PT86318B

PT86318B - Processo de preparacao de proteinas imunogenicas

Info

Publication number: PT86318B
Application number: PT86318A
Authority: PT
Inventors: David R Milich; George B Thornton; Ann M Moriarty; Alan Mclachlan
Original assignee: Scripps Clinic Res
Priority date: 1986-12-09
Filing date: 1987-12-09
Publication date: 1990-11-07
Also published as: PT86318A; CA1329766C; AU8223187A; US4882145A; DK643387A; EP0271302A3; AU618942B2; JPS6425800A; DK643387D0; EP0271302A2

Description

REQUERENTE: SCRIPPS CLINIC AND RESEARCH FOUNDATION, nor te-americana (Estado de Califórnia), com se de em 10666 North Torrey Pines Road, La Jol_ la, Califórnia 92037, Estados Unidos da Amé rica.

EPÍGRAFE: Processo de preparação de proteínas imunogênicas

INVENTORES: George B. Thornton, Ann M. Moriarty, David R.

Milich e Alan McLachlan

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.

Estados Unidos da América em 9 de Dezembro de 1986 sob o n9 939,617 e em 7 de Outubro de 1987 sob o n? 106,538 inpi moo in rf tem

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Ref: EPG:ll-SCRF 110.1

PATENTE N2, 86 318

Processo de preparação de proteínas imunogénicas para que

SCRIPPS CLINIC AND RESEARCH FOOTDATION, pretende obter privilégio de invenção em Portugal.

RESUMO presente invento refere-se ao processo de preparação de polipeptídeos cuja sequência de resíduos de aminoácido corresponde a regiões de estimulação de células T da proteína de nucleocapsídeo do HBV. 0 presente invento refere-se também a um método para aumentar a imunogenicidade de um imunogénio polipeptídeo compreendendo a ligação operativa do polipeptídeo, através de uma cadeia lateral do resíduo aminoácido, a partículas de proteína do núcleo.

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-2MEMORIA DESCRITIVA

Referência cruzada com umpedido de patente relacionado presente invento é uma continuação do pedido de patente copendente n^s de série 939617 depositado em 9 de Dezembro de 1986.

Campo técnico da invenção presente invento refere-se à produção de novos antigénios sintéticos, relacionados com a proteína de nucleocapsídeo do virus da hepatite B (AgcHB), e à utilização desses antigénios na preparação de vacinas, agentes terapêuticos, etc. Mais especificamente, o presente invento refere-se ao processo de preparação de composições polipeptídicas que contêm determinantes de AgcHB de células T.

Antecedentes da invenção

Ho seu trabalho clássico The Specificity of Serological Reactions¹¹ publicado em 1936, Landsteiner mostrou que a formação de anticorpos contra um composto azo simples, podia ser induzida acoplando o composto a uma molécula imunogénica, tal como uma proteína ae soro. Ainda que a molécula azo simples não induza a formação de anticorpos quando injectada sozinha, o conjugado azo-proteína induz, quando injectado em animais, a produção de anticorpos anti-azo, bem como de anticorpos anti-proteína. Desenvolveu-se assim a noção de que, uma pequena molécula não imunogénica, estava a usar a grande molécula de proteína imunogénica como transportador.

fenómeno de uma molécula relativamente grande potenciar a imunogenicidade de uma entidade molecular à qual está ligada é conhecido na arte como o efeito do transportador

Cs efeitos do transportador podem ser definidos como a imunidade para um determinante (o determinante auxiliar ou de células T) de um imunogénio multideterminante aumentando a resposta a outro determinante (o determinante de células B). Assim, (η 052

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-3as células T, reconhecendo os determinantes auxiliares no antigénio, podem de alguma forma auxiliar as células B a produzirem anticorpos contra o antigénio específico das células B. Além disso, sabe-se não estarem os efeitos de transportador confinados a conjugados hapteno-proteína e poaem demonstrar-se, por exemplo, com subunidades de moléculas de proteína. Rajewsky et al., J. Exp. ked. 126:581 (1967).

Está agora bem demonstrado que a maioria dos antigénics requer o auxílio de células T para induzir as células B a produzir anticorpos. 0 cognato clássico do auxílio das células T requer a interacção directa, célula T - célula B, mediada por uma ponte de antigénio. De acordo com Rajewsky et al., J. Exp. Med., 129:1131 (1969), os determinantes antigénicos, reconhecidos pela célula T auxiliar (Th) e pelas células B, têm de estar covalentemente ligados formando uma entidade molecular única, liais recentemente, vários grupos têm sugerido que a ligação cον alente pode não ser necessária, quando o determinante da célula T e o determinante da célula B são apresentados no contexto de uma partícula grande, tal como um vírus. Este mecanismo de auxílio aas células T tem sido designado de intermolecular/intraestrutural, pois os determinantes das células T e B estão presentes como entidades moleculares que não estão covalentemente ligadas, mas que estão operativamente ligadas em termos da interacção célula T - célula B, em virtude de estarem contidos numa estrutura que o sistema imunológico vê como sendo unitária. Veja-se, Russel et al., Mature, 280:147 (1979), Lamb et al., J. Immunol ., 129:1465 (1982), Scherle et al., J. Exp. Med., 164: :1114 (1986), e Lake et al., Cola Spring Harbor Symp. Quant. Bicl., 41:^89 (I976). Alguns antigénios porém, podem induzir a formação de anticorpos na ausência de células T. Estes são designados por antigénios independentes do timo (T-independentes). A maioria, se nãG todos, os antigénics que actuam na ausência de células T auxiliares são compostos de subunidades repetidas do mesmo determinante antigénico. Os antigénios T - independentes mais vulgarmente usados são, a flagelina polimerizada (uma proteína de subunidades repetidas) ou vários polissacáridos (que sao unidades de açúcares repetidas).

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-4Os conjugados hapteno-transportador são hoje muito utilizados na determinação da função qe várias células na resposta imunológica. Porém, se bem que os conjugados hapteno-transportador tenham servido bem a comuniaade científica nas suas investigações sobre a natureza da resposta imunológica, não foram ainda significativamente utilizados na produção de imunogénios que desempenhem um papel importante em diagnóstico ou em modalidades terapêuticas.

Recentemente, verificou-se que uma proteína relacionada com um patogénio, pode ser imunologicamente mimetizada produzin_ do um polipeptídeo sintético cuja sequência corresponde à de um domínio determinante da proteína relacionada com o patogénio. Os resultados são referidos por Sutcliffe et al., Nature, 287: :801 (198o), e Lerner et al., Proc. Hatl. Acad. Sei. USA, 78: :3403 (1981).

Além disso, Gerin et al., (19θ3) Proc» Matl. Acad. Sei. USA, 80:2365 mostraram recentemente a protecção limitada dos chimpanzés ao vírus da hepatite B após imunização com polipeptídeos sintéticos ligados a um transportador, com sequências de resíduos de aminoácidos que correspondem à sequência de uma porção determinante do AgsHB; em particular, os resíduos 110-137 da região S (ue superfície). Porém, a proteína transportadora usada nestes estudos foi a hemocianona de lapa Keyhole” (KLH), um transportador dependente de células T que não é adequado para ser utilizado em seres humanos, uma vez que é uma fonte de irritação que conduz a uma inflamação grave.

Desde há muito que a arte tem procurado uma proteína transportadora, estimulante de células T, capaz de aumentar a imunogeneidade de imunogénios polipeptídicos, que não produza em indivíduos humanos efeitos secundários inaceitáveis. Têm-se usado muito frequentemente proteínas imuncgénicas naturais, particularmente o toxóide tetânico, quando é necessário um transportador adequado para administração a humanos. Porém, mesmo a utilização do toxóide tetânico, tem sido restringida devido a problemas com limitações de dosagem e ao risco de os indivíduos se tornarem sensíveis ao próprio toxóide. Adicionalmente, pode ocorrer uma supressão epítopa específica, mesmo em indivíduos

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-5já imunizados contra o tétano.

Os esforços activos na pressecução da identificação de pro teínas transportadoras altamente imunogénicas, resultaram no trabalho de Delpeyroux et al., Science, 233:472-475 (1986) que refere a utilização da proteína de superfície do VHB (proteína S) como transportador para um imunogénio polipeptídeo do vírus da polja Estes investigadores construíram um veículo de expres são de proteína do ácido desoxiribonúcleico (ADN) recombinante, que produz uma proteína de fusão, designada por AgPoliosHB, capaz de fcrmar partículas bastante iaênticas às partículas autên ticas de AgsHB com 22 nanómetros . G AgPoliosHB consiste de proteína S do VHB com uma sequência de 11 resíduos de aminoácidos inserida, correspondente aos aminoácidos 93ίθ3 8a proteína de capsídeo VPI do vírus da polio do tipo 1 (estirpe Mahaney).

Delpeyroux et al. referiram que o anti-soro de ratinhos imunizados com AgPoliosHB tinha um título significativo de anticorpos neutralizantes do vírus da polio. Contudo, estes autores referem também que 0melhor título obtido é baixo para os padrões do vírus da polio e que é necessário mais trabalho para melhorar 0 título.

Breve sumário da invenção

G presente invento contempla um conjugado polipeptídico imunogénico que compreende uma proteína AgcHB operativamente li gada, através da cadeia lateral de um resíduo de aminoácido, a um imunogénio polipeptídico. Em concretizações preferidas do presente invento, o conjugado compreende a proteína do núcleo na forma de partículas, operativamente ligada a um imunogénio relacionado com um patogénio, tal como 0 AgsHB.

Também se contempla uma proteína de fusão imunogénica compreendendo proteína AgcHB operativamente ligada, no seu terminal carboxilo, por uma ligação peptídica, a um imunogénio polipeptídico, preferivelmente a um imunogénio relacionado com um patogénio, e mais preferivelmente ao AgsHB. Adicionalmente, as proteínas de fusão do presente invento compreendem proteínas AgcHB operativamente ligadas, por uma ligação peptídica, a uma proteína relacionada com um patogénio. Preferivelmente, os re67 052

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síduos de aminoácidos do imunogénio polipeptídico estão substituídos por um certo número, preferivelmente um número idêntico, de resíduos de aminoácidos da proteína do núcleo.

No presente invento é ainda contemplado um polipeptídeo estimulante de células T, consistindo essencialir.ente em cerca de 15 a cerca de 7θ resíduos de aminoácidos, com uma sequencia correspondente a uma região da proteína do núcleo do VHS, desde cerca do resíduo de aminoácido na posição 7 até cerca da posição 140, a partir do terminal amino da proteína do núcleo.

Adicionalmente, o presente invento contempla um imunogénio polipeptídico composto, compreendendo pelo menos 20 resíduos de aminoácidos e incluindo um polipeptídeo estimulante de células T, consistindo essencialmente cie cerca de 15 a cerca de 17 resíduos de aminoácidos, com uma sequência correspondente à sequên cia de resíduos aminoácidos da proteína do núcleo, desde cerca da posição 70 até cerca da posição 140, a partir do terminal amino da proteína do núcleo. 0 polipeptídeo estimulante de células T está operativamente ligado a um imunogénio polipeptídico 0 presente invento contempla também um método para aumentar a imunogenicidade de um imunogénio polipeptídico, preferivelmente de um imunogénio relacionado com um patogénio, que compreende ligar operativamente ao imunogénio um polipeptídeo, contendo um epítopc de AgcHB de células T.

Breve descrição dos desenhos

Nos desenhos, que constituem uma parte da presente descrição:

A figura 1 ilustra a sequência de resíduos de aminoácidos da proteína do núcleo do VHB, subtipo ayw da esquerda para a direita no sentido do terminal amino para o terminal carboxilo e, usando c código de resíduos de aminoácidos de uma letra. As sequências para os outros subtipos são bem conhecidas na arte.

A figura 2 ilustra a sequência de resíduos de aminoácidos, orientada como na figura 1 e usando o código de resíduos de aminoácidos de uma letra da região pré-S do AgsHB de seis subtipos de VHB. A linha adicional de resíduos apresentada representa os aminoácidos que são homólogos em todos os seis subtipos. Os al67 0$2

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-7garismos por cima das sequências ilustram as posições na sequência a partir do terminal amino, com o algarismo que indica cada décima posição representado verticalmente em vez de na forma horizontal usual. As sequências dos subtipos foram publicadas nas referencias que se seguem: ayw - Galibert et al., (1979) Hature, 281;o46; adw/adr - Ono et al., (19θ3) Hucl. Acids Res., 11:1747; adw₉ “ Valenzuela et al., (1908) em ICN-UCLA Symposia on Animal Virus Genetics, Fields et al., eds. ρρ 577θ> Academic Press; adyw - Pasek et al., (1979) Hature, 282:575; © adr^ - Fujiyama et al., (1983) Nucl. Acids Res., 11:4601.

A figura 3 ilustra a sequência de 226 aminoâcidos da proteí na S da proteína ayw/AgsHB, orientaaa como na figura 1 e usando o código de resíduos de aminoâcidos de uma letra, tal corno foi traduzida por Pasek et al., (1979) Nature, 282:575 a partir da sequência de ácido nucleico. As determinações das sequências de nucleotídeos de outros subtipos de VHB podem ser encontradas em Pasek et al., Id.; Valenzuela et al., (1979) k^Tature, 280:815-819; θ Galibert et al., (1979) Mature, 281:646-650.

A figura 4 mostra que a proteína do núcleo, na forma de partículas pode funcionar como um antigénio independente de células T. Imunizaram-se grupos de cinco ratinhos, B10.BR eutímicos (+/+) (Painel A) ou B10.BR atímicos (nu/nu) (B), intraperitonealmente com uma só dose de 4,0 jug (·), 1,5 jug (°) ^ou 0,5 P-S ( · ) de proteína ao núcleo, na forma de partículas, na forma, de AgsHB recombinante derivado de E. coli (AgcHBr; Biogen) ou com

1,5 Jdg (D ) de proteína do núcleo desnaturada (AgcHB-D) em CFA. 0 núcleo em partículas foi desnaturado a uma concentração final de 0,1 fo de SDS e de 0,1 % de 2-mercaptoetanol durante 2 horas a 37°C, dez e vinte e quatro dias após a imunização os socos foram recolhidos, reunidos e analisados em relação a actividade de anticorpos anti AgcHB, por RIA de fase sólida 10 e 24 dias após imunização. Como liganao da fase sólida usou-se o núcleo na forma de partículas ou AgcHB-D, anticorpos de cabra para Ig de ratinho foi o segundo anticorpo, e como sonda usou-se anti125 corpo de suíno para Ig de ratinho marcado com 'I. Os valores são expressos como o inverso da maior diluição de soro para se ter 4X as contagens dos soros de pré-imunização.

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A figura 5 mostra que o AgcHB estimula eficientemente células T. Imunizaram-se grupos de 4 ratinhos uas estirpes indicadas, com 4 p.g de AgcHB em CFA, nas almofadas das patas traseiras, e 8 dias depois as células do gànglio linfático, drenadas foram colhidas e cultivadas in vitro com concentrações variadas de AgcHB, proteína do núcleo em partículas. Após 24 horas de cultura recolheram-se os sobrenadantes e te staram-se para determinar a produção de IL-2.

As estirpes com maior resposta demonstraram uma activação de células T específica do AgcHB para uma concentração de AgcHB tão baixa como 0,03 ng/ml, que é equivalente a 0,0014nM.

A figura 6 mostra o efeito da dose de imunização na resposta proliferativa de células T, específicas do AgcHB. Imunizaram-se grupos de 4 ratinhos C^HQ com 12, 8, 4 ou 1 )Ug de proteína do núcleo em partículas em CFA, nas almofadas das patas traseiras, e 8 dias depois, as células do ganglio linfático, drenadas, foram cultivadas com concentrações variadas de proteína do núcleo, e após 96 horas de cultura determinou-se a proliferação de células T por incorporação de /““^H_7-TdR.

A figura 7 mostra que a produção de anticorpos anti AgcHB precede e é de maior magnitude do que a de anti AgsHB, em ratinhos Balb/c entímicos. Imunizaram-se grupos de cinco ratinhos, Balb/c eutímicos (+/+) (Painel A) ou Balb/c atímicos (nu/nu) (Painel B), intraperitonealmente com uma mistura de AgcHBr (8jig) e de AgsHB (8 /g) em CFA. Amostras de soro, obtidas antes e 6, 12 e 24 dias após a imunização, foram reunidas e analisadas por RIA para determinar a actividade anti-AgcHB e anti-AgsHB. Os valores estão expressos como o inverso do logg da maior concentração de soro para se ter 4X as contagens dos soros de pré-imunização.

A figura 8 mostra que o AgcHB e o AgeHB reagem cruzadamente ao nível da célula T. Inocularam-se grupos de quatro ratinhos C^HQ nas almofadas das patas traseiras, quer com 4,0 μg de proteína do núcleo em partículas (Painel A) quer com 4,0 jug de AgcHB desnaturado (AgcIIB-D) (Painel B) em CFA. Após 8 dias as células de ganglio linfático drenadas foram colhidas, reunidas e cultivadas a concentrações variadas de proteína do núcleo em

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Ref: EPG:11-SCRF 110.1 partículas sonicadas e com AgcHB desnaturado (AgcHB-D), a várias concentrações, de 0,0015 a 1,0 microgramas por mililitro (jug/ml).

Adicionalmente cultivaram-se algumas células T ino culadas com proteína de núcleo em partículas (Painel A) na presença de várias concentrações (ue 0,06 a 240 Jig/ml) de polipeptídeo sintético pl00-120. Mediu-se a activação das células T pela produção de IL-2 induzida pelo antigénio. A produção de IL-2 é expressa como a incorporação de /“^H_7-TaR por células NK-A cultivadas no sobrenadante das culturas tratadas com antigénio, menos a incorporação que ocorreu no sobrenadante de culturas de controlo não tratadas com antigénio CPM). Este é um teste representativo de experiências realizadas em três ocasiões separadas.

A figura 9, Painéis A e B, ilustra a localização de centros de células T na sequência AgcHB/AgeHB usando peptídeos sintéticos. Imunizaram-se grupos de 4 ratinhos de cada uma das estirpes indicadas, com 4 jig de proteína do núcleo em partículas e as células do ganglio linfático drenadas foram colhidas 8 dias após a imunização e cultivadas in vitro, com os fragmentos de peptídeo sintético apresentados, ou com proteína do núcleo em partículas como controlo positivo. Mediu-se a activação de células T pela proaução de IL-2 inuuzida pela concentração de peptídeo óptima (determinada para cada peptídeo e na gama de 25 a 64 jug/ml) que se mostra. A concentração de proteína do núcleo em partículas AgcHB foi de 0,5 /ig/ml.

Os peptídeos diferentes foram reconhecidos pelas diferentes estirpes murinas. A estirpe C^H.Q reconheceu as sequências pl-20 e pl00-120. A estirpe B10.S (Painel A) reconheceu as sequências p2ô-52 e pl20-140. A estirpe B10.D2 (Painel A) reconheceu as sequências p70-94, p85-100 (que se sobrepõem) e pl20-140. A estirpe B10 reconheceu exclusivamente a sequência pl20-140. A estirpe B10.M reconheceu exclusivamente a sequência plOO-120. Os centros de reconhecimento de células T para as estirpes B10.BR e B10.P (ambas do Painel B) não foram ainda identificados. Todos os centros activos são comuns a ambas as sequências AgcHB e AgeHB sugerindo que estes antigénios reagem cruzadamente ao nível da célula T.

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Ref: EPG:11-SCRF-110.1 /fj ......

/ ._,.-,χ. -Jilr¹ -10A figura 10, Painéis A e B, ilustra a capacidade do peptídeo sintético pl20-14o para induzir e estimular na estirpe B10.S, uma resposta de proliferação de células T específica do AgcHB. Imunizaram-se grupos de 4 ratinhos nas almofadas das patas traseiras, quer com 4 jig de proteína do núcleo em partículas (AgcHB Painel A), quer com 100 çig ae pl20-140 (Painel B) e 8 dias depois, as células drenadas do gânglio linfático foram colhidas e cultivadas in vitro, com proteína do núcleo em partículas AgcHB com peptídeo pl20-140 ou com p85-100, nas várias concentrações apresentadas, tendo-se determinado a produção ãe IL-2.

As células T da estirpe B10.S preparadas com AgcHB reconheceram muito eficientemente ο ρ120-14ϋ. A inspecção da curva de resposta à dose demonstra que uma concentração tão baixa como C,OOOl^ yig/ml foi suficiente para induzir a produção de IL-2. As células T da estirpe B10.S inoculadas com AgcHB não reconheceram a sequência ρ85-1ΟΟ. Ha experiência inversa os ratinhos B10.S foram inoculados com pl20-140 (Painel B). As células T inoculadas com pl20-140 reconheceram o peptídeo imunizante e não a sequência p85-100, e reconheceram o AgcHB nativo.

A figura 11, Painéis A e B, ilustra os resultados de um estudo similar ao descrito na figura 10, mas usando a estirpe de ratinhos B10. Aqui as curvas de resposta às doses para o AgcHB (proteína do núcleo em partículas) e para o pl20-140 parecem estar ainda mais de perto relacionadas do que na estirpe B10.S (Figura 10). Este facto pode indicar que o p-120-140 representa o único centro de reconhecimento relevante das células T, para a estirpe B10.

A figura 12, Painéis A, B e C, ilustra a capacidade dos fragmentes pl00-120 e pl-20 para induzir e estimular na estirpe C^H.Q, uma resposta de proliferação de células T específica do AgcHB. Este estudo foi também realizado de uma forma similar ao estudo cujos resultados se apresentam na figura 10. Inocularam-se células T de C^H.Q in vivo, quer com proteína do núcleo em partículas (AgcHB; Painel A), quer com peptídeo sintético pl-20 (Painel B), quer com peptídeo sintético pl00-120 (Painel C). 0 estímulo de proliferação in vitro foi fornecido por proteína ,r

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-lido núcleo em partículas (AgcHB), por pl00-120 ou por pl-20, nas várias concentrações de antigénio apresentadas.

A figura 13, Painéis A e B, ilustra a capacidade do fragmen to peptídico p-85-10 para induzir e estimular na estirpe B10.D2, uma resposta de proliferação ae células T.específica do AgcHB. De novo, este estudo foi realizado de uma forma similar ao estudo cujos resultados se apresentam na figura 10. Inocularam-se células T de B10.D2 in vivo, quer com proteína do núcleo em partículas (AgcHB; Painel A) quer com peptídeo p8£-100 (Painel B). 0 estímulo de proliferação in vitro foi fornecido por proteína do núcleo em (AgcHB), por p85-100 ou por pl20-140, nas várias concentrações de antigénio apresentadas.

A figura 14 mostra que células Th de ratinhos B10.S inoculadas com AgcHB e com pl20-140, podem induzir a produção de anticorpos específicos para as regiões S, pré-S(2) e pré-S(l) do envelope do VHB. Inocularam-se ratinhos B10.S, quer com apenas CFA (0, painel superior), quer com 4,0 pg da AgcHB em CFA (painel do meio), quer com 100 ug de pl20-14G em CFA (painel inferior), que foram inoculados três semanas mais tarde com uma dose sub-optima, quer duma mistura (misturados mas não operativamente ligados) de AgcHB e de AgsHB/P39 (que possui antigénios das regiões pré-S(l), pré-S(2) e S), quercom VHB em adjuvante incomple to ou com adjuvante sozinho. 0s soros foram recolhidos sete dias após a inoculação e analisados para determinar a produção de anticorpos IgG específicos para as regiões S, pré-S(2) e pré-S(l) do AgsHB, por RIA de fase sólida.

A figura 1$ ilustra uma representação esquemática das interacções, células T auxiliares - células B, regulando as respostas imunológicas ao virus da hepatite B e a partículas subvirais (esferas, filamentos). As colunas de células B (anticorpo) ilustram os epítotos antigénicos para os quais se produz o anticorpo. As colunas de células T ilustram as especificidades das células Th que podem fornecer um auxílio funcional para a produção de anticorpos aos vários determinantes de células B. Todas as interacções célula Th-célula B apresentadas têm sido experimentalmente substanciadas, com excepção da capacidade das células Th S-específicas em auxiliar a produção de anticorpos

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-12anti-pré-S(2) e anti-pré-S(l) e da capacidade das células Th pré-S(2)-específicas em auxiliar a produção de anticorpos anti-pré-S(l), que são inferidas. Ilustram-se também as quantidades relativas de vírus e de partículas subvirais circulando no soro, e a expressão diferencial dos antigénios pré-S nas várias formas durante e na ausência de replicação virai.

A figura 16 mostra a especificidade do reconhecimento das células T do AgcHB, na estirpe B10.S (H-2^S). Imunizaram-se grupos de quatro ratinhos B10.S nas almofadas das patas traseiras com (a) 4,0 )ig de AgcHB (b) 100 p.g dos peptídeos sintéticos pl2G-14C; (c) p!20-131; ou (d) pl29-140 em CFA. Oito dias após a preparação, as células PLN drenadas foram colhidas, reunidas e cultivadas com as concentrações indicadas (0,00015-16 ^ig/ml) de AgcHB pl20-14C·, pl2C-131, p!29-140 ou com meio sózinho, e mediu-se a proliferação de células T por incorporação de /^¾ 7-TdR. Os valores obtidos são expressos como CPM corrigida para a proliferação residualna ausência de antigénio (A CPM), A proliferação residual variou de 800-2000 CPM.

A figura 17 ilustra a especificidade do reconhecimento das b células T do AgcHB na estirpe ΒΙΟ (H-2 ). Imunizaram-se grupos de quatro ratinhos B10 nas almofadas das patas traseiras com (a) 4,0 ^ig de AgcHB; (b) 100 jug dos peptídeos sintéticos pl20-140; (c) pl2O-131; ou (d) pl29-140 em CFA. Oito dias após a inoculação, as células PLN drenadas foram colhidas, reunidas e cultivadas às concentrações indicadas (0,00015-16 ^ug/ml) de AgcHB, AgeHB, pl20-14G, pl20-131, P129-141, ou meio sózinho e determinou-se a proliferação de células T, tal como se descreve para a figura 16.

A figura 18 ilustra o facto de os centros sintéticos de células T do AgcHB representados por pl2G-140, pl20-131, e pl29-140 poderem sensibilizar células Th que induzem a produção de anti-HBc in vivo. Inocularam-se grupos de cinco ratinhos, BlQS (painel superior) ou B10 (painel inferior) (l^s) por imunização i.p. com 100 jug de pl20-14C, pl20-131, p-129-14C em CFA ou com CFA sózinho. Três semanas depois os ratinhos inoculados foram sensibilizados (2^S), quer com uma dose subcptima de AgcHB (O,ljUg) em adjuvante incompleto, quer com adjuvante sózinho (0). Sete

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-13dias após a dose ae sensibilização recolheram-se os soros que foram reunidos e analisados por RIA de fase sólida para determinar a produção de anticorpos anti-HBc da classe IgC. 0 título de anti-HEc está expresso como a mais alta diluiçãG de soro requerida para dar quatro vezes as contagens dos soros antes da imunização.

A figura 19 mostra a especificidade do reconhecimento das células T do imunogénio sintético C120-140 (133-140) nas estirpes E1G.S, B10 e B1C.BR. Imunizaram-se grupos de quatro ratinhos, B10.S (painel superior), B10 (painel do meio) ou B10.BR (painel inferior), com 100 pg de cl2C-14C-(133-140) em CFA, nas almofadas das patas traseiras. Cito dias após a imunização, as células PLN drenadas foram colhidas, reunidas e cultivadas a várias concentrações dos antigénios indicados e determinaram-se as respostas de proliferação de células T como se descreve para a figura 1. Ilustra-se o nível ae proliferação de células T induzido por uma concentração de 1,0 jig/ml dos antigénios indicados. A proliferação residual situou-se na gama de CPM.

Descrição detalhada da invenção

A. Definições termo anticorpo refere-se a uma molécula que é membro de uma família de proteínas glicosiladas, designadas por imunoglobulinas, que se podem combinar especificamente com um antigénio.

A palavra antigénio tem sido historicamente utilizada para aesignar uma entidade a que um anticorpo se liga, e também para designar a entidade que inauz a produção do anticorpo. A utilização mais corrente limita o significado de antigénio à entidade a que um anticorpo se liga, enquanto que para a entidade que induz a produção de anticorpos se usa a palavra imunogénio Quanao uma entidade aqui referida for imunogénica e antigénica, esta será tipicamente designada por imunogénio ou por antigénio de acordo com a sua utilidade.

Determinante antigénico refere-se à parte estrutural res.1 do antigénio à qual imunologicamente se ligam, um centro de com-

o52

Ref; EPCríll-SCRF 110.1

-14binação de anticorpo ou um receptor de células T. 0 termo é também interpermutavelmente usado com epítopo.

A palavra conjugado tal como é aqui utilizada refere-se a dois ou mais polipeptídeos operativamente ligados através de um resíduo de aminoácido de cadeia lateral.

termo substituição conservativa tal como é aqui utilizado pretende significar o facto de um resíduo de aminoácido ter sido substituído por outro resíduo biologicamente similar. Exemplos de substituições conservativas incluem a substituição de um resíduo hidrofóbico, tal como- isoleucina, valina, leucina ou metionina, por outro, ou a substituição de um resíduo polar por outro, tal como, arginina por lisina, ácido glutânico por aspártico ou glutamina por asparagina, etc. 0 termo substituição conservativa inclui também a utilização de um aminoácido substituído em vez de um aminoácido idêntico não substituído, desde que os anticorpos criados para um tal polipeptídeo reajam também imunolcgicamente com o polipeptídeo correspondente contendo o aminoácido não substituído.

termo corresponde nas suas várias formas gramaticais, tal como é usado em relação a sequências peptídicas, designa a sequência peptídica descrita mais ou menos até três resíduos de aminoácidos em qualquer ou em ambos os terminais amino ou carboxilo, e contendo apenas substituições conservativas em resíduos de aminoáciaos particulares ao longo da sequência do polipeptídeo,

Epítopo refere-se à porção de uma molécula à qual se ligam especificamente um receptor de antigénio de célula T ou um centro de combinação de anticorpo.

Tal como é aqui utilizado, o termo proteína de fusão designa pelo menos duas sequências de resíduos de aminoácidos, que não se encontram normalmente ligadas na natureza,operativamente ligadas terminal a terminal (da cabeça à cauda) por uma ligação peptídica entre os seus resíduos de aminoácidos terminais respectivos. As proteínas de fusão do presente invento são capazes de induzir a produção de anticorpos que reagem imundogicamente com um polipeptídeo ou com um imunogénio relacionado com um patogénio, que corresponde, na sequência de resíduos de

C$2

Ref: EPGíll-SCRF 110.1

-1$aminoácidos, ao polipeptídeo ou à porção relacionada com o patogénio, da proteína ue fusão.

A expressão AgcHB como é aqui utilizada refere-se a proteínas ou a polipeptídeos estimulantes de células T cora uma sequência de resíduos de aminoácidos que corresponde a uma sequência de resíduos de aminoácidos codificada pelo gene da proteína de nucleocapsídeo do vírus da hapatite B. A proteína do núcleo ccm uma sequência de resíduos de aminoácidos como a apresentada na figura 1, a proteína precursora AgcHB que inclui a sequência apresentada na figura 1, e a proteína AgeHB que é uma porção polipeptídica ua sequência apresentada na figura 1, são exemplos bem conhecidos de proteínas naturais codificadas pelo gene de nucleocapsídeo do VHB. Se é feita alguma referência a uma porção polipeptídica de qualquer das proteínas naturais codificadas pele gene ae nucleocapsídeo do VHB, essa referência é explicita quer indicando, por exemplo, que se está a referir uma porção estimulante ue células T da proteína particular, quer designando especificamente a porção particular da sequência, quer por indicação das posições dos resíduos de aminoácidos incluídos.

termo reage imunologicamente nas suas várias formas designa a ligação entre um antigênio como ligando e uma molécula contendo o centro de combinação de anticorpo, tal como uma porção Fab de um anticorpo inteiro.

A expressão operativamente ligado tal como é aqui utilizada significa que a ligação não interfere com a capacidade de qualquer cios grupos ligados em funcionar como se descreve; por exemplo, em funcionamento como determinante de células B ou T. Assim, ligar operativamente inclui, não apenas ligações covalentes, mas também ligações capazes de induzir o funcionamento intermolecular/intraestrutural de células T auxiliares.

A expressão relacionado, com um patogénio tal como é aqui utilizada designa um polipeptídeo que é capaz de induzir a produção de anticorpos que reagem imunologicamente com um patogénio na sua forma original.

As palavras polipeptídeo e peptídeo são usadas alternadamente através aa descrição e designara uma série linear de aminoácidos ligauos uns aos outros por ligações peptídicas entre

052.

Ref: EPG:11-SCRF 110.1

-16cs grupos alfa-amino e carboxilo de aminoácidos adjacentes. Os polipeptídeos podem ter vários comprimentos, quer nas suas formas neutras (nãocarregadas), quer na forma de sais, e quer sem modificações, tais como glicosilação, oxidação de cadeia lateral ou fcsforilação, quer contendo estas modificações. E bem conhecido na arte que as sequências ue aminoácidos contêm grupos ácidos e básicos, e que o estado de ionização particular exibido pelo peptídeo é dependente do pH do meio envolvente quando a proteína está em solução e/clo meio a partir do qual se obteve a proteína, se esta está na forma sólida. Incluem-se também na definição as proteínas modificadas por substituintes adicionais ligados às cadeias laterais dos aminoácidos, tais como unidades glicosilo, lípioos, ou iões inorgânicos tais como fosfatos, bem como modificações relacionadas com conversões químicas das cadeias, tal como a oxidação de grupos sulfidrilo. Assim polipeptídeo, ou as suas designações equivalentes, pretende incluir a sequência apropriada de aminoácidos referenciada, sujeita às modificações anteriores que não destruem a sua funcionalidade.

A palavra proteína designa um polipeptídeo com cerca de ou mais resíduos de aminoáciaos.

Os termos segrega eproquz são muitas vezes utilizados alternadamente na arte, em relação a células a partir das quais se obtêm moléculas de anticorpos. As células que prGduzem anticorpGS podem porém não segregar essas moléculas para o seu meio ambiente. Aqui, as moléculas ae anticorpo são segregadas e obtidas a partir da corrente sanguínea (anticorpo humoral). Apesar disso, os anticorpos são geralmente referidos como sendo produzidos, mantendo-se a expressão utilizada na arte.

A expressão polipeptídeo (ou proteína) da região S (ou pré -Sl, pré-S2 ou pré-S) é aqui e na arte, utilizada para referir toda a região designada de um subtipo da proteína AgsHB ou de um polipeptídeo com uma sequência de resíduos correspondente. Se se faz referência a uma porção de qualquer dessas regiões, essa referência é explicita, quer indicando, por exemplo, que se está a referir uma porção da região S, quer designando especificamente a porção particular da sequência, quer por indicação das posições dos resíduos de aminoácidos incluídos.

W C'$2 . ,

Ref: EPG:11-SCRF 110.1

-17A designação os pclipeptídeos ae 25 kilodalton (kd) do AgsHB, ou polipeptídeo AgsHB de 25 kd, é aqui usada para indicar o polipeptídeo da região S na forma glicosilada ou não glicosilada, também designado por p25 e gp28. Similarmente, o polipeptídeo de 3 3kd do AgsHB e o polipeptídeo de 39 kd do AgsHB são usadas para designar as formas glicosilada ou não glicosflada desses polipeptídeos, e são também designados por p33 ^eP39.

E. Conjugaaos imunogénicos ae AgcHB

Os requerentes verificaram que ligar operativamente um imunogénio de polipeptídeo ao AgcHB, particularmente ao AgcHB na forma de partícula, aumenta surpreendentemente a imunogenicidade do imunogénio ligado até um grau inesperado, através da operação dos aeterminantes, indepenaentes e dependentes de células T, do AgcHB anteriormente desconhecidos. Assim, o presente invento contempla um conjugado de polipeptídeo imunogénico compreendendo uma proteína AgcHB operativamente ligada a um imunogénio polipeptídico através de um resíduo de aminoâcido de cadeia lateral.

Se bem que a proteína AgcHB presente no conjugado possa estar substancialmente na forma monomérica, nas concretizações preferidas, esta está na forma de um agregado, tal como as bem conhecidas partículas de proteína do núcleo de 27 nanometros (nn) naturais.

São bem conhecidos na arte os métodos para produzir proteínas AgcHB em geral e proteínas do pré-núcleo, núcleo e AgcHB em particular. Por exemplo, pode isolar-se a proteína do núcleo em partículas, de 27 nm (AgcHB em partículas), a partir do sangue ou do fígado de indivíduos cronicamente infectados com VHB. Ver, por exemplo, Feitelson et al., J. Virol., 43:687-96 (19θ2). Adicionalmente, o AgcHB e o AgeHB podem ser preparados por uma variedade de técnicas de ADN recombinante bem conhecidas. Ver, por exemplo, as patentes dos E.U.A. n^e 4356270 de Itakma e n^e4563423 de Murray et al., respectivamente, cujas descrições são todas aqui incorporadas por referência.

São bem conhecidos os métodos para ligar operativamente po-

052

Ref: EPG:ll-SCRF 110.1

-18lipeptídeos individuais, através da cadeia lateral, de um resíduo de aminoácido para formar um conjugado imunogénico, i.e., um polímero polipeptídeo de cadeia ramificada. Esses métodos incluem a ligação através de um ou mais tipos de grupos funcionais em várias cadeias laterais, e resulta em as espinhas dorsais dos polipeptídeos respectivos ficarem ligadas covalentemente (acopladas) mas separadas por pelo menos uma cadeia lateral.

Grupos funcionais de cadeia lateral úteis incluem grupos epsilon-amino, grupos beta-ou gama- carboxilo, grupos tiol (-SH) e aneis aromáticos (por exemplo tirosina e histidina). Métodos para ligar polipeptídeos usando cada um dos grupos funcionais anteriores são descritos por Erlanger, Method of Enzymology, 70:85 (19θθ)? Aurameas, et al. , Scand. J. Immunol., Vol. 8, SupL. 7, 7“23 (1978) o na patente dos E.U.A. n^s 4,493795 úe Hestor et al., cuja descrição é aqui incorporada como referência. Adicionalmente, pode realizar-se uma reacção de acoplamento dirigida a um local, tal como é descrito por Rodwell et al., Biotech, 3, 889-894 (1985); por forma que a actividade biológica dos polipéptídeos não seja substancialmente diminuída.

Além disso, tal como é bem conhecido na arte, poaem usar-se a proteína AgcHB e 0 imunogénio de polipeptídeo na sua forma nativa, ou pode modificar-se o seu conteúdo em grupos funcionais por succinilação dos resíduos lisina ou por reacção com cisteína-tiolactona. Pode também incorporar-se um grupo sulfidrilo em qualquer polipeptídeo, por reacção das funções amino com iminotiolano ou com 3“(3“ditiopiriail)propionato de N-hidroxisuccinimidilo. Os polipeptídeos podem também ser modificados para incorporar braços espaçadores, tal como hexametilenodiamina ou outras moléculas bifuncionais de tamanho similar, para facilitar a ligação.

Pode ligar-se à proteína AgcHB qualquer imunogénio polipeptídico contra o qual se deseje ter uma produção de anticorpos, para formar um conjugado imunogénico do presente invento. Has concretizações preferidas 0 imunogénio polipeptídico é um imunogénio relacionado com um patogénio e o conjugado tem a capacidade de induzir a produção de anticorpos que reagem imunologicamente com 0 patogénio, quando injectado numa quantidade eficaz

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Ref: EPG:11-SGRF 110.1

<

num animal. Exemplos de imunogénios de particular importância são os derivados de bactérias, tais como B. pertussis, S, typosa, S. paratyphoid Λ e B, G. aiptheriae, 0, tetani, C. botulinum, C. perfringens, B. anthracis, P. pestis, P. multocida, V. cholerae, M. meningitides, N. gonorrhea, H. influenzae, T. pal1adium, etc; imunogénios derivados de virus tais como vírus da polio, adenovírus, vírus da paragripe , vírus do sarampo, vírus da papeira, vírus RS, vírus da gripe, vírus da encefalomielite equina, vírus da cólera do porco, vírus de Newcastle, vírus da varíola das aves, vírus da raiva, vírus da esgana felina e canina, vírus da febre aftosa, vírus de imunodeficiência de simio e humana, etc; o imunogénio da rickettsia tal como o tifo epidémico e endémico, e os grupos da meningite, etc. Os imunogénios são bem conhecidos na técnica .anterior em numerosas referências, tais como nas patentes dos E.U.A. n^s 3149036, ^3983228 e n⁹ 4069313; em Essential Immunology 3^a Ed., por Roit, publicado por Blackwell Scientific Publications; em Fundamentais of Clinicai Immunology, de Alexander e Good, publicado por W.B. Saunders; e em Immunology, por Bellanti, publicado por W.B. Saunders. Os imunogénios relacionados com patogénios particularmente preferidos são os descritos nas patentes dos E.U.A. n⁹ 462^015, n⁹ 4544500, n⁹ 4545931, n⁹ 4663436, n⁹ 4631191, n⁹ 4629783 e nas Patent Cooperation Treaty International Publication n⁹ WO87/O2775 © n® WO87/C2892, cujas descrições são aqui incorporadas como referência.

São bem conhecidos na arte os métodos para determinação da presença de anticorpos para um imunogénio, numa amostra do organismo de um animal imunizado.

Em concretizações preferidas o imunogénio polipeptídico é um imunogénio relacionado com um patogénio que reage imunologicamente com, i.e., é imunologicamente ligado por anticorpos induzidos pelo patogénio. Mais preferivelmente, o imunogénio relacionado com 0 patogénio é capaz de induzir uma resposta de anticorpos que fornece protecção contra a infecção provocada pelo patogénio. São bem conhecidos os métodos para determinar a presença de ambos os anticorpos de reacção cruzada e protectores.

Em concretizações preferidasα imunogénio polipeptídico re-

G52

Ref: EPG:11-SCRF 110.1

-20lacionado com um patogénio, é o antigénio de superfície do vírus da hepatite B (AgsHB). Tal como é aqui utilizada, a designa ção AgsHB refere-se às partículas naturais de 22 nm, filamentares e esféricas, aos polipeptídeos individuais mais importantes e às suas formas glicosiladas que compreendem as partículas (tais como, p25/gp28, p39/gp42 e gp33/gP3ó) e aos polipeptídeos sintéticos que correspondem, na sequência de aminoácidos, a porções das proteínas e glicoproteínas individuais.

Assim, numa concretização, o imunogénio relacionado com um patogénio, é o AgsHB filamentar ou esférico. Noutra concretização ó imunogénio relacionado com o patogénio é uma proteína AgsHB de 33 kilodalton ou uma proteína AgsHB de 25 kilodalton. Numa outra concretização o imunogénio polipeptíuico é um polipeptídeo sintético que corresponde a uma porção da região pré-S do AgsHB localizada entre uma posição amino terminal e uma posição carboxilo terminal, respectivamente, seleccionada do grupo consistindo de 1-21, 16-27, 32-53, 53~?4, 94-105, 94-117, 106-117, 120-140, 120-145, 128-138, 133-139, 133-140, 133-143, 133-145, 135-143, 135-145, 137-143, 133-151 e 153-171. Na figura 2 apresenta-se a sequência de resíduos de aminoácidos da região pré-S do AgsHB.

Ainda numa outra concretização, o imunogénio polipeptídico corresponde a uma porção da região 3 do AgsHB, localizada entre as posições amino terminal e carboxilo terminal, respectivamente, seleccionadas de um grupo consistindo de 110-137, 117-137, 122-137 θ 135-155· Na figura 3 apresentou-se a sequência de resíduos de aminoácidos ua região S do AgsHB.

Descrevem-se seguidamente os métodos de preparação dos imunogénios polipeptídicos.

C. Proteínas de fusão AgcHB

Crê-se que a imunogenicidade inesperadamente forte da proteína do núcleo ao VHB em partículas verificada pelos requerentes, seja resultado de um efeito sinérgico entre as suas características inaependentes de células T e dependentes de células T.

Como anteriormente se discutiu, a arte tem sugerido que a independência de células T é consequência de um número mínimo de haptenos ou epitopos apropriadamente espaçados, i.e,, um pa67 052

Ref: EPG:11-SCRF 110.1

-21drão repetitivo de determinantes idênticos, que é expresso numa molécula de peso molecular relativamente elevado. Assim o presente invento contempla a utilização vantajosa da estrutura molecular repetitiva inerente, na proteína do núcleo em partículas para apresentar de outra forma, os imunogénios polipeptídicos dependentes de células T, de um modo independente de células T, i.e., numa disposição independente de células T.

As proteínas de fusão são particularmente bem adaptadas para conseguir o propósito de apresentar os imunogénios polipeptídicos numa disposição independente ae células T. Deste modo, o presente invento contempla uma proteína de fusão compreendendo proteína do núcleo do VHB com um imunogénio polipeptídico, preferivelmente um imunogénio relacionado com um patogénio, inserido entre resíduos de aminoácidos normalmente adjacentes na proteína do núcleo natural, de forma a que o imunogénio polipeptídico se exprima de um modo independente de células T, quando a proteína forma uma partícula ou agregado ordenado. Preferivelmente, os resíduos de aminoácidos que formam o imunogénio polipeptídico são substituídos por um número idêntico de resíduos de aminoácidos da proteína do núcleo que se sabe estarem presentes na superfície de partículas do núcleo de 22 nm.

São bem conhecidos os métodos para determinar a presença de sequências de resíduos de aminoácidos que estão presentes na superfície de uma proteína ou ae uma partícula de proteína: Esses métodos incluem determinar se os anticorpos, induzidos por um peptídeo que corresponde, na sequência de resíduos de aminoácidos, a uma porção da proteína, reagem imunologicamente ou não com a partícula de proteína na sua forma nativa (intacta) Usando este método têm-se verificado que, na superfície de partículas do núcleo intactas, estão presentes sequências de resíduos de aminoáciao, desae cerca da posição 14 até cerca da posição 35 ^e desde cerca aa posição 73 até cerca da posição 87. Gs polipeptídeos inseridos os substituindo essas regiões numa proteína de fusão estão deste modo presentes, numa disposição independente de células T, na superfície das partículas formadas pela proteína de fusão.

.\ssim, em concretizações preferidas, uma proteína imunogé-

c52

Ref: EPG;11-SCRF 11G.1

-2<ínica de fusão do presente invento compreende um imunogénio polipeptídico, consistindo essencialmente de cerca de 10 a cerca de 30 resíduos de aminoácidos, operativamente ligado, por uma ligação peptídica, a uma sequência de flanqueamento do terminal amino e a uma sequência de flanqueamento do terminal carboxilo. Λ sequência cie flanqueamento do terminal amino consiste essencialmente de cerca de 10 a cerca de 20 resíduos de aminoácidos com uma sequência de resíduos de aminoácidos correspondente, em sequência, à proteína do núcleo desde cerca da posição 1 até cerca da posição 35· A sequência de flanqueamento do terminal carboxílo consiste essencialmente ae cerca de 120 a cerca de 160 resíduos de aminoácidos com uma sequência de resíduos de aminoácidos correspondente; em sequência, à proteína do núcleo aesde cerca da posição 10 até cerca da posição 183. Preferivelmente, a sequência de flanqueamento do terminal amino corresponde, em sequência, à proteína do núcleo desde cerca da posição 1 até cerca da posição 15, e a sequência de flanqueamento do terminal carboxilo corresponde, em sequência, à proteína do núcleo desde cerca da posição 3θ até cerca da posição 183.

Fo presente invento está também contemplada uma proteína imuncgénica ue fusão compreendendo, um imunogénio polipeptídico, consistindo essencialmente de cerca de 10 a cerca 3θ resíduos de aminoácidos, operativamente ligado por uma ligação peptídica a uma sequência de flanqueamento do terminal amino e a uma sequência de flanqueamento do terminal carboxilo. A sequência de flanqueamento do terminal amino consiste essencialmente de cerca de 7θ a cerca 90 resíduos de aminoácidos com uma sequência de resíduos de aminoácidos correspondente, em sequência, à proteína do núcleo desoe cerca da posição 1 até cerca da posição 90. A sequência de flanqueamento do terminal carboxilo consiste essencialmente de cerca de 65 a cerca de 85 resíduos de aminoácidos com uma sequência de resíduos de aminoácidos correspondente, em sequência, à proteína do núcleo, desde cerca da posição 80 até cerca da posição 183.

Fuma outra concretização, o presente invento contempla um proteína imunogénica de fusão compreendendo uma proteína AgcHB operativamente ligada,por uma ligação peptídica, a um imunogénio

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Ref: EPG:11-3CRF 110.1

-23relacionado com um patogénio, preferivelmente um imunogénio que reage imunologicamente com anticorpos induzidos pelo patogénio.

Em concretizações preferidas, a proteína imunogénica de fusão compreende a proteína do núcleo do VHB operativamente ligada, por uma ligação peptíuica, a uma sequência de resíduos de aminoácidos que corresponde a uma porção de região pré-S do AgsHB cuja sequência de resíduos ae aminoácidos se mostra na figura 2. São também preferidas as concretizações onde a proteína do núcleo está ligada a uma porção da região S do AgsHB cuja sequência ae resíduos de aminoácidos se mostra na figura 3·

Numa outra concretização, o presente invento contempla uma proteína imunogénica de fusão compreendendo uma proteína AgcHB cperativamente ligada, no seu terminal carboxilopor uma ligação peptídica, ao terminal amino de um imunogénio polipeptídico, pre ferivelmente de um imunogénio relacionado com um patogénio.

Podem preparar-se as proteínas imunogénicas de fusão do presente invento por técnicas de ADN recombinante bem conhecidas. Conhecem-se as sequências de ADN que codificam as proteínas do pré-núcleo, do núcleo e AgeHB. Similarmente, conhecem-se as sequências de ADN de muitos imunogénios polipeptídicos e de imunogénios relacionados ccm um patogénio. Podem ligar-se aprcpriadamente as sequências de ADN que codificam a proteína AgcHB, a uma ou mais sequências de ABN que codificam um imunogénio polipeptídico ou um imunogénio relacionado com um patogénio, formando-se uma molécula de ADN recombinante que é inserida num veículo de expressão e expressa, num hospedeiro apropriado, na forma de uma proteína de fusão da invenção.

Exemplos de descrições que descrevem técnicas de preparação de sequências de ADN por engenharia genética, que se podem usar para produzir uma proteína de fusão do presente invento, podem encontrar-se em: patentes aos E.U.A. n^s 4428941 de Galibert et al.; n^s 4237224 de Cohen et al.; n^s 4273875 de Manis; n^e 4431739 ae Riggs; n^s 4363877 ae Goodman et al.; e em Rodriguez & Tait, Recombinarj.t DNA Techniques; An Introducticn, The Bejamin-Cummings Publishing Co., Inc. Menlo Park, CA (19Ô3), E.U.A. cujas descrições são incorporadas como referência. Discutem-se aqui seguidamente outras técnicas de recombir.ação de ADN aplica-

052

Ref: EPG:11-SCRF 110.1 veis.

D. Polipeptídeos estimulantes de células T

Os estudos que aqui a seguir se descrevem identificaram duas regiões da proteína do núcleo do VHB que contêm epítopos estimulantes de células T. Essas regiões correspondem às posições de resíduos de aminoácidos desde cerca de 1 a cerca de 55 e desde cerca de 70 a cerca de 140 a partir do terminal amino da sequência da proteína do núcleo do subtipo ayw que se mostra na figura 1. Grê-se que essas regiões, 1-44 e 70-140 da proteína do núcleo do VHB não contêm os determinantes que suprimem a activaçãc das células T.

Deste modo, o presente invento contempla um polipeptídeo estimulante de células T consistindo essencialmente de cerca de 15 a cerca de 55 resíduos de aminoácidos, com uma sequência correspondente à sequência de resíduos de aminoácicios da proteína do núcleo do VHB desde cerca da posição 1 até cerca da posição 55 a partir do seu terminal amino. Os polipeptídeos pl-20 e p28-52, cujas sequências de resíduos de aminoácidos mostram na Tabela 1 seguinte, são os polipeptídeos preferidos que correspondem a uma porção da região da proteína do núcleo anteriormente referida.

Tabela 1

Polipeptídeos Sintéticos

Designação do peptídeo Sequência de resíduos de aminoâcido

pl-20	LIDIDPYKEFGATVELLSFLP
p28-52	RDLLDTASALYREALESPEHCSPHH
Ρ70-94	TWVGVNLEDPASRDLVVSYVNTMMG
p85-100	VVSYVMTNMGLKFRQL
p85-96	VVSYVNTHMGLK
pl00-120	LWHISCLTFGRETVIEYLV
plOO-HO	LLWFHISCLTF
Ρ120-140	VSFGVWIRTPPAYRPPNAPIL
P12O-131	VSFGVWIRTPPA
pl2 9-140	PPAYRPPNAPIL
P125-136	WIRTPPAYRPPN

052

Ref: EPGíll-SCRF 110.1

Todos os resíduos de aminoácido aqui identificados estão na sua configuração natural ou configuração L. Mantendo a nomenclatura padrão dos polipeptíaeos, /~~J. Biol. Chem., 243, 3557-59 (1969)^7 na tabela de Correspondência seguinte indicam-se as abreviaturas utilizadas para uesignar os resíduos de ami noácido.

Tabela de Correspondência

Símbolo Aminoácido letra 3 letras

Y	Tyr	L-tirosina
G	Gly	glicina
F	Phe	L-fenilalanina
M	Met	L-metionina
A	Ala	L-alanina
S	Ser	L-serina
I	Ile	L-isoleucina
L	Leu	L-leucina
T	Thr	L-treonina
v	Vai	L-valina
P	Pro	L-prolina
K	Lys	L-lisina
H	His	L-histidina
Q	Gin	L-glutamina
E	Glu	L-ácido glutãmico
Z	Glx	L-ácido glutãmico ou L-glutamina
w	Trp	L-triptofam
R	Arg	L-arginina
D	Asp	L-ácido aspártico
E	Asn	L-asparagina
B	Asx	L-ácido aspártico ou L-asparagina
C	Cys	L-cisteína

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Ref: EPG-.ll-SCRF 110.1

-26Numa outra concretização, o peptídeo estimulante de células T consiste essencialmente em cerca de 15 a cerca de 70 resíduos de aminoácidos com uma sequência correspondente à sequência de resíduos de aminoácidos da proteína do núcleo do VHB desde cerca da posição 7θ até cerca da posição 140 a partir do seu terminal amino. Os polipeptídeos p7G-94, p85-100, p85-96, plOO-120, plOO-110, pl20-140, pl20-131, pl25-136 θ pl29-140, cujas sequências de resíduos de aminoácidos se mostram na tabela 1 anterior, são os polipeptídeos preferidos que correspondem a uma porção da região da proteína do núcleo anteriormente referida.

Os polipeptídeos estimulantes de células T do presente invento correspondem aos epítopos de células T do presente invento correspondem aos epítopos de células T expressos pelas proteínas, do núcleo do VHB e AgeHB naturais. Como consequência, esses polipeptídeos podem ser operativamente ligados a outro imunogénio e utilizados para aumentar a produção de anticorpos que reagem imunologicamente com o imunogénio.

Tal como foi anteriormente referido, podem formar-se ligações por vários processos. São particularmente úteis um grande número de agentes heterobifuncionais que geram uma ligação dissulfureto num terminal do grupo funcional e uma ligação peptídica no outro, incluindo o 3-(2-piridiltio)propionato de N-hidroxissuccinimidilo (SPDP). Este reagente cria uma ligação dissulfureto entre ele próprio e um resíduo cisteína numa proteína, e uma ligação amida através dum grupo amino numa li sina ou de outro grupo amino livre na outra. Conhecem-se uma grande variedade cte agentes que formam dissulfureto/amida. Vêr, por exemplo, Immun. Rev. (1982) 62:185· Outros agentes bifuncionais de acoplamento formam um tioéter em vez de uma ligação dissulfureto. Muitos destes agentes de formação de tioéter estão dis poníveis comercialmente e incluem ésteres reactivos do ácido 6-maleimidocaproíco, do ácido 2-bromoacético, do ácido 2-iodoacético, do ácido 4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-l-carboxílico, etc. Os grupos carboxílo podem ser activados por combinação destes com succinimida ou com o sal de sódio do ácido l-hidróxi-2-nitro-4-sulfonico. 0 agente de acoplamento particularmen./

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-27te preferido para o método do presente invento é o 4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-l-carboxilato de succinimidilo (SMCC) obtido na Pierce Company, Rockford, 111. E.U.A. Não se pretende que a lista anterior seja exaustiva, e podem usar-se, como é óbvio, modificações dos compostos referidos.

Os requerentes demonstram que os epitopos de células T específicos do AgcHB podem auxiliar os clones de células B, específicos do envelope, a produzir anticorpos,, ainda que os centros de células T específicos do AgcHB e os epitopos de células B específicos do envelope estejam presentes em moléculas diferentes na mesma partícula. Deste modo, o aprisionamento de múltiplos centros sintéticos de células T numa partícula artificial torna-se um bom método para concentrar um grande número de determinantes auxiliares de células T que funcionarão para induzir a função de célula Th para a produção de anticorpos, para qualquer epítopo de célula B presente na mesma partícula. Elimina-se assim a necessidade de ligar covalentemente grandes números de células T e de epitopos de células B.

Deste modo, um outro método para ligar operativamente um polipeptídeo estimulante de células T do presente invento e um polipeptídeo relacionado com um patogénio de interesse, inclui o aprisionamento numa estrutura artificial na forma de partículas, tal como, por exemplo, lipossomas e ISC0M'S (complexos imunoestimulantes). E bem conhecida a utilização dos lipossomas e dos ISCOMS como veículos para transportar os ingredientes eficazes duma vacina, bem como a sua preparação. Vêr, por exemplo, Gregoriadis, Trends Biotech., 3*235>-241 (1986) e North et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 79:7504-08 (1982), para a preparação de lipossomas e Morein et al., Nature, 308:4^7-460 (1987) e Dalsgaard, Arch ges. Virusforsch., 44:243-2^4 (1974) para a preparação de ISCOM. Um lipossoma ou um ISCOM do presente invento inclui pois como ingredientes eficazes um polipeptídeo estimulante de células T do presente invento, preferivelmente um peptídeo da tabela 1, e um polipeptídeo relacionaao com um patogénio, preferivelmente AgsHB, e mais preferivelmente o polipeptídeo P133-140 do AgslíB. Outros polipeptídeos relacionados com um patogénio preferidos são, por exemplo, os peptídeos cíclicos

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Ref: EPG:11-SCRF 110.1

-28do AgsHB descritos por Dreesman et al., Nature, 295*158-160 (1982), i.e., peptídeos pll7-137 do AgsHB onde a Cys na posição 121 foi substituída por uma ser, e pl22-137 onde a arg da posição 122 fci substituída por uma lys.

Os polipeptídeos estimulantes de células T do presente invento podem ser preparados por um certo número de formas convencionais. Em virtude de serem sequências curtas, podem ser preparados por síntese química usando processos convencionais, quer na forma de entidades separadas, quer ligadas, terminal a terminal, com um imunogénio polipeptídico.

As técnicas de fase sólida são particularmente convenienI tes (vêr por exemplo Erikson, B. W. et al., The Proteins (1976)

v. 2, Academic Press, New York, p. 255)· De facto, estão disponíveis comercialmente sintetizadores de fase sólida automáticos, bem como os reagentes necessários para a sua utilização. Assim é não só possível imitar as sequências de aminoácidos das regiões 1-20, 28-52,e 7θ“140 da proteína do núcleo do VHB, mas também realizar facilmente na sequência, modificações, por subs tituição, adição ou omissão dos resíduos apropriados. Modificações particularmente convenientes, tal como anteriormente se referiu, incluem a adição de um resíduo cisteína no terminal carboxílo para constituir um grupo sulfidrilo para ligação conveniente ao imunogénio polipeptídico. Adicionalmente, podem incorporar-se elementos espaçadores, tal como um resíduo glicina adicional, na sequência entre o aminoácido de ligação no ter minai C e o restante peptídeo.

Também em virtude das sequências desejadas serem relativamente curtas, as técnicas recombinantes para produzir estes pep tídeos, sozinhos ou em combinação com uma sequência de resíduos de aminoácidos do imunogénio polipeptídico, são particularmente úteis. Como anteriormente se referiu, conhecem-se na arte as sequências de ADN que codifica o AgcHB e uma variedade de imunogénios polipeptídicos. As sequências de codificação para peptídeos do comprimento aqui contemplado poaem ser facilmente sintetizadas por técnicas químicas, por exemplo, pelo método de fosfotriéster de Matteucci, M. et al., J. Am. Chem. Soc. (1981) 103:3185· Claro que, sintetizando a sequência de codificação,

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Ref: EPG:11-SCRF 110.1

-29pode efectuar-se qualquer modificação, desejada, substituindo simplesmente as bases apropriadas pelas que codificam a sequência peptídica original. A sequência de codificação pode então ser munida com ligadores apropriados e ligada em vectores de expressão, agora vulgarmente disponíveis na arte, e a vectores de regulação, e utilizada para transformar hospedeiros adequados para produzir a proteína desejada.

Estão agora disponíveis um certo número de vectores e de sistemas de hospedeiro adequados. São fornecidas em plasmídeos sequências promotoras compatíveis com hospedeiros bacterianos, contendo centros de restrição convenientes, para inserção da sequência de codificação desejada. Vectores plasmídicos típicos são, por exemplo, o pUC8 e o pUC13, preparados por Messing, J., na Universidade do Minnesota, E.U.A.; (vêr por exemplo Messing et al., LTucleic Acids Res. (1981) 9ί3θ9) ou o pBR322, preparado no New England Biolabs. Promotores adequados incluem, por exemplo, os sistemas promotores de beta-lactamase (penicilinase) e de lactose (lac) (Chang, et al., Fature (1977) 198: :1056) e c sistema promotor de triptofano (trp) (Goeddel, D., et al., Kucleic Acids Rec. (1980) 8:4057)· Os vectores de expressão resultantes são transformados em hospedeiros bacterianos adequados usando o método do cloreto de cálcio descrito por Cohen, S.H., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1972) 69í211C·. Os transformantes bem sucedidos podem produzir os fragmentos de polipeptídeo desejados em níveis mais elevados do que os que se verificam em estirpes que produzem normalmente os pili intactos. Podem também, como é óbvio, usar-s© hospedeiros de células de levedura ou de mamífero, utilizando os vectores e as sequências de controlo adequadas.

Assim, numa concretização do presente invento, liga-se ope rativamente um polipeptídeo estimulante de células T do presente invento, preferivelmente um dos polipeptídeos apresentados na tabela 1, ao AgsHB preferivelmente ao terminal amino ou carboxilo do AgsHB para formar uma proteína de fusão, preferivelmente uma proteína de fusão que forma filamentos ou partículas.

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Ref: EPG:11-SCRF 110.1

E. Imunogénio de polipeptídeo composto

Numa concretização, um imunogénio de polipeptídeo composto compreende um polipeptídeo estimulante de células T da invenção, preferivelmente um dos polipeptídeos apresentados na tabela 1, operativamente ligado a um polipeptídeo relacionado com um patogénio. Assim, numa concretização, um imunogénio polipeptídico composto compreende uma sequência de pelo menos 20 resíduos de aminoácidos, que inclui um polipeptídeo estimulante de células T consistindo essencialmente de cerca de 15 a cerca de 70 resíduos aminoácido, com uma sequência correspondente à sequência de resíduos de aminoácidos da proteína do núcleo, desde cerca da posição 70 até cerca da posição 140 a partir do seu terminal amino, operativamente ligado a um imunogénio polipeptíaico. Em concretizações preferidas o polipeptídeo estimulante de células T é p7O-94, p85-lúO, p85-96, pl00-120, pl00-110, p]20 -140, pl2O-131 ou P129-140, como se mostra na tabela 1. Mais preferivelmente, o imunogénio polipeptíaico composto compreende o pl00-120 operativamente ligado a AgsHB em partículas através da cadeia lateral de um resíduo de aminoácido, i.e., o imunogénio composto é um conjugado AgsHB em partículas -pl00-120.

Noutra concretização, o imunogénio polipeptídico composto da presente invenção é caracterizado por compreender um polipeptídeo estimulante de células T do presente invento operativamente ligado, terminal a terminal, a um polipeptídeo relacionado com um patogénio, por uma ligação peptídica para formar uma sequência de resíduos de aminoácidos composta com pelo menos cerca de 15 a cerca de 70 resíduos de aminoácidos.

Um outro imunogénio composto preferido, compreende o plOO-120 ou o pl20-140, operativamente ligado, por uma ligação peptídica, a uma sequência de resíduos de aminoácidos seleccionada do grupo de sequências, da esquerda para a direita e no sentido do terminal amino para o terminal carboxilo, representadas pelas fórmulas:

DPRVRGLYFPAGG, e

DPRVRGLI.

0s imunogénios de polipeptídeos compostos do presente invento podem ser preparados pelos métoaos sintéticos e de ADN

Λ' .......χϊΛΚ*

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Ref: EPG.11-SCRF 110.1

-31bem conhecidos, anteriormente referidos.

F. Métodos para aumentar a imunogenicidade

Podem usar-se os polipeptídeos contendo epítopos de célu-. las T de AgcHB para aumentar a imunogenicidade de um imunogénio polipeptídico, preferivelmente ae um imunogénio relacionado com um patogénio. TJm método para conseguir esse objectivo compreende, genericamente, ligar operativamente um polipeptídeo, contendo epítopos de células T de AgcHB, com o imunogénio.

Em particular, o presente invento contempla um método para aumentar a imunogenicidade de um imunogénio polipeptídico, que compreende ligar operativamente o imunogénio ao AgcHB, preferivelmente à proteína do núcleo e mais preferivelmente à proteína do núcleo em partículas, através da cadeia lateral de um resíduo de aminoacido.

presente invento contempla também um método para aumentar a imunogenicidade de um imunogénio relacionado com um patogénio compreendendo a ligação do imunogénio ao AgcHB, preferivelmente à proteína do núcleo, por uma ligação peptídica. Quando se usa proteína ao núcleo, a ligação ocorre preferivelmente no terminal carboxilo da proteína do núcleo.

No presente invento está também contemplado um método para aumentar a imunogenicidade de um imunogénio polipeptídico, | que compreende ligar operativamente o dito imunogénio de polipeptídeo a um polipeptídeo estimulante de células T, consistindo essencialmente de cerca de 15 a cerca de 70 resíduos de aminoácidos com uma sequência correspondente à sequência de resíduos de aminoácidos do AgcHB, desde cerca da posição 70 até cerca da posição 140 a partir do seu terminal amino.

Os métodos para aumentar a imunogenicidade anteriormente referidos podem ser realizados usando as técnicas de produção e ligação que anteriormente se descreveram.

G. Vacinas

Numa outra concretização, usa-se um conjugado imunogénico de AgcHB, proteína de fusão, polipeptídeo estimulante de célu-

ο?2

Ref: EPG:11-SCRF 110.1

-32las T ou polipeptídeo composto, do presente invento, numa composição farmaceuticamente aceitável que, quando administrada numa quantidade eficaz, é capaz ue induzir anticorpos que reagem imunologicamente com imunogénio polipeptídico ou com imunogénio relacionado com um patogénio, que correspondem, em sequência de resíduos de aminoácidos, ao imunogénio polipeptídico ou relacionado com um patogénio, operativamente ligado,usado na vacina. É também bem conhecida na arte a preparação de vacinas que contêm sequências peptídicas como ingredientes activos. Tipicamente, estas vacinas são preparadas na forma, quer de soluções líquidas quer de suspensões injectáveis; podem também prepaI rar-se formas sólidas adequadas para dissolver ou suspender em líquido antes da injecção. Podem também preparar-se emulsões. 0 ingrediente imunogénico activo é muitas vezes misturado com excipientes que são farmaceuticamente aceitáveis e compatíveis com o ingrediente activo. Excipientes adequados são, por exemplo, água, soro fisiológico, dextrose, glicerol, etanol, etc., e suas combinações. Adicionalmente, a vacina pode conter, se desejado, quantidades menores de substâncias auxiliares, tais como agentes molhantes e emulsionantes, agentes tamponantes do pH ou adjuvantes, que aumentem a eficácia da vacina.

As vacinas administram-se, convencionalmente, parenteralmente, por injecção, quer subcutânea quer intramuscular. Formulações adicionais que são adequadas para outras formas de administração incluem, supositórios e, em alguns casos formulações orais. Para supositórios, os aglomerantes e transportadores convencionais podem incluir, por exemplo, polialquilenoglicois ou triglicéridos; estes supositórios podem ser formados a partir de misturas contendo o ingrediente activo na gama de 0£$ a 10$, preferivelmente de 1-2$. As fGrmulações orais incluem os excipientes normalmente utilizaaos tais como, por exemplo, tipos farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina de sodio, celulose, carbonato de magnésio, etc.. As composições tornam a forma de soluções, suspensões, comprimidos, pílulas, cápsulas, formulações de libertação retar dada ou pós e contêm l,O%-95$ de ingrediente activo, preferível mente 2,5-70$·

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Ref: EPG:11-3CRF 110.1

V·' r

-33Podem formular-se os polipeptídeos em vacina, nas formas neutras ou de sais. Os sais farmaceuticamente aceitáveis inclu em os sais de aaição de ácido (que se formam com os grupos livres amino do peptídeo) e que se formam com ácidos inorgânicos tais como, por exemplo, ácido clorídrico ou fosfórico, ou com ácidos orgânicos, tais como os ácidos acético, oxálico, tartárico, mandélico, etc. Os sais que se formam nos grupos carboxilo livres podem também ser obtidos a partir de bases inorgânicas tais como, por exemplo, hidróxidos de sódio, potássio, amónio, cálcio ou ferrico, ou de bases orgânicas tais como, a isopropilamina, trimetilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, pro) caína, etc..

As vacinas são administradas de uma forma compatível com a formulação de dosagem, e numa quantidade que será terapeuticamen te eficaz e imunogénica. A quantidade a ser administrada depende do sujeito a ser tratado, da capacidade do sistema imunológico do sujeito sintetizar anticorpos, e do grau de protecção desejado. As quantidades precisas de ingrediente activo que é necessário administrar dependem do julgamento do médico, e são características de cada indivíduo. As gamas de dosagem adequadas são, contudo, da ordem das várias centenas de microgramas de ingrediente activo por indivíduo: Os regimes adequados, para a administração inicial e para as injecções de reforço, são | variáveis mas, tipicamente, consistem numa administração inicial seguida, após intervalos de uma a duas semanas, de uma injecção subsequente ou outra administração.

H. Métodos terapêuticos

Uma caracteristica de uma infecção com VHB consiste na produção vigorosa de anticorpos IgM anti-AgcHB, que ocorre cedo durante o estado agudo da infecção. Similarmente, muitos pacien tes cronicamente infectados mantêm também anti-AgcHB IgM, se bem que, usualmente com menores títulos. Em contraste, o AgsHB induz uma resposta de IgM relativamente fraca, durante a infecção e após a vacinação. Um estudo sorológico profundo da produção de IgM anti-AgcHB IgM durante uma infecção com VHB, Gerlich et al., J. Infect, Pis., 142:95 (19θ0), mostrou uma variação na

t>7 052

Ref: SPG:11-SCRF 110.1 r

-34-.

cinética de persistência do IgM em resolver a hepatite aguda, e uma diminuição ou mesmo um aumento em anti-AgcHB IgM em pacientes que progrediam para a cronicicidade.

Além disso, em doentes com hepatite B crónica nos quais a replicação virai foi reactivada por terapia com prednisona, os níveis de anti-AgcHB IgM foram dramaticamente elevados sem modificação nos títulos de IgG. Estas verificações são consistentes com a noção de que a produção de anti-HBc IgM na infecção por VHB pode ser independente de células T e além disso, que a mudança de IgM predominante para títulos elevados de anti-Iíbc IgG requer a função auxiliar ae células T, que pode estar vaI riavelmente presente ae paciente para paciente e que pode ser deficiente em pacientes que progridem para a cronicidade. Este facto explicaria o declínio lento nos títulos de anti-HBc IgM que se verifica nos primeiros 1 ou 2 anos de infecção crónica. Uma vez que o reconhecimento de células T do AgcHB do AgeHB é cruzadamente reactivo de modo elevado, crê-se que o auxílio das células T na produção do anti-HBc IgG auxilie também a produção de anti-HBe.

Assim, o presente invento contempla um método de potenciação da resposta de células T ao AgeHB num indivíduo infectado com VHB, que compreende a administração de uma quantidade eficaz de um polipeptíaeo estimulante ae células T do presente in| vento. Preferivelmente o polipeptídeo estimulante de células T consiste essencialmente em cerca de 15 a cerca de 70 resíduos de aminoácidos com uma sequência correspondente à sequência de resíduos ae aminoácidos da proteína ao núcleo do VHB, desde cerca da posição 70 até cerca da posição 140 a partir do seu terminal amino.

Exemplos

Pretende-se que os exemplos seguintes sejam ilustrativos e não limitativos do presente invento.

1. Síntese de polipeptídeos

Os polipeptídeos, correspondentes às várias regiões do

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Ref: EPG:11-SCRF 110.1

AgcHB, aqui utilizados foram sintetizados quimicamente por métodos de fase sólida como se descreve em Merrifield et al., (1963) J. Am, Chem. Soc., 85:2149. 0 método ae fase sólida para a síntese de polipeptídeos foi posto em prática utilizando um sintetizador de peptídeos Vega 250 e um sintetizador de peptídeos Applied Biosciences 430A disponíveis comercialmente na Vega Biotechnologies, Inc., Tucson, AZ, E.U.A. e na Applied Biosystems, Foster City, CA, E.U.A., respectivamente. A composição de cada polipeptídeo foi confirmada por análise de aminoácidos.

Resumidamente, para preparar um polipeptídeo sintético peI lo método de fase sóliaa anterior, ligam-se os resíduos de aminoácido a uma resina (suporte sólido), através de uma ligação éster, pelo resíduo do terminal carboxilo. Quando se pretende ligar o polipeptídeo a um transportador ou a outro polipeptídeo via um resíduo Cys, ou quando se pretende fazê-lc reagir via resíduos Cys terminais, é conveniente usar esse resíduo Cys como resíduo do terminal carboxilo que está ligado pelo éster ao resíduo.

grupo amino alfa de cada aminoâcido adicionado é tipicamente protegido por um grupo butiloxicarbonilo terciário (t-BCC) antes de o aminoâcido ser adicionado à cadeia de polipeptídeo em crescimento. 0 grupo t-BOC é então removido antes da adição | do aminoâcido seguinte à cacieia de polipeptídeo em crescimento.

Durante a síntese dos polipeptídeos protegeram-se também as cadeias laterais reactivas de aminoácidos. Para os restantes resíduos de aminoácidos usaram-se os grupos protectores de cadeia lateral usuais como se segue: 0-(p-bromobenziloxicarbonilo) para a tirosina; 0-benzilo para a treonina, serina, ácido aspártico e ácido glutâmico; 4-metilbenzilo e S-metoxibenzilo para a cisteína; dinitrôfenilo para a histidina; 2-cloro-benzoxicarbonilo para a lisina; e tosilo para a arginina.

Os peptídeos sintetizados no sintetizador de peptídeos Applied Biosystems, Modelo 430A, foram preparados usando o método do anidrido simétrico de Hagenmaier, Η., and Frank, A. (19θ2), Hoppe-Seyler¹s Z. Physiol. Chem., 353:1973· Para sintetizar os peptídeos com 0 sintetizador de peptídeos Vega 250 usou-se o

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Ref: EPG:11-SCRF 110.1 ,z, Z' ff'·

-36método da DCC in situ descrito por Merrifield et al. (19Ó3) J. Amer. Chem. Soc., 85:2149· Foi por vezes necessário repetir o acoplamento do aminoáóido protegido que se estava a adicionar por forma a assegurar a eficiência total do acoplamento. Pelo teste quantitativo da ninidrina de Sarin (1981), Analytical Che mistry, 117:147, verificou-se terem todas as reacções sido completas em mais de 99%.

Após preparação de um polipeptídeo desejado, tratou-se uma porção do polipeptídeo protegido resultante (cerca de 1 grama) com 2 ml de anisolo e com fluoreto de hidrogénio anidro, cerca de 20 ml, que se condensou no vaso reaccional à temperatura do gelo seco para formar uma mistura. Agitou-se a mistura resultante a cerca de 4°C durante cerca de uma hora para clivar os grupos protectores e para remover o polipeptídeo da resina. Após evapcração do fluoreto de hidrogénio à temperatura de 4°C com uma corrente de extractou-se três vezes o resíduo com éter etílico anidro, para remover o anisolo, e secou-se o resíduo.

Extractou-se o material seco com ácido acético aquoso a 5 por cento (3 vezes 56 mililitros) para separar o polipeptídeo livre da resina. Liofilizou-se a solução contendo o extracto por forma a obter-se o polipeptídeo.

2. Preparação de Polímeros

Pode preparar-se um polímero de polipeptídeo do presente invento sintetizando um polipeptídeo do invento, como se descreve no exemplo 1, e incluindo um resíduo cisteína em ambos os terminais amino e carboxilo por forma a obter-se um polipeptídeo terminado em di-Cys numa forma reduzida, não oxidada. Numa preparação laboratorial típica, após a síntese, dissolvem-se 10 miligramas do polipeptídeo di-Cys (contendo resíduos cisteína numa forma não oxidada) em 250 mililitros (ml) ae tampão de bicarbonato de amónio 0,1 molar (M). Em seguida oxida-se com ar o polipeptídeo terminado em di-Cys dissolvido agitando cuida dosamente a solução aurante cerca de 18 horas ac ar, à temperatura ambiente, ou até não estar presente mercaptano livre detectável pelo teste de Ellman, Arch. Biochem. Biophys., 82:70-

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Ref: EPG:11-SCRF 110.1

-37-77 (1959).

polímero assim preparado contém uma pluralidade de unidades repetidas aleatórias de copolímero de polipeptídeo, sintético, que estão ligadas umas às outras por resíduos cisteína (cistina) oxidados.

3. Acoplamento a Transportadores

Usando o método oescrito por Liu et al., Biochem., 80:690 (1979), podem acoplar-se imunogénios polipeptíaicos sintéticos ao AgcHB como transportador imunogénico. Resumidamente, activam-se 4 miligramas (mg) do transportador (AgcHB) com 0,51 mg de m-maleimidobenzoíl-N - hidroxissuccinimida-éster. Subsequen temente, fez-se reagir o AgcHB activado, com 5 ^mg de imunogénio polipeptídico, através de uma cisteína no terminal amino ou carboxilo, por forma a obter-se um conjugado contendo de cerca de 10 a cerca de 35$ em peso de imunogénio polipeptídico.

4. Comparação das imunogenicidades do AgcHB e do AgsHB

Imunizaram-se várias estirpes murinas consanguíneas, incluinco séries Η-2-congénicas, com 4 yig de AgcHBR ou AgsHB (ambos os antigénios em partículas) em adjuvante de Freund completo (CFA) e analisaram-se as respostas primárias de anticorpo IgG por radio-imuno-ensaios de fase sólida (RIA) de sensibilidades aproximadamente iguais. Os resultados destes ensaios correlacionaram- se com os resultados obtidos em ensaios com anti-AgsHB e com Anti-HBc comerciais (Abbott) e tiveram uma sensibilidade igual ou maior. Todas as estirpes imunizadas com AgcHB mostraram uma resposta primária de anti AgcHB IgG vigorosa (tabela 2).

Tabela 2

Comparação das respostas primárias de anticorpos após imunização com AgsHB e AgcHB

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Ref: EPG:11-SCRF 110.1

- Estirpe	2 H-2^Z	Anti-HBs (título) Anti-Hbc (título)
B10	b	256	40.960
B1C.D2	d	1.024	81.920
B10.S	s	O³	163.840
B10.BR	k	32	163.840
B10.M	f	o^-3	20.480
c₃h.q	q	2.048	327.680
Balb/c	d	1.024	327.680

As estirpes murinas consanguíneas B10, E10.D2, B10.S, E10.ER, B10.M, C^H.Q e Balb/c foram obtidasna colónia de reprodução do Research Institute of Scripps Clinic, La Jolla, CA. E.U.A.. Em todos os estudos usaram-se ratinhos fêmea com idades compreendidas entre seis e oito semanas.

Imunizaram-se Grupos de cinco ratinhos de cada estirpe com 4,0 mg de AgsHB ou AgcHB em CFA, e analisaram-se no 24^s dia os sores reuniaos por RIA ae fase sólida, para determinar o título de anticorpos IgG das especificidades inaicadas. Os resultados são expressos como o inverso da mais alta diluição de soro com a qual se obtêm 4X as contagens dos soros de pré-imunização (título).

□ S f ³ Os haplotipos H-2 e H-2 não respondem ao AgsHB mesmo após uma segunda imunização.

E evidente a influência dos genes ligados a H-2 na resposta de anti-HBc, i.e., as respostas das estirpes B10.S , B10.BR foram superiores às respostas das estirpes B10, B10.D2 e B1C.M, embora não se tenham identificado estirpes que não tivessem respondido. Em todas as estirpes testadas as respostas anti-AgcHB foram significativamente superiores (pelo menos 8o vezes) às respostas anti-AgsHB. Além disso persiste nestes ratinhos um título elevado de anti-AgcHB, mesmo um ano após a administração desta dose única de AgcHB. As granaezas relativas das respostas primárias anti-AgcHB e anti-I-IBs e a ausência de falta de res posta ao AgcHB, são em geral, consistentes com as respostas imunológicas humanas a estes antigénios do VHB, durante o decorrer

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Ref: EPGíll-SCRF 110.1

da infecção pelo VHB.

5. Independência do AgcHB em

Examinou-se a capacidade do AgcHB em activar uirectamente as células B, i.e., em actuar como imunogénio independente de células T. Imunizaram-se intraperitonealmente grupos de cinco ratinhos B10.BR eutímicos (+/+) ou B10.BR atímicos (nu/nu), com uma única dose de 0,5, 1,5 ou 4,0 microgramas (/ig) de AgcHB recombinante derivado da E. coli; (AgcHBr; Biogen).

No 10^e e 24^e dias após a imunização recolheram-se, reuniram-se e analisaram-se os soros para determinar a presença de anticorpos anti-AgcHB, por RIA de fase sólida como se descreve no exemplo 4.

Como se mostra na figura 4, Painel A, os ratinhos B10.BR +/+ produziram, 10 dias depois, anticorpos anti-AgcHB dependentes da dose, e verificou-se um aumento de 4 a 16 vezes no título de anti-AgcHB 24 dias depois. Contudo, embora os ratinhos B10.BR nu/nu tenham também produzido anticorpos anti-AgcHB dependentes da dose, 10 aias após a imunização (figura 4, PainelB) não se verificou qualquer aumento no título de anti-AgcHB 24 dias depois. Não foi necessário adjuvante de Freund completo, uma vez que os ratinhos B1G.BR nu/nu imunizados com AgcHB em adjuvante incompleto produziram também anti-HBc, ainda que com um título menor. Adicionalmente a produção ae anti-HBc por ratinhos atímicos não estava limitada ao AgcHBr aerivado de E.coli uma vez que a imunização com AgcHBr derivado de levedura induziu também uma resposta equivalente.

6. Sensibilidade das células T ao AgcHB

Examinou-se a sensibilidade das células T ao estímulo por AgcHB. Imunizaram-se grupos de 4 ratinhos das estirpes, com 4 microgramas (jig) de AgcHB em CFA, nas almofadas das patas traseiras e 8 dias mais tarde, as células drenadas do gânglio linfático foram colhidas e cultivadas in vitro com várias concentrações de AgcHB. Após 24 horas de cultura recolheram-se os sobrenadantes e testaram-se para determinar a produção de IL-2

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Ref: EPG:11-SCRF 110.1

..£ - - --** < jf·

-40por ura bio-ensaio de IL-2 padrão, usando a linhagem de células NK-A dependente de IL-2. É bem conhecido na arte que a produção de IL-2 é uma meaida sensível da activação das células T.

A figura 5 ilustra os resultados deste estudo. A comparação desses resultados para as várias estirpes congénitas H-2, em termos da mais baixa concentração de AgcHB necessária para induzir uma proaução ue IL-2 significativa, conduz a uma classificação similar à observada para a produção de anticorpos in vivo (i.e., elevada, baixa e intermédia).

Surpreendentemente, as estirpes com resposta elevada demonstraram uma activação ae células T específica do AgcHB, para uma concentração de AgcHB tão baixa como 0,03 nanogramas por mililitros (ng/ml), que é equivalente a uma concentração de 0,0014 nanomolar (nM). Os requerentes não têm conhecimento de outro antigénio que demonstre este grau de eficácia em termos da activação de células T.

7. Resposta à dose de imunização

Estudou-se também o efeito da dose de imunização na resposta aumentada de células T específica do AgcHB. Imunizaram-se grupos de 4 ratinhos C^H.Q, nas almofadas das patas traseiras, por injecção ae 12, 8, 4 ou 1 jig de AgcHB em CFA. Removeram-se assepticamente as células drenadas do gânglio linfático popliteu de cada ratinho e agitou-se a mistura por forma a obter-se uma suspensão de células simples. Lavaram-se as células duas vezes com solução salina equilibrada (BSS) contendo soro fisiológico tamponado com fosfato (pH 7,2). Ressuspenderam-se as células em meio de Click contendo ESS, L-glutamina, piruvatc de sódio, antibióticos, 2-mercaptoetanol, aminoácidos e vitaminas essenciais e não essenciais. (Vêr Click et al., (1972) Cell. Immunol., 3:264). 0 meio de Click foi modificado pela adição de HEPES (ácido Ι'Τ-2-hidroxietilpiperarina-N'-2-etanossulfcnico) 10 milimolar (mM) e de gentamicin_za (10 gg/ml), e pela substituição do soro ae ratinho normal^^^^or cento por soro de vitela fetal.

Testaram-se os antigénios em cultura com uma gama de doses

4*

67.052

Ref: EPG:ll-SCRF 110.1

-41de 0,00015-0,25 jug/hil de uma preparação de AgcHB.

Colocaram-se as células viáveis do gánglio linfático £ (5 ^x 1O^?) em 0,1 ml de meio, em depósitos de microtitulo de fundo plano (Falcon 3072, Falcon Plastics Inc.) com : (a) 0,1 mililitros de meio contendo várias concentrações de uma preparação de AgcHB.

Mantiveram-se as culturas durante cinco dias a 37°C numa atmosfera humidificada contenao 5 por cento de dióxido de carbono no ar.

Ao quarto dia, misturou-se e manteve-se (incubou-se) cada cultura com um microcurie (jiCi) de ^H-timidina (^HTdR) (6,7 Ci/ /milimole, New England Nuclear, Boston, Ma, E.U.A.) durante 16 horas antes da colheita. Colheram-se as células em tiras de ffl. tro e determinou-se a proliferação pela incorporação do ^HTdR no ADN. Os resultados são expressos como contagens por minuto (cpm) corrigidas para ter em conta a proliferação anterior na ausência de antigénio. Foi anteriormente demonstrado que a res posta de proliferação específica do AgsHB das células drenadas PLN, colhidas até 13 dias após a imunização, era devido à proliferação das células T; Milich et al., J. Immunol., 130:1401 (1983). Nas análises aqui descritas usaram-se pois células PLN não fraccionadas.

0s resultados aeste estudo, apresentados na figura 6, indicaram que uma cíose in vivo tão baixa como 1 jug foi suficiente para induzir uma activação de células T significativa. Compara tivamente, para induzir uma resposta de células T similar é necessária uma dose de AgsHB de 16 yug. Para induzir respostas de células T significativas, na maioria dos sistemas de antigénio que não estão na forma de partículas, são usualmente necessárias doses de 50-100 jug. Deste modo, os requerentes verificaram que o AgcHB tem uma capacidade inesperadamente grande para estimular a activação de células T in vivo.

8. Avaliação do AgcHB em partículas

Para determinar se a independência de células T exige que c AgcHB esteja em partículas, imunizaram-se grupos de 5 ratinhos, B1C.BR eutímicos (+/+) ou B10.BR atímicos (nu/nu), intra-

ο52

Ref: EPG:11-SCRF 110.1 peritonealmente, com uma única dose de 1,5 β-S de AgcHB desnaturado (AgcHB-D) em CFA. Desnaturou-se o AgcHB por tratamento com uma concentração final ae 0,1$ de SDS e de 0,1% de 2-mercaptoetanol, durante 2 horas a 37°C. A preparação resultante era imuno-reactiva com anticorpos monoclonais a AgeHB, embora tenha perdido mais de 95$ da sua imuno-reactividade com anticorpos monoclonais a AgcHB. Os anticorpos monoclonais /Takahashi et al., J. Immunol., 130:2903 (19θ2)_7 foram fornecidos por M. Mayumi (Escola Médica de Jichi, Japão). No 10^s e 24^s dias após a imunização recolheram-se, reuniram-se e analisaram-se os soros em relação à actividade anti-AgcHB, por RIA de fase sólida como se descreve no exemplo 4.

Na figura 4 apresentam-se nos Painéis A e B resultados deste estudo, por forma a poderem ser comparados com os resultados obtidos no exemplo 5 onde se usou AgcHB não desnaturado (nativo) como imunogénio. Na figura 4, Painel A, pode observar-se que, ainda que o AgcHB-D tenha sido significativamente menos imunogénico do que o AgcHB nativo, em ratinhos B1G.BR +/+, detectaram-se ao 24^s dia anticorpos reactivos com AgcHB desnaturado.

Em contraste, o Painel B da figura 4 mostra que os ratinhos B10.BR nu/nu não responderam ao AgcHB-D, indicando que a resposta ao AgcHB-D era dependente das células T, ao contrário da resposta específica ao AgcHB (figura 4, Painéis A e B). Uma vez que o AgcHB-D se ligou ao anti-AgeHB monoclonal, e exprimiu menos do que 5$ da antigenicidade do AgcHB original, o D-AgcHB representou o AgeHB como antigénio. Contudo, a objecção à suposição de que o AgcHB-D representa também o AgeHB como imunogénio reside na possibilidade de o AgeHB de ocorrência natural/ter⁷uma estrutura de subunidades diferente (i.e. grau de polimerização) ao contrário do AgcHB-D

9* Comparação da cinética das respostas in vivo ao AgcHB e ao AgsHB

Para examinar as cinéticas relativas da produção in vivo de anticorpos anti-AgcHB e anti-AgsHB e para demonstrar que a preparação de AgcHB não possuía qualquer característica ineren-

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Ref: EPG:11-SCRF 110.1

-43te de adjuvante, imunizaram-se grupos ae 5 ratinhos, Balb/c eutímicos (+/+) e atímicos (nu/nu), intraperitonealmente com uma mistura de AgcHBr (8 ^ug) e de AgsHB (8 yig). Reuniram-se e analisaram-se as amestras ae soro, antes e 6, 12 e 24 dias após a imunização, e analisaram-se por RIA de fase sólida como se descreve no exemple 4, para determinar a presença de anticorpos anti-AgcHB, e para determinar a presença de anticorpos anti-AgsHB como se descreve em Milich et al., J. Immunol. 1279*320 (19θ2).

Os resultados deste estudo, representados na figura 7} Painéis A e B, mostram que os ratinhos Balb/c +/+ produziram anticorpos anti-AgcHB logo 6 dias após a imunização e que o título continuou a subir até ao dia 24. A presença de anticorpos anti-AgsHB não foi porém detectaaa até ao dia 12 e teve um título significativamente menor ao longo do período de observação (figura 7? Painel A). Em contraste, os ratinhos Balb/c nu/nu não produziram qualquer anti-AgsHB mas produziram anti-AgcHB logo ao dia 6; o título teve um máximo por volta do dia 12 e começou a declinar próximo do dia 24 (figura 7, Painel B).

A ausência de uma resposta anti-AgsHB nos ratinhos Balb/c nu/nu é consistente com a natureza dependente do AgsHB, em relação a célulasT,previamente descrita por Roberts et al., Nature, 254:606 (1975)· porém óbvio deste estudo, e dos descritos nos exemplos 5-θ> que o AgcHB pode funcionar como antigénio independente das células T.

1θ· Comparação da resposta de células T ao AgcHB e ao

AgeHB

Examinou-se a possibilidade de as respostas de células T específicas ao AgcHB e D-AgcHB (i.e., AgeHB) poderem ter em conta a imunogenicidade diferencial destes dois antigénios.

Grupos de quatro ratinhos C^H.Q foram inoculados nas almofadas das patas traseiras, com 4,0 pg de AgcHB ou com 4,0 yug de AgcHB desnaturado (AgcHB-D) em CFA. Oito dias depois as células drenadas do gânglio linfático foram colhidas reunidas e cultivadas com várias concentrações de AgcHB, com AgcHB sonicado (AgcHB-D ) e com um peptídeo sintético específico para AgcHB/ /AgeHB representando os resíduos 100-120, ou com o meio sozinho.

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Ref: EPG:11-SCRF 110.1

I

3onicou-se o AgcHB-Ώθ até este ficar totalmente não reactivo com anticorpos monoclonais anti-HBc e anti-HBe. Mediu-se a activação de células T pela produção de IL-2 inauzida pelo antigénio. Vinte e quatro horas após o início aas culturas in vitro, recolheram- se os sobrenadantes e analisaram-se em relação ao teor em IL-2 como se descreve no exemplo 5·

Gomo se mostra na figura 8, Painéis A e B as respostas das células T, inoculadas com AgeHB, quer ao AgeHB quer ao AgeHB-D_sforam equivalentes na extremidade superior da curva de resposta às doses (0,06 a 1,0 mg/ml). A forma em partículas foi mais eficiente na extremidade inferior da curva cie resposta às doses. Surpreendentemente, o AgeHB estimulou a produção de IL-2 por cé lulas T inoculadas com AgeHB, para uma concentração de antigénio tão baixa como 0,15 ng/ml. (figura 8, Painel A).

Na experiência inversa as células T inoculadas com AgcHB-D reconheceram o AgcHBr e o AgcHB-D_s duma forma similar à das células T inoculadas com AgcHBr (figura 8 painel B). Uma vez que a partícula AgcHBr foi melhor reconhecida, independentemente do antigénio de inoculação, o antigénio em partículas pode ser mais eficientemente fagocitado e apresentado às células T. Similarmente, examinou-se a capacidade do AgeHB em activar as células T inoculadas com AgcHBr e verificou-se que o AgeHBr pode activar células T inoculadas com AgeHB.

Os estudos anteriormente descritos indicam que o AgeHB e o AgeHB são virtualmente indistinguíveis ao nível das células T, i.e., ambos exprimem os mesmos epítopos estimulantes de células T. É isto que se passa, ainda que o AgeHB e o AgeHB sejam sorologicamente diferentes. Como suporte desta conclusão, verificou- se que um peptíaeo sintético com 21 resíduos, representar do os resíduos 100-120, na sequência de sobreposição do AgeHB/ /AgeHB (polipeptídeo sintético pl00-12C, como se descreve na tabela 1) é capaz de activar in vitro células T inoculadas com AgeHB. (Figura 8, Painel A)

11. Identificação de polipeptídeos estimulantes de células T

Localizaram-se os determinantes de células T da sequência

052

Ref: EPGíll-SCRF 110.1 de sobreposição AgcHB/AgeHB usando polipeptídeos sintéticos. Imunizaram-se grupos de 4 ratinhos das estirpes C^H.Q, B10.S, B10.D2, ΒΙΟ, B10.M, B10.BR e B10.P com 4 jug de AgcHB e as células drenadas do gânglio linfático foram colhidas 8 dias após a imunização e cultivadas in vitro com o peptídeo sintético ou com AgcHB em partículas como controlo positivo. Mediu-se a activação das células T, pela produção de IL-2, como se descreve no exemplo 5, usando várias concentrações de polipeptídeo compreendidas entre cerca 0,00003 θ cerca de 64 pg/ml.

Na figura 9 mostra-se a proaução de IL-2 induzida pela concentração óptima de cada peptídeo, concentração essa que varia de cerca ue ló-64 jug/ml. A concentração de AgcHB em partículas foi de 0,5 yug/ml.

A figura 9 indica que as diferentes estirpes murinas reconheceram os peptídeos distintos. A estirpe C^H.Q reconheceu as sequências pl-20 e pl00-120. A estirpe B10.S reconheceu as sequências p28-52 e pl20-140. A estirpe B10.D2 reconheceu as sequências p70-94, p85-100 (sobreposta) e pl20-140. A estirpe B1C reconheceu exclusivamente a sequência pl20-140. A estirpe B10.M reconheceu exclusivamente a sequência pl00-120. Não se identificaram ainda os centros de reconhecimento de células T para as estirpes B10.BR e B10.P.

que é mais importante é que os resultados anteriores indicam que todos os centros activos de células T são comuns a ambas as sequências de resíduos de aminoácido do AgcHB e do AgelIB. Tal facto sugere que estes antigénios reagem cruzadamente ao nível das células T, em contraste com a situação que se verifica ao nível das células B (anticorpos).

12. Proliferação de células T específica do AgcHB

Examinou-se a capacidade ao peptídeo sintético p!20-140 em inauzir e extrair, da estirpe B10.S, uma resposta de proliferação de células T específica do AgcHB. Imunizaram-se grupos de 4 ratinhos nas almofaaas das patas traseiras, quer com 4 júg de AgcHB, quer com 100 jug de pl20-140 e 8 dias mais tarde, as células drenadas dos gânglios linfáticos foram colhidas e cultivadas in vitro com os antigénios indicados, e determincu-se a

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Ref: EPG:11-SCRF 110.1 , - -· ·'»;’***

-46produção de IL-2 como se descreve no exemplo 5·

A figura 10, Painel A, ilustra o facto de as células T da estirpe B1G.S inoculadas com AgcHB terem reconhecido muito eficientemente o pl20-140. A observação da curva de respsota à cose demonstra que uma concentração de pl20-140 tão baixa como 0,00015 jug/ml foi suficiente para inauzir a produção de IL-2. As células T da estirpe B10.S, inoculadas com AgcHB não reconhe ceram a sequência p85-100. I:o estudo recíproco inocularam-se os ratinhos B10.S com pl20-140. As células T inoculadas com pl20-140 reconheceram o peptídeo imunizante e não a sequencia p85-100, e reconheceram o AgcHB nativo (figura 10, Painel B). É de notar que a proteína nativa induziu a proliferação ue células T específica do peptídeo, mais eficientemente do que o peptídeo induziu a proliferação específica do AgcHB.

Realizaram-se estudos semelhantes usando a estirpe de ratinho B10 como fonte de células T. Os resultados desses estudos apresentados na figura 11, indicam que, nestes estudos, as curvas de resposta a doses para o AgcHB e para o pl20-140 parecem estar ainda mais ae perto relacionadas, do que para a estirpe B10.S. Isto pode inaicar que o pl20-14G representa o único centro de reconhecimento de células T, relevante para a estirpe B10.

Similarmente examinaram-se os polipeptídeos sintéticos pl00-120 e pl-20 em relação a sua capacidade para induzir e estimular, na estirpe de ratinhos C^H.Q, uma resposta de proliferação de células T específica ao AgcHB. A figura 12, Painel A, indica que embora as células T de C^H.Q inoculadas com AgcHB re conheçam ambos os polipeptídeos pl00-120 e pl-20, o pl00-120 é um estimulante de células T mais eficiente. Não se verificou que a capacidade de um peptídeo em induzir uma resposta de proliferação se correlacionasse com a capacidade desse polipeptídeo em induzir,uma resposta de proliferação relevante a proteína nativa. A sequência pl-20 é o imunogénio de peptídeo superior (figura 12, Painel B) se bem que a imunização com plOG-120 induza uma melhor resposta específica do AgcHB (figura 12, Painel C).

De um modo análogo examinou-se a capacidade do peptídeo

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Ref: EPG:11-SCRF 110.1

I

-47p85-ioo para induzir e estimular, na estirpe B1O.D2, uma resposta de proliferação de células T específica do AgcHB. Como se mostra na figura 13 Painel A, as células T da estirpe 310.D2 inoculadas com AgcHB em partículas, foram capazes de reconhecer o p85-100 e o pl20-14C, ainaa que, nesta estirpe, o p85-100 seja um estimulante de células T mais eficaz. Similarmente c p85-100 foi capaz de inocular células T que reconheceram o AgcHB nativo e o peptídeo imunizante. (figura 13, Painel B).

13. Distribuição da classe e subclasse de anticorpos numa resposta Anti-AgcHB

Para determinar se a proqução de anticorpos anti-AgcHB da classe IgG exigia unicamente a influência das células T, investigou- se, em ratinhos B10.BR +/+ e B1O.BR nu/nu imunizados com AgcHB (tabela 3), a distribuição da classe e da subclasse IgG da prooução de anti-AgcHB.

Tabela 3

Distribuição de classe e subclasse de anticorpos anti-AgcHB produzidos em ratinhos B10.BR eutímicos (+/+) e B10.BR atímicos (nu/nu)

2

Ξ st i rpe Dias _____ Resposta Anti-AgcHB

	IgM	PolilgG		IgG2_a	IgG2_b	IgG₃
B1C.BR
(+/+)	10	2.56o	40.950	40	2.560	10.240	640
	24	I.28O	I63.84O	64C	20.480	I63.84O	2.560
B10.BR
(nu/nu)	10	1.280	2.560	0	0	2.56O	0
	24	I.28O	2.56o	0	40	2.560	0

^x Imunizaram-se grupos de cinco ratinhos B10.BR eutímicos (+/+) ou atímicos (nu/nu) com 4,0 jig de AgcHB em CFA e analisaram-se os soros por RIA, como se descreve no exemplo 4, para de

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Ref: EPG:11-SCRF 110.1 terminar os anticorpos para o AgcHB da classe IgM e da classe IgG e das subclasses (usando segunaos anticorpos específicos das subclasses IgG) nos dias 10 e 24. Os resultados estão expressos como o inverso da maior diluição de soro para se obterem 4X as contagens dos soros de pré-imunização (título)» ^Colheram-se os soros após o número ue dias indicados que se se guiram à imunização.

A análise dos dados da tabela 3 inaica que os ratinhos B10.BR eutímicos produziram anti-AgcHB da classe IgM e de todo o espectro de subclasses da IgG, 10 e 24 dias após a imunização ainda que tenham predominado os anticorpos da subclasse IgGgy É de notar que os anticorpos IgM diminuíram ligeiramente entre os dias 10 e 24, enquanto que os anticorpos IgG mostraram um au mento de 4 a 16 vezes. Os ratinhos B10.BR nu/nu produziram também uma resposta anti-AgcHB da classe IgG, de título equivalente ou superior à resposta da classe IgM; a resposta IgG foi contudo exclusivamente da subclasse IgG^b’ & P^r°6ução de anti-AgcHB da classe IgG não é pois: marcante, per se, da sensibilização das células T, embora a maior diversificação das subclasses IgG e os elevados títulos de IgG o sejam. Nestas experiências usou-se apenas uma única dose de AgcHB em partículas, relativamente pequena, enquanto que a quantiuade de AgcHB produzido durante a infecção por VHB seria superior e persistiria ao longo da fase ae replicação virai.

14. Capacidade das células T inoculadas com polipeptídeo estimulante de células T em auxiliarem a produção de anticorpos contra um imunogénio relacionado com um patogénio

Examinou-se a capacidade de células T inoculadas com AgcHE _em funcionarem como células T auxiliares (helper) (Th) na produção de anticorpos, para epítopos de envelope de superfície (AgsHB), embora o AgsHB e o AgcHB se localizem em moléculas distintas no mesmo virião. Inocularam-se grupos de cinco ratinhos B10.S por imunização intraperitoreal com CFA sózinho com 4,0 |ig de AgcHB em CFA ou com 100 ug do peptídeo sintético pl20-14C em

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Ref: EPG:11-SCRF 110.1

-49CFA. Três semanas após a inoculação desafiaram-se os ratinhos quer com adjuvante incompleto sózinhc, quer com uma dose sub-óptima de uma mistura de AgcHB (0,1 ^ug) e de AgcHB/p39 (0,6 p.g) quer com VHB (0,4 jig) em adjuvante incompleto. As preparações de ÁgsHB/P39 © de VHB eram do subtipo adw^ e foram equilibradas para conter quantidades aproximadamente equivalentes de antigenicidade das regiões S, pre-S (2) e pre-S(l) como se descreve em Milich et al., J. Immunol., 137:315 (1936). Sete dias apos a dose de desafio, (challenge) recolheram-se, reuniram-se e analisaram-se os soros, por RIA de fase sólida, como se descreve em Milich etal., J. Immunol., 137:315 (19θ6), em relação aos anticorpos IgG específicos para as regiões S, pré-S(2) e pré-S (1) do AgsHB. Os ligandos de fase sólida usaaos para detectar os anticorpos anti-S, anti-pré-S(2) e anti-pré-S(l) específicos foram os seguintes: AgsHB/P25, uma sequência da região pré-S(2) representada por pl33-145, © uma sequência da região pré-S(l) representada por p94-117, respectivamente. Os títulos de anticorpos são expressos como o inverso do log^ 6a maior diluição de soro necessária para se ter quatro vezes as contagens dos soros antes da imunização.

Na figura 14 mostram-se os resultados deste estudo, que indicam que os ratinhos não inoculados não produziram anticorpos específicos do envelope.

Similarmente os ratinhos inoculados com AgcHB e desafiadas com uma mistura de AgcHB de AgsHB/P39 não produziram anti-HBs. Contudo, os ratinhos inoculaaos com AgcHB e subsequentemente desafiados com vírus (VHB) produziram anticorpos específicos, anti-S, anti-pré-S(2) e anti-pré-S(l). Este resultado sugere que as células T inoculadas com AgcHB podem funcionar como auxiliares na produção de anticorpos anti-envelope e que a actividade das células Th requereu que estivessem presentes na mesma partícula (virião), o AgcHB e o AgsHB, uma vez que a mistura foi ineficaz.

Para confirmar a natureza das células T do resultado anterior (a inoculação com AgcHB induziu também o anti-HBc), realizou-se um estudo idêntico usando o polipeptídeo pl20-140 sintético, estimulante de células T, como antigénio de inoculação.

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Ref: EPG:11-SCBF 110.1

-5οEste peptídeo induz células T específicas em relação ao AgcHB mas não células B (anticorpo) especificas para AgcHB. Os resultados obtidos foram similares aos obtidos usando, como antigénio de inoculação, AgcHB nativo (figura 14). Os ratinhos pre parados com pl2G-140 e desafiados com VHB produziram anticorpos antienvelope, enquanto qu© os ratinhos inoculados com pl20140 e desafiados com a mistura não o fizeram. Será também de notar que a estirpe B10.S não responae à região 3 do AgsHB ainda que a inoculação com um peptídeo específico para o AgcHB tenha evitado a não resposta ao AgsHB/p25 fornecendo um centro de reconhecimento ae células Th alternativo no VHB, que as células T da estirpe B10.S reconheceram.

Estes resultados demonstram sem ambiguidades que as células T inoculadas com AgcHB são capazes de auxiliar os clones das regiões S, pré-S(2), e pré-S(l) específicos de células B a produzir anticorpos, se o AgcHB e o AgsHB estiverem presentes na mesma partícula, isto é, se estiverem operativamente ligadas. Além disso, estes resultados substanciam o facto de a função intermolecular/intraestrutural das células Th não ser exclusiva do sistema da gripe e de epítopos de células T sintéticos (polipeptídeos estimulantes de células T) poderem mediar esta resposta. As células T dos ratinhos Balb/c inoculados com AgcHB foram também capazes de induzir a produção de anticorpos específicos do envelope, ainda qu© muito menos eficientemente do que as células T da estirpe B10.S. Deste modo a eficiência da função intermolecular/intraestrutural das células Th pode variar e pode ser relacionada com a especificidade fina e do reconhecimento das células T do AgcHB diferente entre os haplotipos H-2.

15. Especificidade Bina da produção de anticorpos após inoculação com pl2C-140

Examinou-se em seguida a diversidade das especificidades finas de anticorpos anti-envelope produzidos sob a influência de células Th, inoculadas com AgcHB e com pl20-140. As experiências de inoculação e desafio realizaram-se como se descreve no exemplo 14 com a excepção de se terem recolhido os soros 7 θ

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Ref: EPG:11-SCRF 110.1

dias após a dose de desafio. Na tabela 4 mostram-se os resultados deste estudo.

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Ref: EPG:11-SCRF 110.1

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Ref: EPG:11-SCRF 110.1

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Inocularam-se grupos de 4 ratinhos B10.S com CFA sozinho (0), com 4,0 yig de AgcHB em CFA, ou com 100 jig de pl20-140 em CFA. Desafiaram-se todos os ratinhos, três semanas mais tarde, com uma dose subóptima de VHB (0,4 yig) em adjuvante incompleto, e analisaram-se os soros por RIA, como se descreve no exemplo 14, para determinar os anticorpos IgG contra o painel de antigé nios, 7 e 14 dias após o desafio. Os títulos são expressos como o inverso da diluição de soro com a qual se produzem 4 x as contagens dos soros de pré-imunização.

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Para detectar o subtipo mais anti-S-específico do grupo usou-se AgsHB/P25 do subtipo ad como ligando de fase sólida, enquanto que para detectar o anti-S específico do grupo se usou, como liganao de fase sólida, o AgsHB/P25 do subtipo ay

Os peptídeos sintéticos da região pré-S(2) tem mostrado representar os centros de ligação de anticorpos dominantes na região pré-S(2) ⁴ Os peptídeos sintéticos da região pré-S(l) têm mostrado representar os centros de ligação de anticorpos dominantes na região pré-S(l) Milich et al., J. Immunol., 137:2703 (1986).

Como se mostra na tabela 4, a inoculação com AgcHB ou com o peptídeo estimulante de células T sintético, pl20-14G, resultou na produção de anticorpos para sete epítopos distintos, nas regiões S e pré-S do AgsHB, após desafio com VHB. Deste modo, as células T inoculadas com AgcHB são capazes de auxiliar funcio nalmente com células T, múltiplos clones de células B específicos para uma variedade de determinantes antigénicos do envelope, incluindo 3 epítopos pré-S(l), 2 epítopos pré-S(2) e epítopos específicos do grupo e do subtipo da região S. Isto é especialmente notável no contexto das células T inoculadas com pl20-140, que representam uma população de células T de heterogeneidade relativamente limitada (i.e., uma para várias especificidades de células T).

Tem-se estudado profundamente a regulação das respostas imunológicas para as determinantes das regiões pré-S e S do

AgsHB. As produções de anticorpos para as regiões S, pré-S (2) e pre-S(l) do AgsHB são reguladas independentemente, devido às

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Ref: EPG:11-SCRF 110.1

-54células Tn que reconhecem em caaa região determinantes únicos, e que são inaependentemente H-2 - restringidas. Além disso, uma vez que os determinantes das regiões S e pré-S existem no mesmo polipeptídeo (P39), as células Th, específicas para um ae terminante numa região, são capazes de fornecer auxílio funcional aos clones de células B que reconhecem um determinante noutra região. Ver a figura 15· 0 facto de as regiões S e pré-S (2) não responderem pode deste modo ser evitado por imunização com AgsHB/P39.

Estas observações cumulativamente sugerem que, apos a vacinação com AgsHB/P39 ou durante a infecção per VHB, deverão produzir-se tcuas ou nenhumas especificidades anti-envelepe. Em geral, as observações clínicas confirmam até à data, esta previsão. A produção de anticorpos específicos para as regiões S e pré-S ocorre durante a resolução da infecção aguda por VHB, mas não durante a fase aguda ou, subsequentemente, na infecção crónica por VHB. Contudo, tem sido referido que um subconjunto de pacientes cronicamente infectados por VHB produzem apenas anti-pré-S(l) na ausência de anticorpos anti-pré-S(2) ou anti-(S), o que se correlacionou com a soroconversão do AgeHB no estado anti-HBe e com a aepuração virai. Similarmente, referiu-se que uma proporção de animais cronicamente infectados com o vírus da hepatite do esquilo teirícola produz apenas anticorpos de envelope anti-pré-S(l). Estas observações não pociem ser explicadas somente com base nos dados existentes, e realçam que factores adicionais podem influenciar a produção de anticorpos durante a infecção natural, ao contrário do que acontece com a vacinação.

Os resultados aqui apresentados sugerem que a evolução para a infecção crónica necessita, ou é consequência, de uma não resposta aos antigénios ao envelope ao nível aas células T, e além disso, que a produção ae anti-pré-S(l) na ausência da produção de anti-pré-3(2) e de anti-S, é mediada por células Th específicas para os determinantes AgcHB/AgeHB. Este facto é consistente com a correlação da produção de anti-pré-S(l) com o soroconversão de anti-HBe, e com a capacidade das células T específicas do AgcHB/AgeHB em auxiliarem a produção de anticorpos específicos ao envelope, como aqui se descreveu. A questão

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Ref: EPGíll-SCRF 110.1 _ f'/ .

-55pÕe-se então em saber porque é que apenas se produz anti-pré-S (1) , uma vez que as células Th, específicas para AgcHB, podem também funcionar para auxiliar a produção de anticorpos anti-S e anti-pré-S(2). Isto pode ser explicado pelo facto de as partículas virais esféricas com 22 nm, sem antigénios de nucleocapsídeo (AgcHB), circularem a níveis de vírus intactos em grande excesso durante a infecção por VHB. As partículas esféricas exprimem ambos os antigénios das regiões 3 e pré-S(2) mas não, ou apenas minimamente, os antigénios da região pré-S(l). Vêr a figura 5· Deste modo, os determinantes para as regiões S e pré-3 (2) , específicos das células B, ligam-se mais provavelmente às partículas esféricas do que aos vírus e não benificiarão das células Th específicas do AgcHB. Em contraste, é mais provável que as células B específicas da região pré-S(l) reconheçam os seus liganaos em virus intactos, em virtude de ο P39 estar preferencialm^nte associado com o virus. As partículas subvirais filamentosas contém também P39, mas contudo, esta forma morfolc gica é menos prevalente no soro, quando comparada com as partículas esféricas. Vêr figura 15.

facto de a infecção crónica pelo VHB, se resolver frequen temente com o tempo, no contexto da não resposta a antigénios do envelope, sugere que a depuração virai é um processo complexo, e que a necessidade de uma resposta das células Th para os antigénios de envelope, pode ser evitada. De uma forma concebível, apenas a produção de anticorpos anti-pré-S é necessária para neutralisar a infecção virai de uma célula para a outra, e a este respeito a função da célula Th, específica para o AgcHB/ /AgeHB, pode substituir as células Th específicas da região pré —S. Simultaneamente , pode ser necessária uma resposta citotóxica de linfócitos T (CTL), específica para o AgcHB/AgeHB, para eliminar células onde o vírus se está a replicar, tal como tem sido sugerido por outros. Permanece por determinar se o CTL distingue ou não entre o AgcHB e o AgeHB, como fazem as células B, ou se reconhece o AgcHB e o AgeHB de um modo cruzadamente reactivo, como o fazem as células Th.

facto de as células Th específicas do AgcHB/AgeHB poderem induzir anticorpos anti-envelope, que são neutralizantes de

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Ref: EPG:11-SCRF 110.1

-56vírus, pode explicar a noticiada capacidade da vacinação com AgcHB para proteger contra a infecção com VHB. Além disso, uma vez que aqui se mostrou que as células Th específicas do AgcHB/ /AgeHB induzem a produção de anticorpos anti-S em ratinhos que não respondem à região S, os presentes estudos descrevem outro mecanismo para evitar a não resposta ao AgsHB. 0 único requisito é o de que o AgcHB e o AgsHB estejam operativamente ligados, por forma a que sejam capazes de induzir a função intermolecular/ /intraestrutural cias células Th.

16. A especificidade fina do reconhecimento de células T do peptídeo pl20-14C· específico do AgcHB é dependente do haplotipo H-2 da estirpe que responde

Demonstrou-se que as células T das estirpes de ratinhos HS t)

-2 e H-2 , inoculadas com AgcHB reconheceram predominantemente a sequência pl20-140 do AgcHB. Era pois de interesse determinar se cada haplotipo reconhecia os mesmos ou diferentes centics na sequência pl20-14C. Com este objectivo sintetizaram-se os peptídeos contendo o terminal N (pl20-131), contenao o terminal C, e um peptíaeo sobreposto (pl25-136). Prepararam-se grupos de 4 ratinhos B10.S, B10 ou B10.BR nas almofadas das patas traseiras, quer com 4,0yug de AgcHB, quer com 100 jug aos peptídeos sintéticos: pl20-140, pl20-131, ou pl29-14C em CFA. Oito dias após a inoculação, as células PLII drenadas foram colhidas, reunidas e cultivadas com várias concentrações (0,00015-16 jug/ml de AgcHB, pl20-140, pl20-131, pl29-140, pl25-133 ou apenas com meio, e mediu-se a sensibilização das células T por proliferação de células T (Tp) como se descreve no exemplo 7· Como se ilustra na figura 16a, para a estirpe B10.S (H-2^S), as células T inoculadas com AgcHB proliferaram ©m resposta ao AgcHB, ao peptídeo grande pl20-140 e ao peptídeo com o terminal IT pl20-131, mas não com 0 peptídeo com 0 terminal C pl29-140. 0 peptídeo pl25-136 era também activo, embora significativamente menos do que o pl20-131 (não se apresentam os resultados). Será de notar que as curvas de resposta à dose para as células T inoculadas com AgcHB, estimuladas com AgcHB ou com os peptídeos activos, foram similares.

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Ref: EPG:11-SCRF 110.1

-57As experiências alternativas envolveram a inoculação com peptíaeos e o desafio in vitro com AgcI-IB ou com os peptídeos. Na estirpe B10.S as células T inoculadas com pl20-14G reconheceram os AgcHB, o peptídeo imunizante pl20-140 e o peptídeo contenao o terminal N pl20-131, mas não o peptídeo pl29-14G (figura 16b). Desta forma analogamente, às células T inoculadas com AgcHB nativo e as células T inoculaaas com pl20-140 reconheceram o pl20-131 N-terminal. Similarmente as células T inoculadas com pl20-131 foram activados pelo pl20-140, pl20-131 e AgcHB (figura 16c), 0 peptídeo com 12 resíduos, o pl20-131, foi deste modo suficientemente imunogénio para inocular in vivo células T específicas do AgcHB. Ainda que as células T inoculadas com peptideo tenham respondido ao AgcHB e à sequência pl20-131 nos peptíaeos sintéticos, as respostas em relação aos peptíaeos sintéticos foram mais eficazes, e tal é especialmente verdade para as células T inoculadas com pl20-131 (figura 16 b,c). Este facto está em contraste com o que acontece com as células T da B10.S inoculadas com AgcHB, que responderam equivalentemente ao AgcHB e aos peptídeos activos (figura 16a). 0 peptídeo com o terminal C, 0 pl25-140, foi apenas marginalmente imunogénico na estirpe B10.S (figura 16d).

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Nos ratinhos H-2 congénicos (Ií-2^D) realizaram-se experiências similares (figura 17). Na estirpe B10, as células T inoculadas com AgcHB proliferaram em resposta ao AgcHB, ao pl20-140 e ao fragmento C-terminal pl20-140, mas não com o p!20-131 ou com ο Ρ125-136, em contraste com as células T da estirpe B10.S inoculadas com AgcHB (figura 17a). Em virtude da sequência p]20 -14C ser comum ao AgcHB e ao AgeHB estes resultados deixam antever que o AgcHB e o AgeHB reagem cruzadamente ao nível da proliferação das células Τ. A utilização de AgeHB recombinante fornecido pela Biogen SA, Genebra, Suiça, permitiu a confirmação desta predição, pois as células da estirpe B1G inoculadas com AgcHB reconheceram 0 AgeHB (figura 17a). As células T da estirpe B1G, inoculadas com pl20-140 ou com pl29-140 foram específicas para o fragmento pl29-14G C-terminal, e reconheceram 0 AgcHB, quase tão bem como o peptídeo imunizante (figura 17b,d) As células T inoculadas com c pl29-140 proliferaram também em

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Ref: EPG:11-SCRF 110.1

-58resposta ao AgelíB (figura 17d). 0 fragmento pl20-131 H-terminal foi não imunogénico na estirpe B10 (figura 17c). Experiências idênticas realizadas em ratinhos B10.BR (H-2^) revelaram que, ainda que as células T da estirpe B10.BR, inoculadas com AgcHB tenham reconhecido o AgcHB e o AgeHB, a sequência pl2C-140 e os peptídeos truncados não foram nem estimulantes nem imunogénicos (não se apresentam os resultados).

17. Os peptídeos sintéticos p!20-140, pl20-131 e p!29-140 podem induzir in vivo a activiuade funcional de células T auxiliares

Realizaram-se ensaios com células T auxiliares como método alternativo para examinar a especificidade fina do reconhecimento das células T do AgcHB e como meio de determinar a capacidade funcional uos peptídeos sintéticos, estimulantes de células T, em induzir in vivo a produção de anticorpos. Determinou-se a actividade de células T auxiliares inoculando grupos de cinco ratinhos, B10.S, B10 ou B10.BR, com 106 yig dos peptídeos específicos de AgcHB , pl2C-140, pl20-131 ou pl29-140, em CFA, e desaflando-os, 21 dias mais tarde, com uma dose subóptima de AgcHB (0,1 ug) em adjuvante incompleto. Sete dias após c desafio, mediram-se os anticorpos anti-HBc no soro, por RIA de fase sólida como é descrito por Milich et al., J. Immunol., 129:320-325 (1982).

Resumidamente, analisaram-se soros murinos reunidos, para determinar o teor de anticorpos, por um radio-imunoensaio (RIA) de fase sólida indirecto usando como fase sólida AgcHB (0,1 jug/ /depósito), AgsHB/GP33 (0,1 jig/depósito), ou peptídeos sintéticos (1 a 2 jig/depósito) e usou-se, como segundo anticorpo, IgG anti-ratinho de cabra, e foram desenvolvidos com Ig anti-cabra 125 de porco, purificado por afinidade marcado com ^yI. As partículas de AgsHB recombinante, contendo aproximadamente 35$ de GP33, foram fornecidas por P. Tiollais (Instituto Pasteur, Paris, França), e são aqui designadas por AgsHB/GP33. 0s resultados foram expressos como o título de anticorpos representando a maior diluição com a qual se obtêm quatro vezes as contagens dos soros de pré-imunização.

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Os controlos consistiram de ratinhos inoculados com CFA sozinho e desafiados com AgcHB, ou inoculados com peptídeos sem o uesafio, com AgcHB. Como se mostra na figura 18, a inoculação com centros sintéticos de células T, pl2G-140, pl2G-131, e pl29 -140 não induziu, em ratinhos B10.S, a produção de anticorpos anti-HBc, e o pl29~140 induziu, em ratinhos B10, apenas uma produção mínima de anti-HBc. Deste modo, ainda que estes peptídeos contenham centros de reconhecimento de células T, os epítopos de células B presentes nos peptídeos não são relevantes ou não estão expostos no AgcHB activo, i.e., são específicos do peptídeo. Assim, foi possível examinar a capacidade destes peptídeos inocularem in vivo células Th directamente, em oposição ao que acontece na realização de experiências de transferência de células T. Esta aproximação requer que se chame, por desafio com AgcHB, a memória das células Th inoculados por imunização com peptídeo, indicando a relevância do centro de reconhecimento de células T sintético para a molécula original.

Na estirpe B10.S, os ratinhos não inoculados desafiados com AgcHB produziram in vivo uma quantidade mínima de anti-HBc (1:40), enquanto que os ratinhos inoculados com pl2C-140 e úesa fiados com AgcHB produziram eficientemente IgG anti-HBc (1:5’120) 7dias após o desafio (figura 18 painel superior). Para examinar a especificidade fina da actividade das células Th, inocularam-se ratinhos B10.S com os peptídeos N-terminal e C-terminal e desafiaram-se então com AgcHB. A inoculação com o peptídeo N-terminal, pl20-131, induziu uma produção de anti-HBc significativa (258 vezes a dos não inoculados) e o peptídeo C-terminal foi apenas marginalmente reactivo (4 vezes a dos não inoculados) (figura 18). Similarmente, na estirpe B10.S, a imunização com pl20-14G induziu a produção de anti-HBc (1:10,240). Contudo, em contraste com 0 que acontece na estirpe B10.S, o peptídeo C-terminal, pl29-140, induziu na estirpe B10 a produção de anti-HBc, enquanto que o peptídeo N-terminal foi inactivo (figura 18, painel inferior). A sequência p!2G-140 do AgcHB não induziu, na estirpe de ratinhos B10.BR, a produção de anti-HBc (não se apresentam resultados). Estes resultados são consistentes com os resultados da proliferação ae células T e in-

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Ref: EPG: ll-SCRF 110.1

-60dicam uma concordância entre a especificidade fina cias células Tp e das Th.

18. 0 peptídeo pl20-14G específico do AgcHB pode funcio- nar como molécula transportadora ue células T para um epítopo de células B sintético do envelope do VHB

Em virtude de se ter mostrado que a sequência pl20-14C engloba centros de reconhecimento de células Th, distintos para os ratinhes B10.S e B10, capazes de inauzir, in vivo, a produção de anti-HBc, acoplou-se o peptídeo pl20-140 directamente a um epítopo de células B sintético e examinou-se a sua capacidade em actuar como transportador de células T para esse epítopo. 0 epítopo de células B escolhido foi o peptídeo pl33~140 (DPRVRGLY) da região pré-3(2), que anteriormente se demonstrou representar ura centro de combinação de anticorpos, dominante na região pré-S(2) das partículas AgsHB/GP33· A sequência pl33 -140 não conjugada da região pré-3(2) é não imunogénica nas estirpes B1C.S, B10 e B10.BR (não se apresentam resultados). Imunizaram-se grupos de 5 ratinhos B10.S, B10 e B10.BR com ICO yig em CFA, de um composto de peptídeo constituído pelos resíduos 120-140 da sequência do AgcHB pelos resíduos 133-140 da região pré-S(2) do envelope, tendo sido o imunogénio de polipeptídeo composto designado por cl20-14G-(133“14C). Injectaram-se os ratinhos com 5θ yug do peptídeo composto em adjuvante incompleto 4 semanas mais tarde, Recolheram-se os soros, antes da imunização, 3 semanas após a imunização primária (l^e) e 2 semanas após a imunização secundária (2^S) e analisaram-se os soros para determinar os anticorpos da classe IgG, específicos para c peptídeo transportador de células T, C120-14G, para partículas de AgcHB para o epítopo de células B (133-14G), e para as partículas AgsHB GP33 do envelope, por RIA de fase sólida como se descreve no exemplo 17· Ha tabela 5 apresentam-se os resultados deste estudo.

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Ref: EPG:11-SCRF 110.1

-62As estirpes inaicadas foram imunizadas i.p. com 100 /Lg de cl20-14C“(133-140) em CFA e reforçadas 4 semanas mais tarde i.p. com 5θ /.g em adjuvante incompleto. Recolheram-se os soros antes da imunização (Pré), 3 semanas após a imunização primária (l^s), e 2 semanas após a imunização secunctária (2^S).

p título de anticorpos (IgG), específicos para os antigénios indicados, foi determinado por RIA de fase sólida, e expres so como o inverso da diluição com a qual se obtêm 4X as contagens dos soros de pré-imunização.

Após a imunização primária com C120-140 - (133-140) a estir pe E10.S produziu anticorpos para o peptídeo (cl20-140) específico de AgcHB que não reagiram cruzaaamente com o AgcHB nativo (i.e., são específicos do peptíaeo); e anticorpos para o peptídeo (133-14G) da região pré-S(2), que não reagiram cruzadamente com as partículas de AgSHB/GP33 nativo. Após a imunização secundária, todos os títulos de anticorpos aumentaram de 4 vezes (anti-cl2C-140) a 16 vezes (anti-133-140). E de notar que o anticorpo anti-cl20-140 secundário foi apenas minimamente reactivo com a proteína AgcHB nativa, enquanto que o anticorpo anti-(133-140) reagiu muito de uma forma cruzada com. a proteína AgsHB/ /GP33 original. A estirpe B10 respondeu menos à imunização com C120-140 - (133-140) do que a estirpe B10.S, tal como é evidenciado pela necessidade de uma imunização de reforço para induzir a produção de anticorpos anti-(133-140) que foi de 4 a 8 vezes menor ao que a resposta secundária da estirpe B10.S (tabela 5). Similarmente à estirpe B10.S, o anticorpo anti-(133-140) da estirpe B10 reagiu muito de uma forma cruzada com AgsHB/GP33> enquanto que c anti-cl20-140 foi apenas minimamente reactivo de uma forma cruzada com o AgcHB nativo. Ambas as estirpes B10.S e B10 produziram com títulos elevados, anticorpos para a sequência C120-140 predominantemente específicos do peptídeo. Em ambas as estirpes, os anticorpos foram específicos para o fragmento C-terminal, pl29-140 (não se apresentam resultados). Gomo se podia prever a partir das experiências de proliferação de células T e de células Th, a estirpe B10.BR nãc respondeu à imunização com C120-140 - (133-140). Estes resultados indicam que c

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Ref: EPG:11-SGRF 110.1

-63peptídeo sintético pl20-14G, específico cio AgcHB, pode funcionar como transportador de células T, para ura epítopo de células B sintético representado no envelope do VHB, em estirpes que reconhecem a sequência 120-140 do AgcHB ao nível das células T.

19. Especificidade fina do reconheciemente de células T do imunogénio sintético, C120-140 - (133-140)

Por forma a confirmar que os centros previstos no imunogénio composto estavam a funcionar como centros de reconhecimento ae células T, avaliaram-se ratinhos, imunizados com C12G-140 - (133-140), ao nível das células T. Imunizaram-se grupos de 4 ratinhos, B10.S, B10 e B10.BR, com 100 pg de C120-140 - (133-140) em GFA, nas almofadas das patas traseiras © 8 dias mais tarde colheram-se as células PLH drenadas. Cultivaram-se as cé lulas T, inoculadas com peptídeo composto, com várias concentra çces de AgcHB AgsHB/GP33? com peptíaeos específicos do AgcHB : :pl20-140, pl20-131, pl29-140: e com o peptídeo (133-140) da região pré-S(2), e determinou-se a proliferação das células T.

Na figura 19 ilustra-se o nível ae proliferação de células T in* duzida por uma concentração de 1,0 jig/ml de antigénio. As células T da estirpe B10.S, inoculaaas com C120-140 - (133-140), responderam ao C120-140, ao fragmento M-terminal, pl20-131, e ao AgcHB nativo. 0 epítopo de células B (133-140) e as partículas de AgsHB/GP33 nativas foram não estimulantes em todas as concentrações (figura 19, painel superior). As células T da estirpe B10 inoculadas com C120-140 - (133-140) foram activada pelo C120-140, pelo fragmento c-terminal, pl29-140 , e pelo AgcHB nativo. 0 epítopo de células B (133-140) e o AgSHB/GP33nativo foram não estimulantes para todas as concentrações (figura 19, painel do meio). As respostas de proliferação de células T específicas do peptídeo, significativamente superiores para a estirpe B1C.S quando comparadas com as da estirpe B10, pode explicar a maior produção de anticorpos anti-pré-S(2) observada na estirpe B10.S após a imunização com C120-140 - (133-140) (tabela 5). As células T da estirpe B1G.BR, inoculadas com cl20-140 - (133-140), não responderam a todo o painel de antigénios (figura 19, painel inferior). Estes resultados e os resultados

052

Ref: EPGíll-SCEF 110.1

dos anticorpos apresentados na tabela 5 indicam que o reconhecimento das células T do peptldeo composto é Η-2-dependente e que se correlaciona cora os padrões de especificidade observados para o pl2C-140 em termos da actividade Tp e Th.

Pretende-se que a descrição anterior, incluindo as concretizações específicas e exemplos, seja ilustrativa e não limitativa do presente invento. Podem efectuar-se numerosas outras variações e modificações sem afastamento do âmbito e campo do presente invento.

052

Ref: EPGíll-SCRF 110.1

-65-REIVIDICAÇÕES-

Claims

1®. _ processo de preparação de um conjugado polipeptídeo imunogénico caracterizado por se ligar operativamente AgcHB, através ae uma cadeia lateral ao resíduo de aminoácido, a um imunogénio polipeptíaeo.

2-. - Processo de acordo cora a reivindicação 1, caracterizado pele facto de o dito AgcHB estar presente como proteína do núcleo na forma de partículas.

3®. - Processe de acordo com a reivinaicação 1, caracterizado pelo facto de o dito imunogénio polipeptídeo ser um imunogénio relacionauo com um patogénio e ue o dito conjugado ter a capacidade de induzir· a produção ue anticorpo que reagem imunologicamente com o dito patogénio, quando injectado num animal numa quantidade eficaz.

4®. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto ae o dito imunogénio polipeptídeo ser um imunogénio relacionado com um patogénio que reage imunologicamente com anticorpos induzidos pelo uito patogénio.

5^ê. - Processo de acordo com a reivinaicação 3? caracterizado pelo facto de c dito patogénio ser o HBV e o dito imunogénio polipeptídeo ser c AgsHB.

6-. - Processo de preparação de uma proteína de fusão imunogénica caracterizado pelo facto de se ligar operativamente a proteína AgcHB, por uma ligação peptídica, a um imunogénio relacionado com um patogénio.

7®. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de o uito imunogénio relacionado com um patogénio reagir imunologicamente com os •'inticorpos induziaos pelo dito patogénio.

8^ê. - Processo de acordo com a reivinaicação 6, caracterizado pelo facto de o dito imunogénio afim de um patogénio ser operativamente ligado ao resíduo de aminoácido de terminal amino do dito AgcHB.

6η 052

Ref: EPG-.ll-SCRF 110.1

-669^a. - Processe ue preparação de uma proteína de fusão imunogénica caracterizado pelo facto de se ligar operativamente um imunogénio polipeptídeo consistindo essencialmente em cerca de 10 a cerca de 30 resíuuos de aminoácido, a uma sequência flanqueadora de terminal amino e a uma sequência flanqueadora de te_r minai carboxilo, a dita sequência flanqueadora de terminal amino consistindo essencialmente em cerca de 10 a cerca de 20 resíduos de aminoácido com uma sequência de resíduos de aminoácidos correspondendo, em sequência, à proteína ao núcleo do HBV desde cerca da posição 1 até cerca da posição 35 e por a cita sequência flanqueadora de terminal carboxilo consistindo essencialmente em cerca de 120 a cerca de 160 resíduos de aminoácido tendo uma sequência ae resíduos de aminoácido correspondendo, em sequência, à proteína do núcleo desde cerca da posição 10 até cer ca da posição 183.

10^a. - Processo de preparação de uma proteína de fusão imunogénica caracterizado por se ligar operativamente um imunogénio polipeptídeo consistindo essencialmente em cerca de 10 a cerca de 30 resíduos de aminoácido por meio de uma ligação peptídica a uma sequência flanqueadora de terminal amino e a uma sequência flanqueadora de terminal carboxilo, a dita sequência flanqueadora de terminal amino consistindo essencialmente em cer ca de 70 a cerca de 90 resíduos de aminoácido tenao uma sequência de resíauos de aminoácido correspondendo, em sequência, à proteína do núcleo do HBV desae cerca da posição 1 até cerca da posição 90, a dita sequência flanqueadora de terminal carboxilo consistindo essencialmeijte em cerca de 65 a cerca ae 85 resíduos ae aminoáciao tendo uma sequência de reá.auos de aminoácido correspondendo em sequência, à proteína do núcleo aesde cerca da posição 8o até cerca da posição 183.

11^a. - Processo ue preparação de um polipeptídeo estimulante de célulasT consistindo essencialmente em cerca de 15 a cerca de 70 resíduos de aminoácido tendo uma sequência corresponden do a uma parte da sequência de resíduos de aminoácido da proteína do núcleo desde cerca da posição 70 até cerca da posição 140 a partir do seu terminal amino, caracterizado por compreender os

67 c52

Ref: EPG:11-SCRF 110.1

-67passos de:

a) ligar o grupo carboxilo do aminoácido de terminal carbóxilo, ao polipeptídeo a ser preparado, a um suporte sólido por meio de uma ligação éster, sendo o grupo amino-alfa do referido aminoácido bloqueado por um grupo de bloqueio removível, e por quaisquer cadeias laterais reactivas do referido aminoácido serem também bloqueadas com um grupo de bloqueio removível diferente;

b) remover o referido grupo de bloqueio do grupo amino-alfa para formar um grupo amino-alfa livre;

c) ligar o grupo carboxilo de um aminoácido adicional, cujos grupo amino-c^ e quaisquer grupos laterais reactivos são bloqueaaos por grupos de bloqueio, removíveis, diferentes, ao grupo amino-alfa livre que está ligado ao suporte sólido, para formar uma ligação peptídica;

u) remover o grupo de bloqueio do aminoácido ligado por uma ligação peptídica para formar um grupo amino-alfa terminal, livre;

e) repetir os passos c) e d) até que o polipeptídeo com a sequência desejada esteja formado;

f) remover todos os grupos de bloqueio do polipeptídeo assim formado;

g) clivar a ligação éster entre o aminoácido de terminal carboxilc ao polipeptídeo preparado e o suporte sólido;

h) separar o polipeptídeo preparado do suporte sólido: e

i) recuperar o polipeptídeo preparado.

12^a. - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por o polipeptídeo preparado compreender uma sequência de resíduos de aminoácido, da esquerda para a direita e no sentido do terminal amino para o terminal carboxilo, representada pela fórmula seleccionada do grupo consistindo em:

TWVGVNLEDPASRDLVVSYVNTNMG,

VVSYVNTNMGLKFRQL, LLWHISCLTFGRETVIEYLV, e VSFGVWIRTPPAYRPPNAPIL.

67 052

Ref: EPG:11-SCRF 110.1

-6813^è. - Processo de acordo com a reivinaicação 11 caracterizado pelo facto do polipeptídeo estimulante de células T consis tir essencialmente de uma sequência de resíauos de aminoacido, da esquerda para a direita e no sentido do terminal amino para o terminal carboxilo, representada por uma fórmula seleccionaaa do grupo consistindo em:

(a) IWIDPYKEFGATVELLSFLP, (b) RDLLDTASALYREALESPEHCSPHH, (c) TWVGVNLEDPASRDLVVSYVNTNMG, (d) VVSYVNTNMGLKFRQL, (e) VVSYVMMGLK, (f) LLWFHISCLTFGRETVIEYLV, (g) LLWFHISCLTF, (h) VSFGWIRTPPAYRPPNAPIL, (i) VSFGVWIRTPPA, (j) PPAYRPPNAPIL, e (k) WIRTPPAYRPPN.

14^ê. - Processe de preparação de um imunogénio polipeptídeo compósito com pelo menos 2G resíduos ae aminoáciao caracterizado por se ligar operativamente um polipeptídeo estimulante de células T consistindo essencialmente em cerca de 15 a cerca de 70 resíauos de aminoacido tendo uma sequência correspondendo à sequência de resíduos de aminoácido ao AgcHB desde cerca da posição 70 até cerca aa posição 140 a partir ao seu terminal amino, a um imunogénio polipeptíaeo.

15®. - Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo facto ae o dito polipeptídeo estimulante de células T ter uma sequência de resíduos de aminoácido, da esquerda para a direita e no sentido do terminal amino para o terminal carboxilo, representada pela fórmula:

LLWFHISCLTFGRETVIBYLV e por o dito imunogénio polipeptídeo ser seleccionado do grupo consistindo de AgsHB na forma de partículas, e ae um polipeptídeo mais pequeno consistindo essencialmente numa sequência de resíduos de aminoácido, da esquerda para a direita e no sentido do terminal amino para o terminal carboxilo, representada pelas ό7 ο52

Ref: EPG:11-SCRF 110.1 ' ..

** /

-69formulas:

DPRVRGLYFPAGG e DPRVRGLY;

sendo o dito polipeptídeo estimulante de células T operativamente ligado a) ao dito AgsHB através ae uma cadeia lateral de resíduo de aminoácido, e (b) ao dito polipeptídeo mais pequeno por uma ligação peptídica.

16^a. - Método para aumentar a imunogenicidade de um imunogénio polipeptídeo compreendendo a ligação operativa do dito imunogénio ao AgcHB através de uma cadeia lateral de resíduos de aminoácido ou através de uma ligação peptídica.

17^a. - Método para aumentar a imunogenicidade de um imunogénio polipeptídeo, compreendendo a ligação operativa do dito imunogénio polipeptídeo a um polipeptídeo estimulante de células T consistindo essencialmente de cerca de 15 a cerca de 70 resíduos de aminoácido, com uma sequência correspondendo à sequência de resícuos ae aminoácido do AgcHB desde cerca da posição 70 até cerca da posição 140 a partir do seu terminal amino.

18^a. - Métoao para aumentar a imunogenicidade de um imunogénio polipeptídeo, compreendendo a ligação operativa, por uma ligação peptídica, ao dito imunogénio polipeptídeo, de um polipeptídeo estimulante de células T com uma sequência de resíduos de aminoácido representada por:

(a) DIDPYKEFGATVELLSFLP, (b) RDLLDTASALYREALESPEHCSPHH, ( c) TWVGVNLEDPASRDLVVSYVNTNMG, (d) VVSYVNTNMGLKFRQL, (e) WSYVNTNMGLK, (f) LLWFHISCLTFGRETVIEYLV, (g) LLWFHISCLTF, (h) VSFGVWIRTPPAYRPPNAPIL, (i) VSFGVWIRTPPA, (j.) PPAYRPPNAPIL, e (k) WIRTPPAYRPPN.

67 052

Ref: EPG:11-SCRF 110.1

-70lisboa,

Por SCRIPPS CLINIC AND RESEARCH FOUNDATION

1/20

IIPPS CLINIC AND RESEABCH FOUNDATION /20

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7/20

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RIPPS CLINIC AND BESEARGH FOUNDATION

18/20

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CRIPPS CLINIC AUD RESEARCH FOUNDATION

Estirpe 1^o 2° B1O.S CFA HBcAg 120-140 0 120-140 HBcAg 120-131 0 120-131 HBcAg 129-140 0 129-140 HBcAg B10 CFA HBcAg 120-140 0 120-140 HBcAg 120-131 0 120-131 HBcAg 129-140 0 129-140 HBcAg

CRIPPS CLINIC AND RESEARCH FOUNDATION

20/20

I

FIG. 19

PH] TdR (cpmx 1 D'³)

Estirpe Imunogénio Antigénio [1.0 pg/ml]

B10.S cl 20-1404133-140) HBcAg

C120-140

C120-131 c129-140 (133-140)

HBsAg/GP33

10 20 30 40 50 60

70 ι

B10 c! 20-1404133-140). HBcAg

C120-140

0120-131

429-140 (133-140)

HBsAg/GP33

B10.BR 420-1404133-140) HBcAg

C120-140

C120-131

C129-140 (133-140)