pH 9,5 e depois dialisado extensivamente contra tampão TS (0,lM NaCl/0,05M Tris-HCl/0,1 mM fluoreto de fenilmetilsulfonilo/0,5 mM EDTA/0,02% NaN^, pH 7,5).

B. Cromatografia em iPR~-Factor X. —¹ z-<

Affi-Gel. A preparação dialisada foi clarificada por centrifugação (lOOOOxg durante 15 min.) e aplicada numa coluna de iPR_P-Factor X -Affi-Gel 15 equilibrada em tampão TS. O gel â foi lavado como tampão de partida e o material ligado foi eluido com 2M NaSCN/0,05M Tris-HCl, pH 7,5/0,05% Lubrol PX/0,02% ΝθΝ^/Ο,Ι mM fluoreto de fenilmetilsulfonilo (FIG. 1). As fracções contendo actividade TFI foram reunidas e concentradas para ~ 1 ml usando uma membrana de ultrafiltração hidrofilica YM5 (Amicon).

acetona.

C. Filtração em gel e delipidação com A amostra concentrada foi aplciada numa coluna de

Sephadex G-75 superfina equilibrada em 1M NaSCN/0,05M Tris-HC1 , pH 7,5/0,05% Lubrol PX/0,02% NaN^/O^M fluoreto de fenilmetilsulf onilo (FIG. 2). As fracções contendo actividade de TFI foram reunidas e misturadas com 8 volumes de acetona. Após 30 min. o precipitado foi colhido por centrifugação (10000xg) 20 min. 10°C).

D. Cromatografia de permuta jónica em Mono Q. O precipitado de acetona foi solubilizado com 1,0 ml de 6M ureia/0,02M Tris-HCl/0,05% Lubrol PX, pH 8,3 e aplicado numa coluna Mono Q equilibrada no mesmo tampão. A coluna foi eluida com um gradiente linear de 30 ml desde o tampão de partida até 6M ureia/0,5M Tris-HCl/0 ,05% Lubrol PX, pH 8,3 (FIG. 3). As fracções contendo actividade TFI foram reuni-d das como indicado na Fig. 3, concentrado para ££ 1 ml (YMS, Amicon ) , dialisado contra 1M NaSCN/0,05M Tris-HC1/0,05% Lubrol PX, pH 7,5 e guardado a 4°C.

Propriedades do TFI. NaDodSO^/PAGE do TFI purificado mostrou uma banda predominante a M 38.000 (não reduzido) ou 39.000 (reduzido) (FIG. 4). A extracção de fatias de gel após NaDodSO^/PAGE da amostra não reduzida da preparação purificada mostrou que a actividade inibidora comigrava com a banda corada com Coomassie. Conforme se esperava, esta mesma banda foi reconhecida pelo Factor X mar125 ^a cado com I quando da imunotransferência (resultado não apresentado). A composição de aminoácidos do TFI purificado esta' apresentada na Tabela 2 abaixo. O TFI purificado parece ser semelhante ao inibidor presente no soro por necessitar de Factor VII , Factor X e Ca^{2 +} para a expressão de actividade / Broze e Miletich, supra 7 (Tabela 3, abaixo) e as diluições do TFI purificado produziram uma linha paralela à curva padrão do soro humano normal (FIG. 5).

com o Factor X coagulação de to inibidor do contra todas a todo afectada

A incubação do TFI purificado (250 ng/ml) (25 ng/ml) levou a uma perda da actividade de 3

X num bioensaio funcional (FIG. 6). Este efei3

TFI não foi uma propriedade geral dirigida s proteases uma vez que a trombina não foi de pela incubação com TFI (FIG. 6).

Na presença de Factor VII Ca , TFI produziu uma inibição muito rápida da TF com uma aparente de 20 segundos (FIG.

, Factor X e ' a actividade de 7 ) . A inclusão

de heparina (0,5 unidades/ml) nas misturas acelerou 3 vezes a velocidade inicial da inibição (t^^ ⁼ & ^se<3^undos ) . A inibição da actividade TF aparente por TFI não foi afectada pela inclusão de antitrombina III (65 ug/ml) na reacção.

Tabela 2. Composição de aminoácidos do TFI

Aminoác ido	Abreviatura	Moles por 38.000 g de proteína
Acido aspártico	Asp	40
Treonina	Thr	20
Serina	Ser	19
Acido glutâmico	Glu	44
Prolina	Pro	15
Glicina	Gly	33
Alanina	Ala	19
Cisteína	Cys	13*
Valina	Vai	12
Met ion ina	Met	+
Isoleuc ina	Ile	15
Leucina	Leu	27
Tirosina	Tyr	10
Fenilalanina	Phe	20
Histidina	His	5
Lis ina	Lys	26
Arginina	Arg	18
Triptofano	Trp	ND

ND, não determinado valor de cisteina de 24 h de hidrólise; não se fez oxidação com ácido perfórmico ⁺A metionina foi oxidado durante a hidrólise; nenhuma foi detectada.

Tabela 3. Necessidade de Factor VII, Factor X e Ca^{2 +} para a expressão da actividade por TFI purificado

Delecção a partir da primeira	Tempo de coagualção, +
fase	seg
Nenhuma	95,3
Factor X	40,2
Factor VII	41,3
a
Ca²⁺ (5 mM EDTA)	40,8
Testemunha	37,7

*

Ver descrição do ensaio de TFI, acima.

⁺0s resultados são as médias de ensaios em duplicado. A concentração final de TFI foi de 10 ng/ml na primeira fase do ensaio.

As propriedades funcionais do TFI isolado a partir de meio condicionado de HepG2, acima, foram ilustradas como se segue.

Ensaios de coagulação: Inibição do Factor por TFI. As misturas de reacção contendo TFI purificado (250 ng/ml), Factor X (25 ng/ml) e EDTA (1 mM) ou CaCl₂ (5 mM) e uma diluição 1:40 de cefalina de cérebro de coelho (preparado de acordo com as instruções publicadas da Sigma) em TBSA (O,1M NaCl, 0,05M Tris-HCl, pH 7,5, 1 mg/ml de albumina do soro bovina) foram incubadas à temperatura ambiente. A vários tempos uma amostra de 100 foi adicionada a uma taça de fibrometro já contendo 50 yul de CaCl₂ (25 mM) e 50 ^il de afalina de cérebro de coelho (diluição 1 para 10 do stock) a 37°C. Adicionou-se então imediatamente cinquenta ^ul de plasma deficiente em Factor X, e determinado o tempo de formação de coágulo num fibrometro (BBL, Cockeysville MD). A actividade de Factor X^ foi determinada compreendendo os tempos de coagulação com uma curva padrão construída usando diluições de X^ nas mesmas misturas de incubação sem TFI.

Inibição da trombina por TFI: Misturas de reacção contendo TFI (400 ng/ml) e trombina (0,5 unidades/ml, 180 ng/ml) foram incubadas á temperatura ambiente em TBSA. Em vários pontos adicionou-se uma amostra de 100 ^ul a 100 yul de 0,15M NaCl, 6,6 g/1 de PEG-6200, 10 mM Imidazole, mM CaCl₂ , pH 7,4, aquecido a 37°C. Cinquenta ^ul de fibrinogénio (2 mg/ml) foi então adicionado imediatamente e determanado o tempo de formação de coágulo num fibrometro. A actividade relativa da trombina foi determinada usando uma curva padrão construída com diluições de trombina.

Inibição de TF por TFI: Cem microlitros de uma mistura contendo Factor VII (200 ng/ml), Factor X 3 3 (200 ng/ml), CaCl₂ (8 mM) e TF (2% v/v), que tinham sido incubados à temperatura ambiente durante 1 minuto foi adicionado a 100 ^jl de TBSA contendo TFI (600 ng/ml) com ou sem anti-23-

trombina ΙΙΙς^ (130 jug/ml) e heparina (1 unidade/ml). A partir daqui em tempos determinados removeu-se 10 jjl de amostra e dilui-se 100 vezes com TBSA contendo 5 mM CaCl

Devido a considerações práticas as amostras diluídas obtidas nos tempos iniciais foram mantidas até à amostra final ter sido obtida, e depois foram todas testadas relativamente a actividade TF residual usando um ensaio de duas fases. Cinquenta ^il de Factor VII^ (1 ^Lig/ml), 50 p 1 de CaCl₂ (25 mM) , 50 pil de amostra diluída e 50 pl de Factor X (10 pg/ml) foram incubados a 37°C. Após 1 minuto, adicionou-se 50 pl de uma mistura contendo 10 partes de plasmas deficiente em Factor X e 1 parte de reagente stock de cefalina de células de coelho (preparado como descrito por Sigma) e determinou-se o tempo de formação de coágulo com um fibrómetro. Uma vez que este ensaio de TF envolve uma diluição da amostra da mistura de incubação original e mais 1-2 minutos de incubação, as velocidades de inibição derivadas são aqui consideradas como velocidades aparentes.

Os resultados do trabalho laboratorial preparativo conduzido ao isolamento e testagem funcional do TFI purificado são ainda exemplificados pela descrição detalhada que se segue das FIGS. 1 a 7 dos desenhos.

FIG. 1. Esta figura mostra a cromatografia de afinidade em iPr-P-Factor X -Affi-Gel. A preparação de TFI dialisada ( 100 ml) após precipitação com CdCl₂ e extracção foi aplicado a uma coluna de 1,5x40 cm de iPr₂P-Factor X_a-Affi-Gel 15 equilibrada em 0,lM NaCl/0,05 Tris-HCl, pH 7,5/0,5 mM EDTA/0,02% NaN^/0,1 mM fluoreto de fenilmetilsulfonilo. Após lavagem com o tampão de partida, o TFI foi eluido com 2M NaSCN/0,05M Tris-HCl, pH 7,5/0,05% Lubrol PX/0,1 mM fluoreto de fenilmetilsulfonilo.

e o volume das fracções foi de 4 ml

500 vezes para o ensaio de TFI. As fracções 66-70 foram reunidas.

caudal foi de 3 ml/h Diluiram-se as amostras

FIG. 2. Esta figura mostra a filtração em gel de Sephadex G-75 superfina. A amostra concentrada ( 1 ml) da cromatografia em iPr₉P-Factor X -Affi-Gel foi aplicada a uma coluna de 1x120 cm de Sephadex G-75 superfina. O caudal foi de 1,5 ml/h e o volume das fracções 1 ml. As amostras foram diluidas 2000 vezes para o ensaio de TFI. Reuniram-se as fracções 34-41.

FIG. 3. Esta figura mostra a cromatografia de permuta iónica em Mono Q. Após precipitação com acetona, o TFI foi solubilizado com 6M ureia/0,02M Tris-HCl , pH 8,3/0,05% Lubrol PX e aplicado numa coluna Mono Q de 1 ml equilibrada no mesmo tampão. Após lavagem com o tampão de partida a coluna foi desenvolvida com um gradiente de 30 ml do tampão de partida ató ao tampão final (6M ureia/0,5M Tris-HC1, pH 8,3, 0,05% Lubrol PX). O caudal foi de 20 ml/h e o volume das fracções 1 ml. As amostras foram diluidas 2000 vezes para este ensaio de TFI. As barras horizontais indicam fracções que foram reunidas.

FIG. 4. Esta figura mostra a NaDodSO^/ PAGE do TFI purificado. 0 TFI purificado (3,75 jug por calha) foi sujeito a NaDodSO^/PAGE não reduzido (2 calhas) ou após redução com 2-mercaptoetanol a 10% (1 calha). (Superior) Uma das calhas contendo TFI não reduzido foi cortado do gel e dividida em fatias e a actividade de TFI foi extraída para ensaio. (Inferior) Coloração com azul Coomassie do TFI reduzido (R) e não reduzido (U). A origem ó à esquerda.

FIG. 5. Esta figura mostra uma comparação do ensaio com TFI purificado e com soro normal humano no ensaio de TFI. As diluições de TFI purificado foram testadas no ensaio funcional para TFI e comparadas com uma curva padrão construída usando soro normal humano. O eixo dos y é o prolongamento da coagulação para lá do valor testemunha (39 seg.) e o eixo dos X é a concentração final de TFI (·, em ng/ml) ou soro humano normal (0 em % vol/vol) na primeira fase

do ensaio.

FIG. 6. Esta figura mostra o efeito de

TFI sobre o Factor X e trombina. As misturas de reacção a ^v contendo TFI purificado e Χθ ou trombina foram construídas como descrito atrás. Em tempos específicos foram construídas como descrito atrás. Em tempos específicos retiraram-se amos tras e testaram-se relativamente a actividade enzimática residual pelo bioensaio. O -- □ , trombina; ·--©, X ; 0--0, â

X_a com fosfolípidos e Ca⁺⁺. Em misturas testemunha sem TFI não houve perda de actividade de Χθ ou de trombina (não apresentado ) .

FIG. 7. Esta figura mostra a inibição do Factor de Tecido (TF) por TFI. As misturas contendo VII (100 ng/ml), X (100 ng/ml), Ca⁺⁺ (4 mM), TF (1% v/v), TFI d (300 ng/ml) com ou sem antitrombina ΙΙΙοζ (65 ^ig/ml) e heparina (0,5 unidades/ml) foram construídas à temperatura ambien te. Em tempos específicos retiraram-se amostras, diluiram-se e testaram-se quanto à actividade de TF residual, o--o , sem antitrombina IIIo^ ou heparina; v -- V , com heparina mas sem antitrombina IIIoç ; Q -- α , com antitrombina IIIc^ mas sem heparina; com antitrombina III^ e heparina; os símbolos abertos na linha horizontal superior (100% de actividade) representam as misturas de incubação res pectivas na ausência de TFI.

EXEMPLO 2

O isolamento de TFI a partir do meio condicionado decélulas HepG2 foi efectuado como no Exemplo 1, acima, exceptuando as variações que se seguem:

1. 0 isolamento foi efetuado essêncialmente através de um método de três passos em vez do método de quatro passos como aqui definido atrás.

2. Na precipitação com CdCl₂ do passo A empregou-se um sistema tampão diferente (ver abaixo) e omitiu-se a diálise.

3. A cromatografia de afinidade em Factor X Affi-Gel no Passo B utilizou Factor X bovino sem lia a gação a iPr₂P em vez do Factor X^ humano ligado a iPr₂P.

4. Usou-se gel Suprose 12 em vez de gel Sephadex G-75 na filtração em gel do passo C.

As condições detalhadas destas variações foram como se segue:

Precipitação com CdCl₂

Meio condicionado sem soro de células HepG2 (4 litros) foi centrifugado a 2500 x g durante 30 minutos para remover detritos. Adicionou-se então CdCl₂ (l,0M) para uma concentração final de 10 mM e a mistura foi agitada durante 30 minutos. O precipitado que continha a actividade de TFI foi colhida por centrifugação (lO.OOOxg durante 20 minutos) e o sobrenadante decantado. 0 sedimento foi dissolvido em 80 ml de 0,5M EDTA, 100 Kl unidades/ml de aprotinina (Sigma) pH 9,5 e o material insolúvel foi removido por centrifugação (lO.OOOxg durante 20 minutos).

Purificação do Factor X bovino

Factor X bovino foi purificado a partir do elueto com sulfato de bário de plasma bovino (Sigma Chemical Co., St. Louis). 40 unidades (a partir de 1 litro de plasma) do eluato foram ressuspensas em 1,6 litros de e o pH ajustado a 6,0 com HC1. Adicionou-se benzamidina seca para uma concentração final de 1 mM e a mistura foi centrifugada a lO.OOOxg e 4°C para remover o material insolúvel. A amostra foi então aplicada (100 ml/h) numa coluna de 5x95 cm com DEAE Sepharose que tinha sido equilibrada em citrato de sódio 0,02M, 1 mM benzamidina, 0,02% NaN^ , pH 6,0, a 4°C.

Após lavagem da coluna com 2 litros de tampão de partida esta foi desenvolvida com um gradiente de 15 litros de tampão de partida até 0,8M NaCl , citrato de sódio 0,02M, benzamidina lmM, 0,02% NaNg , pH 6,0. As fracções contendo Factor e X₂ bovino, que eluiram após a Proteína C mas antes da Proteína Z, foram reunidas, concentradas para 40 ml (PM10, Amicon , Lexigton , MA), e dialisadas contra 0,lM MOPS, pH 7,5. O rendimento foi de 68 mg de Factor X purificado. O Factor X foi produzido por activação do Factor X com XCP insolubilizado (proteína coagulante do Factor X derivada do veneno de víbora de Russell ) .

Cromatografia de afinidade em Factor X Bovino Affi-Gel 3

A amostra foi diluída com um volume igual de 0,lM NaCl, 0,05 Tris-HCl, pH 7,5, 0,2% Lubrol PX e aplicada com um caudal de 4 ml/h numa coluna de agarose Sepharose 4B ligada em série a uma coluna de 3 ml contendo Factor X bovino-Affi-Gel que tinha sido equilibrado em 0,lM NaCl,

0,05M Tris-HCl, pH 7,5, 0,1% de Lubrol PX. As colunas foram lavadas com 0,lM NaCl, 0,05M Tris-HCl, pH 7,5, 0,1% Lubrol (20 ml) e depois 0,lM NaCl, 0,05M Tris-HCl, pH 7,5, 2% de Lubrol PX (20 ml). A pré-coluna de Sepharose 4B foi então removida do circuito e a coluna de Factor X bovino-Affi-Gel foi ainda lavada com 0,lM NaCl, 0,05M Tris-HCl, pH 7,5, 2% de

-28Ç) -Octilglucosido (20 ml) e eluida com 0,5M benzamidina, 0,05M Tris-HCl, pH 7,5, 2% de -octiglucosido. As fracções contendo TFI conforme determinado pelo ensaio de TFI foram reunidas (FIG. 8, Fracçoes 62-66) e concentradas para gy 0,4 usando uma membrana YMS (Amicon Corp. , Danvers, Mass. ). A quantidade maior de Α₂θθ ^nas ^^rac?°^es eluidas é devido à benzamidina.

Filtração em gel Superose 12

A amostra concentrada ( ^0,4 ml) foi aplicado a duas colunas de 25 ml contendo Superose 12 ligadas em série que foram equilibradas em 1M NaSCN, 2% de β-octilglucosido, 0,02M MOPS, pH 7,0. As colunas foram desenvolvidas com tampão de partida num caudal de 0,3 ml/min.. Asfracções 27-31 contendo actividade de TFI foram identificadas e reunidas (FIG. 9).

Caracterização de TFI

SDS-PAGE - Electroforese em gel de dodecilsulfato de sédio-poliacrilamida do material TFI purificado e reduzido revelou uma banda difusa com um peso molecular aparente de 39.000 daltons quando corado com nitrato de prata. A eluição de fatias de gel mostrou que a actividade de TFI comigrava com a banda de proteína (FIG. 10).

125

Temperatura Western e Coloraçao com I-X

O material purificado liga-se ao FactorX O TFI reunido da cromatografia em Superose 12 foi sujeito a SDS-PAGE e transferido electroforéticamente para nitro125 celulose. Incubaçao subsequente da nitrocelulose com I-X mostrou que a proteína purificada se liga ao Factor X 3 3 (FIG. 11).

Os resultados do trabalho laboratorial

preparativo no Exemplo 2 conduzindo ao isolamento do TFI purificado são ainda exemplificados pela descrição detalhada que segue relativa às FIGS. 8 a 11 dos desenhos.

FIG. 8. Esta figura mostra a cromatografia de afinidade em Factor X bovino-Affi-Gel. As fracções 1 a 60 tinham 4 ml de volume e 60 a 70, 1 ml de volume. A absorvância (A^gg) está representada por a actividade de TFI de amostras diluidas 1000 vezes o--o.

FIG. 4. Esta figura mostra a filtração em gel Superose 12. As fracções 27-31 contendo actividade

TFI foram reunidas e guardadas a -4°C. A absorvância (A_oon) zoU está apresentada como linha --; a actividade de TFI da amostra diluida 1000 vezes está apresentada como o--o.

cado e reduzido.

FIG. 10, mostra SDS-PAGE de TFI purifi0 TFI purificado (2 ^ug/ml) foi sujeito a NaDodSO^/PAGE após redução com 10% de 2-mercaptoetanol e coloração com prata. Os marcadores de pesos moleculares em Kilodaltons estão apresentados à esquerda. λ direita está uma banda difusa do TFI reduzido com um peso molecular aparente de 39.000 daltons.

FIG. 11 mostra a SDS-PAGE de TFI purificado e reduzido na transferência superior em que o TFI purificado (2 pg ) foi sujeito a NaDodSO./PAGE e coloração com prata. A transferência inferior com

I-X mostra o TFI não reduzido (1 ng ) transferido electroforéticamente para nitro' 125 celulose, corado com I-X e autorradiografádo. O painel superior da figura mostra a actividade de TFI de fatias de gel extraídas após SDS-PAGEde 1 pg de TFI.

EXEMPLO 3

O isolamento de TFI a partir de várias fontes celulares, nomeadamente células Chang Liver, células SK-HEP-1 e células HepG2 foi efectuado por cromatografia de imunoafinidade usando como imunogénio um peptídeo sintético tendo uma sequência dos aminoácidos 3-25 do TFI aqui descrito anteriormente, como se segue:

Imunização

Um peptídeo de TFI contendo uma sequência correspondendo à sequência de aminoácidos 3-25 do TFI maduro foi sintetizado usando a síntese de peptídeos em fase sólida da Biosystem. O peptídeo de TFI (5 mg) foi conjugado com 10 mg de hemocianina de lapa através de glutaraldeido. Dois coelhos da Nova Zelândia foram imunizados por injecção intradérmica com um homogenato contendo 1 ml de adjuvante completo de Freund e 1 ml de conjugado (200 pg de peptídeo do TFI). Um mês mais tarde os coelhos receberam uma injecção de memória contendo um homogenato de 1 ml de adjuvante incompleto de Freund e 1 ml do conjugado (100 jjg do peptídeo de TFI). Colheu-se o anti-soro todas as semanas daqui em diante. A injecção de memória foi administrada mensalmente até os coelhos serem sangrados após 3 meses.

Isolamento da Ig anti-peptídeo do TFI

O precipitado sintético do TFI (3 mg) foi acoplado a 0,8 g de Sepharose^ 4B activada com CNBr usando o processo indicado pelo fabricante (Pharmacia). Para isolar o anticorpo específico, o anti-soro reunido (15 ml) foi misturado com igual volume de uma solução (PNBT) contendo PBS, 0,4M NaCl, 0,lM benzamidina e 1% de Triton® X-100 e cromatografado na coluna do Peptídeo de TFI-Sepharose 4B à temperatura ambiente. Lavou-se a coluna com 30 ml de solução de PNBT e depois com a mesma solução sem Triton-X-100. 0 an-31-

ticorpo ligado foi eluido com O,1M glicina/HCl, pH 2,2, imediatamente neutralizado pela adição de 1/10 do \olume de 1M Tris-OH e extensivamente dialisado contra solução salina. A partir de 15 ml de anti-soro isolou-se aproximadamente 6,5 mg de Ig anti-peptídeo do TFI.

Cultura de células

Células Chang Liver , hepatoma SK e HepG2 foram cultivadas até à confluência em Meio de Eagle modificação de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% do soro fetal bovino, 50 unidades/ml de penicilina e 50 ^ig/ml de estrepto micina em frascos de 175 cm². Cinco frascos de cada uma das células foram tripsinizados e usados para semear uma fábrica de células de 10 câmaras (Nunc). Após confluência (lsemana) as células foram lavadas com PBS duas vezes e incubadas num meio sem soro. O meio sem soro consistiu em DMEM suplementado com 0,5% de hidrolisato de lactalbumina, 50 unidades/ /ml de aprotinina, ITS premix (insulina - transferrina - selénio, Collaborative Research), 20 ng/ml do factor de crescimento das células do fígado (glicil-histidil-lisina) e 100 ng/ml de 12-miristato 13-acetato de forbol. O meio sem soro foi substituído por meio fresco de 3 em 3 dias. As células podem ser mantidas nestas condições durante mais de 2 meses. Os meios condicionados reunidos foram ajustados a 0,02% de ng/ml do factor de crescimento das células do fígado (glicil-histidil-lisina) e 100 ng/ml de 12-miristato 13-acetato de forbol. O meio sem soro foi substituído por meio fresco de 3 em 3 dias. As células podem ser mantidas nestas condições durante mais de 2 meses. Os meios condicionados reunidos foram ajustados a 0,02% de NaN^ e 0,01% de Triton X-100 e guardados a 4°C. Alguns meios foram concentrados 20 a 100 vezes por ultrafiltração pirai Amicon YM30.

usando um sistema de membrana em es-

Purificação de TFI por imunoafinidade

A Ig anti-peptídeo do TFI isolada (20 mg) foi acoplada a 2 g de Sepharose 4B activada com CNBR pelo processo publicado pelo fabricante. O volume do leito de gel foi de 7 ml. Para isolar TFI os meios condicionados (não concentrados ou concentrados das células de Chang Liver, SK hepatoma ou HepG2 foram cromatograf ados numa coluna de Iganti-peptídeo de TF Ι-Sepharose 4B a uma velocidade de 2 ml/min. na câmara fria, até aparecer no efluente uma actividade de TFI significativa. A coluna foi então lavada com 70 ml de PNBT e 70 ml da mesma solução sem Triton X-100. O TFI ligado foi eluido com O,1M glicina/HCl, pH 2,2 e concentrado até aproximadamente 0,6 ml por diálise sob vácuo contra O,1M glicina/HCl , pH 2,2.

Resultados

Por cromatografia de imunoafinidade numa coluna de Ig anti-peptídeo de TFI-Sepharose 4B, isolou-se TFI a partir de uma série de linhas celulares derivadas do fígado, Chang Liver, hepatoma SK e hepatoma HepG2. A Figura 12A mostra a SDS-PAGE das proteínas eluidas da coluna de Ig anti-peptídeo do TFI-Sepharose. Em diferentes preparações observa-se perfis de jgoteina algo diferentes. Nalgumas preparações, uma proteína de 40 KDa é a única proteína principal (calhas 4 e 5 ) ; noutras uma série de bandas de proteínas coexistem e uma proteína de 38 KDa é uma banda proeminente em vez de proteínas de 40 KDa. Para estabelecer quais as proteínas que estão relacionadas com o TFI fez-se o estudo da

125 ligaçao de I-X . As amostras de TFI isoladas foram sujeia tas a electroforese num gel de 12% de SDS-poliacrilamida e as proteínas foram então transferidas electroforeticamente para um papel de nitrocelulose e testadas quanto â activida125.

de de ligação de

I-X

Encontrou-se que tres bandas principais com pesos moleculares aparentes de 40, 38 e 25 Kda pos125 suem actividade de ligaçao a I-X enquanto que outras â

bandas não a possuem. (Figura 12B). A análise da sequência da banda de 38 KDa derivada de células de hepatoma SK mostra que possui a mesma sequência amino terminal do TFI de 40 Kda isolado a partir das células HepG2 no Exemplo 1, acima. Baseado na imunoafinidade, na sequênciação de aminoácidos e

125 nos estudos de ligaçao de I-X parece que os inibidores 3 de 40, 38 e 25 KDa podem ser derivados da mesma molécula.

Os resultados do trabalho laboratorial conduzindo ao isolamento de TFI a partir de váde células por cromatografia de imunoafinidade emplifiçados pela descrição das FIGS. 12(A) e segue.

preparativo rias fontes são ainda ex 12(B ) que s e

FIG. 12. Esta figura mostra a SDS-PAGE do TFI isolado por imunoaf in idade e o despiste da actividade 125 de ligação a I-X . (A) SDS-PAGE. Electroforese efectuaa da num gel de 12% de poliacrilamida. Calha 1, marcadores de pesos moleculares; calha 2, TFI de Chang Liver; calha 3, TFI de hepatoma SK (preparação 1); calha 4, TFI de hepatoma SK (preparação 2); calha 5, TFI de HepG2 (preparação 1); calha

6, TFI de HepG2 (preparação 2). (B) Despiste da actividade

125 de ligaçao a I-X . As amostras foram sujeitas a electro3 forese num gel de 12% de poliacrilamida. As proteínas foram transferidas electroforéticamente para um papel de nitrocelulose usando um sistema Bio-Rad Trans-Blot®. Após transferência o papel de nitrocelulose foi primeiro agitado suavemente em solução de PBS (PBS contendo 5 mg/ml de BSA e 2,5 mg/ml de gama globulina bovina) e depois em solução PBB conten125 do 400 ng/ml de biente. O papel de nitrocelulose foi então seco e autorradiografado durante 3 dias usando filme Kodak XAR-5. Calha 1, TFI de Chang Liver; calha 2, TFI de hepatoma SK (preparação 1); calha 3, TFI dehepatoma SK (preparação 2); e calha 4,

TFI de HepG2 (preparação 2).

I-X_a, de cada vez 1 hora a temperatura am-

Vários outros exemplos serão evidentes para os familiarizados com o assunto após leitura desta divulgação sem se afastarem do espirito e âmbito do presente invento. Pretende-se que todos esses exemplos sejam incluidos no âmbito das reivindicações apensas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

I^a. - Método de isolamento do inibidor do factor de tecido a partir de meio condicionado de células SK-HEP-1 e células Chang Liver, caracterizado por compreender:

A. Precipitação com CdCl^,

B. Cromatografia de afinidade em Factor X Affi-Gel do precipitacl do novamente solubilizado e

C. Filtração em gel Superose 12 das fracções da cromatografia de afinidade contendo actividade TFI.
2^a. - Método de isolamento do inibidor do factor de tecido a partir de meio condicionado de células SK-HEP-1 e células Chang Liver, caracterizado por compreender:

A. Precipitação com CdCl₂,

B. Cromatografia de afinidade em di-isopropilfosforil (ipr₂P)-Factor X Affi-Gel 15 do precipitado novamente solubilizado,

C. Filtração em gel Sephadex- G-75 das fracções da cromatografia de afinidade contendo actividade TFI e

D. Cromatografia de permuta iónica em Mono Q das fracções da filtração em gel contendo actividade TFI.
3^a. - Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por se obter inibidor do factor de tecido tendo as seguintes características:

A. existe em duas formas, TFI^ que migra a cerca de 37-40 000 daltons e TFI₂ a cerca de 25-26 000 daltons, conforme determinado por electroforese em gel de dodecilsulfato de sódio e poliacrilamida.

B. ele tem uma sequência de aminoácidos N-terminal como se segue:

^X-X-Glu-Glu—Asp-Glu-Glu-His-Tre-Ile-Ile-Tre-Asp-Tre-Glu¹⁵16 2 7

Leu-Pro-Pro-Leu-Lis-Leu-Met-His-Ser-Fen-(Fen)-Ala em que X-X não for determinado e

C. ele apresenta uma actividade inibidora relativamente ao

Factor X .

a
4^â. - Método de inibição da produção de Factor X num mamífero, caracterizado por se administrar ao referido mamífero uma quantidade eficaz do inibidor do factor de tecido obtido de acordo com as reivindicações 1 a 3, sendo a gama de dosagem 10 a 600 nanogramas de composto activo por mililitro de fluído corporal tratado.
5¹. - Método de inibição da formação do complexo enzimático Factor VII /TF num mamífero, caracterizado por se

3.

administrar ao referido mamífero uma quantidade eficaz do inibidor do factor de tecido obtido de acordo com as reivindicações 1 a 3, sendo a gama de dosagem de 10 a 600 nanogramas de composto activo por mililitro de fluído corporal a ser tratado.