FI97298C

FI97298C - Menetelmä kudosfaktorin inhibiittorin eristämiseksi

Info

Publication number: FI97298C
Application number: FI883477A
Authority: FI
Inventors: Jr George John Broze
Original assignee: Univ Washington
Priority date: 1987-07-23
Filing date: 1988-07-22
Publication date: 1996-11-25
Also published as: IL87172A; NO883271D0; KR890001581A; DK413588A; FI883477A0; BR1100464A; ZA885371B; DK413588D0; CA1338122C; NO174776B; AU1928688A; NZ225534A; EP0300988A3; US7060805B2; FI97298B; ZA885370B; PT88075B; JPS6447799A; PT88075A; KR900007261B1

Description

97298

Menetelmä kudosfaktorln Inhibiittorin eristämiseksi Tämä keksintö koskee menetelmää hyytymi s inhibiittorin nimeltä kudosfaktorln inhibiittori (TFI) eristysmene-5 telmää.

Nisäkkäiden veressä tapahtuva hyytymiskaskadi muodostuu kahdesta erillisestä systeemistä - niinkutsutuista sisäisestä ja ulkoisesta systeemistä. Jälkimmäinen systeemi aktivoituu veren altistuessa kudoksen tromboplastiinil-10 le (Faktori 111), jota tästälähin kutsutaan kudosfaktorik-si (TF). Kudosfaktori on lipoproteiini, jota löytyy monien solutyyppien plasmamembraanilta ja jota on erittäin paljon aivoissa ja keuhkoissa. Tullessaan yhteyteen TF:n kanssa, plasman Faktori VII tai sen aktivoitu muoto Faktori VIIa 15 muodostaa kalsiumista riippuvaisen kompleksin TF:n kanssa ja sitten proteolyyttisesti aktivoi Faktori X:n Faktori Xa:ksi ja Faktori IX:n Faktori IXa:ksi.

Aikaisemmat TF:n aloittaman hyytymisen säätelyä koskevat tutkimukset näyttivät, että TF:n inkuboiminen 20 (raaoissa kudoksen tromboplastiinipreparaateissa) seerumin kanssa inhiboi sen aktiivisuutta in vitro ja esti sen tappavaa vaikutusta, kun se infusoitiin hiireen. Laajat kokeet [Hjort, Scand. J. Clin. Lab. Invest. 9. Suppl. 27, 76-97 (1957)] vahvistivat ja laajensivat tämän alueen • 25 aiempia töitä ja johtivat päätelmään, että seerumin inhi boiva osa tunnisti Faktori VII-TF kompleksin. Yhdenmukaisia tämän hypoteesin kanssa ovat tosiseikat, että plasmassa tapahtuva TF:n inhibitio tarvitsee Ca2+:n läsnä-oloa (joka on myös tarpeellinen Faktori VII/VIIa:n sitoutumisel-30 le TF:ään) ja että inhibitio voidaan estää ja/tai kumota sitomalla divalentit kationit EDTA:11a. Tämän keksijän ja muiden tekemät uudemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että ei ainoastaan Faktori VIIa:ta vaan myös katalyyttisesti aktiivista Faktori Xa:ta ja yhtä lisäfaktoria tarvitaan 35 TF:n inhibition aikaansaamiseksi plasmassa tai seerumissa.

2 97298

Katso Broze ja Miletich, Blood_69, 150-155 (1987), ja Sanders et ai., Ibld.. 66. 204-212 (1985). Tätä lisäfaktoria, jota tässä kutsutaan kudosfaktorln Inhibiittoriksi (TFI), on läsnä bariumilla absorboidussa plasmassa ja se näyttää 5 olevan assosioituneena lipoproteiinien kanssa, koska TFI:n funktionaalinen aktiivisuus kulkee lipoproteiinifraktion kanssa, joka kulkee tiheyteen 1,21 g/cm3, kun seerumia sen-trifugoidaan. Brozen ja Miletichin, supra, mukaan HepG2-solut (ihmisen hepatoomasolulinja) erittävät inhiboivaa 10 osaa, joka on ominaisuuksiltaan samanlainen kuin plasmassa oleva TFI.

Esitetään kudosfaktorln inhibiittori (TFI), jolla on seuraavat ominaisuudet: A. se esiintyy kahdessa muodossa, TFIX kulkee noin 15 37-40000 daltönin kohdalle ja TFI2 noin 25-26000 daltonin kohdalle natriumdodekyylisulfaatti-polyakrylamidigeeli-elektroforeesilla (SDS-PAGE) määritettynä, B. sen osittainen N-pään aminohapposekvenssi on seuraavanlainen: 20 1 15 X-X-Glu-Glu-Asp-Glu-Glu-His-Thr-Ile-Ile-Thr-Asp-Thr-Glu-16 27

Leu-Pro-Pro-Leu-Lys-Leu-Met-His-Ser-Phe-(Phe)-Ala jossa X-X:ää ei ole määritetty, ja 25 C. sillä on inhibitorista aktiivisuutta Faktori Xa:- lle.

Tämä TFI on eristetty erittäin puhtaina muotoina, joina se ei esiintynyt soluissa ja alkuperäisissä kudos-lähteissä, joista se on saatu. Se tarkoittaa, että se on 30 valmistettu puhdistettuina muotoina, jotka ovat oleellisesti vapaita muista proteiineista ja vapaita muista solu-komponenteista ja kudosaineksesta.

Esitetyllä TFI:llä on biologista aktiivisuutta, joka antaa olettaa, että se on tärkeä lääketieteelle hyy-35 tymiskaskadin tutkimuksessa. Erikoisesti tämä TFI on • 97298 3 osoittanut terapeuttista kelpoisuutta käytettäväksi hyyty-misinhibiittorina ja veritulppien vastaisena aineena.

Tätä TFI:tä eritetään ravintoviljelyalustassa kasvavista HepG2-soluista ja sitten se voidaan eristää sääde-5 tystä alustasta. Eristys suoritetaan mieluummin kolmivaiheisella menetelmällä seuraavasti: A. CdClj-saostus, B. uudelleen liuotetun saostuman Faktori X, Affi-Gel 15 affiniteettikromatografia, ja 10 C. TFI-aktiivisuutta omaavien affiniteettikromato grafiafraktioiden Superose 12 geelisuodatus.

Vaihtoehtoisessa eristysmenetelmässä Faktori X, in-aktivoidaan vaiheessa B sitomalla di-isopropyylifosfaat-tiin (iPr2P), vaiheessa C käytetään geelisuodatusmateriaa-15 Iina Sephadex G-75:ttä ja neljäs vaihe D suoritetaan seuraavasti : D. TFl-aktiivisuutta omaavien geelisuodatusfrakti oiden Mono-Q ioninvaihtokromatografia.

Edellämainituissa menetelmissä HepG2 on hyvintun-20 nettu ja laajasti käytetty ihmisen hepatoomasolulinja, jonka muodostaminen ja ominaisuudet on kuvattu US-paten-tissa 4393133. Tämän solulinjan näytteitä on myös saatavissa American Type Culture Collection'in pysyvästä kokoelmasta, Rockville, Maryland, koodinumerolla ATCC HB 8065. 25 HepG2-soluja voidaan kasvattaa noin 37 °C:ssa tavan omaisessa ravintoviljelyalustassa TFI:n ekspressoimiseksi. Suositeltava alusta on Earle'n modifioitu perusalusta (EMEM), jota on kaupallisesti saatavana. Muita sopivia kaupallisesti saatavia alustoja on kuvannut, esimerkiksi, 30 Helen J. Morton, In Vitro 6 (2), 89-108 (1970). Nämä ra-vintoviljelyalustat sisältävät aminohappoja, mineraaleja, hiilihydraatteja, vitamiineja ja niitä on usein vahvistettu nisäkkään seerumilla, esim. härän sikiön seerumilla tai vasikan seerumilla, ja erilaisilla kasvutekijöillä. Tässä 35 käytettynä HepG2-soluja kasvatetaan ensin mieluummin see- 4 97298 rumia sisältävässä alustassa ja sitten ne siirretään see-rumivapaaseen alustaan, johon on lisätty kasvua stimuloivia määriä transferriiniä, seleeniä, insuliinia, maksasolun kasvutekijää ja laktalbumiinihydrolysaattia.

5 Ylläolevassa vaiheessa A muodostunut CdCl2-saostuma laimennetaan suositeltavasti samalla tilavuudella puskuri-liuosta ennen vaiheen B affiniteettikromatografiapylvää-seen laittoa. Puskuriliuoksen tulisi sisältää biologisesti hyväksyttävän puskurimateriaalin vesiliuoksen, jonka pH on 10 säädetty noin 7,5:een. 0,05 M Tris-HCl:n käyttö on valaiseva esimerkki. Oleellisesti samanlaista puskuria voidaan sitten käyttää affiniteettikromatografiapylvään tasapainottamiseen.

Vaiheessa B käytetty A£fi-Gel 15 on kaupallisesti 15 saatavissa, aktivoitu affiniteettikantaja on valmistettu derivatoidun ristiinsidotun agaroosigeelin N-hydroksisuk-kinimidiesterinä.

Geelisuodatusvaiheessa C käytetyt Superose 12 ja Sephadex G-75 ovat kaupallisesti saatavissa, pallomaiset 20 geelit on valmistettu ristiinsitomalla dekstraani epiklo-rohydriinin kanssa. Suositeltavalla superhienolla laadulla on halkaisija kokoluokkaa noin 20-50 pm.

Ennen laittoa geelisuodatuspylvääseen, vaiheen B TFI-aktiviteettia omaavat affiniteettikromatografiafrak-• 25 tiot suositeltavasti konsentroidaan esimerkiksi ultrasuo- datuksella, jotta työskentelyliuoksen tilavuutta saadaan pienennettyä, ja pylväs voidaan tasapainottaa 1 M NaSCN:-llä, joka on puskuroitu pH:hon noin 7,5.

Vaihtoehtoisessa eristysmenetelmässä geelisuodatus-30 vaiheen C jälkeen TFI-aktiviteettia omaavat fraktiot suositeltavasti seostetaan asetonilla ja saostuma liuotetaan sitten uudelleen Mono-Q pylvääseen laittoa varten. Jälkimmäinen pylväs voidaan tasapainottaa 6 M urealla, joka on puskuroitu pH:hon noin 8,3.

5 97298

Vaiheessa D käytetty Mono-Q on kaupallisesti saatavissa, se on vahva anioninvaihtoresiini, joka perustuu pallomaisessa muodossa olevaan hydrofiiliseen polymeeriin, jonka halkaisija on noin 10 pm, jolla on kvatemaarisia 5 aminovarattuj a ryhmiä.

Esillä olevan keksinnön kohteena on menetelmä ku-dosfaktorin inhibiittorin eristämiseksi, jolle menetelmälle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa esitetään. Sopivia solulähteitä TFI:n saamiseksi ovat SK-HEP-1-10 solut (ATCC HTB 52) ja Chang Liver-solut (ATCC CCL 13).

Keksintö tulee paremmin ymmärrettäväksi seuraavien suositeltavien suoritustapojen ja mukanaseuraavien piirrosten kuvausten myötä, joissa piirroksissa lyhyesti:

Kuvio 1 on graafinen esitys, joka näyttää HepG2-so-15 luista eristetyn konsentroidun TFI-preparaatin iPr2P-ihmi-sen Faktori Xa Affi-Gel affiniteettikromatografian jälkeisen eluutioprofiilin eräässä suoritustavassa.

Kuvio 2 on graafinen esitys, joka näyttää kuvion 1 TFI-aktiivisista fraktioista muodostetun konsentroidun 20 näytteen Sephadex G-75 geelisuodatuksen jälkeisen eluutioprofiilin.

Kuvio 3 on graafinen esitys, joka näyttää kuvion 2 TFI-aktiivisista fraktioista muodostetun konsentroidun näytteen Mono-Q ioninvaihtokromatografian jälkeisen eluu-25 tioprofiilin.

Kuvio 4 näyttää kuvion 3 puhdistetun TFI-näytteen SDS-PAGE:n.

Kuvio 5 on graafinen esitys, joka näyttää vertailun kuvion 3 puhdistetun TFI:n ja normaalin ihmisen seerumin 30 välillä TFI-kokeessa.

Kuvio 6 on graafinen esitys, joka näyttää kuvion 3 puhdistetun TFI:n inhibitorisen vaikutuksen Faktori X,:han verrattuna sen vaikutuksen puutokseen trombiinilla.

Kuvio 7 on graafinen esitys, joka näyttää kuvion 3 35 puhdistetun TFI:n aiheuttaman nopean TF-aktiviteetin inhi bition Faktori VIIa:n, Faktori Xa:n ja Ca~:n läsnäollessa.

97298 e

Kuvio 8 on graafinen esitys, joka näyttää HepG2-so-luista eristetyn konsentroidun TFI-preparaatin härän Faktori Xa Affi-Gel affiniteettikromatografiän jälkeisen eluu-tioprofiilin toisessa suoritustavassa.

5 Kuvio 9 on graafinen esitys, joka näyttää kuvion 8 TFI-aktiivisten fraktioiden muodostaman konsentroidun näytteen Superose 12 geelisuodatuksen jälkeisen eluutio-profiilin.

Kuvio 10 näyttää kuvion 9 pelkistyneen, puhdistetun 10 TFI-näytteen SDS-PAGE:n.

Kuvio 11 näyttää kuvion 9 pelkistymättömän, puhdistetun TFI-näytteen SDS-PAGE:n.

Kuvio 12(A) näyttää keksinnön mukaisesti Chang Liver-soluista (kaista 2) ja SK-HEP-l-soluista (kaistat 3 15 ja 4), sekä HepG2-soluista (kaistat 5 ja 6) immunoaffiniteettikromatograf iällä eristetyn TFI:n SDS-PAGE:n kaistalla 1 näytettyjen molekyylipainostandardimarkkereiden kanssa.

Kuvio 12(B) näyttää kuvion 12(A) elektroforeetti-20 sesti erotettujen proteiinien Western-blottauksen nitro- selluloosapaperille kaistoilta 2, 3, 4 ja 6 vastaavassa järjestyksessä kaistoilla 1, 2, 3 ja 4 ja 125I-Xa-värjäyksen jälkeisen autoradiografian.

Keksinnön spesifisten suositeltavien suoritustapo- i 25 jen tarkempaa yksityiskohtaista kuvausta varten suoritet tiin seuraavat esimerkkeinä käytetyt laboratoriotyöt. Esimerkissä 1 TFI eristettiin nelivaiheisella menetelmällä ja esimerkissä 2 kolmivaiheisella menetelmällä HepG2-solujen säädetystä alustasta, kuten tässä on aiemmin määritelty. 30 Esimerkit 1 ja 2 ovat vertailuesimerkkejä. Esimerkissä 3 TFI eristettiin keksinnön mukaisesti useista solulähteistä immunoaffiniteettikromatografiällä.

Esimerkki 1 (Vertailuesimerkki)

Materiaalit. Affi-Gel 15 ja matalan molekyylipainon 35 omaavat standardit polyakrylamidielektroforeesiin hankit- i 7 97298 tiin Bio-Rad Laboratories'lta. Na125I (kantaja-vapaa) hankittiin New England Nuclear'lta, ja Iodo-Gen hankittiin Pierce Chemical Co.:lta. Sephadex G-75 superhieno laatu ja Mono-Q pylväs saatiin Pharmacia Inc.:lta. Earle'n modi-5 fioitu perusalusta (EMEM) ja härän sikiön ja vasikan seerumit saatiin KC Biological Inc.:lta (Lenexa, KS) ja maksasolun kasvutekijä saatiin Miles Laboratories *lta. Härän seerumialbumiini, fenyylimetyylisulfonyylifluoridi, di-isopropyylifluorofosfaatti (iPr2P-F), akrylamidi, metylee-10 ni-bis(akrylamidi), kanin aivojen kefaliini, transferrii-ni, seleeni, insuliini, laktalbumiinihydrolysaatti, HEPES (N-2-hydroksietyylipiperatsiini-N'-2-etaanisulfonihappo), MOPS (3-(N-morfolino)propaanisulfonihappo) ja Trizma-emäs [Tris(hydroksimetyyli )aminoetaani] hankittiin Sigma Chemi-15 cal Co.:lta. Kaikki muut kemikaalit olivat reagenssilaatua tai parempaa ja hankittiin Fisher Scientific Co.:lta tai Sigma'lta. Ihmisen plasma, josta puuttui Faktori X, hankittiin George King Biomedical'lta (Overland Park, KS). Terveiden verenluovuttajien seeruminäytteet saatiin Ameri-20 kan Punaiselta Ristiltä (St. Louis, MO). HepG2-solut hankittiin American Type Culture Collection'lta.

Proteiinit. Valmistettiin raakapreparaatti TF:stä ja pestiin voimakkaasti EDTA:11a [Broze ja Miletich, Blood 69., 150-155 (1987); Broze ja Majerus, J. Biol. Chem. 225. 25 1242-1247 (1980)]. Faktori X hyytymisproteiini Russell'in kyykäärmeen myrkystä (XCP), antitrombiini lila, Faktori VIIa ja ihmisen Faktori X puhdistettiin kuten ovat kuvanneet Broze ja Miletich, supra; Broze et ai., J. Biol. Chem. 260. 10917 (1985); Peterson ja Blackburn, J. Biol. 30 Chem. 260. 610-615 (1985); ja Miletich, Broze ja Majerus, Methods Enzymol. 80. 221-228 (1981). Faktori Xa tuotettiin puhdistetusta Faktori X:stä inkuboimalla liuottamattoman X hyytymisproteiinin kanssa ja inaktivoitiin iPr2P-F:llä [Broze ja Miletich, supra; Bajaj et ai., Prep. Biochem. 35 11, 397-412 (1981)]. iPr2P-Faktori Xa kiinnitettiin Affi- 8 97298

Gel 15:een niin, että loppukonsentraatioksi tuli noin 2 mg/ml pakattua geeliä käyt-täen valmistajan julkaisemia ohjeita (MOPS-puskuri, pH 7,5).

Koe. Allaolevaa kolmivaiheista koetta käytettiin 5 TF:n inhibitioon puhdistuksen aikana (Broze ja Miletich, supra). Ensimmäisessä vaiheessa 10 μΐ Faktori VIIa:ta (1 pg/ml), 10 μΐ Faktori X:ää (10 μg/ml), 10 μΐ CaCl2:ia (40 mM), 10 μΐ antitrombiini lila (650 μg/ml), 50 μΐ testattavaa näytettä laimennettuina TBSA-puskuriin (0,1 M NaCl/ 10 0,05 M Tris-HCl, pH 7,5, joka sisältää härän seerumialbu- miinia 1 mg/ml) ja 10 μΐ raakaa, EDTA-pestyä TF:ää (10 % voi/voi) inkuboitiin huoneenlämmössä. 30 minuutin kuluttua 10 pl:aa näytettä laimennettiin 100-kertaisesti TBSA-puskuriin, jossa oli 5 mM CaCl2:ia. Viisikymmentä mikrolitraa 15 tätä laimennettua näytettä, 50 μΐ Faktori VIIa:ta (1 pg/ ml), 50 μΐ CaCl2 (25 mM) ja 50 μΐ Faktori X:ää (10 pg/ml) inkuboitiin sitten 37 °C:ssa. Minuutin kuluttua lisättiin 50 μΐ seosta, joka sisälsi 10 osaa Faktori X puutteellista plasmaa ja yhden osan kanin aivojen kefaliinin kantarea-20 genssia (valmistettu, kuten ovat kuvanneet Bell ja Aitone, Nature 174. 880 (1954) ja saatettu käyttövalmiiksi valmistajan julkaisemien ohjeiden mukaisesti, Sigma) ja hyytymän muodostumiseen kulunut aika mitattiin fibrometrillä (Baltimore Biological Laboratory, Cockeysville, MD).

25 Seokset, joissa TBSA:ta mieluummin kuin näytettä inkuboitiin ensimmäisessä vaiheessa, toimivat kontrolleina. Kokeessa raa'an TF:n konsentraatio valittiin niin, että kontrollin hyytymisajaksi tuli 35-40 sekuntia. Kokeeseen sisällytettiin antitrombiini lila:aa, jotta saatiin 30 vähennettyä ensimmäisen vaiheen inkubaation aikana muodostuneen Faktori Xa:n vaikutusta kokeen kolmannen vaiheen hyytymisaikaan. Suhteellinen TFI aktiivisuus laskettiin standardi suoralta, joka valmistettiin piirtämällä (log-log paperille) kontrolliarvon yli menneet hyytymisajan piden-35 nykset sekunteina normaalin yhdistetyn seerumin (50 luo- 9 97298 vuttajaa) loppukonsentraation funktiona kokeen ensimmäisessä vaiheessa. Tämä standardisuora oli lineaarinen see-rumikonsentraatioissa 1-10 % (voi/ voi). Yksi yksikkö TFI aktiivisuutta määritettiin määräksi, jonka 1 ml normaalia 5 yhdistettyä seerumia sisälsi. Tulokset kromatografiafrak-tiokokeista on ilmoitettu hyytymisaikoina eikä niitä ole muutettu yksiköiksi/ml.

NaDodS04/PAGE suoritettiin 15 % geeleissä (4 % kon-sentrointigeeli) Laemmlin menetelmällä, Nature (London) 10 227. 680-685 (1970). Pelkistettyjä näytteitä kuumennettiin 100 °C:een 5 minuuttia 10 % 2-merkaptoetanolin läsnäollessa ennen elektroforeesia. TFI eristettiin NaDodS04/PAGE:n jälkeen leikkaamalla kaista geelistä, antamalla sen liota 30 minuuttia 0,1 M NaCl/0,05 M Tris-HCl-liuoksessa, pH 7,5, 15 leikkaamalla se 2 mm:n paloihin ja inkuboimalla kutakin palaa yön yli 100 plrssa 1 M NaSCN/0,05 M Tris-HCl, pH 7,5/0,025 % Lubrol PX-liuoksessa (biologinen nonioninen detergentti, joka koostuu rasva-alkoholin etyleenioksidi-tiivisteestä), joka sisälsi härän seerumialbumiinia 0,5 20 mg/ml. Sitten uutetun materiaalin 1:50 laimennos TBSA:ssa testattiin kuten on kuvattu yllä TF:n inhibitiota varten. Western-blottaus suoritettiin, kuten ovat kuvanneet Broze, Hickman ja Miletich, J. Clin. Invest. 76. 937-946 (1985), käyttäen koettimena 125I-leimattua Faktori Xa:ta. Puhdiste-25 tun TFI:n (110 pmol) aminohappokoostumus määritettiin 6 M HCl:ssa 110 °C:ssa suoritetun 24 tunnin hydrolyysin jälkeen Beckman 6300 autoanalysaattorissa pylvään jälkeisellä nin-hydriini-derivatisaatiolla.

Soluvinelv. HepG2-soluja viljeltiin muovisissa tai 30 lasisissa pyörivissä pulloissa (850 cm2). Alkunuorennuksen jälkeen soluja kasvatettiin EMEM:ssä, jossa oli vähemmän tärkeitä aminohappoja ja penisilliiniä (103 yksikköä/ml), streptomysiiniä (100 pg/ml), amfoterisiiniä (250 ng/ml), natriumpyruvaattia (100 mM), L-glutamiinia (200 mM) ja 5 % 35 härän sikiön seerumia ja 5 % naudan seerumia vaihtaen ra- 10 97298 vintoalusta kahdesti viikossa. 2 viikon kuluttua seerumia sisältävä ravintoalusta poistettiin ja solut pestiin varovaisesti EMEM:llä ja sen jälkeen viljeltiin seerumivapaassa ravintoalustassa, joka koostui samoista yllämainituista 5 aineista ja lisäksi mukana oli transferriiniä (5 pg/ml), seleeniä (5 ng/ ml), insuliinia (5 pg/ml), maksasolun kasvutekijää (20 pg/ ml), laktalbumiinihydrolysaattia (5 mg/ ml) ja HEPES:iä (25 mM). Säädetty ravintoalusta poistettiin ja korvattiin tuoreella seerumivapaalla ravintoalus-10 talla kahdesti viikossa. HepG2-soluja voidaan ylläpitää näissä olosuhteissa >3 kuukautta.

N-pään aminohapposekvenssin määritys. Puhdistetun TFI:n NH2-pään proteiinisekvenssin määritykseen käytettiin automatisoitua Edmanin degradaatiokemiaa. Degradaatioissa 15 käytettiin Applied Biosystems Inc.:n malli 470A kaasufaa-sisekvenaattoria (Foster City, CA), Hunkapiller et ai., Methods Enzvmol. 91. 399-413 (1983). Vastaavat PTH-amino-happojohdannaiset tunnistettiin RP-HPLC-analyysillä on-line-tavalla käyttäen Applied Biosystems Inc.:n Model 120A 20 PTH Analyzer'ia, johon oli sovitettu Brownlee 2.1 mm I.D. PTH-C18 pylväs. Näytteeseen käytettiin elektroblottaustek-niikkaa suoraan SDS-PAGE:sta eristettyjen rintamien sek-vensoimiseksi. Käytetyt menetelmät olivat, kuten ovat kuvanneet Aebersold et ai., J. Biol. Chem. 261. 4229-4238 * 25 (1986). Näitä sekvensointimenetelmiä käyttäen kahta ensim mäistä N-pään aminohappoa ei saatu selville, mutta aminohapot 3-27 määritettiin seuraaviksi: 1 15 X-X-Glu-Glu-Asp-Glu-Glu-His-Thr-Ile-Ile-Thr-Asp-Thr-Glu-30 27

Leu-Pro-Pro-Leu-Lys-Leu-Met-His-Ser-Phe-(Phe)-Ala TFI:n puhdistus. Jollei muuten mainittu, puhdistus-menetelmä suoritettiin huoneenlämmössä. Puhdistusmenetelmästä on tehty yhteenveto allaolevan taulukon 1 oleelli-35 sesti nelivaiheisessa kaaviossa. 1 97298 11 V +1 +1 +1

M

3 G ^ νο O

+J O) O H Pv CM

ra G in «-I vo co

•H -rl · w w VO

Ό (0 LO ^

Λ -P 1-1 «— C" O O

3 μ m in en o

PL, Q) O' in tH

s in n) 0 m

P

G

«0

(0 rt» O CO 00 O CO

CO O O' CM CS H

iH

ra 3 3 ” 2 S H e H O) 2 Ϊ £ '5 30 £2 “ ίο +| h e j1 — w «o S -H in

e co in C C C

5 X O <0 3 2 >i <-i «0 3

Ti w «ο -μ -μ TJ m ra -h 01 oo cm o o ra«oo o, co in o in o ·· > m m v v cd o oo E >i O 00 rH iH O' C 3 Ή •H (0

O P H

tn 00 3 Ό 2 CM Λ 2 M (0

2 so e 3 H

2 O -H 0. H

T? X 0 10 2 ä p co > "Ί H O OOOO PEnp

Hra o ov M1 es O' 0) «0 % x tji o cm co in x 3 i -$ >, ^ H W -P M-f **< 3 -H vh

C O O

e m i - 0) >1 P> 5 6 H 3

•H -H (0 O

ra e «o 1h

3 -H + > Ό O

+J -H CO VO O

m ® oo o o co o so -h o •h +? 1 o 1rt oo - «. - -p -p o

Ό Po "rt CO 'rt O O -P M H

C. Ρ E · CM O) <0 3 P« CO ' <0 t, a cm - x Σ

e X

e I 0) (0 -P

.. « «o e «ο H I X -P -H > * (0 -P O 3 : e-· m-H-Hin <D>4->

(0 3 0 Ρ C" HM

• (0 -P OI O C 3

H Q. M (0 -P O OP

«0 0 τ-> X 3 0) o >io «on k -p «o a x h ra o fci o a) -pio

X E(ÖIH ΙΟΌΟΙ O -P -P

3 a> 3·Ρν·ρ-ηο«ι(0 i Aimo h xi praH3Mrg-HÄ O ra3>

3 H (DSOSfiipmft C <0 H P

(0 «0 Q) H Ό H >1 ΛΉ O) O J<<

E-t > W«OOQ)HH<CO S -K++I

12 97298

Yksityiskohtainen puhdistusmenetelmä oli seuraavanlainen.

A. Kadmiumkloridisaostus

HepG2-solujen seerumivapaata säädettyä alustaa (4 5 litraa) sentrlfugoitiin fenyylimetyylisulfonyylifluoridin (loppukonsentraatio 0,1 M) ja NaN3 (loppukonsentraatio 0,05 % wt/vol) lisäyksen jälkeen 2500 x g 30 minuuttia partikkeleista muodostuvan roskan poistamiseksi. Sitten lisättiin CdCl2:ta (1,0 M) niin, että loppukonsentraatioksi tuli 10 5 mM ja seosta sekoitettiin 15 minuuttia. Saostuma, joka sisälsi TFI-aktiivisuuden, kerättiin sentrifugoimalla (2500 x g 30 minuuttia) ja supernatantti kaadettiin pois. Nappi liuotettiin 40 ml:aan 0,5 M EDTA/5 mM iPr2P-F-liuos-ta, pH 9,5, ja sitten dialysoitiin voimakkaasti TS-pusku-15 ria (0,1 M NaCl/ 0,05 M Tris-HCl/0,1 mM fenyylisulfonyyli-fluoridi/0,5 mM EDTA/0,02 % NaN3, pH 7,5) vastaan.

B. iPr2-Faktori X. Affi-Gel 15 kromatografia

Dialysoitu preparaatti kirkastettiin sentrifugoimalla (10000 x g 15 minuuttia) ja laitettiin TS-puskurissa 20 tasapainotettuun iPr2P-Faktori X.-Affi-Gel 15 pylvääseen. Geeliä pestiin aloituspuskurilla ja sitoutunut materiaali eluoitiin 2 M NaSCN/0,05 M Tris-HCl, pH 7,5/0,05 % Lubrol PX/0,02 % NaN3/0,l mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridi-liuoksella (kuvio 1). TFI-aktiivisuutta omaavat fraktiot 25 yhdistettiin ja konsentroitiin noin 1 ml:aan käyttäen YM5 hydrofHiistä ultrasuodatusmembraania (Amicon).

C. Geelisuodatus ja asetonidelipidaatio

Konsentroitu näyte laitettiin Sephadex G-75 super- hienoa laatua sisältävään 1 M NaSCN/0,05 M Tris-HCl, pH 30 7,5/ 0,05 % Lubrol PX/0,02 % NaN3/0,l mM fenyylimetyylisul- fonyylifluoridiliuoksella tasapainotettuun pylvääseen (kuvio 2). TFI-aktiivisuutta omaavat fraktiot yhdistettiin ja sekoitettiin 8 tilavuuden kanssa asetonia. 30 minuutin kuluttua kerättiin saostuma sentrifugoimalla (10000 x g, 35 20 minuuttia 10 °C:ssa).

13 97298 D. Mono-Q ioninvaihtokromatagrafia

Asetonisaostuma liuotettiin 1,0 ml:aan 6 M urea/ 0,02 M Tris-HCl/0,05 % Lubrol PX-liuosta, pH 8,3, ja laitettiin samassa puskurissa tasapainotettuun Mono-Q pylvää-5 seen. Pylväs eluoitiin 30 ml:n lineaarisella gradientilla, joka alkoi aloituspuskurilla ja päättyi 6 M urea/0,5 M Tris-HCl/0,05 % Lubrol PX-liuokseen, pH 8,3 (kuvio 3).

TFI-aktiivisuutta sisältävät fraktiot yhdistettiin kuvion 3 osoittamalla tavalla, konsentroitiin noin 1 ml:aan (YM5, 10 Amicon), dialysoitiin 1 M NaSCN/0,05 M Tris-HCl/0,05 % Lubrol PX-liuosta, pH 7,5, vastaan ja säilytettiin 4 °C:-ssa.

TFI:n ominaisuudet. Puhdistetun TFI:n NaDodS04/PAGE osoitti vahvan rintaman kohdilla Mr 38000 (pelkistymätön) 15 tai 39000 (pelkistynyt) (kuvio 4). Puhdistetun preparaatin pelkistymättömän näytteen NaDodS04/PAGE:n jälkeen suoritettu geelipalojen uutto osoitti, että inhibitioaktiivisuus kulki yhdessä Coomassie-värjätyn rintaman kanssa. Kuten odotettua, 125I-leimattu Faktori Xa tunnisti tämän saman 20 rintaman immunoblottauksessa (tuloksia ei nähtävillä).

Puhdistetun TFI:n aminohappokoostumus näytetään allaolevassa taulukossa 2. Puhdistettu TFI näytti olevan samanlainen seerumissa läsnäolevan inhibiittorin kanssa siinä, että se tarvitsi Faktori VIIa:ta, Faktori X:ää ja Ca2*:ia 25 aktiivisuuden ilmentymiseen (Broze ja Miletich, supra) (taulukko 3, alla), ja puhdistetun TFI:n laimennokset tuottivat normaalin ihmisen seerumin standardisuoran kanssa yhdensuuntaisen suoran (kuvio 5).

Puhdistetun TFI:n inkubaatio (250 ng/ml) Faktori 30 Xa:n (25 ng/ml) kanssa johti Xa:n hyytymisaktiivisuuden häviämiseen toiminnallisessa biotestissä (kuvio 6). Tämä TFI:n inhibitorinen vaikutus ei ollut yleinen, kaikkia seriiniproteaaseja vastaan suunnattu ominaisuus, koska trombiiniin inkubaatio TFI:n kanssa ei vaikuttanut miten-35 kään (kuvio 6).

14 97298

Faktori VIIa:n, Faktori Xa:n ja Ca2*:n läsnäollessa TFI aiheutti erittäin nopean TF-aktiivisuuden inhibition, jonka havaittava t1/2 oli 20 sekuntia (kuvio 7). Hepariinin (0,5 yksikköä/ml) sisällyttäminen mukaan seoksiin kiihdyt-5 ti inhibition alkunopeutta 3-kertaisesti (t1/2 = 6 sekuntia). äntitrombiini IIIa:n (65 pg/ml) sisällyttäminen reaktioon ei vaikuttanut TFI:n aiheuttamaan havaittavan TF-aktilvisuuden inhibitioon.

15 97298

Taulukko 2. TFI:n aminohappokoostumus

Aminohappo_Lyhennys Moolia per 38000a proteiinia

Asparagiinihappo Asp 40

Treoniini Thr 20

Seriini Ser 19

Glutamiinihappo Glu 44

Proliini Pro 15

Glysiini Gly 33

Alaniini Ala 19

Kysteiini Cys 13* Väliini Vai 12

Metioniini Met +

Isoleusiini Ile 15

Leusiini Leu 27

Tyrosiini Tyr 10

Fenylalaniini Phe 20

Histidiini His 5

Lysiini Lys 26

Arginiini Arg 18

Tryptofaani Trp ND

ND, ei määritetty.

*Kysteiiniarvo on 24 tunnin hydrolyysistä; performaatti-happohapetusta ei suoritettu.

-•-Metioniini hapetettiin hydrolyysin aikana; yhtään ei havaittu .

Taulukko 3. Faktori VII:n, Faktori X:n ja Ca2*:n tarve puhdistetun TFI:n aktiivisuuden ilmentymiselle : Poisto ensimmäisestä vaiheesta* Hyytymisaika,+ _sekunteja_

Ei mitään 95,3

Faktori X 40,2

Faktori VII. 41,3

Ca2+ (5 mM EDTA) 40,8

Kontrolli 37,7 ‘ *Katso ylläoleva TFI-kokeen kuvaus.

+Tulokset ovat keskiarvot kahdesta kokeesta. TFI:n loppu-konsentraatio oli 10 ng/ml kokeen ensimmäisessä vaiheessa.

. « « 16 97298

Ylläolevasta HepG2-säädetystä alustasta eristetyn TFI :n funktionaaliset ominaisuudet kuvattiin seuraavanlai-sesti.

Hyytymiskokeet: TFI:n aiheuttama Faktori Xa:n inhi-5 bitio. Reaktioseoksia, jotka sisälsivät puhdistettua TFI:-tä (250 ng/ml), Faktori Xa:ta (25 ng/ml) ja joko EDTA:ta (1 mM) tai CaCl2:ia (5 mM) ja kanin aivojen kefaliinin varas-toliuoksen 1:40 laimennosta (valmistettu Sigman julkaisemien ohjeiden mukaisesti) TBSA:ssa (0,1 M NaCl, 0,05 M 10 Tris-HCl, pH 7,5, 1 mg/ml härän seerumialbumiinia), inku-boitiin huoneenlämmössä. Lisättiin eri aikoina 100 μ1:η osanäytteitä fibrometrin kuppiin, joka jo sisälsi 50 μΐ CaCl2:ia (25 mM) ja 50 μΐ kanin aivojen kefaliinia (varas-toliuoksen 1:10 laimennosta) 37 °C:ssa. Sitten välittömästi 15 lisättiin 50 μΐ Faktori X:ää sisältämätöntä plasmaa ja hyytymän muodostumiseen kulunut aika mitattiin fibromet-rillä (BBL, Cockeysville, MD). Faktori Xa-aktiivisuus määritettiin vertaamalla hyytymisaikoja standardisuoraan, joka oli valmistettu käyttäen samoihin inkubaatioseoksiin 20 valmistettuja Xa:n laimennoksia, joista TFI puuttui.

TFI:n aiheuttama trombiinin inhibltio: TFl:tä (400 ng/ml) ja trombiinia (0,5 yksikköä/ml, 180 ng/ml) sisältäviä reaktioseoksia inkuboitiin huoneenlämmössä TBSA:ssa. Eri aikoina lisättiin 100 μ1:η osanäytteitä 100 pl:aan 37 25 °C:ssa lämmitettyä 0,15 M NaCl, 6,6 gm/1 PEG-6000, 10 mM imidatsoli, 10 mM CaCl2-liuosta, pH 7,4. Sitten lisättiin välittömästi 50 μΐ fibrinogeeniä (2 mg/ml) ja hyytymän muodostumiseen kulunut aika mitattiin fibrometrillä. Suhteellinen trombiiniaktiivisuus määritettiin käyttäen trom-30 biinilaimennoksien avulla valmistettua standardisuoraa.

TFI:n aiheuttama TF:n inhibitio: 100 μΐ seosta, joka sisälsi Faktori VIIa:ta (200 ng/ml), Faktori Xa:ta (200 ng/ ml), CaCl2:ia (8 mM) ja TF:ää (2 % v/v), jota oli inkuboitu huoneenlämmössä 1 minuutti, lisättiin 100 pl:aan 35 TFI:tä (600 ng/ml) sisältävää TBSA:ta, jossa joko oli tai 97298 17 el ollut antltrombllnl lila:ta (130 pg/ml) ja hepariinia (1 yksikkö/ml). Sen jälkeen poistettiin spesifioiduissa aikapisteissä 10 μ1:η näyte ja laimennettiin 100-kertai-sestl TBSA:han, jossa oli 5 mM CaCl2:ia. Käytännöllisyyden 5 vuoksi alemmista aikapisteistä valmistetut laimennetut näytteet jätettiin odottamaan kunnes lopullinen 1 minuutin näyte oli saatu ja sitten kaikki testattiin jäljelläolevan TF-aktiivisuuden suhteen käyttäen kaksivaiheista koetta.

50 μΐ Faktori Vila:ta (1 pg(ml), 50 μΐ CaCl2:ia (25 mM), 50 10 μΐ laimennettua näytettä ja 50 μΐ Faktori X:ää (10 pg/ml) inkuboitiin 37 °C:ssa. 1 minuutin kuluttua lisättiin 50 μΐ seosta, joka sisälsi 10 osaa Faktori X:ää sisältämätöntä plasmaa ja 1 osan kanin aivojen kefaliinin varastoreagens-sia (valmistettu Sigman kuvauksen mukaisesti) ja hyytymän 15 muodostumiseen kulunut aika mitattiin fibrometrillä. Koska tämä TF-koe sisältää näytteen laimentamisen alkuperäisestä inkubaatioseoksesta ja 1-2 minuutin lisäinkubaation, saatuja inhibitionopeuksia pidetään tässä "ilmeisinä" nopeuksina.

20 Ylläolevien puhdistetun TFI:n eristykseen ja funk tionaaliseen testaukseen johtaneiden laboratoriotyötulos-ten lisäksi esitetään esimerkkeinä seuraavat yksityiskohtaiset piirrosten kuvaukset kuvista 1-7.

Kuvio 1. Tämä kuva esittää iPr2P-Faktori Xa-Affi-Gel : 25 affiniteettikromatografian. CdCl2-saostuksen ja uuton jäl keen dialysoitu TFI-preparaatti (noin 100 ml) laitettiin 1,5 x 40 cm:n iPr2P-Faktori Xa-Affi-Gel 15 pylvääseen, joka oli tasapainotettu 0,1 M NaCl/0,05 M Tris-HCl, pH 7,5/0,5 mM EDTA/ 0,02 % NaN3/0,l mM fenyylimetyylisulfonyylifluori-30 di-liuoksessa. Aloituspuskuripesun jälkeen TFI eluoitiin 2 M NaSCN/0,05 M Tris-HCl, pH 7,5/0,05 % Lubrol PX/0,1 mM f enyylimetyylisulfonyylif luoridi-liuoksella. Virtausnopeus oli 3 ml/tunti ja fraktion koko oli 4 ml. Näytteet laimennettiin 500-kertaisesti TFI-kokeeseen. Fraktiot 66-70 yh-35 distettiin.

18 97298

Kuvio 2. Tämä kuva esittää uitrasuodatuksen Sepha-dex G-75 superhienolla laadulla. iPr2P-Faktori Xe-Affi-Gel kromatografiästä saatu konsentroitu näyte (noin 1 ml) laitettiin Sephadex G-75 superhienoa laatua sisältävään 1 x 5 120 cm:n kokoiseen pylvääseen. Virtausnopeus oli 1,5 ml/ tunti ja fraktion koko oli 1 ml. Näytteet laimennettiin 2000-kertaisesti TFI-kokeeseen. Fraktiot 34-41 yhdistettiin.

Kuvio 3. Tämä kuva esittää Mono-Q ioninvaihtokroma-10 tografian. Asetonisaostuksen jälkeen TFI liuotettiin 6 M urea/0,02 M Tris-HCl, pH 8,3/0,05 % Lubrol PX-liuokseen ja laitettiin samassa puskurissa'tasapainotettuun 1 ml:n Mono-Q pylvääseen. Aloituspuskuripesun jälkeen pylväs eluoi-tiin 30 ml:n gradientilla, joka alkoi aloituspuskurista ja 15 päättyi lopetuspuskuriin (6 M urea/0,5 M Tris-HCl, pH 8,3/ 0,05 % Lubrol PX). Virtausnopeus oli 20 ml/tunti ja fraktion koko oli 1 ml. Näytteet laimennettiin 2000-kertaisesti TFI-kokeeseen. Vaakasuora viiva osoittaa fraktiot, jotka yhdistettiin.

20 Kuvio 4. Tämä kuva esittää puhdistetun TFI:n

NaDodS04/PAGE:n. Puhdistettu TFI (3,75 pg per kaista) ajettiin NaDodS04/PAGE:ssa joko pelkistymättömänä (2 kaistaa) tai pelkistyksen jälkeen 10 % 2-merkaptoetanolilla (1 kaista). (Ylempi) Yksi pelkistymätöntä TFI:tä sisältävä 25 kaista leikattiin geelistä ja pilkottiin ja TFI-aktiivi-suus uutettiin koetta varten. (Alempi) Coomassie blue-vär-jäys pelkistetystä (R) ja pelkistymättömästä (U) TFI:stä. Aloituskohta on vasemmalla.

Kuvio 5. Tämä kuva esittää puhdistetun TFI:n ja 30 normaalin ihmisen seerumin vertailun TFI-kokeessa. Puhdistetun TFI:n laimennokset testattiin TFI:n funktionaalisessa kokeessa ja verrattiin normaalia ihmisen seerumia käyttäen valmistettuun standardisuoraan. y-akselilla on hyytymisen pidentyminen kontrolliarvon yli (39 sekuntia) ja 35 x-akselilla on TFI:n (·, ng/ml) tai normaalin ihmisen see- 19 97298 rumin (o % vol/vol) loppukonsentraatio kokeen ensimmäisessä vaiheessa.

Kuvio 6. Tämä kuva esittää TFI:n vaikutuksen Faktori Xa:han ja trombiiniin. Puhdistettua TFI:tä ja joko 5 Xa:ta tai trombiinia sisältävät reaktioseokset valmistettiin, kuten yllä on kuvattu. Spesifioituina aikoina poistettiin näytteitä ja testattiin jäljelläolevan entsyymiaktiivisuuden suhteen biotestillä. — , trombiini; o—o, Xa; O—O, Xa fosfolipidien ja Ca~ kanssa. Kontrolliseoksissa, 10 joissa ei ollut TFI:tä, ei tapahtunut Xa:n tai trombiinin aktiviteetin häviämistä (ei näytetty).

Kuvio 7. Tämä kuva esittää TFI:n aiheuttaman kudos-faktorin (TF) inhibition. Seokset, jotka sisälsivät VIIa:ta (100 ng/ml), Xa:ta (100 ng/ml), Ca~:ia (4 mM), TF:ää (1 % 15 v/v), TFI:tä (300 ng/ml) antitrombiini III:n (65 pg/ml) ja hepariinin (0,5 yksikköä/ml) läsnäollessa tai ilman niitä, valmistettiin huoneenlämmössä. Spesifioituina aikoina poistettiin näytteitä, laimennettiin ja testattiin jäljelläolevan TF-aktiivisuuden suhteen, o--o, ilman antitrom-20 biini Illatta tai hepariinia; -- , hepariinin kanssa, mutta ilman antitrombiini lila:ta; -- , antitrombiini lila:n kanssa, mutta ilman hepariinia; -- , antitrombiini lila:n ja hepariinin kanssa; avoimet merkit yläosan vaakasuoralla linjalla (100 % aktiivisuus) edustavat vastaavia 25 inkubaatioseoksia ilman TFI:tä.

Esimerkki 2 (Vertailuesimerkki) TFI:n eristys HepG2-solujen säädetystä alustasta suoritettiin kuten ylläolevassa esimerkissä 1 seuraavin muutoksin: 30 1. Eristys suoritettiin oleellisesti kolmivaihei sella menetelmällä tässä aiemmin määritellyn nelivaiheisen menetelmän sijasta.

2. CdCl2-saostusvaiheessa A käytettiin erilaista puskurisysteemiä (katso alla) ja dialyysi jätettiin pois.

20 97298 3. Faktori Xa Affi-Gel 15 affiniteettikromatografia-vaiheessa B käytettiin härän Faktori X,:ta ilman sitomista iPr2P:hen iPr2P:hen sidotun ihmisen Faktori X,:n sijasta.

4. Geelisuodatusvaiheessa C käytettiin Superose 12 5 geeliä Sephadex G-75 geelin sijasta.

Näiden muutosten yksityiskohtaiset olosuhteet olivat seuraavanlaiset:

CdCl7-saostus

Seerumivapaa HepG2-solujen säädetty alusta (4 lit-10 raa) sentrifugoitiin 2500 x g 30 minuuttia partikkeleista muodostuvan roskan poistamiseksi. CdCl2:ta (1,0 M) lisättiin sitten niin, että loppukonsentraatioksi tuli 10 mM ja seosta sekoitettiin 30 minuuttia. Saostuma, joka sisälsi TFI-aktiivisuuden, kerättiin sentrifugoimalla (10000 x g 15 20 minuuttia) ja supernatantti kaadettiin pois. Nappi liuotettiin 80 ml:aan 0,5 M EDTA, 100 KI yksikköä/ml apro-toniini (Sigma)-liuokseen, pH 9,5, ja liukenematon materiaali poistettiin sentrifugaatiolla (10000 x g 20 minuuttia) .

20 Härän Faktori X:n puhdistus Härän Faktori X puhdistettiin härän plasman barium-sulfaattieluaatista (Sigma Chemical Co., St. Louis). 40 yksikköä (kukin 1 litrasta plasmaa) eluaattia liuotettiin uudelleen 1,6 litraan H20:ta ja pH säädettiin 6,0:aan HC1:-.· 25 11a. Lisättiin kuivaa bentsamidiinia niin, että loppukon sentraatioksi tuli 1 mM ja seosta sentrifugoitiin 10000 x g ja 4 °C:ssa liukenemattoman materiaalin poistamiseksi. Sitten näyte laitettiin (100 ml/tunti) 5 x 95 cm:n kokoiseen DEAE-Sepharose pylvääseen, joka oli tasapainotettu 30 0,02 M natriumsitraatti, 1 mM bentsamidiini, 0,02 % NaN3- liuoksessa, pH 6,0, 4 °C:ssa. Kun pylvästä oli pesty 2 litralla aloituspuskuria, se eluoitiin 15 litran gradientil-la, joka alkoi aloituspuskurista ja päättyi 0,8 M NaCl, 0,02 M natriumsitraatti, 1 mM bentsamidiini, 0,02 % NaN3-35 liuokseen, pH 6,0. Härän Faktori Xx:tä ja X2:ta, jotka 21 97298 eluoitulvat proteiini C:n jälkeen, mutta ennen proteiini Z:aa, sisältävät fraktiot yhdistettiin, konsentroitiin noin 40 ml:aan (PM10, Amlcon, Lexington, MA) ja dialysoi-tlin 0,1 M MOPS-puskuriin, pH 7,5. Saanto oli 68 mg puh-5 distettua Faktori X:ää. Faktori Xa tuotettiin aktivoimalla Faktori X liukenemattomalla XCP:llä (Faktori X hyytymis-proteiini Russell'in kyykäärmeen myrkystä).

Härän Faktori X„ Affi-Gel affiniteettikromatoqrafia Näyte laimennettiin samalla tilavuudella 0,1 M 10 NaCl, 0,05 M Tris-HCl, pH 7,5, 0,2 % Lubrol PX-liuosta ja laitettiin virtausnopeudella 4 ml/tunti 2 ml:n Sepharose 4 B agaroosipylvääseen, joka oli kytketty sarjaan 3 ml:n kokoisen, 0,1 M NaCl, 0,05 M Tris-HCl, pH 7,5, 0,1 % Lubrol PX-liuoksella tasapainoteun härän Faktori Xa-Affi-Gel 15 pylvään kanssa. Pylväät pestiin 0,1 M NaCl, 0,05 M Tris-HCl, pH 7,5, 0,1 % Lubrol-liuoksella (20 ml) ja sitten 0,1 M NaCl, 0,05 M Tris-HCl, pH 7,5, 2 % Lubrol PX-liuoksella (20 ml). Sitten ensimmäisenä ollut Sepharose 4 B pylväs poistettiin systeemistä ja härän Faktori Xa-Affi-Gel pyl-20 västä pestiin lisää 0,1 M NaCl, 0,05 M Tris-HCl, pH 7,5, 2 % beta-oktylglukosidi-liuoksella (20 ml) ja eluoitiin 0,5 M bentsamidiini, 0,05 M Tris-HCl, pH 7,5, 2 % beta-oktyl-glukosidi-liuoksella. TFI-kokeella määritetyt TFI:tä sisältävät fraktiot yhdistettiin (kuva 8, fraktiot 62-66) ja 25 konsentroitiin noin 0,4 ml:aan käyttäen YM5 membraania (Amicon Corp., Danvers, Mass.). A280 suuri määrä eluoiduissa fraktioissa johtuu bentsamidiinista.

Superose 12 aeelisuodatus

Konsentroitu näyte (noin 0,4 ml) laitettiin kahteen 30 25 ml :n 1 M NaSCN, 2 % beta-oktylglukosidi, 0,02 M MOPS- liuoksessa, pH 7,0, tasapainotettuun Superose 12 pylvää seen, jotka oli kytketty sarjaan. Pylväät eluoitiin aloituspuskurilla virtausnopeudella 0,3 ml/minuutti. TFI-ak-tiivisuutta sisältävät fraktiot 27-31 tunnistettiin ja 35 yhdistettiin (kuva 9).

• < 22 97298 TFI: n luonnehtiminen

Puhdistetun pelkistetyn TFI-materiaalin SDS-PAGE-natriumdodekyylisulfaattipolyakrylamidigeelielektroforee-si osoitti diffuusin rintaman, jonka näennäinen molekyyli-5 paino oli 39000 daltonia, kun se värjättiin hopeanitraa-tilla. Geelipalojen eluutio osoitti, että funktionaalinen TFI-aktiivisuus kulki yhdessä proteiinirintaman kanssa (kuva 10).

Western-blot 1a värjäys 125I-X.:lla 10 Puhdistettu materiaali sitoutuu Faktori Xa:han.

Superose 12 kromatografiästä saaduille yhdistetyille TFI-fraktioille tehtiin SDS-PAGE ja siirrettiin elektroforeet-tisesti nitroselluloosalle. Seuraava nitroselluloosan in-kubointi 125I-Xa:lla osoitti, että puhdistettu proteiini si-15 toutuu Faktori Xa:han (kuva 11).

Ylläolevan puhdistetun TFI:n eristykseen johtaneen esimerkin 2 laboratoriotyötulosten lisäksi esitetään esimerkkeinä seuraavat yksityiskohtaiset piirrosten kuvaukset kuvista 8-11.

20 Kuvio 8. Tämä kuva esittää härän Faktori Xa-Affi-Gel affiniteettikromatografiän. Fraktiot 1-60 olivat tilavuudeltaan 4 ml ja 60-70 olivat 1 ml tilavuudeltaan. Absor-banssi (A2eo) kuvataan merkillä ·—·, 1000-kertaisesti laimennettujen näytteiden TFI-aktiivisuus kuvataan merkillä 25 o—o.

Kuvio 9. Tämä kuva esittää Superose 12 geelisuoda-tuksen. TFI-aktiivisuuden omaavat fraktiot 27-31 yhdistettiin ja säilytettiin 4 °C:ssa. Absorbanssi (A280) kuvataan yhtenäisenä linjana —, 1000-kertaisesti laimennettujen 30 näytteiden TFI-aktiivisuus kuvataan merkillä o—o.

• Kuvio 10. Tämä kuva esittää puhdistetun, pelkiste tyn TFI:n SDS-PAGE:n. Puhdistettu TFI (2 pg) ajettiin NaDodS04/ PAGE:ssa 10 % 2-merkaptoetanolipelkistyksen jälkeen ja hopeavärjättiin. Molekyylipainomarkkerit näkyvät 35 kilodaltoneina vasemmassa kaistassa. Oikeassa kaistassa «I IN l mil I I ! 23 97298 näkyy pelkistetyn TFl:n diffuusi rintama, jonka näennäinen molekyylipaino on 39000 daltöniä.

Kuvio 11. Tämä kuva esittää pelkistymättömän, puhdistetun TFI:n SDS-PAGE:n ylempänä täplänä, jossa puhdis-5 tettu TFI (2 pg) ajettiin NaDodS04/PAGE:ssa ja hopeavärjättiin. Alempi 125I-Xa täplä osoittaa pelkistymättömän TFI:n (1 pg), joka on siirretty elektroforeettisesti nitrosellu-loosalle, värjätty 125I-Xa:lla ja jolle on suoritettu auto-radiografia. Ylempi osa kuvasta osoittaa TFI-aktiivisuuden 10 uutetuista geelipaloista, jotka on saatu ajettaessa 1 pg TFI:tä SDS PAGE:ssa.

Esimerkki 3 TFI:n eristys useista solulähteistä, nimittäin Chang Liver-soluista, SK-HEP-l-soluista ja HepG2-soluista 15 suoritettiin immunoaffiniteettikromatografialla käyttäen immunogeeninä keinotekoista peptidiä, jolla on tässä aiemmin kuvatun kypsän TFI:n aminohapposekvenssi 3-25, seuraavasti :

Immunisointi 20 TFI-peptidi, joka sisältää kypsän TFI:n aminohappo- sekvenssiä 3-25 vastaavan sekvenssin, syntetisoitiin käyttäen Biosystem'in kiinteäfaasipeptidisynteesiä. TFI-peptidi (5 mg) konjugoitiin 10 mg:aan Keyhole lympet-koti-lon hemosyaniinia glutaraldehydillä. Kaksi Uuden Seelannin 25 valkoista kania kumpikin immunisoitiin ihonalaisella injektiolla käyttäen homogenaattia, joka sisälsi 1 ml Freun-din täydellistä adjuvanttia ja 1 ml konjugaattia (200 pg TFI-peptidiä). Kuukautta myöhemmin kummallekin kanille tehtiin uusi immunisaatio homogenaatilla, joka sisälsi 1 30 ml Freundin epätäydellistä adjuvanttia ja 1 ml konjugaattia (100 pg TFI-peptidiä). Antiseerumia kerättiin joka viikko siitä lähtien. Uusi injektio annettiin kuukausittain kunnes kaneista päästettiin veri pois 3 kuukauden kuluttua.

24 97298

Anti-TFI-peptidi-Ia;n eristys

Synteettinen TFI-peptidi (3 mg) kiinnitettiin 0,8 g:aan CNBr-aktivoitua Sepharose 4 B:tä käyttäen valmistajan julkaisemia ohjeita (Pharmacia). Spesifisen vasta-ai-5 neen eristämiseksi yhdistetty antiseerumi (15 ml) sekoitettiin saman tilavuuden kanssa liuosta (PNBT), joka sisälsi PBS:ää, 0,4 M NaCl:ia, 0,1 M bentsamidiinia ja 1 % Triton X-100:aa ja suoritettiin kromatografia TFI-peptidi Sepharose 4 B pylväässä huoneenlämmössä. Pylväs pestiin 30 10 ml:11a PNBT-liuosta ja sitten samalla liuoksella ilman Triton X-100:aa. Kiinnittynyt vasta-aine eluoitiin 0,1 M glysiini/HCl-liuoksella, pH 2,2, neutraloitiin välittömästi lisäämällä 1/10 osa tilavuutta 1 M Tris-0H:ta ja dialy-soitiin voimakkaasti suolaliuosta vastaan. 15 ml:sta an-15 tiseerumia eristettiin noin 6,5 mg anti-TFI-peptidi Ig:ia.

Soluvin elv

Chang Liver-, SK hepatooma- ja HepG2-soluja kasvatettiin konfluenteiksi Dulbecco'n modifioidussa Eagle'n alustassa (DMEM), johon oli lisätty 10 % härän sikiön see-20 rumia, 50 yksikköä/ml penisilliiniä ja 50 pg/ml streptomysiiniä 175 cm2 pulloissa. Viisi pulloa kutakin solulinjaa trypsinoitiin ja käytettiin yhden 10-kammioisen solukas-vattimen (Nunc) nuorennukseen. Kun oli saavutettu kon-fluenssi (noin 1 viikko), solut pestiin PBS:llä kaksi ker-25 taa ja inkuboitiin seerumivapaassa alustassa. Seerumivapaa alusta koostui DMEM:stä, johon oli lisätty 0,5 % laktalbu-miinihydrolysaattia, 50 yksikköä/ml aprotiniinia, ennakkoon valmistettua ITS-seosta (insuliini-transferriini-se-leeni, Collaborative Research'in tuote), 20 ng/ml maksa-30 solun kasvutekijää (glysyyli-histidyyli-lysiini) ja 100 ng/ml forboli-12-myristaatti-13-asetaattia. Seerumivapaa alusta vaihdettiin tuoreeseen alustaan joka 3:s päivä. Soluja voidaan ylläpitää näissä olosuhteissa >2 kuukautta. Yhdistetyt säädetyt alustat tehtiin 0,02 %:ksi NaN3:n suh-35 teen ja 0,01 %:ksi Triton X-100:n suhteen ja säilytettiin 4 °C:ssa. Jotkin alustat konsentroitiin 20-100-kertaisesti il »HM *1«! IM#» - 25 97298 ultrasuodatuksella käyttäen Amicon'in YM30 spiraalimem-braanisysteemiä.

TFI:n immunoaffiniteettipuhdistus

Eristetty anti-TFI-peptidi-Ig (20 mg) kiinnitettiin 5 2 g:aan CNBr-aktivoitua Sepharose 4 B:tä valmistajan jul

kaisemien ohjeiden mukaisesti. Geelin tilavuus oli 7 ml. TFl:n eristämiseksi Chang Liver-, SK hepatooma- tai HepG2-solujen säädetylle alustalle (konsentroimattomalle tai konsentroidulle) suoritettiin kromatografia anti-TFI-pep-10 tidi-Ig Sepharose 4 B pylväässä nopeudella 2 ml/minuutti kylmähuoneessa kunnes oli havaittavissa merkittävää TFI-aktiivisuutta läpivirranneessa nesteessä. Pylväs pestiin sitten 70 ml:11a PNBT-liuosta ja 70 ml:11a samaa liuosta ilman Triton X-100. Kiinnittynyt TFI eluoitiin 0,1 M gly-15 siini/HCl-liuoksella, pH 2,2 ja konsentroitiin noin 0,6 ml:aan vakuumidialyysillä 0,1 M glysiini/HCl-liuosta, pH

2,2, vastaan.

Tulokset Käyttäen immunoaf finiteettikromatografiaa anti-TFl-20 peptidi-lg Sepharose 4 B pylväässä TFI eristettiin useista maksasoluista johdetuista solulinjoista, Chang Liver-, SK hepatooma- ja HepG2-soluista. Kuva 12A esittää anti-TFI-peptidi-Ig Sepharose pylväästä eluoitujen proteiinien SDS-PAGE:n. Eri preparaateissa voidaan havaita hiukan erilai-25 set proteiiniprofiilit. Joissain preparaateissa 40 kD:n proteiini on ainoa yleinen proteiini (kaistat 4 ja 5); toisissa on useita proteiinirintamia ja 38 kD:n proteiinin rintama on hallitseva 40 kD:n proteiinin sijasta. Jotta saataisiin selville, mitkä proteiinit ovat TFI:n sukulai-30 siä, suoritettiin 125I-Xa sitoutumiskoe. Eristetyt TFI-näyt-teet ajettiin elektroforeesissa 12 % SDS-polyakrylamidi-geelissä ja proteiinit siirrettiin sitten elektroforeet-tisesti nitroselluloosapaperille ja seulottiin 125I-X, si-toutumisaktiviteetin suhteen. Havaittiin, että kolme ylei-35 sintä rintamaa, joiden näennäiset molekyylipainot olivat 40, 38 ja 25 kD, omasivat 125I-X, sitomisaktiivisuuden, kun 26 97298 taas muut rintamat eivät omanneet (kuva 12B). SK hepatoo-ma-solujen 38 kD:n rintaman sekvenssianalyysi osoittaa, että se omaa saman aminopään sekvenssin kuin 40 kD:n TFI, joka oli eristetty HepG2-soluista ylläolevassa esimerkissä 5 1. Perustuen immunoaffiniteettiin, aminohapposekvensoin- tiin ja 125I-Xa sitoutumiskokeisiin vaikuttaa siltä, että 40, 38 ja 25 kD:n inhibiittorit voivat olla peräisin samasta molekyylistä.

TFI:n eristykseen useista solulinjoista immunoaffi-10 niteettikromatografialla johtaneen ylläolevan laboratoriotyön tulosten lisäksi esitetään esimerkkeinä seuraavat yksityiskohtaiset piirrosten kuvaukset kuvista 12(A) ja 12(B).

Kuvio 12. Tämä kuva esittää immunoaffiniteetillä 15 eristetyn TFI:n SDS-PAGE:n ja 125I-Xa sitomisaktiivisuuden seulonnan. (A) SDS-PAGE. Elektroforeesi suoritettiin 12 % polyakrylamidigeelissä. Kaista 1, molekyylipainomarkkerit;

kaista 2, Chang Liver TFI; kaista 3, SK hepatooma TFI

(preparaatti 1); kaista 4, SK hepatooma TFI (preparaatti 20 2); kaista 5, HepG2 TFI (preparaatti 1); kaista 6, HepG2 (preparaatti 2). (B) 125I-Xa sitomisaktiivisuuden seulonta.

Näytteet ajettiin 12 % polyakrylamidigeelielektroforeesis- sa. Proteiinit siirrettiin elektroforeettisesti nitrosel- 9 luloosapaperille käyttäen Bio-Rad Trans-Blot -laitetta ja 25 -menetelmää. Siirron jälkeen nitroselluloosapaperia ensin heiluteltiin varovaisesti PBB-liuoksessa (PBS, joka sisältää 5 mg/ml BSA:ta ja 2,5 mg/ml härän gammaglobuliinia) ja sitten PBB-liuoksessa, joka sisälsi 400 ng/ml 125I-Xa:ta, kumpikin ravistelu suoritettiin huoneenlämmössä 1 tunti.

30 Sitten nitroselluloosapaperi kuivattiin ja suoritettiin autoradiografia 3 vuorokautta käyttäen Kodak XAR-5 filmiä. Kaista 1, Chang Liver TFI; kaista 2, SK hepatooma TFI (preparaatti 1); kaista 3, SK hepatooma TFI (preparaatti 2); ja kaista 4, HepG2 TFI (preparaatti 2).

35 Useat muut esimerkit ovat ilmeisiä alan tuntevalle henkilölle esillä olevan hakemuksen luettuaan, niiden esimerkkien kuitenkaan poikkeamatta esillä olevan keksinnön luonteesta ja piiristä.

Claims

97298 Patenttivaatimus Menetelmä kudosfaktorin inhibiittorin (TFI) eristämiseksi, tunnettu siitä, että SK-HEP-l-solujen 5 tai Chang-maksasolujen säädetty alusta saatetaan immunoaf-finiteettipuhdistukseen, jossa vasta-aineena käytetään anti-TFI-peptidi-immunoglobuliinia, joka on saatu käyttämällä immunogeeninä TFl-peptidiä, jolla on aminohapposekvenssi :
10 Glu-Glu-Asp-Glu-Glu-His-Thr-Ile-Ile-Thr-Asp-Thr- Glu-Leu-Pro-Pro-Leu-Lys-Leu-Met-His-Ser-Phe ja vasta-aineeseen sitoutunut kudosfaktorin inhibiittori otetaan talteen. 15
20 Förfarande för isolering av en vävnadsfaktorinhibi- tor (TFI), kännetecknat därav, att ett kondi-tionerat medium frän SK-HEP-l-celler eller Chang-levercel-ler underställs immunoaffinitetsrening, där man som anti-kropp använder anti-TFI-peptid-immunoglobulin, som erhäl- 25 lits genom att som immunogen använda en TFI-peptid med aminosyrasekvensen Glu-Glu-Asp-Glu-Glu-His-Thr-Ile-Ile-Thr-Asp-Thr-Glu-Leu-Pro-Pro-Leu-Lys-Leu-Met-His-Ser-Phe ooh den tili antikroppen bundna vävnadsfaktorinhibitorn 30 tas tillvara. * t »