PT85928B

PT85928B - Estojo para a colheita de celulas endoteliais

Info

Publication number: PT85928B
Application number: PT85928A
Authority: PT
Inventors: Phillip Dalton Bowman; David Mark Workinger; John Lewis Fisher
Original assignee: Gore & Ass
Priority date: 1986-10-17
Filing date: 1987-10-15
Publication date: 1993-07-30
Also published as: AU7770787A; EP0264191A3; PT85928A; DK543887A; ATE72512T1; DE3776680D1; GB8721634D0; FI874444A; DK543887D0; IL84140A0; GB2197662A; FI874444A0; NO874326L; EP0264191A2; NO874326D0; EP0264191B1; US4736850A; JPS63186636A; ZA877794B

Description

MEMÓRIA DESCRITIVA

A presente invenção refere-se a um estojo para a colheita de células endoteliais que permite a obtenção rápida de células endoteliais humanas viáveis. Os esforços de investigação anteriores têm sido dirigidos no sentido de desenvolver revestimentos antitrombogénicos em próteses vasculares sintéticas por sementeira de células endoteliais. A fim de desenvolver estes revestimentos, as células endoteliais naturais têm primeiro que ser extraídas de segmentos de artérias e velas humanas.

A colheita de células endoteliais é um processo para a remoção de células endoteliais viáveis de uma porção de veia autóloga. A colheita de células é obtida por raepagem mecânica ou por atrito, ou ainda por tratamento enzimátioo.

- 1 N.

Uma utilização das células colhidas consiste em semear préteses vasculares.

Experimentação extensiva em animais e experiên cias limitadas em seres humanos indicam que os enxertos semea dos endotelializam mais rapidamente * produzem uma menor reacção das plaquetas e têm uma melhor exposição que os enxertos não semeados. Pode ser necessária uma terapêutica anti-plaque tas acessória até que o revestimento endotelial se tenha desenvolvido. A terapêutica anti-plaquetas é aliás um procedimento normalizado para os pacientes que recebem enxertos vasculares.

Em resumo, a colheita é realizada como segue: extirpa-se um segmento de veia autóloga, isto é, proveniente do próprio indivíduo, de uma pessoa e retiram-se as células endoteliais. Concentram-se as células assim obtidas, por centrifugação, faz-se a sua suspensão numa fracção de sangue do indivíduo em questão e colocam-se no enxerto vascular até que se forme uma fina camada de coágulo na parede do enxerto. 0 enxerto semeado é imediatamente implantado na pessoa. As cé lulas endoteliais semeadas no enxerto crescem depois para confluir na superfície luminar, proporcionando assim uma verdadeira neoíntima. Neste processo são usadas apenas células autáIogas.

Ê proporcionado um estojo de colheita de célu las que compreende um recipiente de acondicionamento contendo três tinas, um suporte que suporta os componentes necessários para a colheita das células e três frascos contendo enzimas, enzimas reconstituídas e HBSS (Hank's balanced salt solution- Solução salina equilibrada de Hank), respectlvamente.A três tinas incluem uma tina exterior, com uma tampa que se aplica de maneira estanque à tina exterior para preservar a esterili dade do seu conteúdo* uma tina dos componentes no interior da tina exterior, tendo a tina dos componentes uma tampa vedada e tendo uma prateleira em torao da sua periferia para apoiar

um elemento de suporte que têm no mesmo cavidades para oonter os componentes necessários para a colheita das células, contendo a tina dos componentes a terceira tina, que compreende uma tina de processamento com uma calha na qual pode colocar-se uma veia extirpada para dela colher as células, 0 elemento de suporte da tina dos componentes do estojo de colheita de células contétn além disso pelo menos duas pipetas descartáveis, dois tubos de centrifugação, duas cânulas, duas pontas de seringa numa caixa e dois fundos de seringa numa caixa.

Numa outra forma de realização da tina de pro cessamento, a referida calha está desviada do eixo central da tina de processamento e há trás cavidades situadas na mesma , nas quais se mantém no seu lugar os três frascos,

Proporciona-se também um processo para a colheita de oélulas de uma veia de um paciente que compreende as fases de extirpar uma veia do paciente e colocar a veia na calha da tina de processamento e alongar a veia até atingir apràximadamente o seu comprimento in vivo, lavar a veia com HBSS, encher a veia com protease neutra, deixar que a protease neutra e a solução de células assente e transferir a solução para um tubo de centrifugação. Usam-se como protease neutra de preferência dispase I e II. Podem repetir-se as fases da colheita das oélulas a partir de urna veia.

Descreve-se a seguir a presente invenção, a título de exemplo, com referência aos desenhos anexos, cujas figuras representam»

A fig· 1« uma vista em planta de um estojo de colheita de células segundo a presente invençãoj

A fig. 2, uma vista em alçado lateral, em par te com oorte transversal do estojo de colheita de células da fig. 11

A fig. 3« uma vista em alçado lateral, parcial mente em corte, do estojo de colheita de células, sendo o cor te feito pela linha (3-3) da fig. 1;

A fig. b, uma vista em planta da tina de processamento do estojo;

A fig. 5» um alçado de frente, parcialmente em corte, da tina de processamento, sendo o corte feito pela linha (5-5) da fig. 4;

A fig. 6, uma vista em alçado de topo da tina de processamento;

A fig. 7» uma vista de cima de uma forma de realização alternativa da tina de processamento na qual a calha para o processamento da vela está situada para um dos lados da tina;

A fig. 8, uma vista em alçado lateral de uma outra tina de processamento segundo a presente invenção, parcialmente em corte, sendo este feito substancialmente pela li nha (8-8) da fig. 7i

A fig. 9» uma vista de topo de uma outra tina de processamento;

A fig. 10, a fase do processo de eneanuiação da veia;

A fig. 11, a fase do processo de montagem da veia e da cânula na oalha de processamento;

A fig. 12, a fase do processo de lavar as células proveniente da veia no interior de um tubo de centrifugação ;

A fig. 13» a fase do processo de centrlfuga4

çao da solução para formar uma bola de células no fundo do tu bo ;

A fig· 14, a fase do processo de retirar a fracção flutuante, com a pipeta, depois da centrifugação;

A fig* 15, a fase do processo de fazer de novo a suspensão das células numa pequena quantidade de sangue;

A fig* 16, a fase do processo de introduzir a mistura de sangue-células na seringa; e

A fig. 17» a fase do processo de injecçSo da mistura sangue-células num enxerto.

No estojo de colheita de células endoteliais ilustrado, reune-se uma combinação dos componentes necessários para a colheita, enzimas e soluções salinas, para serem facilmente acessíveis na colheita de células de veias. Este estojo pode ser usado directamente na sala de operações e a colheita de células pode fazer-se durante a operação. A tempo ratura preferida das soluções usadas durante a colheita está na gama dos 20°C aos 37°C· A temperatura pode ser mantida por melo de um elemento suplementar de aquecimento, não provido no estojo. As enzimas de protease neutras que podem ser usadas neste estojo e cotn este processo incluem Dispase I e Dispase II.

No estojo de colheita de células é proporcionado um recipiente rectangular com uma tampa vedada e contendo três tinas e um elemento de suporte. As três tinas incluem uma tina de processamento, na generalidade rectangular, que possui uma calha longitudinal na qual deve colocar-se uma veia para a colheita de células, contida com uma tina dos componen tes, que tem um suporte moldado no qual se situam várias cavi dades para utensílios usados na colheita de células, tais como pipetas, cânulas, seringas, agulhas e tubos centrífugos, tudo contido no interior de uma tina vedada hermeticamente pa

ra manter a esterilidade da tina dos componentes e a tina de processamento contida no interior. Numa variante de realização da tina de processamento» há um certo número de cavidades situadas na tina de processamento nas quais são colocados fras cos contendo protease neutra e soluções salinas e a calha na qual deve colocar-se uma veia para a colheita das células está desviada do eixo central da tina.

Na forma de realização representada na fig. 1 , o estojo de colheita (10) é constituído por um recipiente de acondicionamento (11) e as três tinas, nomeadamente uma tina exterior (12) com uma tampa (13), uma tina dos componentes (14) com um suporte (16) e a tampa (17)· e uma tina de processamen to (31)· De preferênoia as tampas (13) e (17) são de plástico transparente. Como se ilustra na fig. 1, o elemento de suporte (16) contém as depressões (19)» (21), (23) (25) e (27) dimensionadas para reter os componentes necessários para a 00lheita de células. Encontram-se os seguintes componentes dentro deste elemento de suporte (16)1 duas pipetas descartáveis (18) situadas nas cavidades (19)» dois tubos de centrifugação de 15 <nl (20) colocados nas cavidades (21), duas cânulas (22) nas cavidades (23), duas caixas de agulha de seringa (24) con tendo agulhas (34) situadas nas cavidades (25) e duas caixas de seringa (26) contendo seringas (15) situadas nas cavidades (27)· Uma cavidade longitudinal (29) proporciona o acesso fácil aos vários componentes pela pessoa que utiliza o estojo.

Três frascos (28) estão colocados fora do ele mento de suporte (16) da tina dos componentes (14) e da tina exterior (12), mas no interior do recipiente (11). Os três frascos contêm enzimas de protease neutras, HBSS para reconstituir as enzimas e HBSS para lavar a veia e as células, respectivamente .

Na vista em corte da fig. 2, vê-se uma calha (30) na tina de processamento, sendo a calha dimensionada para conter a veia extirpada.

Os componentes ego oolocados no interior do elemento de suporte (16) de modo que, no caso de pares de com ponentes (18), (20), (22) e (26), a parte superior de um componente do par está Junto da parte inferior do outro componen te do par dentro das suas depressões específicas. Assim, por exemplo, as pipetas (18) que se vêm na fig. 2 mostram a parte superior de uma pipeta Junto da parte inferior da outra.

Como se mostra na vista em planta na fig· 4 , na tina de processamento (31)» a calha (3θ) na qual se deve colocar a veia está colocada no centro da tina (31) e em cada uma das extremidades da calha (30) estão situadas ranhuras (32) para receberas cânulas.

Na variante de realização da tina de processa mento (31*) representada nas figs. 7» β · 9» a calha (30*) pa ra a veia está situada para um dos lados da tina de processamento (31' ) θ’⁷¹ vez de estar centrada na tina. Há também três cavidades (33) no interior da tina (31’) para suster os frascos (28). Em cada uma das extremidades da calha (30’) estão situadas ranhuras (32*) para receber cânulas.

Componentes que podem também ser necessários mas que não fazem parte do estojo incluem uma centrifugadora clínica capaz de proporcionar uma força centrífuga 3θθ vezes a aceleração da gravidade» com um rotor para receber tubos de 15 ml, um bloco de aquecimento para aquecer a tina e um valvu látomo·

Podem introduzir-se modificações no desenho do recipiente e das tinas, na embalagem das enzimas e da HI3SS, no número e dimensões das seringas, no número de pipetas, no número de tubos centrífugos e/ou no processo de recolher as células depois da colheita.

As figs. 10 a 17 representam as fases do processo seguido na utilização do estojo para a colheita de célu

las endoteliais. Em geral, a utilização do estojo* enquanto um paciente está a ser preparado para uma intervenção oirdrgi ca de reconstrução ou de contorno vascular, retira-se um pequeno segmento de veia (35). Como se ilustra na fig. 10, a veia removida ê encanulada com as cânulas (22) em cada uma das extremidades da veia. Como se mostra na fig. 11» a veia (35) e as cânulas (22) são depois montadas na tina de processamento (31) no interior da calha (30). Lava-se a luz da vela suavemente por meio de HBS5. Se se encontrarem válvulas obstruídas, têm que se cortadas com um valvulótomo. Enche-se a veia com a protease neutra reconstituída, de preferência Dispase.

' Passados cinco minutos retira-se a solução da enzima e substi tui-se por enzima fresca. Passados outros 10 minutos, drena-se de novo a veia (35). As duas recolhas da solução de enzima são combinadas num dos tubos de centrifugação (20) como se representa na fig. 12.

Lava-se depois a veia com HBSS, que é recolhi do e dividido entre os dois tubos centrífugos (20). Depois de igualizar os níveis da solução nos dois tubos com HBSS, centrifugam-se as soluções numa centrifugadora de 4o a 3θ0 vezes a aceleração da gravidade durante 3 minutos, como se mostra na fig. 13. Uma bola será visível no fundo de uma ou das duas ( tinas depois da centrifugação.

Como se mostra na fig. 14, aspira-se cuidadosa mente a fracção flutuante de sobre a bola d· células no tubo de centrifugação (20) que contém as soluções das enzimas, com uma pipeta (18), Lança-se HBSS fresca no tubo (20) e faz-ee novamente a suspensão das células agitando suavemente. As pira-se também cuidadosatnente a fracção flutuante no segundo tubo (20) e faz-se de novo a suspensão da bola de células na suspensão de células do primeiro tubo (20) agitando suavemente. Retira-se uma gota da suspensão de células e colooa-se na lâmina de vidro do mlcrozcõplo de modo que pode confirmar-se a presença de oélulas.

Vinte minutos antes da implantação do enxerto, retlram-ee 10 a 20 ml de sangue não heparinizado do paciente. Mistura-se uma pequena quantidade de sangue não heparinizado fresco com a suspensão de células no primeiro tubo (20) como se mostra na fig. 15« Esta fase é realizada imediatamente antes da sementeira do enxerto vascular (42).

Usa-se também uma pequena quantidade de sangue não heparinizado para revestir a superfície interior do enxerto vascular (42). Isso faz-se fechando ump extremidade do enxerto com um tampão atraumático e injectando o sangue no interior do enxerto. Massaja-se suavemente o enxerto para revestir compLetamente a superfície interior. Passados cinco mi nutos, lança-se para fora do enxerto qualquer excesso de sangue» Depois lança-se a suspensão de oélulas na seringa (15), como se mostra na fig. 16 e injecta-se no enxerto (42)» como se mostra na fig. 17 e tapa-se a extremidade aberta. A suspen são de células de sangue é distribuída pela superfície do enxerto dando pancadas ligeiras, virando e massajando.

Podem introduzir-se modificaçães no estojo pa ra aperfeiçoar o manejo simples da veia e das células endoteliais, aumentar o rendimento de obtenção de células endoteliaie e/ou reduzir o tempo necessário para a colheita e a semen teira das oélulas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

- 1* Estojo paira a colheita de células, caracterizado por compreender um recipiente de acondicionamento (11) contendo três tinas (12, 14, 31)« utn suporte (16) que contém os componentes necessários para a colheita das células e três frascos (28)« contendo os referidos frascos enzimas HBSS paira, a reconstituição das enzimas e HBSS, respectivamente, compreendendo as referidas três tinasi

a) uma tina exterior (12) com uma tampa (13) aplicada de maneira vedada à referida tina exterior para preservar a esterilidade do seu conteúdo;

b) uma tina dos componentes (14) no interior da referida tina exterior, tendo a tina dos componentes uma tampa vedada(17) e uma prateleira em torno da sua periferia para suportar um elemento de suporte que tem nela formadas cavidades para reter os referidos componentes necessários para a colheita das células, contendo a referida tina dos componen- ( tes também a terceira das referidas tinas, compreendendo a referida terceira tina.

c) uma tina de processamento (31) com uma calha (3θ) na qual pode ser colocada uma veia extirpada para dela colher célu las.

- 28 Estojo para a colheita de células de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido suporte compreender pelo menos duas pipetas descartáveis (18), dois tubos centrifugadores (20), duas cânulas (22), duas pontas de

- 10 wwity seringa (24) e dois fundos de seringa (27)

- 3? -

Estojo para a colheita de células de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido canal na referida tina de processamento estar desviado da linha de eixo central da tina de processamento e por a referida tina de processamento ter nela formadas três cavidades nas quais os referidos três frascos são mantidos no seu lugar.

- 4» -

Processo para a colheita de células de uma veia de um paciente usando um estojo de colheita de células, tendo o referido estojo uma tina de processamento contendo um canal ou calha, caracterizado por incluir as fases des

a) depois de extirpar a referida veia do paciente, colocação da referida veia na calha da referida tina de processamento e alongamento da referida veia até apréximadamente o seu comprimento in vivoi

b) lavagem da referida veia com HBSS;

c) enchimento da referida veia com uma protease neutra e permitir que a solução da protease e da célula assentei e

d) transferência da referida solução da protease e de das células para um tubo centrifugador para processamento ulterior.

- 5» Processo de acordo com a reivindicação 4, ca11 racterizado por a referida protease neutra ser Dispase I.
6* racterizado ora

Processo de acordo com a reivindicação 4, capor a referida protease neutra ser Dispase II.
7’ racterizado por

Processo de acordo com a reivindicação 4, case repetirem as fases b), o) e d)

A requerente desta patente foi depositado 17 de Outubro de 1986, sob o declara que o primeiro pedido nos Estados Unidos da América em ndmero de série 920,206.