PT868435E - Sistema de distribuição de compostos especifíco para tecidos de alta eficiência utilizando uma proteína de fusão estreptavidina-proteína a - Google Patents

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DESCRIÇÃO "SISTEMA. DE DISTRIBUIÇÃO DE COMPOSTOS ESPECÍFICO PARA TECIDOS DE ALTA EFICIÊNCIA UTILIZANDO UMA PROTEÍNA DE FUSÃO ESTREPTAVIDINA-PROTEÍNA A"

1. INTRODUÇÃO A presente invenção refere-se a métodos e composições que podem ser empregues para introduzir toxinas e ácidos nucleicos no citoplasma ou núcleo de uma célula eucariótica, particularmente uma célula de um vertebrado superior. A invenção permite a distribuição eficiente e especifica das toxinas e ácidos nucleicos em células que se ligam a um anticorpo. A invenção diz particularmente respeito à utilização de uma proteína de fusão de sequências de estreptavidina e proteína A para formar um complexo não covalente de uma toxina ou ácido nucleico e um anticorpo. A invenção proporciona um método de tratamento de doenças humanas por introdução de toxinas ou nucleótidos anti-sentido em células humanas, por exemplo, células tumorais, in vivo ou ex vivo. A invenção também proporciona métodos para conduzir investigações biológicas e métodos úteis na geração de produtos biológicos por introdução de moléculas de DNA em hélice dupla exógenas em células cultivadas.

2. CONTEXTO DA INVENÇÃO A introdução selectiva de compostos no citoplasma ou núcleo de células específicas tem sido uma técnica de valor em investigação biológica e médica e na prática clínica. Tem-se realizado abordagem específica de células por citotoxinas através de complexação de toxinas com proteínas 2 que se ligam a células que se podem ligar preferencialmente a células-alvo. As proteínas do complexo que se ligam a células podem ser anticorpos, particularmente anticorpos monoclonais, ou ligandos proteicos, por exemplo, factores de crescimento que reconhecem os correspondentes antigenes de superfície ou receptores. Complexos de toxina e anticorpo foram denominados imunotoxinas.

Convencionalmente, a toxina e proteína que se liga a células do complexo têm sido ligadas de forma covalente por acoplamento químico ou fusão genética. As imunotoxinas convencionais têm sido preparadas por ligação química de um componente de toxina a um anticorpo, tipicamente um anticorpo monoclonal, com um reagente de formação de ligações cruzadas heterobifuncional que é inespecífico. Em conformidade, este método dá origem a um produto heterogéneo no qual algumas moléculas de toxina bloqueiam a capacidade do anticorpo para se ligar a antigenes por ligação à porção F(ab) do anticorpo. Adicionalmente, a química de acoplamento pode destruir parcialmente a actividade das toxinas.

Muitos dos problemas associados à conjugação química foram ultrapassados por geração de toxinas de fusão de cadeia simples utilizando tecnologia de DNA recombinante. No entanto, esta tecnologia requer uma nova toxina recombinante para cada célula-alvo. A actividade biológica de cada nova toxina recombinante é imprevisível.

Foram desenvolvidas técnicas alternativas nas quais a citotoxina se liga de forma não covalente ao anticorpo ou ligando. Uma dessas técnicas explora a interacção específica entre a proteína A Staphylococcal aureus e 3 imunoglobulinas para gerar complexos de anticorpos com duas especificidades. De acordo com esta técnica, a proteína A é complexada com anticorpos com duas especificidades diferentes: um anticorpo específico para toxinas e um anticorpo específico para a superfície celular. Esses complexos foram utilizados para distribuir a toxina ricina em células-alvo (Laky et al., 1986/1987, Immunology Letters 14: 127-132) . Num segundo sistema de abordagem selectiva por imunotoxinas, anticorpos de cadeia simples são fundidos a estreptavidina, que tem uma afinidade de ligação forte e específica para biotina. Utilizando esta construção, toxina biotinilada foi distribuída numa célula-alvo (Dubel et al., 1995, Journal of Immunological Methods, 178: 201-209) .

Recentemente, Sano et al. descreveram uma proteína de fusão que consiste em estreptavidina e um ou dois domínios de ligação à imunoglobulina G (IgG) da proteína A em Escherichia coli (Patente U.S. 5 328 985, publicada em 12 de Julho de 1994, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade). A proteína de fusão estreptavidina-proteína A (ST-PA) tem sítios de ligação funcional de biotina e IgG. Sano também descreveu complexos da proteína de fusão estreptavidina-proteína A, um anticorpo monoclonal para BSA e peroxidase de rábano bravo biotinilada.

Sano também descreveu um método de etiquetagem de células utilizando a proteína de fusão ST-PA. Células foram incubadas com um anticorpo para um antigene da superfície celular, Thy-1. O complexo proteína quimérica-marcador biotinilado foi subsequentemente adicionado à suspensão de células. Esta técnica foi utilizada para distribuir FITC biotinilado na superfície de células com antigene Thy-1 presente na sua superfície. No entanto, Sano não descreveu 4 nem sugeriu a utilização da proteína de fusão ST-PA para distribuir compostos no citoplasma ou núcleos de células específicas.

As imunotoxinas parecem entrar na célula via endocitose mediada por receptores (Pastan et al., 1986, Cell Al_: 1-44, e Pirker et al., 1987, Lymphokines 1_4: 361-382). A ligação da fracção de anticorpo do complexo de imunotoxina ao receptor de superfície é seguida, primeiramente, por agregação do complexo em depressões revestidas e depois por interiorização do complexo em endossomas ou receptossomas presentes no interior da célula (Middlebrook et al., 1994, Microbiol. Rev. ^8_: 199-221; Morris et al., 1985, Infect. Immun. 50_: 721-727; Fitzgerald et al., 1980, Cell 2_1: 867 — 873). Durante a viagem para o interior da célula, o complexo pode ser transportado por diferentes compartimentos intracelulares cujo pH e actividade de enzimas proteolíticas variam, antes das toxinas mudarem de localização através de uma membrana intracelular e para o citoplasma da célula, onde podem causar morte celular.

Uma área secundária que foi desenvolvida diz respeito a métodos de introdução de ácidos nucleicos em células. Os métodos mais amplamente utilizados empregam fosfato de cálcio ou DEAE-dextrano para promover a captação de ácidos nucleicos. Estes métodos parecem envolver os passos de ligação de DNA à superfície celular, entrada no citoplasma por endocitose e subsequente transferência para o núcleo. Maniatis, "Laboratory Cloning Manual", volume 2, 16.30. Dependendo do tipo de células, até 20% de uma população de células cultivadas podem recolher DNA utilizando fosfato de cálcio ou DEAE-dextrano. 5 A electroporação é um método de transfecção alternativo no qual se aplica um campo eléctrico para abrir poros na membrana plasmática celular. 0 DNA parece entrar na célula por estes poros.

Também foram utilizados lipossomas para introduzir ácidos nucleicos em células. De acordo com esta técnica, vesículas de bicamadas lipídicas artificiais contendo lípidos catiónicos e neutros medeiam a transferência de DNA ou RNA para o interior de células. 0 mecanismo de transfecção mediada por lipossomas não está bem compreendido, mas parece que grupos fosfato de carga negativa presentes em DNA se ligam à superfície de carga positiva do lipossoma, e que a carga positiva residual se liga a resíduos de ácido siálico de carga negativa presentes na superfície celular.

Sano não utilizou o complexo para introduzir ácido nucleico na célula. Sano et al. descreveram complexos DNA-anticorpo com a proteína de fusão ST-PA por incorporação de uma única molécula de biotina numa extremidade de um plasmídeo pUC 19 linearizado. Em contraste com os métodos de transfecção de ácidos nucleicos para o interior da célula que são descritos acima.

3. RESUMO DA INVENÇÃO A invenção refere-se a um método de distribuição de toxinas ou ácidos nucleicos para tipos específicos de células e aos complexos para a prática do método. De acordo com a invenção, um anticorpo que reconhece um antigene da superfície celular liga-se de forma não covalente ao sítio de ligação de anticorpos de uma proteína de fusão ST-PA; uma toxina ou ácido nucleico biotinilado liga-se ao sítio de ligação de biotina. Numa especificação alternativa, a 6 toxina ou ácido nucleico pode ligar-se a uma terceira molécula biotinilada, um adaptador, que está ligado ao sitio de ligação de biotina.

Numa especificação da presente invenção, um ácido nucleico é distribuído num tipo específico de células. 0 ácido nucleico pode ser um ácido nucleico de filamentação simples biotinilado ligado ao sítio de ligação de biotina da proteína de fusão ST-PA. Numa especificação alternativa, o ácido nucleico pode ser um ácido nucleico em hélice dupla que forma uma hélice tripla complementar com um ácido nucleico de filamentação simples biotinilado que, por sua vez, está ligado ao sítio de ligação de biotina. 0 método da invenção refere-se aos passos de formação de um complexo entre uma proteína de fusão estreptavidina-proteína A; um anticorpo que é específico para uma proteína da superfície celular, que sofre endocitose após ligação ao anticorpo; e algum material de abordagem selectiva, por exemplo, um produto genético resistente a múltiplos fármacos (mdr), pró-fármaco, toxina ou ácido nucleico biotinilado; isolamento do complexo de toxina que não está ligada ao sítio de ligação de biotina, e exposição da célula-alvo ao complexo, de modo que o material de abordagem selectiva entre na célula.

3.1 DEFINIÇÕES

Tal como é aqui utilizado, toxina refere-se a holotoxinas, toxinas modificadas, subunidades catalíticas de toxinas ou quaisquer enzimas que normalmente não estão presentes numa célula e que, em condições definidas, causam a morte da célula. Uma toxina biotinilada refere-se a uma toxina 7 directamente biotinilada ou a uma toxina que está ligada a um adaptador biotinilado. 0 termo "anticorpo" refere-se a qualquer molécula que contém um ou mais domínios de ligação funcional de antigenes e um domínio Fc que se liga especificamente à proteína A.

4. DESCRIÇÃO BREVE DAS FIGURAS FIGURA IA. Representação esquemática da ligação de imunotoxina ou toxina recombinante ao correspondente antigene de superfície ou receptor presente na superfície celular. FIGURA 1B. Representação esquemática da ligação do complexo estreptavidina-proteína A/macromolécula biotinilada ao correspondente antigene de superfície ou receptor presente na superfície celular. FIGURA 2. Comparação da distribuição de biotina-β galactosidase em células A431 de um complexo ST-PA/mAB anti-EGFR/biotina-β galactosidase e de um complexo ST-TGF/biotina^-galactosidase. FIGURA 3. Análise temporal da coloração de células com β galactosidase após transferência de β galactosidase para o interior das células. FIGURA 4A. Linhas de células e moléculas da superfície celular abordadas selectivamente pelo complexo ST-PA-biotina-β galactosidase-anticorpo. FIGURA 4B. Transferência de ST-PA/mAB/biotina-β galactosidase para o interior de células humanas, em que o mAb é específico para moléculas da superfície celular HLA-DR, CD33 ou CD34. 8 FIGURA 5. Representação esquemática da construção do vector de expressão ρΑΤ-β galactosidase para formar DNA em hélice tripla com oligonucleótido poli (dT) biotinilado. FIGURA 6A. Homologia de aminoácidos entre fibronectina (ID SEQ NO: 1) e estreptavidina (ID SEQ NO: 2) . Caracteres a cheio indicam resíduos homólogos. Os domínios RGD e RYD de cada proteína estão sublinhados. A sequência apresentada para a fibronectina começa no resíduo 1481 e a sequência da estreptavidina começa no resíduo 49. FIGURA 6B. "Primers" oligonucleotídicos DES (ID SEQ NO: 3) e DER (ID SEQ NO: 4) concebidos para modificar a sequência RYD do gene da estreptavidina. FIGURA 6C. Representação esquemática da metodologia a ser utilizada na modificação da sequência RYD da estreptavidina.

5. DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DAS ESPECIFICAÇÕES PREFERIDAS A presente invenção proporciona um método de distribuição específica de material de abordagem selectiva, por exemplo, toxinas, pró-fármacos, produtos genéticos mdr ou ácidos nucleicos, em células por um complexo do material de abordagem selectiva, um anticorpo específico para um antigene da superfície celular presente na célula, cujo antigene sofre endocitose quando a célula é exposta a uma concentração efectiva do anticorpo, e uma proteína de fusão ST-PA. A proteína de fusão estreptavidina-proteína A (ST-PA) liga-se de forma não covalente ao anticorpo específico para células no sítio de ligação de anticorpos e o material de abordagem selectiva biotinilado no sítio de ligação de biotina. 0 modo e método pelos quais o material de abordagem selectiva é biotinilado não são críticos; a 9 invenção inclui a utilização de qualquer um e de todos esses métodos e reagentes.

Numa especificação, a invenção proporciona um método para a destruição especifica de células, por exemplo, a destruição de células tumorais num hospedeiro, ou ex vivo em cultura de curta duração ou longa duração. Uma toxina pode ser seleccionada do grupo que consiste em: timidina quinase, endonuclease, RNAse, alfa toxina, ricina, abrina, exotoxina A de Pseudomonas, toxina da difteria, saporina, momordina, gelonina, proteina antiviral de tintureira, alfa-sarcina e toxina da cólera. A toxina é biotinilada e forma-se o complexo de PA-ST/Ab/toxina biotinilada. Em seguida, uma quantidade eficaz do complexo pode ser administrada ao hospedeiro ou ao sistema de cultura ex vivo.

Numa especificação alternativa, a invenção proporciona um método de utilização de um anticorpo para uma célula com a finalidade de introduzir na célula um pró-fármaco citotóxico, isto é, um composto não tóxico que é convertido por uma enzima, normalmente presente na célula, num composto citotóxico. A especificação contempla a utilização de um complexo da proteina quimérica ST-PA com um anticorpo monoclonal selectivo para um tumor e pró-fármaco. Compostos adequados como pró-fármacos incluem, a titulo exemplificativo, derivado glutamilo de um agente de alquilação de mostarda nitrogenada do ácido benzóico, derivados fosfato de etoposido ou mitomicina C e derivado fenoxiacetamida da doxorrubicina.

Outra especificação da invenção contempla um complexo para a distribuição de ácido nucleico de filamentação simples em células. Tal como é aqui utilizado, o termo "ácido nucleico 10 de filamentação simples" refere-se a ácidos nucleicos de ocorrência natural e não natural. O ácido nucleico a ser distribuído pode ser biotinilado utilizando qualquer um dos métodos presentemente disponíveis, tais como incorporação aleatória, reacções de extensão utilizando DNA polimerase e PCR com "primers" biotinilados. Esses ácidos nucleicos podem ser utilizados para destruir especificamente mRNAs aos quais são complementares.

Outra especificação da invenção diz respeito à introdução numa célula de um DNA em hélice dupla que se pode integrar no genoma da célula ou replicar de forma epissomal e que pode ser transcrito. A incorporação directa de biotina num DNA em hélice dupla pode interferir na replicação e transcrição do DNA. Para ultrapassar estes problemas, o DNA em hélice dupla a ser distribuído na célula é modificado de modo a incluir uma sequência que pode formar uma região de ácido nucleico em hélice tripla com um ácido nucleico de filamentação simples.

Foram descritas formações de DNA em hélice tripla, e consistem tipicamente em tríades de nucleótidos T-A-T e C-G-C. O terceiro filamento da hélice tripla ocupa o sulco maior de uma hélice de DNA de forma A e forma pares de bases de Hoogsteen com o DNA em hélice dupla homopolimérico. Alternativamente, pode formar-se uma hélice tripla com DNA em hélice dupla. Tal como é aqui utilizado, o termo "hélice tripla" refere-se a uma estrutura formada por emparelhamento de bases de Hoogsteen entre um DNA em hélice dupla e um ácido nucleico de filamentação simples.

Nesta especificação, o complexo contém um DNA em hélice dupla com emparelhamento de Hoogsteen a um ácido nucleico 11 de filamentação simples, que é biotinilado e complexado com o complexo ST-PA/mAb. 0 DNA em hélice dupla pode ser um DNA em hélice dupla linear, que é adequado para recombinação no genoma de uma célula, ou, alternativamente, a hélice dupla pode ser um DNA circular ou circular super-helicoidal, que se pode replicar de forma epissomal.

Esta especificação da invenção pode ser utilizada em quaisquer circunstâncias em que se deseje introduzir DNA clonado numa célula, por exemplo, para expressar um produto ou para alterar o fenótipo da célula, para investigar a função de qualquer gene clonado.

Outra especificação da invenção compreende um complexo de um anticorpo para uma proteina da superfície celular presente numa célula apresentadora de antigenes, a proteína de fusão ST-PA e uma proteína biotinilada de uma bactéria ou vírus patológico, e esse complexo pode ser utilizado para localizar o antigene para células apresentadoras de antigenes e, assim, aumentar a resposta imunológica de células T positivas para CD4 relativamente à de outros linfócitos.

Os complexos da presente invenção podem ser formados por simples mistura de ST-PA, um anticorpo monoclonal e o material biotinilado nas razões apropriadas. Os componentes podem ser misturados em qualquer ordem. A proteína de fusão ST-PA forma tetrâmeros que se ligam até quatro moléculas biotiniladas e quatro moléculas de IgG, em que cada uma delas é bivalente. Sem limitações no que se refere à teoria, crê-se que a ligação octavalente de complexos da invenção à superfície celular dota os 12 complexos de propriedades superiores de ligação e interiorização em comparação com outras imunotoxinas e complexos farmacêuticos imunológicos. A estreptavidina bloqueada com biotina consegue interagir especificamente com superfícies celulares através de uma sequência Arg-Tyr-Asp presente na proteína (o "sítio RYD"). Este sítio é distinto da fenda de ligação de biotina da proteína e tem homologia elevada com o domínio de ligação celular que contém RGD da fibronectina, que medeia interacções fibronectina-superfície celular (Alon et al.r 1993, Europ. J. Cell Biol. _60: 1-11). Estudos sugeriram que a estreptavidina actua como mimético próximo da fibronectina (Alon et al.r 1993, Europ. J. Cell Biol. 60: 1-11) .

Os domínios RYD e RGD conservados da fibronectina e estreptavidina funcionam como sequências de reconhecimento universais para interacções com muitos receptores ligados a membranas. Numa especificação da invenção, o componente estreptavidina do complexo pode ser modificado para alterar o sítio RYD. Tal como é aqui utilizado, o termo "sequência RYD modificada" inclui qualquer alteração no sítio RYD ou região flanqueadora que elimine a interacção relacionada com sítios não de ligação de biotina da estreptavidina com proteínas da superfície celular. Uma dessas modificações é a substituição de ácido aspártico por ácido glutâmico.

6. EXEMPLOS

6.1 MATERIAIS E MÉTODOS O plasmídeo pTSAPA-2, descrito na Patente dos Estados Unidos 5 328 985, publicada em 12 de Julho de 1994, tem o gene quimérico da estreptavidina e proteína A (região E e 13 D) . A expressão e purificação da fusão genética de ST-PA foram realizadas de acordo com os métodos seguintes.

Preparação da Proteína de Fusão 0 lisogene de estirpe bacteriana BL21 (DE3) (pLysS) foi transformado com o vector de expressão da fusão de estreptavidina-proteina A pTSAPA-2. A estirpe transformada cresceu a 37 °C em meio LB suplementado com 50 μg/ml de ampicilina, 34 μρ/ΓηΙ de cloranfenicol e glucose 0,2%. Quando a absorvância a 600 nm da cultura se situou entre OD 0,8 e 1,0, adicionou-se isopropil-p-D-tiogalactopiranósido (IPTG) 100 mM dissolvido em água para uma concentração final de 0,4 mM, com a finalidade de induzir o gene da RNA polimerase de T7 colocado sob o promotor lac UV5. Após a indução, as células foram incubadas a 37 °C com agitação durante 2 horas.

Procedeu-se à purificação da proteína quimérica de fusão estreptavidina-proteina A a 4 °C ou em gelo, a menos que indicado em contrário. A cultura (100 ml) de BL21 (DE3) (pLysS)(pTSAPA-2), incubada durante 2 horas após a indução, foi centrifugada a 2 900 x g durante 15 minutos. O grânulo celular foi suspenso em 10 ml de EDTA 2 mM, Tris-Cl 30 mM (pH 8,0), Triton X-100 0,1%, PMSF 0,5 mM, para proceder à lise das células, e o lisato foi armazenado a -70 °C até ser utilizado. Ao lisato celular descongelado adicionaram-se PMSF, leupeptina e pepstatina A para concentrações finais de 0,5 mM, 1 μΜ e 1 μΜ, respectivamente. Em seguida, o lisato foi tratado com 10 μg/ml de desoxirribonuclease I e 10 μg/ml de ribonuclease A na presença de MgS04 12 mM à temperatura ambiente durante 20 minutos. A mistura foi centrifugada a 39 000 x g durante 15 minutos e o grânulo 14 foi dissolvido em 100 ml de cloridrato de guanidina 7 M durante a noite a 4 °C com agitação. Depois da dissolução do grânulo, a proteína foi dialisada contra NaCl 150 mM, Tris-Cl 50 mM (pH 7,5), Tween 20 0, 05%, PMSF 0,1 mM, leupeptina 1 μΜ, pepstatina A 1 μΜ, NaN3 0, 02%. Para remover lentamente o cloridrato de guanidina, o saco da diálise com a solução proteica foi deixado durante a noite na solução de diálise (~1 000 ml) sem agitação, seguido de 3 mudas da solução de diálise e diálise com agitação a 4 °C. O dialisado foi centrifugado a 39 000 x g durante 15 minutos e o sobrenadante foi aplicado numa coluna de IgG Sefarose 6 Fast Flow (1,2 x 1,1 cm) previamente lavada com 5-10 volumes do leito de Tampão TST. Depois, a coluna foi equilibrada com 2-3 volumes do leito de cada um dos seguintes: 1) Ácido acético 0,5 M, pH 3,4 (pH ajustado com NH4CH3COOH (NH4Ac) ); 2) NaCl 150 mM, Tris-Cl 50 mM (pH 7,5), Tween 20 0,05% (Tampão TST); 3) Ácido Acético 0,5 M, pH 3,4, e 4) TST. A amostra foi aplicada na coluna e a proteína não ligada foi removida por lavagem da coluna com os seguintes: 1) 10 volumes do leito de TST e 2) 2 volumes do leito de NH4Ac 5 mM, pH 5,0. A eluição foi realizada com Ácido Acético 0,5 M, pH 3,4. O eluato foi recolhido em fracções de 1-2 ml e as fracções com a maior OD a 280 foram dialisadas contra NaCl 1 M, carbonato de sódio 50 mM (pH 11,0). O dialisado foi clarificado por centrifugação a 39 000 x g durante 15 minutos e foi aplicado numa coluna de 2-iminobiotina agarose (1,2 x 1,2 cm) previamente equilibrada com NaCl 1 M, carbonato de sódio 50 mM (pH 11,0). Depois das proteínas não ligadas terem sido removidas com a mesma solução, as proteínas ligadas foram eluídas com ureia 6 M, acetato de amónio 50 mM (pH 4,0). As proteínas eluídas foram dialisadas contra solução salina tamponada com Tris [TBS; NaCl 150 mM, Tris-Cl 20 mM (pH 7,5)] contendo NaN3 15 0,02% e o dialisado foi armazenado a 4 °C após filtração num filtro de 0,22 μιη (Millex-GV, Millipore) .

Formação do complexo ST-PA/mAb/^-Galactosidase biotinilada

Uma mistura de ~2 μς de anticorpo, ~28 μς de proteína de fusão e ~2 unidades de β-Galactosidase biotinilada foi incubada à temperatura ambiente durante pelo menos 10 minutos. Após esta incubação, o complexo está pronto a ser utilizado.

Coloração com β-Galactosidase (Coloração com X-GAL) A coloração com β-galactosidase de células que aderiram à placa foi realizada de acordo com Sanes et ai., 1986, EMBO J. 5: 3133-3142.

Utilizou-se o protocolo da Molecular Probes, Inc. para detectar a expressão do gene lacZ da β-Galactosidase em células que crescem em suspensão.

Utilizaram-se os protocolos acima para determinar se o complexo que contém o anticorpo acoplado à proteína de fusão e a enzima β-Galactosidase biotinilada foi transduzido com êxito na célula de eleição. Se a transdução tiver sido completa, as células ficaram azuis após incubação durante a noite. 2) Modificação da sequência RYD da proteína estreptavidina A estreptavidina bloqueada com biotina liga-se especificamente (Kd = 3 x 108 M) a superfícies celulares, presumivelmente via uma sequência contendo RYD que é distinta da fenda de ligação de biotina da proteína. 16

Espera-se que a alteração do domínio (sequência) RYD noutros resíduos de aminoácidos elimine a ligação superficial específica não relacionada com biotina de uma grande variedade de células.

Uma forma de modificar a sequência RYD consiste em alterar a sequência RYD em RYE. Pode alterar-se a sequência RYD em RYE introduzindo uma mutação pontual utilizando passos de PCR sequenciais. Isto pode ser feito concebendo dois "primers", DES (ID SEQ NO: 1) e DER (ID SEQ NO: 2) (ver Figura 5) e utilizando o vector de expressão pTSAPA-2 como modelo do gene da estreptavidina. Em primeiro lugar, conduz-se PCR utilizando dois pares de "primers": promotor de T7/DER e terminador de T7/DES. Em segundo lugar, os dois fragmentos de DNA amplificados são então purificados e reunidos numa amostra. Seguidamente realiza-se uma segunda ronda de PCR utilizando os produtos purificados reunidos da primeira ronda como modelos e os "primers" promotor de T7 e terminador de T7. A sequência RYE mutada no componente do gene da estreptavidina é confirmada por análise de sequências do produto da segunda ronda de PCR. 3) Distribuição de biotina-p-galactosidase em células A431

Para estudar a capacidade de ST-PA para distribuir compostos numa célula, comparou-se a distribuição deste complexo com a de um complexo em que a estreptavidina do "core" estava covalentemente ligada ao receptor de TGFa. Construiu-se pTSA-TGFa, um vector de expressão para estreptavidina-TGF-α (ST-TGF) substituindo o gene da proteína A em pTSAPA-2 por um gene do TGF-α humano maduro (aminoácidos 1-50) . 17

Para demonstrar a capacidade das proteínas de fusão ST-PA e ST-TGFa para distribuir proteína biotinilada em tipos específicos de células, β-galactosidase biotinilada foi complexada com o componente estreptavidina da proteína de fusão. Quantificou-se a distribuição de β-galactosidase em células A431 utilizando técnicas de coloração conhecidas e análise FACS. A ST-PA/biotina β-galactosidase foi complexada com mAb anti-EGFR, e o complexo resultante foi seguidamente incubado com células epidermóides humanas A431 que super-expressam o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR). Alternativamente, ST-TGF foi misturada com biotina-β-galactosidase, e o complexo resultante foi administrado a células A431.

Como mostrado na Figura 2, a proteína de fusão ST-PA distribuiu eficientemente biotina^-galactosidase em células A431 através de EGFR presente na sua superfície (células positivas > 99%). A proteína de fusão ST-TGFa também exibiu distribuição eficiente de biotina-β-galactosidase em células A431 (células positivas > 99%) . Surpreendentemente, a quantidade de biotina^-galactosidase distribuída em cada célula pela proteína de fusão ST-TGFa foi inferior à observada no sistema de distribuição ST-PA (a actividade de fluorescência média observada foi 214 e 2402, respectivamente). A distribuição altamente eficiente pela proteína de fusão ST-PA de biotina^-galactosidase em células A431 pode dever-se aos quatro sítios de ligação de biotina e IgG contidos em cada tetrâmero de ST-PA (Figura 1B) . Numa experiência temporal apresentada na Figura 3, mais de 99% de células exibiram coloração positiva para β-galactosidase 18 até 2 dias após a transferência de biotina-p-galactosidase para a célula. 4) Distribuição de biotina β-galactosidase em células utilizando mAbs de especificidades diferentes

Também se utilizou o procedimento experimental aplicado no estudo da distribuição de biotina β-galactosidase em células A431 para estudar a distribuição do complexo anticorpo/ST-PA/^-galactosidase biotinilada noutros tipos de células. No estudo utilizaram-se anticorpos que reconhecem várias moléculas diferentes da superfície celular. As linhas de células e moléculas da superfície celular utilizadas nesta experiência estão resumidas na Figura 4A. Como mostrado na Figura 4B, o complexo ST-PA/mAb foi altamente eficiente (células positivas > 99%) na transferência de β-galactosidase para os tipos de células humanas testados através das moléculas HLA-DR, CD33 e CD34 presentes na superfície destas células. 5) Vector de expressão ρΑΤ-β-galactosidase

Apesar da biotina poder ser incorporada em DNA (por exemplo, plasmídeos de expressão), a incorporação aleatória de biotina em DNA pode resultar em perda da actividade de transcrição. Para reter a actividade de transcrição do DNA a ser introduzido na célula, desenvolveu-se um novo sistema de transferência genética que emprega um vector de expressão pAT com um tracto poli(dA)/poli(dT) a jusante da cassete de expressão (Figura 5). De acordo com este sistema de transferência, o DNA a ser distribuído na célula é clonado no vector de expressão. 0 vector de expressão pAT 19 forma DNA em hélice tripla com um oligonucleótido poli(dT) biotinilado que se liga ao sítio de ligação de biotina da proteína de fusão ST-PA. 0 anticorpo ligado ao sítio de ligação de anticorpos da proteína de fusão ST-PA aborda selectivamente as células onde deve ser distribuído o DNA. 0 protocolo de formação de DNA em hélice tripla e transferência pelo DNA do gene da β-galactosidase para células é o seguinte. 0 gene da β-galactosidase é clonado na cassete de expressão do vector de expressão pAT (Figura 5) . A mistura de 4 μg de vector de expressão ρΑΤ-β-galactosidase e 20 pmol de oligonucleótido poli(dT) biotinilado (Promega) em tampão TMN (Tris 10 mM, pH 8,0, MgCl2 10 mM, NaCl 50 mM) é incubada a 37 °C durante 1 hora. Em seguida adicionam-se à mistura proteína de fusão ST-PA (0,5 μρ) e mAB (1,0 μς) e a mistura resultante é incubada à temperatura ambiente durante 30 minutos. O complexo DNA em hélice tripla-ST-PA-mAb é adicionado às células (1 x 106) e incubado a 37 °C durante 48 horas. Detecta-se a actividade de β-galactosidase por FACS.

Referências

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Goshorn, S.C., Svensson, H.P., Kerr, D.E., Somerville, J.E., Senter, P.D. e Fell, H.P. 1993. "Genetic construction, expression, and characterization of a single chain anticarcinoma antibody fused to b-lactamase". Câncer Res. 53: 2123-2127. 20

Siegall, C.B., Xu, Y.-H., Chaudhary, V.K., Adhya, S., FitzGerald, D. e Pastan, I. 1989. "Cytotoxic activities of a fusion protein comprised of TGFa and pseudomonas exotoxin". FASEB J. 3: 2647-2652.

Ghetie, M.-A., Laky, M., Moraru, I. e Ghetie, V. 1986. "Protein A vectorized toxins-I". "Preparation and properties of protein A-Ricin toxin conjugates". Mol.Immunol. 23g 1373-1379.

Kiyama, R., Nishikawa, N. e Oishi, M. 1994. "Enrichment of human DNAs that flank poly(dA). Poly (dT) tract by triplex DNA formation". J. Mol. Biol. 237: 193-200.

Ito, T., Smith, C.L. e Cantor, C.R. 1992. "Sequence-specific DNA purification by triplex affinity capture." Proc.Natl.Acad.Sei. USA 89: 495-498.

Alon, R., E. Bayer, M. Wilchek, 1993, "Cell Adhesion to streptavidin via RGD-dependent integrins" European Journal of Cell Biology 60_: 1-11. 21

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

(1) INFORMAÇÕES GERAIS (i) CANDIDATO: Meruelo, Daniel

Ohno, Kouichi Levin, Brandi

(ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: Sistema de Distribuição de Compostos Especifico para Tecidos de Alta Eficiência Utilizando Uma Proteína de Fusão Estreptavidina-Proteína A (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 4 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) DESTINATÁRIO: Pennie and Edmonds (B) RUA: 1155 Avenue of the Américas (C) CIDADE: Nova Iorque (D) ESTADO: Nova Iorque (E) PAÍS: E.U.A. (F) CÓDIGO POSTAL: 10036-2711 (v) FORMA DE LEITURA EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disquete

(B) COMPUTADOR: PC compatível com IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) "SOFTWARE": Patentln Tiragem #1.0, Versão #1.30 (vi) DADOS DA PRESENTE CANDIDATURA:

(A) NÚMERO DA CANDIDATURA (B) DATA DO REGISTO: (C) CLASSIFICAÇÃO: (viii) INFORMAÇÕES DO ADVOGADO/AGENTE: (A) NOME: Poissant, Brian M. (B) NÚMERO DO REGISTO: 28,462 (C) NÚMERO DE REFERÊNCIA/EXTRACTO: 8105-007 (ix) INFORMAÇÕES DE TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: (212) 790-9090 (B) TELEFAX: (212) 869-8864

(C) TELEX: 66441 PENNIE (2) INFORMAÇÕES PARA ID SEQ NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido 22 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO: 1: fy* ttiss'· iy mr ty* hi* v*i fjs* «iy Mf mp ser Pm M*

i $ 3.C SI f§ (2) INFORMAÇÕES PARA ID SEQ NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO: 2: il» SIw ãm Mf fw ¥«1 fia*· ®ly ff* Se® ¥®ô Ϊ i 10 10 (2) INFORMAÇÕES PARA ID SEQ NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO: 3: CGTTACGAAA GCGCCCCG 18 (2) INFORMAÇÕES PARA ID SEQ NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 15 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTAÇÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: ID SEQ NO: 4: 23 23 15

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Lisboa, 17 de Setembro de 2007

Claims (23)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Complexo para a transferência de um material de abordagem selectiva para uma célula, que compreende: (a) uma proteína de fusão de estreptavidina e proteína A com um sítio de ligação de anticorpos e um sítio de ligação de biotina; (b) um anticorpo ligado ao sítio de ligação de anticorpos, em que o anticorpo é específico para uma proteína da superfície celular e em que a proteína da superfície celular sofre endocitose depois de se ligar ao anticorpo, e (c) um material de abordagem selectiva biotinilado ligado ao sítio de ligação de biotina, cujo complexo é capaz de transferir o referido material de abordagem selectiva para uma célula quando contactado com a célula após a formação do referido complexo.

2. Complexo da Reivindicação 1, em que o material de abordagem selectiva é seleccionado do grupo que consiste numa toxina, um pró-fármaco, um produto genético MDR, um ácido nucleico de filamentaçâo simples, um ácido nucleico em hélice dupla ou uma proteína de uma bactéria ou vírus patológico.

3. Complexo da Reivindicação 2, em que o material de abordagem selectiva é uma toxina.

4. Complexo da Reivindicação 3, em que a toxina é seleccionada do grupo que consiste em: (a) timidina quinase; (b) endonuclease; 2 (c) RNAse; (d) alfa toxina; (e) ricina; (f) abrina; (g) exotoxina A de Pseudomonas; (h) toxina da difteria; (i) saporina; (j) momordina; (k) gelonina; (l) proteína antiviral de tintureira; (m) alfa-sarcina, e (n) toxina da cólera.

5. Complexo da Reivindicação 2, em que o material de abordagem selectiva é um pró-fármaco.

6. Complexo da Reivindicação 2, em que o material de abordagem selectiva é um produto genético MDR.

7. Complexo da Reivindicação 2, em que o material de abordagem selectiva é um ácido nucleico de filamentação simples.

8. Complexo da Reivindicação 2, que também compreende um ácido nucleico de filamentação simples biotinilado, com uma porção homopurina ou homopiridina, ligado ao sítio de ligação de biotina, e em que o material de abordagem selectiva é um ácido nucleico em hélice dupla que compreende um DNA de filamentação dupla que forma uma estrutura em hélice tripla com o ácido nucleico de filamentação simples biotinilado. 3

9. Complexo da Reivindicação 2, em que o material de abordagem selectiva é uma proteina de uma bactéria ou vírus patológico.

10. Complexo da Reivindicação 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9, no qual há quatro sítios de ligação de anticorpos e quatro sítios de ligação de biotina.

11. Complexo da Reivindicação 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9, em que o componente estreptavidina da referida proteína de fusão de estreptavidina e proteína A tem uma sequência RYD modificada.

12. Complexo da Reivindicação 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9, que também compreende um anticorpo que se liga ao receptor da transferrina.

13. Complexo da Reivindicação 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, em que o anticorpo reconhece um antigene de superfície seleccionado do grupo que consiste em: (a) HLA DR; (b) CD33; (c) CD34, e (d) receptor do EGF.

14. Complexo da Reivindicação 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9, em que o anticorpo é um anticorpo IgG.

15. Composição farmacêutica que compreende: (a) o complexo da Reivindicação 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9, e (b) um transportador farmaceuticamente aceitável, cuja composição está substancialmente livre de toxina não 4 ligada à proteína de fusão de estreptavidina e proteína A.

16. Método de transferência de uma toxina para uma célula, que compreende os passos seguintes: (a) formar um complexo que compreende: (i) uma proteína de fusão de estreptavidina e proteína A com um sítio de ligação de anticorpos e um sítio de ligação de biotina; (ii) um anticorpo ligado ao sítio de ligação de anticorpos, em que o anticorpo é específico para uma proteína da superfície celular e em que a proteína da superfície sofre endocitose depois de se ligar ao anticorpo, e (iii) uma toxina biotinilada ligada ao sítio de ligação de biotina; (b) isolar o complexo de toxina que não está ligada ao sítio de ligação de biotina, e (c) expor o complexo isolado a uma célula, de modo que a toxina entre na célula.

17. Método de transferência de material de abordagem selectiva para uma célula, que compreende os passos seguintes: (a) formar um complexo que compreende: (i) uma proteína de fusão de estreptavidina e proteína A com um sítio de ligação de anticorpos e um sítio de ligação de biotina; (ii) um anticorpo ligado ao sítio de ligação de anticorpos, em que o anticorpo é específico para uma proteína da superfície celular e em que a proteína da superfície sofre endocitose depois de se ligar ao anticorpo, e 5 (iii) material de abordagem selectiva biotinilado ligado ao sitio de ligação de biotina; (b) expor o complexo isolado a uma célula, de modo que o material de abordagem selectiva entre na célula; em que o material de abordagem selectiva é seleccionado do grupo que consiste num ácido nucleico de filamentação simples, um produto genético MDR e um pró-fármaco.

18. Método da Reivindicação 17, em que o material de abordagem selectiva é um ácido nucleico de filamentação dupla, em que um ácido nucleico de filamentação simples biotinilado está ligado ao sitio de ligação de biotina, e também compreendendo um DNA de filamentação dupla que forma uma estrutura em hélice tripla com o ácido nucleico de filamentação simples biotinilado.

19. Método da Reivindicação 16, 17 ou 18, em que o complexo tem quatro sitios de ligação de anticorpos e quatro sítios de ligação de biotina.

20. Método da Reivindicação 16, 17 ou 18, em que o componente estreptavidina da referida proteína de fusão de estreptavidina e proteína A tem uma sequência RYD modificada.

21. Método da Reivindicação 16, 17 ou 18, em que o complexo também compreende um anticorpo que se liga ao receptor da transferrina.

22. Método da Reivindicação 16, 17 ou 18, em que o anticorpo reconhece um antigene de superfície seleccionado do grupo que consiste em: (a) HLA DR; 6 (b) CD33; (c) CD34, e (d) receptor do EGF. que o

23. Método da Reivindicação 16, 17 ou 18, em anticorpo é um anticorpo IgG. Lisboa, 17 de Setembro de 2007