PT87505B - Processo para a producao de um polipeptido determinado em um organismo hospedeiro transformado por um adn recombinante contendo sequencias nucleicas que codificam para este polipeptido e para uma proteina afim para uma ose, e suas aplicacoes, em particular para a preparacao de composicoes de vacina - Google Patents

Description

INSTITUT PASTEUR e INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA

PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE UM POLIPEPTIDO DETERMINADO EM UM

ORGANISMO HOSPEDEIRO TRANSFORMADO POR UM ADN RECOMBINANTE CONTENDO SEQUÊNCIAS NUCLEICAS QUE CODIFICAM PARA ESTE POLIPEPTIDO E PARA UMA PROTEÍNA AFIM PARA UMA OSE, E SUAS APLICAÇÕES, EM

PARTICULAR PARA A PREPARAÇAO DE COMPOSIÇQES DE VACINA

A presente invenção diz respeito a um processo para a produção de um polipéptido ou de uma proteína com determinadas propriedades escolhidas, mediante cultura de um organismo-hospe deiro previamente transformado por um ADN recombinante contendo sequências que codificam para este polipéptido e para uma prote£ na afim para uma ose. Uma forma preferida do processo de acordo com a presente invenção comporta uma etapa suplementar de p£ rificação deste polipéptido compreendendo o contacto deste polipéptido com uma ose insolubi1izada.

A presente invenção diz igualmente respeito aos vectores contendo o ADN recombinante referido antes, assim como ãs cult£ ras de células transformadas por estes vectores, e suas uti li za_ ções, particularmente para a produção de composições de vacina.

Varias técnicas foram descritas para a produção de um polipéptido ou de uma proteína por organismos-hospedeiros previ£ mente transformados por um vector apropriado ele mesmo modifica do por uma sequência de inserção contendo um ácido nucleico que codifica para este enzima ou esta proteína, convenientemente co

-2locada sob o controlo de elementos de regulação, particularmente um promotor, autorizando a expressão deste ãcido nucleico no organismo-bospedeiro transformado. Uma vez o gene (ou o vector que o contenha) colocado no devido lugar, torna-se uma fonte permanente de polipéptidos.

Esta aproximação genética para a concepção de novos polipeptidos possui vãrios inconvenientes: o polipeptido pode ser degradado ¹¹ in vivo , ser toxico para a célula-hospedeira ou ser difícil de purificar a partir de extractos bacterianos. Foi jã proposto contornar o problema da degradação, particularmente quaji do o hospedeiro celular escolhido é E. coli¹¹ , mediante fusão do polipeptido estranho a uma proteína estável, por exemplo ã ^-galactosidasa, que serve de vector. A fusão de um polipeptido com uma proteína vector, via os seus genes que codificam, pode igualmente facilitar a purificação deste polipeptido se a proteí na vector conservar a sua actividade no híbrido e se for fácil de purificar, por exemolo mediante uma cromatografia de afinidai de. A ^-galactosidase, a proteína A de S. aureus e imunoglobulinas foram utilizadas para este fim. A introdução, na junção entre as duas sequências nucleicas, de sequências específicas , permite a clivagem do polipeptido enxertado apos purificação da proteína híbrida.

Outras soluções foram igualmente propostas. Citar-se-ã para memória as técnicas em que a sequência que codifica para o polipeptido estranho foi fundida com uma sequência sinal visando permitir a exportação do polipeptido estranho fora do citoplasma do hospedeiro celular, para evitar o efeito tóxico possível do polipeptido estranho em relação ao hospedeiro celular. Foi ioual_ mente proposto obviar o possível efeito toxico do polipeptido

-3estranho, colocando o gene que codifica sob o controlo de um promotor normalmente reprimido, sendo este promotor em seguida desreprimido na fase terminal de crescimento da cultura celular para induzir então a síntese do polipeptido estranho.

Uma outra dificuldade frequentemente encontrada reside na conservação da actividade do polipeptido estranho assim produzido, por exemplo quando este polipeptido consiste em um enzi_ ma. A este respeito, a técnica referida antes, que consiste em fundir a sequência que codifica para o polipeptido estranho com uma sequência sinal, tem igualmente, em certos casos, sido proposta para se obter a replicação normal do polipeptido estranho em um meio menos redutor que o citoplasma celular, parti cul armeji te quando o hospedeiro celular utilizado pertencer a uma espécie bacteriana. Mas, até hoje, não foi frequentemente possível reme: diar estas dificuldades, sobretudo quando o polipeptido estranho demonstrou ser de um tamanho muito considerável. Finalmente as tentativas para promover o transporte de uma proteína citoplasmatica, a partir do citoplasma para a região periplasmãtica das bactérias transformadas nas condições referidas antes, malogra-tse geralmente, permanecendo a proteína ci topl asmãtica imobi_ lizada ou bloqueada nas membranas mesmo das bactérias.

Do mesmo modo, as purificações finais foram até hoje di_ fíceis de realizar. Por exemplo, no caso das proteínas híbridas, nem sempre ê fácil separar as proteínas híbridas correctamente replicadas - e activas - das proteínas incorrectamente replicadas e inactivas que puderam ser simultaneamente produzidas pelo mesmo organismo-hospedeiro.

Além disso, no caso de purificações de proteínas produzidas mediante técnicas cromatográficas ou análogas, utilizan-4 do moléculas afins para as proteínas a purificar, fixadas sobre um suporte solido adequado, nem sempre se exclui que algumas destas moléculas afins não sejam separadas ao mesmo tempo que as proteínas selectivamente retidas, durante as operaçoes de eluição finàl.Mesmo que as proporções de moléculas afins, assim separadas, possam ser extremamente pequenas, elas podem contribuir para contaminar o produto final de um modo nefasto, em relação às aplicações para que as proteínas assim purificadas podem constituir em seguida o objectivo. Sabe-se igualmente que a própria preparação das colunas de afinidade, para estas purificações, e quase sempre delicada e dispendiosa, sobretudo quaji do se demonstrar que a redução a um mínimo dos inconvenientes a_n teriormente mencionados constitui um imperativo essencial.

A presente invenção tem por objectivo fornecer um proce.s so de engenharia genética que permite remediar, melhor do que o frequentemente possível até hoje, as dificuldades mais particularmente referidas antes, de aplicação fácil, relativamente po£ co dispendioso e muito eficaz, para produzir um polipéptido co_n tendo uma cadeia peptídica possuindo as propriedades escolhidas, susceptíveis de ser em seguida completamente expressas.

Assim, a presente invenção diz respeito a um processo para a preparação e a purificação de um polipéptido contendo uma determinada cadeia peptídica possuindo propriedades escolhidas, que compreende uma etapa que consiste em provocar a expressão em um organismo-hospedeiro apropriado transformado e cultivado para este efeito, de um acido nucleico recombinante em fase de leitura aberta compreendendo uma sequência que codifica para a cadeia peptídica e uma ou varias sequências distintas que codificam para uma ou varias partes do polipéptido vector, e uma etapa para

-5a recuperação do polipéptido híbrido expresso pelo acido nuclei_ co recombinante sob a forma de um extracto a partir do referido hospedeiro celular e uma etapa de purificação, caracterizado pe. lo facto de o polipéptido vector ser uma proteína afim para pelo menos uma ose determinada, em que as referidas uma ou varias sequências que codificam para uma ou várias partes do polipepti_ do vector são tais que as propriedades de transportes fora do citoplasma e de afinidade para a ose determinada do polipéptido vector intacto são conservadas no referido polipéptido híbrido, em que a etapa de purificação compreende o contacto entre o extracto do polipéptido híbrido e uma ose correspondente sob uma forma insolubi1izada compatível com a afinidade mutua da proteína afim e da ose, particularmente uma ose polimerizada, e pelo facto de se recuperar, apos separação dos compostos não fixados sobre a ose, o polipéptido híbrido contendo a referida cadeia peptídica determinada.

processo de acordo com a presente invenção compreende igualmente, com vantagem, uma etapa suplementar para a recupera, ção da referida cadeia peptídica determinada a partir do polipeR tido híbrido e que sera desenvolvida mais adiante.

De acordo com um modo de realização do processo de acor do com a presente invenção, o acido nucleico recombinante compreende uma sequência nucleica que codifica para o polipéptido vector colocado inteiro a jusante, ou a montante, da sequência nucleica que codifica para a cadeia peptídica determinada.

acido nucleico recombinante compreende, com vantagem, uma primeira sequência nucleica que codifica para uma primeira parte do polipéptido vector colocado a montante da sequência nu

-6cleica que codifica para a cadeia peptídica determinada, e uma segunda se ^quencia nucleica que codifica para uma segunda parte do pol ipéjo tido vector, colocada a jusante desta ultima sequência, represen_ tando as primeira e segunda partes referidas antes a totalidade do polipépti do vector quando elas estiverem reunidas. As condi_ ções em que a sequência nucleica que codifica para a cadeia pejo tidica determinada e introduzida entre duas partes da sequência nucleica que codifica para o polipe^ptido vector sem, para tanto, ✓

modificar as funções de transporte fora do citoplasma do polipejo tido vector assim modificado, nem a afinidade deste ultimo para a ose determinada, estão mais particularmente descritas no pedi_ do de patente de invenção europeia ηθ 87 400 .505.4 depositado em 6 de Março de 1987 ou os pedidos de patence de invenção correspondentes depositados noutros países e em (11). Os sítios localizados sobre a sequência nucleica que codifica para o polipéptido vector, e ao nível dos quais a sequência nucleica que codifica para a cadeia oeptídica determinada pode ser inserida sem para tanto modificar as funções características do polipéptido vector determinado antes, são designados no que se segue pela expressão sítios permissivos.

Um polipéptido vector particularmente preferido e constituído pela proteína MalE.

A proteína MalE e uma proteína de 370 aminoScidos que e codificada pelo gene malE de _E. col i¹¹. 0 seu promotor, malEp , e um promotor forte que ê activado pela proteína MalT na preseji ça de um indutor maltose e reprimido pela glucose. Estes controlos operam ainda quando ma 1E e o seu promotor são transpor; tados por um plasmídeo com copias múltiplas, como pPDl, cuja preparação foi descrita em (1).

Ma7E é uma proteína abundante. £ exportada no periplas. ma bacteriano por intermédio de um péptido sinal N-terminal que e cortado durante a exportação (2). MalE é uma proteína afim para a maltose e os mal todextrin.as, que ê necessária ao transpor te destes açucares através do invólucro bacteriano. MalE, do mesmo modo que o seu precursor, pode ser purificada em uma etapa mediante cromatografia de afinidade sobre amilase com pontes por tratamento com epicloridrina. A proteína é eluída por competição com maltose 10 mM (3).

Demonstrou-se igualmente que esta proteína pode ser modificada em alguns dos seus sítios, sem que pôr isso perca algumas das suas actividades. Referir-se-á particularmente o artigo de DUPLAY e colab. (4). Este artigo e todos os outros documentos identificados no fim deste texto devem ser considerados como fazendo parte integrante desta descrição, do mesmo modo que os seus conteúdos respectivos servem para a completar, quanto a na_ tureza e ã estrutura dos compostos iniciais a partir dos quais a presente invenção foi produzida.

A este respeito, recorda-se que DUPLAY e colab. inseriram ao acaso um adaptador (linker) BamHI no gene malE de um plasmídeo pPO-j que o contém. Dois dos plasmídeos modificados por estas inserções, malE91 e malE40 mudam o quadro de leitura e conduzem ã síntese de proteínas modificadas possuindo 362 (respectivamente 369) aminoácidos N-terminais de MalE e uma extensão C-terminal de 12 (respectivamente 27) aminoácidos. Uma terceira inserção, mal EI 27 , na sequência sinal, impede a exportação da proteína MalE no periplasma (4).

A presente invenção fornece pois um processo particular

-8-/ mente eficaz para produzir, por engenharia genética, e purificar qualquer cadeia peptídica ou proteína determinada, e isto graças a um vector recombinante obtido por construção, em que uma sequência nucleica que codifica para a referida proteína foi co locada a jusante da sequência que codifica para o polipétido ve£ tor, particularmente para a proteína MalE, ela própria colocada sob ocontrolo de um promotor eficaz.

A construção do vector recombinante utilizado no processo referido antes de acordo com a presente invenção, pode igualmente ser realizada de maneira que esta sequência nucleica que codifica para a proteína determinada fique situada a montante da sequência do ADN que codifica para o polipéptido vector, particjj larmente para a proteína MalE, e a jusante de um promotor eficaz da expressão da sequência do ADN que codifica para a rferida pro. teína seguida da que codifica para MalE.

De acordo com um modo de realização do processo segundo a presente invenção, o organismo-hospedeiro utilizado para esta preparação consiste numa bactéria E. coli¹¹, caso em que ê vantajoso recorrer ao próprio gene malΕ , o qual compreende então igualmente o promotor endógeno correspondente malEp. Na hipótese anterior, a etapa de purificação compreende o contacto da ose insolubi1izada correspondente à proteína MalE, com vantagem com uma maltodextrina insolubi1izada ou uma amilose com pontes obtidas nas condições jã referidas antes. A utilização do par de características:-!. produção da proteína pretendida com a ajuda de um vector contendo a sequência de codificação fundida com o gene malE -2. purificação mediante contacto com maltose ou g1_u cose levada ao estado polimerizado, ê vantagem para muitos efeitos. Ao nível da produção, utiliza-se com vantagem a capacidade

-9do gene malE para se exprimir de um modo abundante em E. co1 i¹¹ e simultaneamente a capacidade da glucose ou da maltose insolubilizada para permitir a separação das proteínas híbridas isoladas tendo conservado a capacidade afim da proteína MalE natural ou selvagem. E notável que se pode, graças a estes ve£ tores, obter igualmente uma proteína híbrida, na qual a parte correspondente 5 proteína pesquisada conserva a actividade desta última, manifestando-se esta actividade directamente ou apos restituição, como sera demonstrado nos exemplos descritos adi a_n te, com determinadas proteínas de grande tamanho, tais como as nucleases (150 aminoãcidos) e o fragmento de Klenow de uma pol£ merase (650 aminoacidos) utilizados como modelos experimentais.

Importa naturalmente que a sequência nucleica que codifica para a proteína pesquisada seja inserida em uma região conveniente do gene malE, para que sejam conservadas no seio da e£ trutura desta última as propriedades afins para a maltose da pro teína MalE e a actividade pretendida para a proteína determina^ da a ser sintetizada. Para este fim, e vantajoso que a sequência nucleica que codifica para a proteína determinada seja col£ cada a jusante, ou a montante, da sequência que codifica para a proteína MalE em relação ao sentido da transcrição do gene recombinante. Esta condição não e contudo, de maneira nenhuma, imposta » A determinação da localização mais vantajosa da inserção da sequência que codifica para a proteína pretendida no gene malE pode ser determinada particularmente de acordo com a técnica de inserção ao acaso da sequência que codifica para uma determinada cadeia peptídica descrita no pedido de patente de invenção europeia referida antes.

 capacidade de purificação absolutamente notável que

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F^!' permite o sistema de acordo com a presente invenção, acrescentã-se ainda a grande flexibilidade dos vectores preferidos referidos antes, pelo que se pode escolher a região da bactéria em que a proteína híbrida produzida é transportada, seja no citoplasma, seja no periplasma (pelo menos quando a natureza da própria proteína híbrida não interdite o transporte nesta ultima região). Esta escolha estã sob o controlo do utilizador, gr£ ças a possibilidade que ele tem de se assegurar 5 vontade do transporte da proteína híbrida formada, seja no periplasma (desde que este transporte seja possível pelas razões evocadas antes) utilizando as propriedades específicas a este respeito da sequência sinal normalmente intercalado no gene malE entre a sequência que codidica e o promotor, isto é assegurando que de qualquer modo a proteína híbrida não sera transportada para alem da região citoplasmatica, graças a introdução de uma mutação ne£ ta sequência sinal, mutação essa cujo efeito sera precisamente impedir exportação da proteína híbrida no periplasma. No primeiro caso, a proteína híbrida poderá ser facilmente recuperada a partir do periplasma, particularmente submetendo as bactérias transformadas a um choque osmÕtico, por exemplo nas condições descritas em (4). No outro caso, a proteína híbrida serã recuperada a pa_r tir do citoplasma apos ruptura completa das paredes bacterianas, por exemplo no fim de um tratamento com detergentes ou com a ajuda de meios mecânicos ou enzimaticos bem conhecidos do enten. dido na matéria. Esta segunda alternativa, certamente de utili_ zação menos pratica, sera contudo preferida, desde que se pretenda proteger a bactéria contra o stress que poderá ser ger£ do pela tendência natural ao transporte da proteína híbrida no periplasma sob o efeito da sequência sinal não mutada, quando este mesmo transporte se reconheça difícil em virtude da própria estrutura híbrida.

processo de acordo com a presente invenção permite, de um modo notável - para as proteínas que são efectivamente transportáveis através da membrana bacteriana que separa as regiões citoplasmatica e periplasmatica do organismo—hospedeiro - a exportação no periplasma de proteínas normalmente citoplasmaticas , portanto com um grande coeficiente de purificação, antes de qualquer contacto com a ose insolubi1izada , ou contacto com qualquer outra técnica de purificação suplementar.

A presente invenção diz portanto mais particularmente re£ peito , como variante, ao processo para a produção e purificação definido antes, no qual a etapa de purificação por contacto com a ose-insolubi1izada ê omitida, e isto mais particularmente qua_n do a cadeia peptídica pretendida consiste na totalidade ou em parte numa proteína citoplasmatica, ou seja numa proteína não excretada pelo seu hospedeiro natural; e isto mais parti cul armeji te no caso em que o organismo- hospedeiro e uma bactéria.

Uma outra vantagem ainda do sistema preferido descrito antes reside no caracter indutível ou reprimível a vontade do promotor malEp , em que as capacidades de activação na preseji ça do indutor maltose e de repressão na presença de glucose foram ja recordadas antes. E particularmente vantajoso realizar o crescimento das culturas bacterianas previamente transformadas na presença de doses de glucose que não interfiram com a capaci_ dade de desenvolvimento das culturas, mas suficientes para evitar a expressão do gene recombinante, sendo a cultura em seguida subtraída ã acção da glucose, logo que ela atinja o estado /

de desenvolvimento pretendido e que a expressão do gene recombj_ nante, por consequência com a produção da proteína híbrida, seja a desejada. Nestas condições, protege-se a cultura bacteri_a na em desenvolvimento contra o eventual efeito toxico da proteí na hTbrida formada, sendo esta ultima produzida em quantidades importantes apenas no termo do estádio de desenvolvimento da cultura inicialmente pretendido.

Por outro lado, e vantajoso realizar todas estas operaçoes a uma temperatura inferior a 37 C, particularmente a uma temperatura compreendida entre 28° e 35°C, por exemplo a cerca de 30°C. 0 eventual efeito toxico da proteína hTbrida encontra-se então diminuído.

Ainda que seja vantajoso recorrer ao gene mal E natural para a construção do ADN recombinante, e imediatamente evidente para o entendido na matéria que estas condições não são de manej_ ra nenhuma limitativas. Em particular, o promotor malEp pode ser substituído por construção por qualquer outro promotor eficaz reconhecido pela bactéria. Em particular, pode-se recorrer a qualquer promotor forte cuja actividade constitutiva possa ser reprimida ou ainda por qualquer promotor forte indutível mediaji te regulação apropriada das condições de cultura das bactérias transformadas. A título de exemplo de promotores que poderão deste modo ser substituídos por construção no promotor malEp , para se obter uma expressão em E_. col i¹¹ , menciona-se os promotores PL e PR do fago λ , o promotor tac indutível pelo IPTG (isopropil-^-tiogalactosido), os promotores do operão lactose , do operão triptofano, dos promotores mistos derivados dos anteriores, etc.

L

13E evidente que a expressão sequência que codificapara a pro teína MalE deve ser considerada como respeitante tanto ã sequência que codifica para a proteína selvagem como para as proteínas MalE modificadas, com a condição de se conservar a afinidade caracteristica para a ose correspondente. E absolutamente obvio que esta expressão diz igualmente respeito ãs sequências de aci. dos nucleicos que diferem das anteriores, por substituições de nucleotidos sem alterar a estrutra da proteína correspondente.

Deste ponto de vista, a presente invenção diz igualmente respei. to ã utilização de sequências de ácidos nucleicos produzidos par cialmente ou totalmente de um modo sintético, utilizando a dege. nerescencia do codigo genético.

Alem das bactérias Gram”, tais como JZ. co 1 i¹¹ referida antes, qualquer outro hospedeiro utilizável nas técnicas de engenharia genética pode assim ser utilizado, desde que os vectores utilizáveis para a transformação estejam disponíveis ou pos. sam ser conheci dos . Menci onar-se-«ã, a título de exemplo, outros ti_ pos de bactérias em que MalE se possa utilizar como suporte para purificar proteínas, as bactérias Gram+, por exemplo ¹¹B. subtilis, ou as corinobactérias ou ainda leveduras ou células eucariotas superiores, particularmente de mamíferos. Naturalmente , a sequência que codifica a proteína MalE devera, em cada caso , ser colocada por construção sob o controlo de um promotor apropriado para a sua expressão no organismo-hospedeiro . Em cada caso, a operação de purificação que se segue permite separarefi_ cazmente as proteínas híbridas pretendidas, graças a sua afinj_ dade para a ose insolubi1izada correspondente.

No que respeita ã expressão de MalE nas bactérias Gram+, os inventores demonstraram que a proteína MalE, apresenta uma

-14t forte homologia com a proteína MalX de Streptococcus pneumoniae¹¹. Esta proteína MalX e indutível pela maltose, e desempenha provavelmente um papel na captura das maltodrexinas, tais como a maltotetraose, nas bactérias Gram⁺ (12, 13). MalX e uma proteina ligada a membrana das bactérias Gram , diferindo de MalE que se situa no periplasma das bactérias Gram . A proteína MalX é sintetizada sob a forma de um precursor, exportado para fora do citoplasma, e a transformação da cisteína aminoterminal em acido aminado lipofílico é provavelmente responsável pela ancoragem de MalX no exterior da membrana citoplasmatica das bactérias Gram⁺. Um estudo comparativo entre as proteínas MalE e MalX será mais particularmente detalhado nos exemplos que se seguem.

A expressão da proteína MalE nas células eucariotas será mais particularmente detalhada nos exemplos descritos adiante. A utilização de células eucariotas oferece particularmente a vantagem de fabricar proteínas que necessitam, para a sua fun ção, de ser glicosi1adas, ou de possuirem pontes de dissulfure to, ou proteínas dificilmente exportadas nas bactérias.

No que antecede, a presente invenção foi descrita mais particularmente em relação a sequência nucleica que codifica pa ra uma proteína MalE. Contudo, a presente invenção não se 1 imi_ ta a utilização de vectores recombinantes incluindo uma sequência nucleica que codifica para esta proteína. A presente inven ção estende-se igualmente a utilização de qualquer outra proteí na-vector , desde que apresente uma actividade marcada para uma ose. Mencionar-se-ã a título de exemplo para a produção de ADNs recombinantes necessários a utilização, para a produção da proteína determinada pretendida, da sequência nucleica que codifica para a proteína MalX afim para a maltose nas bactérias Gram⁺

-15sequencias nucleicas que codificam para as proteínas afins da arabinose, da galactose, da ribose, etc., compreendendo então as operações de purificação correspondentes o contacto ulterior das proteínas híbridas assim produzidas com as oses respectivamente adicionadas no estado insolubi1izado , particularmente mediante polimerização, se necessário com um agente de reticulaçao tal como a epicloridrina ou qualquer outro agente que permita ao mesmo tempo a realização desta polimerização e a conservação das afinidades mutuas da ose e da proteína afim para esta ose.

A este respeito, ê necessário ainda sublinhar a vantagem essencial que representa a utilização de colunas de ose insolubi_ lizada, nesse caso funcionais como colunas de cromatografia afim, ao nível da inocuidade posterior dos compostos que podem ser se parados por técnicas de eluição usuais, apos terem sido previamente fixadas de um modo selectivo sobre estas colunas. Os com postos constitutivos destas colunas são normalmente desprovidos de qualquer toxicidade e a sua utilização sera de um interesse muito particular para a produção de proteínas ou de polipéptidos com aplicação em medicina humana ou veterinária.

Alem disso, a capacidade de retenção seletiva destas colunas é muito importante visto ser a própria matriz dos compostos insolubi1izados postos em contacto que possui a afinidade para o polipéptido vector selectivamente ligado ao composto pre tendido, contrariamente ãs colunas de cromatografia de afinidade clássicas, em que a matéria constitutiva da coluna é formada por um material de suporte, normalmente inerte em relação ãs pro. teínas ou polipéptidos a isolar, sobre o qual foram previamente fixadas moléculas ou compostos com a afinidade pretendida relativamente aos compostos a separar.

Os polipêptidos ou proteínas híbridas podem em seguida ser recuperadas a partir da ose insolubi1izada , particularmente mediante eluição com uma solução combinando um princípio que permita o seu deslocamento. Esta solução contém, de preferência, a ose solúvel correspondente, neste caso maltose, visto que o pol ipêptido vector e derivado da proteína MalE, ou MalX.,

Anteriormente a etapa de purificação em coluna de ose das proteínas híbridas, estas últimas são recuperadas a partir do peri_ plasma das bactérias Gram (como se precisou antes no caso da uti_ lização de MalE), ou ao nível das membranas das células hospdeiras após lavagem com uma solução apropriada, ate mesmo a partir do citoplasma das referidas células hospedeiras apos ruptura das membranas destas últimas. E necessário precisar que para as proteínas híbridas contendo um polipéptido vector, tal como a proteí na MalX, que permanece ancorada ã superfície da membrana das bactê rias Gram⁺ , ê particularmente vantajoso prever a inserção de uma sub-sequência nucleica que codifica para uma sequência de aminoãcidos especificamente clivavel por um determinado enzima, ou por um processo químico, ao nível aminoterminal da proteína MalX (particularmente a jusante da cisteína aminoterminal referida antes).

tratamento da membrana celular com o enzima ou processo químico que cinde especificamente a sequência de aminoácidos referida aji tes, conduz a libertação da proteína híbrida. A proteína híbrida contendo MalX nas bactérias Gram⁺, pode obter-se igualmente , directamente, mediante modificação da parte aminoterminal da sequência nucleica que codifica para MalX, de maneira que a proteí na híbrida ão se fixe ã superfície da membrana da bactéria.

Na descrição anterior não se evocou o caso da purificação das proteínas híbridas contendo o polipéptido ou a proteína

-1 7-.

pretendi dos .

Por outro lado, é necessário sublinhar que a proteína híbrida pode formar ela própria o polipéptido pretendido, de cada vez que se pretenda beneficiar da conservação de propriedades próprias do polipéptido vector ou ainda, no caso de polipéptidos ou de proteínas imunogênicas, do efeito adjuvante de imunidade que pode transportar a proteína afim para uma ose, parti cul arme^i te MalE ou MalX.

Este aspecto e particularmente interessante quando o polipéptido pretendido apresenta um peso molecular relativamente pequeno, incompatível com uma i munogéni cidade suficiente in vivo do referido polipéptido pretendido. A este respeito poder-se-ã ainda fazer uso da técnica descrita no pedido de patente de invenção europeia n9 87.4005044 ou em (11) para determinar o sítio apropriado de introdução (ou sítio permissivo) da sequência que codifica para o polipéptido pretendido na sequência que codifica para o gene malE ou maIX , de modo a conservar simul taneameji te na proteína híbrida as propriedades afins da proteína MalE ou MalX para a ose insolubi1izada e assegurar a exposição conv£ niente do polipéptido pretendido no seio da proteína híbrida, para que esta possua as propriedades imunogênicas pretendidas do polipéptido.

Em consequência, a presente invenção diz respeito as com posições i munogéni cas dirigidas contra anti gê n ios (parti cu 1arraente antigénios patogénicos susceptíveis de serem neutralizados por anticorpos), caracterizadas pelo facto de se associar, com um veículo apropriado para a produção de composições de vacina, um polipéptido híbrido obtido mediante transformação, de acordo

com o processo da presente invenção, de bactérias Gram , ou Gram⁺, ou de células eucariotas, com um acido nucleico recombinante constituído por uma sequência nucleica que codifica para um polipeptido afim para uma ose, particularmente para MalE ou MalX, contendo esta última sequência nucleica, ao ηίνθΐ de um dos seus sitios permissivos, a sequência de ADN que codifica pa ra um epítopo determinado.

A presente invenção diz mais particularmente respeito a uma composição imunogenica dirigida contra a SIDA, caracterizada pelo facto de o polipéptido híbrido que a compõe conter um peptido anti-HIV, particularmente um fragmento activo do receptor T4, inserido em MalE, estando o referido polipétido híbrido associado com um veículo apropriado para a produção de composições de vacina.

Proteínas híbridas entre MalE e polipéptidos possuindo caracteres imunológicos tais como o receptor T4 situado sobre os linfocitos T4, e constituindo o alvo para os virus do tipo HIV característicos da SIDA, assim como o epítopo Cg da proteína VP1 do polivírus, serão mais particularmente descritos nos exeimplos de realização do processo de acordo com a presente invenção, que se seguem.

A presente invenção não estã de modo nenhum limitada ã purificação de proteínas ou polipéptidos híbridos. Em particular, a purificação pode ser conduzida em condições que permitam a separação da cadeia peptídica determinada (ou ainda da proteí na pretendida) do polipéptido vector colocado a montante ou a j£ sante, na proteína híbrida, em relação ao sentido da tradução, e mesmo a recuperação da única proteína pretendida, desde que ela se encontre colocada inteiramente a jusante, ou a montante, do

-19polipéptido vector, na medida em que por construção de uma pequena sequência nucleica (ou sub-sequência) que codifica para uma sequência de aminoácidos especificamente clivavel por um d£ terminado enzima ou um processo químico tendo primeiramente sido intercalada no ácido nucleico recombinante, entre a sequência que codifica para o polipéptido vector e a sequência que codifi_ ca para a proteína pretendida. Se necessário, poderão ser ins£ ridas outras sub-sequências semelhantes a mencionada antes no acido nucleico recombinante, especialmente de modo que esta sequência que codifica para a cadeia peptídica determinada seja iri tercalada entre duas destas sub-sequências, para melhor isolar ainda a cadeia peptídica determinada.

A operação de eluição da proteína pretendida compreende então o tratamento da ose insolubi1izada, sobre a qual se fixou previamente a proteína híbrida, por tratamento cindindo especificamente a sequencia de aminoácidos, ficando então o polipepti_ do vector fixado sobre a ose.

Como variante, apos recuperação do polipéptido híbrido a partir da ose insolubi1izada, trata-se o polipéptido híbrido em solução com o enzima específico ou o tratamento químico específico, coloca-se em contacto os produtos da clivagem da proteína híbrida com a ose insolubi1izada e recupera-se o polipeptido nesse caso não fixado consistindo essencialmente na cadeia de aminoácidos pretendida.

E evidente que o polipéptido pretendido se pode igualmente separar da proteina híbrida, mesmo se ele se encontrar i_n corporado entre dois fragmentos do polipéptido yector no seio de um híbrido, como se descreveu antes.

Neste caso de figura , o aminoacido nucleico recombina_n te utilizado no processo de acordo com a presente invenção, e construído de modo a conter duas sub-sequencias que codificam para uma sequência de aminoacidos selectivamente clivãvel por um enzima específico e colocadas respectivamente a montante e a jusante da sequência nucleica que codifica para a cadeia peptídica determinada.

A título de exemplo de sequência nucleica susceptível de ser inserida, especialmente entre as primeira e segunda partes da sequência que codifica, mencionar-se-a, por exemplo, a S£ quenci a:

ATCGAGGGTAGG

IleGluGlyArg a qual e variavel selectivamente pelo factor Xa, cuja intervenção na coagulação do sangue ê bem conhecida. E evidente que a utiliza ção desta sequência particular apenas pode ser considerada com a condição de a proteína pretendida não conter sequência tetrapeptídica suplementar. Mencionar-se-á ainda, como outro exemplo de sequência de aminoacidos selectivamente cliváveis deste modo, as sequências que aparecem no quadro I que se segue e no qual estão referidas as sequências características assim como os enzimas que permitem a sua clivagem ao nível do aminoacido assina^ lado com uma pequena seta vertical.

-2lQuadro I

Enteroqui nase Colagenase Tripsi na

Cl os tri di opepti dase

Protease estafi1ococica Asp^e Glu^ 4- ψ lado do aminoãcido

C-termi nal

Asp Asp Asp Lys

J, i

Pro X Gly Pro Y*(Pro Val*Gly Pro) Lys^e Arg^

Arg (Lys)

Leu, lie, Phe e Vai (e outros)

I 4/

Phe, Trp e Tyr

Termo!isina

Quimotrisi na Pepsina Phe^, Trp^e Tyr^(e outros)

POde-se igualmente recorrer a clivagens químicas ao nível dos aminoScidos ou dipeptidos que se seguem

Quadro II lado do aminoãcido

C-termi nal

Brometo de cianogenio Met

Ψ

Ãcido formico Asp Pro

Amina hidroxiada Asn Gly

Reagentes oxidantes Trp¹^

Ψ

2-Ni tro-5-ti oci anobenzoato Cys

A escolha da sequência utilizada dependerá da estrutura do polipéptido cuja integridade deverá ser conservada no fim de_s ta operação de purificação.

A presente invenção diz egualmente respeito ãs culturas de células comportando, particularmente, ao nível da sua superfície externa, um epítopo característi co reconhecível pelo siste_ ma imunitário do organismo em que as referidas células são susceji tíveis de ser introduzidas, caracterizadas pelo facto de as refe ridas células serem transformadas com a ajuda de um ãcido nucleico recombinante na fase de leitura aberta compreendendo uma sequência nucleica que codifica para o referido epTtopo inserido ao nível de um sítio permissivo de uma sequência nucleica que codifica para uma proteína afim para uma ose.

A proteína afim para uma ose referida antes, é com vantagem, a proteína MalE ou MalX.

Entre as células referidas antes comportando ao nível da superfície externa um epTtopo, distingue-se particularmente as bactérias Gram (por exemplo ¹¹E. coli), as bactérias Gram⁺ (por exemplo B. subtilis) e as células eucariotas.

A inserção da sequência que codifica para o referido epí topo ao nível de um sítio permissivo da sequência que codifica para a proteína MalE, ao mesmo tempo que se conservam as proprie dades de transferência para fora do citoplasma e de afinidades pa_ ra a maltose destas ultimas, permite a proteína híbrida contendo o epTtopo, e que foi codificada pelo ácido nucleico referido antes, ser localizada ao nível do periplasma das bactérias Gram , quando estas ultimas são utilizadas como células-hospedeiras , fazendo destas células reagentes de escolha para a apresentação de um epTtopo característico no organismo em que as referidas células são susceptíveis de ser introduzidas.

De uma maneira geral, a utilização das proteínas MalE ou MalX na qualidade de péptidos vectores para a apresentação de epí topos, pode ser considerada nas bactérias Gram , Gram ou nas células eucariotas.

A presente invenção tem igualmente por objectivo composi_ çoes imunogenicas dirigidas contra antigênios (particularmente antigenios patogênicos neutralizáveis por anticorpos dirigidos contra um determinado epTtopo), e caracterizadas pelo facto de se associar as células referidas antes (vivas ou mortas, particularmente pelo calor, no caso das bactérias) comportando ao ní vel da sua superfície externa o referido epítopo, com um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico apropriado para a produção de composições para vacina.

A presente invenção diz igualmente respeito a um acido nucleico recombinante na fase de leitura aberta compreendendo uma sequência nucleica que codifica para a cadeia peptídica determinada e uma ou varias sequências distintas que codificam pa ra uma ou varias partes do polipéptido vector, caracterizado pe lo facto de as referidas uma ou várias sequências que codificam para uma ou várias partes do polipéptido vector serem tais que as propriedades de transporte no citoplasma e de afinidade para a ose determinada do polipéptido vector intacto, são conservadas no polipéptido híbrido expresso pelo referido ácido nucleico recombinante e pelo facto de as referidas sequências nucleicas estarem sob o controlo de elementos de regulação, particularmente da promoção e da terminação da transcrição, reconhecidos por bactérias Gram⁺ ou por células eucariotas.

As referidas uma ou várias sequências distintas que co dificam para uma ou várias partes do polipetido vector são, com vantagem, as sequências nucleicas que codificam para a tota lidade ou parte das proteínas MalE ou MalX.

A presente invenção diz igualmente respeito a um ácido nucleico recombinante tal como o definido antes, caracterizado pelo facto de o polipéptido vector ser a proteína MalX e pelo facto de os referidos elementos de regulação serem reconhecidos pelas bactérias Gram⁺.

De acordo com diversos modos de realização do processo segundo a presente invenção os ácidos nucleicos recombinantes referidos antes são construídos de tal modo que;

- a sequência nucleica que codifica para MalE e MalX ê colocada nteira a montante da sequência de ADN que codifica pa ra a cadeia peptídica determinada.

-24-j

- a sequência nucleica que codifica para MalE e MalX e colocada inteira a jusante da sequência de ADN que codifica para a cadeia peptídica determinada, a sequência nucleica que codifica para a cadeia peptídj_ ca determinada é inserida ao nível do sítio permissivo da sequen cia nucleica que codifica para MalE e MalX.

Sub-sequências que codificam para uma sequência de amin£ ácidos clivável por um enzima específico, ou por um tratamento químico podem igualmente ser inseridas entre as partes dos ácidos nu cleicos recombinantes referidos antes que codificam respectivamente para a parte MalE ou MalX e para a cadeia peptídica deter minada, como foi anteriormente descrito.

A presente invenção diz igualmente respeito aos ácidos nucleicos recombinantes referidos antes na qualidade de vectores, particularmente do tipo plasmídico, aptos para serem replicados nas bactérias Gram ou Gram , ou nas células eucariotas.

Características preferidas da presente invençSo aparec^ rão ainda durante a descrição que se segue de construções preferidas da invenção, representadas esquematicamente nas figuras 1, 2, 3 e 5, sem que estas possam ser consideradas como tendo um carácter limitativo.

Far-se-á igualmente referencia no que se segue ã figura 4 que representa a expressão j_e construções MalE-T^ e T^-MalE em E. coli, representando as figuras 6 a 8 a expressão MalE em células eucariotas e a figura 9 as homologias entre MalE e MalX.

Os plasmídeos utilizados nestas construções foram já objecto de descrições anteriores. Far-se-á particularmente referenci a

- a publicação de VIERA e MESSING, 1982, para o plasmídeo PUC9,

- ã publicação de WILLIAMS e NEUBERGER, 1986, para a descrição do fragmento BamHI-polAK-BamHI que codifica para o fragmento de Klenow e da ADN-polimerase I,

- ao artigo de NEUBERGER e colab., 1984, para a descrição do fago M13Mp8 recombinante que contem o gene nuc da nulcea^ se de S. aureus

- a publicação de P. DUPLAY e colab., Y. Mol. Biol. , 194, 663-673, 1987, para os plasmTdeos pPD91 , pPD127 e pPD140, que constituirá assunto adiante.

1) - Preparação de um plasmTdeo que codifica para a proteína híbrida MalE91-Klenow, exprimindo simultaneamente a acti_ vidade de MalE e a actividade do enzima de Klenow.

>

híbrido entre malE e polAK e construído do seguinte modo.

fragmento BamHI-polAK descrito em NEUBERGER 1986, re tomado a partir do plasmídeo PUC9 recombinante obtido, é inserj_ do no plasmídeo pPD91, mais particularmente no linker BamHI deste ultimo, ele proprio contido no gene malE, ao nível do tri pleto que codifica para o 362- aminoácido de MalE. Esta descrição devia por isso ter como resultado colocar o gene pol AK a j£ sante da parte maior do gene malE. A orientação de polAK nos plasmídeos recombinantes obtidos foi determinada por dupla digestão BglII-SacI. Os plasmídeos em que polAK se encontrava

-26correctamente orientado foram denominados pHBll. Este codifica para a proteína MalE91-Klenow.

plasmídeo pHBll estã representado esquematicamente na figura 1. 0 sítio BamHi, representado na parte direita da f i gu_ ra, separa a parte do gene que codifica para a parte distai de MalE91 e a parte proximal do gene polA que codifica para o enzima de Klenow.

A partir de pHBll, obteve-se um plasmídeo pHB12 compor, tando uma mutação na sequência sinal do gene malE. Para este efeito, efectuou-se uma troca mediante recombinação genética ejn tre os fragmentos PstI-BglII de pHBll, que comportava esta sequer^ cia desprovida no entanto de mutação com a sequência Pst-BglIX correspondente resultante do plasmídeo pPD127 descrito em (4) , que continha uma tal mutação. pHB12 codifica para a proteína hí brida mal EI 27/91-Klenow.

2) - Preparação de um plasmídeo que codifica para uma proteína híbrida MalE140-Nuc, exprimindo simultaneamente uma actividade MalE e uma actividade de nuclease.

Um fragmento (BamHI: nuc-Sal I) que codifica para a nuclease de aureus foi cortado do fago MP8 recombinante de£ crito em NEUBERGER e colab., 1984, e substituído, por ligação em pBR322 , em vez e lugar do fragmento BamHI-SalI inicialmente cori tido neste último. 0 plasmídeo obtido foi denominado pHB13.

Por troca do fragmento EcoRI-BamHI de pHB13, imediatameji te a montante do fragmento (BamHi-nuc-SalI), com o fragmento /ÈcoRI-(malEp-malE)-BamHIJ do plasmídeo pDP140, obteve-se o plasmídeo pHB14, no qual o gene nuc estava então colocado a ju-27sante do gene malE. Estes dois genes foram colocados em fase:

- mediante preenchimento das extremidades coesivas do sí tio único BamHl contido no pHB14, na presença dos quatro desoxinucleotidos e da polimerase de Klenow.

pHB15 codifica então para uma proteína híbrida MalE140-nuclease.

plasmídeo pHB estã representado esquematicamente na fi. gura 2. 0 sítio (BamHI)Cla I na parte direita da figura, separa a parte do gene que codifica para a parte distai de MalE e a parte proximal do gene nuc que codifica para a nuclease referida antes.

3) - Produção e purificação das proteínas híbridas Ma1E91-Klenow e Mal EI40-Nuclease por culturas de£, coli¹¹ previamente transformadas pelos plasmídeos pHBll, pHB12 e pHB15, respe cti vamente.

A estirpe PD28, um derivado Δ ma 1E444, mal T-l, recA: : tnlO de MC4100 de E^. col i¹¹ (4) foi realizada como hospedeiro pa ra a expressão dos genes híbridos. A eliminação A malE444 do gene malE, que é não polar sobre a expressão dos genes distais do operão malE-malF-malG , evita a expressão da proteína MalE selvagem a partir do cromossoma bacteriano e a sua co-purificação com os híbridos em MalE. & malE444 torna a estirpe Pd28 defectiva p£ ra o transporte da maltose. A mutação malT- permite a activação constitutiva do promotor malEp na ausência de maltose indutora. Para evitar o risco de letalidade da expressão constitutiva de proteínas híbridas para a célula, fez-se crescer todos os derivados de P028 em meio completo a que se adicionou de 0,4

a 2% de glucose. Nestas condições, o promotor ma 1 Ep e fortemeji te reprimido, sem que seja entravado o desenvolvimento da cultjj ra sobre o meio completo. Uma lavagem das células e a sua sementeira em um meio completo desprovido de glucose, a que se adicionou eventualmente maltose, permite então obter a expressão de MalE ou de proteínas híbridas a partir destes plasmídeos de^ de a primeira geração. Efectua-se todos os crescimentos a 30°C. Experiências de controlo demonstraram que a expressão ou a exportação em grande quantidade de MalE a partir de um plasmídeo são abolidas a 42°C.

Quando são introduzidos na estirpe PD28, os plasmídeos plDl, pPD91, plD140 e pHBÍ5 provocam a expressão, em quantidade importante, das proteínas MalE, MalE91, MalE140 e do híbrido Mal EI40-Nuclease. Encontra-se estas quatro proteínas na fracção celular libertada a partir do periplasma, quando as bactérias produtoras são submetidas a um tratamento visando provocar um choque osmotico.

Os plasmídeos pPD127, pHBll e pHB12 provocam a expressão, em quantidades importantes,da proteína MalE127 e dos híbridos MalE91-Klenow e Mal EI 27/91-Klenow na fracção celular solúvel.

De salientar que uma certa proporção de Mal EI27-Klenow foi igualmente exportada no periplasma (produzida pelo plasmídeo pHBll que não comportava nenhuma mutação na sequência sinal do gene malE).

As proteínas MalE selvagem , MalE91, MalE140 e MalE127 (proteínas testemunhas) e as proteínas híbridas MalE-140-Nuclea se, MalE91-Klenow e Mal EI 27/91-Klenow, respectivamente obtidas a partir de culturas bacterianas correspondentes, foram purifi-

-29cadas mediante cromatografia de afinidade sobre amilose com po_n tes nas condições descritas em (4). No caso de MalE selvagem , Ma 1 EI40-Nuclease e MalE91-Klenow, esta purificação faz-se a par tir de extractos periplasmicos. No caso de MalE127 e MalE127-Klenow, a purificação faz-se a partir de um extracto solúvel de células inteiras.

Em cada caso, trata-se uma cultura de 500 ml semeada com uma densidade Õptica, medida a 600 nm, igual a 0,1 e recolhida a uma densidade igual a 1. Cada um dos extractos (cerca de 140mg de proteína para os extractos solúveis, obtida a partir das bactérias inteiras, e cerca de 14 mg para os extractos periplasmicos), ê retomado em 25 ml de um tampão (por exemplo 50 mM Tris-C1 pH7,5; 2,5 mM jõ-mercapto-etanol; 0,1 PMSF) e depositado s£ bre uma coluna de 6 ml de resina; as colunas foram lavadas com cerca de 5 volumes de tampão, eluindo-se depois as proteínas com maltose 10 mM.

As quantidades retidas e eluídas são iguais a 1,76 mg para MalE selvagem, 1,64 mg para o híbrido MalE140-Nuclease e 1,16 mg para MalE127. As colunas não estavam saturadas visto que MalE e o híbrido Mal EI40-Nuclease não foram encontrados nas fracçoes que passaram através das colunas sem serem retidos.

Em compensação, apenas uma pequena proporção (68 ^ug) do híbrido Mal EI 27/91-Klenow era retida na coluna nas mesmas condj_ ções, o que sugere que, no caso particular desta proteína híbri da, a porção polimerase de Klenow perturba a replicação correcta da porção malE desta ultima.

Obteve-se 172 jug de proteína híbrida Mal E91-Klenow pur£ ficada a partir do extracto periplasmico, apõs cromatografia de afinidade nas condições referidas antes.

Verificou-se que a actividade do híbrido Mal EI 40-Nucl eja se era igual a 2100 unidades de nuclease/mg de híbrido, quer di_ zer 8942 u/mg da porção nuclease do híbrido. Por comparação a actividade de uma preparação comercial de nuclease (Boehringer) era igual a 2580 u/mg. Por consequência, a nuclease tem a sua plena actividade no híbrido. A estirpe PD28 (pHB15) tem um f£ notipo Mal sobre meio Macconkey maltose a 30 C. Por consequeji cia, o gene híbrido mal EI40-nuc ê capaz de completar a eliminação δ malE444 para a fermentação da maltose e o híbrido Mal EI40-Nuclease e pelo menos parcialmente activo para o tran£ porte da maltose. Em resumo, o híbrido Mal EI40-Nuclease ê exportado no periplasma e conserva as actividades dos seus dois parcei ros.

Verificou-se que a actividade do híbrido Mal EI 27/91-Kle now era igual a 4514 unidades de polimerase/mg de híbrido, quer dizer 7431 u/mg da porção de fragmento de Klenow do híbrido Por comparação, a actividade de uma preparação comercial de fra£ mento de Klenow (Boehringer) e igual a 9445 u/mg. Por consequência, o fragmento de Klenow tem a sua plena actividade no hí brido . Em resumo, o híbrido Mal EI 27/91-Klenow ê uma proteína citoplasmatica que possui a actividade de polimerase e pelo menos algumas das propriedades de MalE.

Verificou-se que a actividade do híbrido MalE91-Klenow era igual a 3100 unidades de polimerase por mg de híbrido, ou seja 5100 unidades/mg de porção de fragmento de Klenow do híbrido. Por consequência, o fragmento de Klenow conserva igua([ mente a sua actividade no híbrido MalE91-Klenow,

Em resumo, o híbrido MalE91-Klenow pode ser transferido no periplasma, conservando a actividade polimerase e algumas das propriedades de malE.

As preparações de proteínas eram puras a 95%, como foi demonstrado por analises mediante electroforese em gel de pol i_ acri 1 amida-SDS . 0 entendido na matéria verificara que estas proteínas poderiam ainda ser mais purificadas, por meios classi. cos, por exemplo medi antediãlise .

4) - Preparação de plasmídeos que codificam para as proteínas híbridas MalE-T4 e T4-MalE. Os sítios receptores para o gene T4 são, por um lado, o sítio BamHI inserido em C-terminal de malE no plasmídeo pDD140 (utilizado para a fusão MalE-T4) e, por outro lado, o sítio BamHI inserido em N-terminal de MalE no plasmídeo plD127 (utilizado para a fusão T4-MalE).

Polinucleotidos sintéticos foram, em uma primeira etapa, inseridos nos sítios receptores referidos antes de modo a introduzirem novos sítios compatíveis com os fragmentos T4 a i£ serir, combinar as fases de leitura dos dois genes, se for neces^ sãrio restituir as partes em falta ou introduzir codãos de inter rupção ou de fim de construção. Os plasmídeos pMEC e pMEN foram assim respectivamente obtidos a partir dos plasmídeos pPD140 e pPDl27.

Para a realização da fusão MalE-T4, o fragmento Fnu4HI /contendo o gene T4 mas não a sequência sinal (ss) nem as partes transmembranar e citoplasmãtica C-terminal_/ descrito em MADDON e colab., Cell, 42, 93-104 (1985), foi inserido no plasmídeo pMEC, mais particularmente ao nível do sítio Xba introduzido quando da primeira etapa neste ultimo. 0 gene T4 e colocado a

-32, jusante do gene MalE no plasmídeo pMET assim obtido.

Para a realização da fusão T4-MalE, o fragmento Hpall ^contendo o gene T4 e a quase totalidade da sequência sinal , mas não as partes transmembranar (mb) e citoplasmatica (cit) C-terminaisy descrito na referencia mencionada antes, foi inserido no plasmídeo pMEN, mais particularmente ao nível do sítio EcoRI introduzida neste ultimo quando da etapa anterior. 0 gene T4 é colocado a montante do gene MalE no plasmídeo pTME assim obti do.

Os plasmídeos pD140, pPD127, pMEC, pMEN, pMET, pTME, r£ feridos antes, contem o promotor natural de malE (Pr mal, indutível pela maltose, sensível ã repressão catabõlica) e estão iji dicados na figura 3.

Os plasmídeos pTE356 ^^const^ruídos mediante inserção de um fragmento EcoRI-BamHI contendo o promotor tac do plasmídeo pDR340, comercializado pela sociedade PHARMACIA, no plasmídeo pPD356 descrito por DUPLAYe colab., J. Mol. Biol. 194, 663-673, (1987jJ⁷ , pTMET e pTTME obtidos a partir deste ultimo de acordo com o princípio anterior, contem respectivamente os genes malE, malE-T4 e T4-malE sob o controlo do promotor tac (ind£ tível pelo IPTG, insensível ã repressão catabõlica) e estão igualmente representados na figura 3.

Experiências da imunoprecipitação (figura 4) permitem observar que as duas construções MalE-T4 e T4-MalE são expressas em E. coli e são mais ou menos degradadas de acordo com a estirpe utilizada.

As colunas numeradas de 1 a 10 correspondem ãs estirpes de E. coli contendo as construções MalE-T4 , T4-malE repartj_

das do seguinte modo:
esti rpes:
lon :	1,2,6,7
wt :	4,5
degP :	8,9

construções;

MalE-T4: 1 ,4,5

T4- malE: 6,7,8,9

Testemunhas:

MalE: 2,3,10

As colunas 1 a 3 e 6 a 10 correspondem a i munopreci pi ta^ ção de extractos brutos revelados por anticorpos anti-MalE.

As colunas 4 e 5 correspondem a imunoprecipitação de ex tractos radioactivos revelados por anticorpos anti T4 (0KT4A) (coluna 4) e por anticorpos anti MalE (coluna 5).

5) - Utilização da proteína MalE como vector de apresentação do epítopo epítopo Cg da proteína VP1 do poliovírus foi inserido geneticamente em dois sítios da proteína MalE de acordo com o método descrito no pedido de patente de invenção europeia ηθ 87.400.504.4. As proteínas recombinantes retém as principais características da proteína selvagem: exportação no periplasma , retenção sobre uma coluna de amilose, complementação de uma eli_ minação cromossÓmica do gene. Um estudo da imunogenicidade de£

-34tas proteínas foi empreendido na estirpe Balb/C.

Os murganhos foram imunizados com bactérias vivas, bactérias mortas pelo calor, lisados bacterianos obtidos pela acção de ultra-sons e preparações semi-puri fi cadas (choque osmoti_ co. Proteínas 50 a 70 % puras). Foram testadas duas vias de imunização: intravenosa e subcutânea.

Por via intravenosa, todas as preparações deram títulos - 4 6 altos anti-peptido de 10 a mais de 10 . Por via subcutânea , so a preparação de bactérias mortas pelo calor deu uma resposta 5 anti-peptido (superior a 10 ).

Os soros foram testados pela sua capacidade para imunoprecipitar partículas virais nativas e desnaturadas pelo calor: -r 4 todos os soros dao títulos superiores a 10 precipitando as pa_r tículas desnaturadas a 100%. Os soros foram testados pela nejj tralização “in vitro e dão títulos compreendidos entre 1/8 e 1/64 correlacionados com as respostas anti-péptidos e os resultados da imunoprecipitação.

θ) “ Expressão da proteína MalE nas células eucariotas fragmento BamHI-ACCI compreendendo o gene malE do plasmídeo pTE356 anteriormente citado foi inserido no vector pSUTK MOp ^descrito em NICOLAS e BERG (1983), Cold Spring Har bor, Symposium Quantitative Biology, 469-485_y por tratamento deste último com a ajuda de Bgl II + Nru I.

plasmídeo pSVME assim obtido esta representado na figura 5. Este plasmídeo contem o gene malE assim como elementos genéticos que tornam possível a sua expressão nas células eucariotas (promotores do vírus SV40 e do gene da timidina Kina^

-357 t

se do vírus do herpes, regiões intrõnicas do gene T de SV40 e da j^-globina de coelho, sítio de poiiadeni1 ação do ARN precoce de SV40). Estas construções foram introduzidas nas células em cultura (fibroblastos embrionários de hamster chinês transformados por SV40 ou células L de murganho) mediante transferencia (técnica do precipitado de fosfato de de cálcio). Uma síntese importante de material imunoprecipitãvel pelos anticorpos dirigidos contra MalE foi evidenciada pela técnica de imunotrans ferência (Western Blot) (figura 6). MalE assim sintetizada coexiste sob duas formas. Uma e do mesmo tamanho que a proteína MalE sintetizada nas bactérias (forma natural). A outra e de um tamanho ligeiramente superior compatível com a do precursor de MalE (tendo o corte da sua sequência sinal). A proteína MalE e exportada no meio de cultura em que se encontra essencialmenji te sob a sua forma (natural). A fracção extraída a partir das células é, em compensação, constituída na maior parte dos casos pela espécie mais pesada.

Estabeleceram-se linhas celulares exprimindo MalE de um modo estável (figura 7). Este resultado foi obtido mediante co-transferência das células pelas construções MalE e uma construção que confira ãs células a resistência a geneticina (G418).

A quase totalidade dos clones resistentes exprimem MalE em qua£ tidades variáveis de acordo com os clones conservando sempre as propriedades de crescimento normais. MalE e, como nas experi_ ências de expressão transitória, exportada no meio de cultura.

Evidenciou-se igualmente que a proteína MalE expressa nas células eucariotas e purificavel numa etapa em coluna de amilose (figura 8).

-36Visto que a proteína e expressa e exportada nas células eucariotas, a introdução nas células eucariotas das construções que permitem a expressão de proteínas híbridas, em particular fusões entre o gene malE e o gene receptor dos linfócitos T4, para os purificar em uma etapa, cpnduz a um tipo de tecnologia apresentando várias vantagens:

a) replicação correcta das proteínas eucariotas que não são necessariamente exportadas com sucesso pelas bactérias. Com efeito, as modificações pos-traducionais , indispensáveis para a actividade biológica de algumas proteínas eucariotas (glicosila. ções, formação exacta de pontes de dissulfureto etc,,) não se realizam nas bactérias Ferenci , T. e colab., (1978) F. E. B.

S. Letters 94, 213-217 ;

b) e possível obter clones estáveis produzindo proteínas híbridas;

c) e possível aumentar a expressão das proteínas híbri_ das mediante adição, quando da introdução do ADN recombinante nas células, de construções que permitem a amplificação géníca das estruturas integradas (por exemplo a gene dhfr cuja ampl ifi_ cação pode ser seleccionada pela resistência ao metotrexato).

d) As proteínas serão purificadas em uma etapa a partir dos sobrenadantes de culturas celulares mediante fixação em coluna de amilose e eluição pela maltose.

e) Pode-se criar artificialmente sítios de clivagem ao nível da junção entre MalE e a proteína pretendida, por exemplo sítios específicos para a cologenase (GERMINO J. e colab., (1984), Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 81_, 4692-4696). 0 produ to da hidrólise poderã ser desembaraçado da fracção que contem

-37MalE (assim como dos produtos não clivados) mediante retenção destes últimos em coluna de amilose.

As técnicas e os resultados das experiências ilustradas pelas figuras 6,7 e 8 referidas antes são os seguintes:

- Fig^ura θ

Técnica: As células C060 de hamster foram transferidas com o plasmídeo pSVME.

Apos 5 dias , as proteínas sintetizadas por estas células foram analisadas (Western Blot) (linhas 3 a 5). Células não transferidas foram utilizadas como testemunhas (linhas 1 e 2).

As células (linhas 1, 3 e 4) assim como os sobrenadantes de cul tura (linhas 2 a 5) foram analisadas. Nas linhas 2,4,5 e 6 os extractos foram imunoprecipitados por um anticorpo anti-MalE depositado sobre gel SDS-PAGE (nestas condições vê-se as imunoglobulinas assinaladas ig.) Nas linhas 1 e 3 os extractos celulares foram depositados directamente. 0 resultado da transferência é revelado por um anticorpo anti-MalE.

Linha 6: proteína MalE purificada a partir de extractos bacteri anos.

Resultados: As células CQ60 não exprimem proteínas reconhecidas por um anticorpo dirigido contra malE (células linha 1 ou sobrenadante: linha 2). As células transferidas por pSVME sintetizam MalE (linhas 3 e 4) sob 3 formas; uma é do tamanho de MalE (linha 6) e a outra ê mais pesada. MalE e exportada no meio de cultura (linha 5) sob a forma natural (linha 6).

Por consequência MalE e verosimilmente sintetizada sob a forma de precursor nas células (forma pesada) e exportada no meio de cultura.

-38( \,._w>

Figura 7

Técnica: As células C060 foram transferidas com o p1 a£ mídeo pSVME misturado com o plasmídeo RSVneo. Clones resistentes ao G418 foram seleccionados e os sobrenadantes de cultura analisados (imunoprecipitação, SDS-PAGE, transferido sobre nitrocelulose, revelação por um anticorpo anti-MalE, proteína A . , . 125 , iodada )

Linhas 1 a 12: clones resistentes ao G418.

Linhas 13 e 14: MalE purificada a partir de extractos bacteria^nos* Resultados: a quase totalidade dos clones exporta MalE no meio de cultura sendo o nível de expressão variável (no 1 imj_ te da detecção: clones 2, 4 e 5 ou em abundância: clones 3 e 12).

E então possível obter clones estáveis exprimindo e ex portando MalE.

Figura 8

Técnica: sobrenadantes de culturas celulares (em a: C060 e em b ; clone 12-cf figura 7) foram depositados sobre coluna de amilose. A coluna foi lavada e eluida com maltose lOOmM. Em a (experiência de reconstituição), 1 jjg de MalE purificada a partir de extractos bacterianos foi misturada com o sobrenadante de células C060 antes de carregar a coluna. A fracção 8 foi recolhida em cada caso depois da eluição.

Resultados: _a: a experiência de recons ti tui ção demon^ tra que se encontra a proteína MalE eluída pela maltose nas cori dições experimentais utilizadas, A coluna é provavelmente sobrecarregada porque MalE se encontra desde as primeiras fracções. E provável que uma lavagem mais extensiva tendera para um per-39-

fi 1 de eluição mais conforme com os resultados habituais b.: a proteína MalE sintetizada pelo clone 12 é retida na coluna de amilose e eluída pela maltose (fracção 8).

Assim, e possível purificar a proteína MalE sintetizada pelas células de Hamster em coluna de amilose. As proteínas fun didas com MalE sintetizadas pelas células eucariotas são igualmente purificáveis por esta técnica.

Em conclusão, MalE possui varias vantagens como proteí na vector em relação aos outros sistemas existentes. Trata-se de uma proteína bacteriana; ê de tamanho médio e monomérica, ã vontade periplasmica ou citoplasmãtica: ê expressa pelas células eucariotas e é facilmente purificãvel mediante cromatografia de afinidade sobre um suporte de afinidade pouco dispendioso; pode-se eluir da resina nas condições fisiológicas, compatíveis com a conservação das plenas actividades dos polipéptidos ou proteí nas sintetizadas. Além disso, permite exportar no espaço periplasmãtico proteínas normalmente citoplasmãticas.

A capacidade destas últimas para serem transportadas na re gião periplasmática poderá ser cada vez apreciada experimenta], mente. Pode-se ainda sublinhar que a capacidade de transporte nesta região pode ser interpretada como reunindo a enorme eficã cia para este efeito da proteína MalE e a possibilidade de este transporte se poder efectuar antes mesmo que a replicação correcta da proteína acabe.

7) - Homologia entre a proteína MalX de Streptococcus pneumoniae¹¹ e a proteína MalE de E. coli.

Os resultados deste estudo estão indicados na figura 9

na qual:

- os resíduos idênticos de MalE e MalX estão indicados por regiões cinzentas;

- os resíduos homólogos entre duas proteínas estão indi_ cados por barras verticais;

- a seta negra indica o sítio de clivagem do precursor de MalE;

- a seta cinzenta indica o sítio de clivagem provável de MalX;

- cerca de 60 a 80 aminoacidos constituem a parte C-terminal de MalX.

A homologia entre MalE e MalX é muito pronunciada (31% de resíduos idênticos em 334 aminoacidos e a homologia atinge cerca de 75% se nao se fizer distinção entre resíduos idênticos e homólogos).

Os plasmídeos pHBll e pHB15 foram depositados na Colec ção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM) do INSTITUTO PASTEUR de Paris, em 18 de Maio de 1987, sob as n9s. 1-662 e

1-663, respectivamente. Os plasmídeos pSVME, pTME, pTMET, pTTME foram depositados na COLECÇÃO NACIONAL DE CULTURAS DE MICRORGANISMOS em 10 de Maio de 1988, sob os numeros 1-759, 1-760, 1-761 e 1-762, respectivamente e o pMET foi depositado em 10 de Maio de 1988 sob o numero 1-763.

Claims (20)

1.- Processo para a produção e purificação de um polipéptido contendo uma determinada cadeia peptídica possuindo por si própria propriedades escolhidas, que compreende uma etapa que consiste em provocar a expressão em um organismo hospedeiro apropriado transformado e cultivado para este efeito, de um ácido nucleico recombinante na fase de leitura aberta compreendendo uma sequência que codifica para a cadeia peptídica e uma ou várias sequências distintas que codificam para uma ou várias partes do polipéptido vector, e uma etapa de recuperação do polipéptido híbrido expresso pelo ácido nucleico recombinante sob a forma de um extracto a

42partir do referido hospedeiro celular e uma etapa de purificação, caracterizado pelo facto de o polipéptido vector ser uma proteína afim para pelo menos uma ose determinada, em que as referidas uma ou várias sequências que codificam para uma ou várias partes do polipéptido vector são tais que as propriedades de transporte fora do citoplasma e de afinidade para a ose determinada do polipeptido vector intacto, são conservadas no referido polipéptido híbrido, de a etapa de purificação compreender a colocação em con tacto do extracto do polipéptido híbrido com uma ose correspondente sob uma forma insolubilizada compatível com a afinidade mútua da proteína afim e da ose, particularmente uma ose polimerizada, e de se recuperar, apõs separação dos compostos não fixados sobre a ose, o polipéptido híbrido contendo a referida cadeia polipeptídica determinada.

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2.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de compreender uma etapa suplementar de recuperação da cadeia peptídica determinada, tendo as referidas propriedades escolhidas, mediante separação a partir do polipéptido híbrido.

3.- Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo facto de o ácido nucleico recombinante compreender uma sequência nucleica que codifica para o polipéptido vector colocado inteiro a jusante da sequência nucleica que codifica para a cadeia peptídica determinada.

-434. - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo facto de o ãcido nucleico recombinante compreender uma sequência nucleica que codifica para o polipeptido vector colocada toda inteira a montante da sequência nucleica que codifica para a cadeia peptídica determinada.

5. - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo facto de o ãcido nucleico recombinante compreender uma sequência nucleica que codifica para a cadeia peptídica determinada, inserida ao nível de um sítio permissivo da sequência nucleica que codifica para o polipeptido vector.

6. - Processo de acordo com as reivindicações 2 a 3, caracte rizado pelo facto de o ãcido nucleico recombinante conter uma sub-sequência que codifica para uma sequência de aminoacidos selectivamente clivãvel por uma enzima específica ou um tratamento químico específico e colocada entre as partes do ãcido nucleico recombinante que codificam, respectivamente, para o referido polipeptido vector e para a referida cadeia peptídica e, se necessário, uma sequência semelhante colocada a jusante da sequência que codifica para o polipeptido vector.

7.- Processo de acordo com as reivindicaçês 2 e 4, caracterizado pelo facto de o ãcido nucleico recombinante conter uma sub-sequência que codifica para uma sequência de aminoacidos se-44ί { * lectivamente clivável por uma enzima específica e colocada entre as partes do acido nucleico recombinante que codificam, respectivamente, para o referido polipéptido vector e a referida cadeia peptídica e, se necessário, uma sequência semelhante colocada a jusante da sequência que codifica para a referida cadeia peptídica.

8. - Processo de acordo com as reivindicações 2 e 5, caracte rizado pelo facto de o ácido nucleico recombinante conter duas sub-sequências que codificam para uma sequência de aminoácidos selectivamente clivável por uma enzima específica ou um tratamento químico específico e colocadas, respectivamente, a montante ou a jusante da sequência nucleica que codifica para a referida cadeia peptídica determinada.

9. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações

2 a 8, caracterizado pelo facto de se recuperar a cadeia peptídica determinada tendo as referidas propriedades escolhidas a partir dos compostos fixados sobre a ose, mediante tratamento destes últimos com a enzima específica ou o tratamento químico específico

10.- Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 2 a 8, caracterizado pelo facto de, após recuperação do polipepti do híbrido a partir da ose insolubilizada,. se tratar o polipeptido híbrido em solução com a enzima específica ou o tratamento

-45químico específico, de se colocar em contacto os produtos da clivagem da proteína híbrida com a ose insolubilizada e de se recuperar o polipéptido então nao fixado consistindo essencialmente na cadeia peptídica pretendida.

11,- Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo facto de o acido nucleico recombinante estar sob o controlo de um promotor reprimível por um composto susceptível de ser transportado do exterior para o organismo hos- . pedeiro, particularmente no seu meio de cultura, e de se realizar, em um primeiro tempo, a cultura do organismo hospedeiro previamente transformado com a referida sequência nucleica na presença deste composto, tendo de se subtrair a cultura a acção deste composto em condições que permitam a expressão da referida sequência nucleica.

12. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo facto de o polipéptido vector ser constituído por uma proteína afim para a maltose e de a ose insclubilizada ser um polímero insolúvel de (1-4) glucose ou de amilose.

13. - Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo facto de o polipéptido vector ser uma proteína afim para a maltose nos bactérias Gram .

14. - Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo facto de o polipeptido vector ser a proteína afim da maltose de E. coli (MalE ).

15. - Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo facto de o polipeptido vector ser uma proteína afim para a maltose em bactérias Gram⁺.

16. - Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo facto de o polipeptido vector ser a proteína afim para a maltose no Streptococcus pneumoniae(MalX ).

17. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações

12 a 16, caracterizado pelo facto de o organismo hospedeiro utilizado para a produção do polipeptido híbrido ser uma bactéria Gram , particularmente E. coli.

18. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações

12 a 16, caracterizado pelo facto de o organismo hospedeiro utilizado para a produção do polipeptido híbrido ser uma bactéria Gram⁺, particularmente B. subtilis.

19. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 12 a 16, caracterizado pelo facto de o organismo hospedeiro utilizado para a produção do polipeptido híbrido ser uma célula eucariota.

20, - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 17 a 19, caracterizado pelo facto de o polipeptido determinado ser um epitopo e de a sequência nucleica que codifica para este epitopo estar inserida ao nível do sítio permissível da sequência que codifica para a proteína afim para a maltose.

21. - Processo para a preparação de uma composição imunogênica dirigida contra antigênios patogênicos neutralizáveis pelos anticorpos dirigidos contra um determinado epitopo, caracterizado pelo facto de se associar o polipeptido híbrido obtido pelo processo de acordo com a reivindicação 20 e contendo o epitopo deter minado com um Veículo apropriado para a produção de composições para vacinas,