PT85546B - Processo de preparacao de inibidores proteicos de proteases - Google Patents
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Description
Campo da invenção
A presente invenção refere-se ao processo de preparação de inibidores microbianos de proteases e, especificamente, ao processo de preparação de inibidores proteicos de proteases produzidos por Streptomyces, que estão estruturalmente relacio nados com Inibidor da Subtilisina de Streptomyces e aos seus genes clonados e suas utilizações em processos com ADÍM recombi nante.
Antecedentes da invenção
Os inibidores proteicos de proteases parecem desempenhar um papel importante na regulação das funções protease em orqa nismos e células vivos. Estes inibidores de protease encontram-se largamente distribuídos em animais e plantas. Exemplos destes inibidores são a alfa-l-antiprotease, o inibidor da tripsina de soja, □ inibidor da tripsina de pancrêas bovino e a antitrombina. Os inibidores proteicos de protease pro duzidos microbianamente incluem uma família de proteínas dimé ricas, cada uma com 10 a 12 kilodaltons (kd). Esta família inclui o SSI, o inibidor alcalino de protease (API-2) a partir de S,. griseoincarnatus, plasminoestreptina (PSfj) a partir do S, antifibrinolyticus e um inibidor de protease a partir do Streptoverticilium cinnamoneum. Os inibidores da família SSI partilham uma homologia de sequência extensiva, p.e., cerca de 70% entre o SSI e PSIM, mas parecem ter especificidades de proteases diferentes. Ver geralmente, Protein Protease Inhi bitors - The Case of Streptomyces Subtilisin Inhibitor (SSI), publicado por Hiromi et al., Elsevier, 1985,páginas 1-14, 139-161 e 365-395. Kakinuma et al., Patente dos Estados Unidos 4 014 860, descreve o PSN e uma estirpe sua produtora.
Os inibidores proteicos de protease têm aplicação médi, ca p.e. no tratamento da degradação do tecido pulmonar provocada por deficiência de alfa-l-antiprotease. Os inibidores
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-3proteícos de protease podem também ser usados para evitar a degradação de proteínas provocada por proteases tais como as que estão presentes no soro. Wilson, Pedido de Patente Europeia n2. 113 319, refere o uso dB inibidor de tripsina Erythrina para inibir a conversão de um activador de plasminogé. nio de tecido de cadeia simples, na forma de cadeia dupla que ocorre na presença de soro.
Os Streptomyces são hospedeiros atractivos para a preparação dos poliptídeos desejados por técnicas de ADN recombi nante em virtude de possuírem a maquinaria celular necessária para exportar proteínas e em virtude de ter já sido adqui. rida uma grande experiência na cultura de Streptomyces para a produção de antibióticos.
Um problema que tem sido encontrado na preparação de proteínas heterólogas em Streptomyces é o da degradação da proteína por proteases endógenas. Um segundo problema que tem sido encontrado reside na obtenção de sequências de sinal de exportação que possam ser fundidas com as sequências de co dificação heterólogas, para exportar directamente os produtos genéticos heterólogos.
Além disso, é desejável obter regiões reguladoras, p. e., promotores, centros de ligação de ribossomas e sequências de transcrição de intensificação/estabilização que possam ser usadas para exprimir as sequências de codificação heterólogas em Streptomyces a altos níveis. Estes produtos estão tipicamente associados com a produção de ARN-m abundante e/ou de produtos genéticos.
Brauiner et al., Pedido de Patente Europeia n2. A-187630 descreve uma unidade de expressão genética de beta-galactosidase em Streptomyces e a utilização do seu promotor e da sua sequência de sinal de exportação para exprimir e exportar pro dutos genéticos heterólogos.
Um dos objectivos do presente invento consiste em proporcionar novos inibidores proteicos de proteases a partir de
Streptomyces. Um outro objectivo do presente invento consiste
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-4no processo de preparação de pequenas proteínas exportadas que são produzidas em quantidades abundantes, e das suas sequências de codificação de ADN, sinais de exportação e regiães reguladoras.
Sumário da invenção
A presente invenção refere-se ao processo de preparação de novos inibidores proteicos de protease seleccionados do gru po consistindo da Proteína Exportada Lividans (10 kd) (LEP-10) e do Inibidor de Tripsina Longisporus (LTI).
Sob outras perspectivas, o presente invento refere-se ao processo de preparação de uma molécula de ADN recombinante compreendendo (i) a unidade de expressão genética LEP-10 ou LTI, (ii) a sequência de codificação de LEP-10 ou de LTI, (iii) a região reguladora de LEP-10 ou de LTI, (iv) a sequência de sinal de .exportação de LEP-10 ou de LTI, ou (v) uma sequência de codificação híbrida, fundida com uma sequência de codificação heteróloga e de um microrganis mo ou célula transformados com eles.
Descrição detalhada da invenção
A LEP-10 e o LTI são novos inibidores proteicos de pro tease muito semelhantes. São aproximadamente do mesmo tamanho e partilham homolcgia de sequência cam os inibidores de protease da família SSI.
A LEP-10 foi originalmente identificada, por coloração com Azul Brilhante de Coomassie de geles de proteína SDS-PAGE, comc sendo uma proteína exportada de baixo peso molecular (cerca de 10 000 daltons) presente no meio de uma cultura da estirpe 1326 de Streptomyces lividans. Os dados obtidos sobre a sequência de aminoácidos em peptídeos derivados de uma digestão tríptica do LEP-10 sugerem homologia com o PSN e o SSI. Usando a sequência de aminoácidos de um dos peptídos
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-5trípticos da LEP-10 prepararam-se sondas de oligonucleotídeo que foram usadas para identificar os fragmentos de ADN preseji tes na biblioteca cromossómica do _S. lividans 1326 que continha uma sequência putativa da LEP-10. Os plasmídeos que continham estas sequências putativas foram usados para transformar o S. albus, que não produz naturalmente a LEP-10 e verifi. cou-se que os transformantes exprimem o LEP-10.
LTI foi também originalmente identificado em geles de proteína a partir de uma cultura de _S. longisporus. Preli. minarmente, a determinação da sua sequência de aminoácidos i_n dicou homologia com a LEP-10. 0 rastreio inicial de uma biblioteca de um _S. longisporus com sondas de oligonucleotídeo da LEP-10, resultou na obtenção de fragmentos de ADN cromossj5 mico que foram hibridados com as sondas da LEP-10 mas que não codificaram o LTI. Cultivou-se um anticorpo policlonal contra □ LTI. 0 anticorpo anti-LTI reagiu com a proteína produzida pelo S_. longisporus mas não com a LEP-10. Por sondagem com fragmentos de polinucleotídeo contendo a sequência de codificação da LEP-10, identificou-se então um fragmento de Bam Hl de 2,1 kilopares de base, de ADN cromossómico do S_. longisporus contendo putativamente o gene LTI. Transformou-se o S,. lividans 1326, que não produz □ LTI, com um plasmídeo compreendendo a sequência de 2,1 kb que por reacção com o anticorpo anti-LTI mostrou produzir o LTI. Este procedimento que constitui parte do presente invento, compreende a transformação dum hospedeiro de Streptomyces com fragmentos de ADN de outro microrganismo ou célula que se sabe ser capaz de produzir uma proteína exportada. Os clones transformantes são então incubados numa placa de ágar em contacto com um substrato adsorvente, p.e., um filtro de nitrocelulose com um diâmetro de p_g ro de 0,2^m, para permitir que as proteínas exportadas se adsorvam no substrato. 0 substrato é então retirado e seco, e testado para determinar a reactividade com anti-soros específicos para a proteína exportada, por técnicas convencionais de imuno-ensaio. São seleccionados os clones dos transformar» tes que reagiram com os anti-soros. 0 fragmento de ADN, in-
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-6troduzido nos transformantes pode então ser sub-clonado.
Assim, o presente invento inclui um processo de clonação e identificação de sequências de ADN que codificam um pro duto genético exportado, que compreende:
1) o isolamento do produto genético de uma cultura de um microrganismo ou célula produtores, formando-se além disso anti-soros específicos;
2) a clonação de fragmentos de ADN de um microrganismo ou célula produtores numa estirpe de Streptomyces não produtora;
3) o contacto dos transformantes Streptomyces do passo 2 com um substrato adsoruente e a incubação dos transformantes por um período de tempo suficiente para permitir que as proteínas exportadas pelos transformantes se adsorvem no substrato, e em seguida
4) o teste do substrato por forma a determinar a sua reactividade com os anti-soros do passo 1.
Similarmente, as sequências de codificação de LEP-10 e de LTI, ou sequências para proteases similares, podem ser identificadas e isoladas a partir de fontes microbianas ou ce lulares, por sondagem de hibridação, de fragmentos de ADN cro. mossómico com fragmentos simples isolados da sequência de codificação da LEP-10 ou do LTI» Estes fragmentos sonda têm preferivelmente um comprimento de pelo menos cerca de 30 nucle otídeos. Assim, o presente invento inclui também um processo de identificação de sequências de codificação de ADN para ini bidores de protease que compreende a hibridação de fragmentos das sequências de codificação de LEP-10 ou de LTI com fragmeri tos de ADN cromossómico de um microrganismo ou célula.
Os inibidores de protease de LEP-10 e de LTI partilham homologia um com o outro e com o SSI e o PSN. A LEP-10 e o
LTI são aproximadamente 80$ homólogos um com o outro e aproxi.
madamente 70$ homólogos com o SSI e o PSN. Apresentam-se se-
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-7guidamente as sequências de aminoácidos da L.EP-10 matura e do LTI maturo, tal como foram determinadas por sequenciação de aminoácidos de digestão tríptica e/ou por análises da sequência de ADN. As análises de aminoácidos foram realizadas num sequenciador de aminoácidos Beckman 890M (Beckman Instruments, Fullerton, Califórnia). Mostram-se também as sequências do SSI e PSN publicadas em relatórios onde elas diferem da LEP-10 e do LTI.
I
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-ΒΙΟ
LEP-10 NH2-SER-LEU-TYR-ALA-PR0-SER-ALA-LEU-VAL-LEU-THR-VALLTI NH2-ALA-SER-LEU-TYR-ALA-PR0-SER-ALA-LEU-VAL-LEU-THR-VALPSN NH2-GLY- -METSSI ASP-ALA-PRO-SER-ALA20
LEP-10 GLY-HIS-GLY-GLU-SER-ALA-ALA-THR-ALA-ALA-PRO-LEU-ARG-ALA-VALLTI GLY-HIS-GLY-THR-SER-ALA-ALA-ALA-ALA-ALA-PRO-LEU-ARG-ALA-VALPSN -ASN- -THR-VAL-ASN- -GLUSSI -LYS- -VAL- -THR-THR- -GLU30 40 LEP-10 THR-LEU-THR-CYS-ALA-PRO-THR-ALA-SER-GLY-THR-HIS-PRO-ALA-ALALTI THR-LEU-ASN-CYS-ALA-PRO-THR-ALA-SER-GLY-THR-HIS-PRO-ALA-ALAPSN -ASNSSI -GLY-PRO50
LEP-10 ALA-ALA-ALA-CYS-ALA-GLU-LEU-ARG-GLY-ALA-HIS-GLY-ASP-PRO-SERLTI ALA-LEU-ALA-CYS-ALA-ASP-LEll-ARG-GLY-VAL-GLY-GLY-ASP-ILE-ASPPSN LEU-GLN- -GLY- -PHE-ASPSSI GLY-SER- -ASP- -ALA-ALA-VAL-GLY- -LEU-ASN60 70 LEP-10 ALA-LEU-ALA-ALA-GLU-ASP-SER-VAL-MET-CYS-THR-ARG-GLU-TYR-ALALTI ALA-LEU-LYS-ALA-ARG-ASP-GLY-VAL-ILE-CYS-ASN-LYS-LEU-TYR-ASPPSN -THR-VAL-ARG-GLY-ASP- -ALA- -LYS-GLN-PHE-ASPSSI -THR-ARG-GLY-GLU-ASP- -PRO-MET-VAL- -ASP80
LEP-10 PRO-VAL-VAL-VAL-THR-VAL-ASP-GLY-VAL-TRP-GLN-GLY-ARG-ARG-LEULTI PRO-VAL-VAL-VAL-THR-VAL-ASP-GLY-VAL-TRP-GLN-GLY-LYS-ARG-VALPSN -LYS-ARG-VALSSI
-LYS-ARG-VAL90 100 LEP-10 SER-TYR-GLU-ARG-THR-PHE-ALA-ASN-GLU-CYS-VAL-LYS-ASN-ALA-GLYLTI SER-TYR-GLU-ARG-THR-PHE-GLY-ASN-GLU-CYS-VAL-LYS-ASN-SER-TYRPSN -THR- -SER-TYRSSI -VAL- -SER- -GLU-MET- -HISLEP-10 SER-ALA-SER-VAL-PHE-THR-PHE-COOH LTI GLY-THR-SER-LEU-PHE-ALA-PHE-COOH PSN GLY-MET-THR- -PHE-COOH SSI GLY-SER- -ALA-PHE-COOH
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-9A sequência anterior ê substancialmente exacta e não é, em nenhum caso, limitativa do presente invento. Está pressuposto que podem obter-se outras sequências de LEP-10 ou de LTI devido, por exemplo, a variações que não afectam significativamente a actividade, a processos alternativos ou a erros analíticos.
A LEP-10 e □ LTI têm mostrado inibir a tripsina num teste convencional de inibição de tripsina. Ver, Travis, Meth. Enzym., 80:755-765 (1981). Assim, quer a LEP-10, quer o LTI, podem ser usados em aplicações médicas ou noutras aplj. cações nas quais se deseje a inibição da tripsina ou a inibição de outra protease. Em comparação com a aprotinina, o LTI é um fraco inibidor da tripsina. Este resultado não é surpre endente dado que os inibidores de protease tendem a ter diferentes especificidades por proteases, mesmo entre os inibidores da família SSI.
A actividade inibidora da tripsina foi determinada num teste cromogénico usando o KABI S2288 como substrato (HO-ILE-PRO-ARG-p-nitroanileto). 0 corte da ligação ARG-p-nitroanileto liberta a p-nitroanilina que absorve a 410 nm; assim, é medido o grau de clivagem pelo aumento da absorvãncia a 410 nm. Este teste foi usado duma forma qualitativa para determi nar a actividade inibidora de LTI e de LEP-10, Resumidamente, diluições em série de um para dois, quer de meio condicionado (MC) quer de concentrados de sulfato de amónio (SA) de meio condicionado, foram misturadas com 25 ng de tripsina às quais se adicionou o substrato. Após 30 minutos à temperatura ambi ente, parou-se o teste por adição de ácido acético. 0 teste foi efectuado em placas de microtitulação que foram então lidas num leitor de ELISA. Incluíram-se como controlos amostras similares de PSN. As amostras de LTI tinham um forte pigmento preto-acastanhado, que deu um grande contraste no ensaio; a proteína purificada contudo mostra também actividade inibidora. Os valores apresentados são os valores de absorvância medidos após a clivagem do substrato cromogénico pela tripsina, 0 meio de crescimento não mostra ele próprio qualquer aç. tividade (não se apresentam os valores).
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-10Inibidor
| Diluição | MC | MC | SA | SA | SA |
| Reciproca | LTI | PSN | LTI | PSN | LEP-10 |
| No. In. | 0,898 | 0,772 | 0,763 | 0,751 | n. d. |
| 1 | 0,170 | 0,010 | 0,081 | 0,018 | 0,070 |
| 2 | 0,195 | 0,046 | 0,087 | 0,021 | 0,091 |
| 4 | 0,187 | 0,046 | 0,078 | 0,023 | 0,130 |
| 8 | 0,182 | 0,053 | 0,081 | 0,024 | 0,165 |
| 16 | 0,187 | 0,058 | 0,092 | 0,036 | 0,219 |
| 32 | 0,2 09 | 0,273 | 0,176 | 0,076 | 0,293 |
| A LEP | -10 e o LTI | mostraram | ambos uma | elevada | actividade |
quando comparada com a do PSN. Porém, em virtude das diluições usadas serem todas baixas demais para atingir um grau de inibição de 50$, as actividades não podem ser comparadas com exactidão. (n.d. significa não detectada).
As proteínas podem também ser usadas para inibir protea ses endógenas de Streptomyces ou outras proteases e desse modo inibir a degradação de produtos proteicos desejados, incluindo as proteínas heterélogas produzidas por técnicas de ADN recom binante. Para este propósito podem adicionar-se um ou ambos os inibidores a uma cultura de Streptomyces ou de outros microrganismos ou células, p.e., E.. coli, Bacillus, levedura, células de insectos ou mamíferos. Alternativamente, as estir pes de Streptomyces ou outros hospedeiros podem ser transforma, dos por engenharia genética para produzir um ou ambos os inibidores conjuntamente com uma proteína de interesse, tal como a seguir se descreve.
As proteínas podem também ser usadas para inibir a degradação de proteínas em soluções contendo proteases, e como reagentes laboratoriais, por exemplo num teste de inibição de protease. Por exemplo, o LTI tem demonstrada inibir a conver são do tPA de cadeia simples no tPA de cadeia dupla.
A unidade de expressão genética da LEP-10, isto é, a sequência de ADN contendo a sequência de codificação da LEP-10 e as regiões reguladoras necessárias para a transcrição e tra
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-11dução foi localizada num fragmento PstI de 4 kb de ADN cremos. sómico do S.. lividans 1326, e além disso num seu fragmento BamHI-PstI de 2,97 kb. Verificou-se que a unidade de expressão genética de LTI está presente num fragmento BamHI de 2,1 kb de ADN cromossómico do S> longisporus.
As unidades de expressão genética de LEP-10 e de LTI podem ainda ser isoladas por endonuclease de restrição adicio nal ou por digestões de endonucleases/exonucleases e por clonação e expressão dos seus fragmentos ou por sequenciação de ADN adicional. A sequência de codificação sozinha pode ser isolada e clonada por técnicas similares, na forma de um vector de expressão e a região reguladora sozinha pode ser isola da e clonada, na forma de um vector sonda promotor. Mais especificamente, pode fundir-se a sequência de codificação, em cadeia com um promotor, num plasmídeo. Este plasmídeo é usado para transformar um hospedeiro de Streptomyces ou outro, p.e., de JE. Coli, de _B. subtilis, de levedura, de insecto ou de mamífero. Este hospedeiro recombinante é então cultivado e os extractos de meio ou celulares são rastreados para detejr minar a presença do inibidor. 0 rastreio pode ser realizado, por exemplo, por electroforese de proteínas em gel, onde o inibidor pode ser detectado como uma proteína de 10 kd, por um teste de inibição da tripsina, por imunodetecção usando um anticorpo anti-LTI ou anti-LEP-10, por hibridação com sondas ou fragmentos LTI ou LEP-10, e/ou por análise da composição de aminoãcidos ou sequenciação de proteínas putativas de LTI ou de LEP-10. Exemplos de promotores que se sabe funcionarem em Streptomyces são o promotor da beta-galactosidase do Streptomyces, o promotor de lâmbda (PL), à esquerda, o promotor da tirosinase e os promotores de genes que conferem resis. tência aos antibióticos, p.e., resistência à eritromicina, re sistência à neomicina e resistência a tioestreptona.
As regiões reguladoras da LEP-10 ou de LTI podem ser inseridas num vector sonda promotor, isto é, num vector com uma sequência de codificação para um marcador fenotípico facil mente detectável, de tal modo que, apôs a inserção de um pro-
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-12motor funcional a montante da sequência do marcador, a sequêri cia seja expressa. Exemplos de marcadores úteis em Streptomyces são: marcadores de resistência a antibióticos, p.e., a tioestreptona, a canamicina e a -galactosidase de Streptomyces.
As regiões reguladoras de LEP-10 e de LTI podem ser usadas para exprimir a LEP-10 ou o LTI na unidade de expressão genética nativa, ou para exprimir polipeptídèos ou proteínas heterólogas numa unidade de expressão genética híbrida na for, ma de fusões de transcrição ou de tradução. 0 promotor quer da LEP-10 quer do LTI pode, por exemplo, ser fundido em cadeia a montante de uma sequência de codificação para antigénios de vacina, p.e., antigénio de superfície da Hepatite B, e glicoproteína rábica; ou para proteínas farmacologicamente activas, p.e. interleuquinas, activadores de plasminogénio, outros inibidores de protease tais como a alfa-l-antiprotease, o faç. tor de necrose de tumores, o Factor VIII e o da gripe NS1. 0 sinal de exportação de LEP-10 ou de LTI pode igualmente ser isolado e ligado a uma sequência de codificação de um polipeptídeo que não é normalmente excretado, em cadeia e a jusan te de um promotor.
Os derivados funcionais de cada domínio das unidades de expressão genética do invento, i.e., funções de promotor, funções de exportação e funções de inibição de protease, podem ser preparados pela utilização de endonucleases de restri ção, por mutagénese aleatória, p.e., por irradiação com ultra violetas e por mutagénese dirigida a centros, p.e., por inse£ ção, adição ou substituições de oligonucleotídeos sintéticos. Estes derivados podem ser facilmente testados em relação ao seu efeito na função. Uer, p.e., Davis et al., Adv. Bact. Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory (1980); Miller, Experiments in Molecular Genetics, Unit III, Cold Spring Ha_r bor Laboratory (1972); Botstein et al., Science 229:1193 (1985); e Estell et al., Science 233:659 (1986). No âmbito do presente invento estão também incluídos derivados funcionais das sequências de codificação e o processo de preparação das proteínas variantes.
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-13Os derivados funcionais das proteínas podem também ser preparados por alteração directa das proteínas. Esta alteração pode ser realizada por meios químicos incluindo a clivagem para remover aminoácidos e a inserção ou adição de aminoácidos. Estes derivados quimicamente preparados podem ser testados relativamente à sua actividade, por exemplo, por um teste de inibição de tripsina. No âmbito do presente invento inclui-se também o processo químico de preparação destes deri vados funcionais.
LTI parece ser expresso na forma de um LTI pré-pró, com uma sequência de sinal que aparentemente é clivada na secreção e com uma sequência pró que é clivada extracelularmente. No S_. longisporus são segregadas espécies com dois pesos moleculares. 0 pró LTI putativo tem 6 aminoácidos adicionais no terminal N quando comparado com o LTI maturo. No S_. lividans observam-se também espécies com dois pesos moleculares, mas a análise da sequência de aminoácidos N-terminal indica que os centros de processamento no S_, lividans podem ser dife rentes dos do S,. longisporus.
Indica-se seguidamente a sequência de ADN para a sequência de codificação do LTI e para algumas regiães a montante e a jusante não traduzidas. Na sequência indicam-se por barras (/) os centros de sinal putativo e de clivagem extracelular no S.. longisporus. Os centros de sinal putativo e de cli vagem extracelular no S_. lividans estão respectivamente 3 ami noácidos e 1 aminoácido a jusante (3')·
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14-140 -130 -120 -110 -100 SstII -80 ***** | *
TTCAACAOGC AAGGTTACTG AAACACATCG GGTOGAGGTG TITITOCGOG GOGCTACATG OCTGOGACTC
-70 -60 -50 -40 -30 -20 -10 *******
GOGCTOGCOG CTCCGGCACC AAACOGGAAC GGGTOGGCAC ACCCTOGAAT OCTCOGGAAG GATCCACACA
20 30 40 50 * * * * *
| ATC OGG AAC ACC GOG CGC TGG GCA GCC ACC CTC GOC met arg asn thr ala arg trp ala ala thr leu ala | CTC AOG GOC AOC GCC GTC TCC | ||||||||||||||||
| leu | thr ala | thr | ala vai cys | ||||||||||||||
| 60 | 70 | 80 | 100 | 110 | |||||||||||||
| * | * | * | * | * | |||||||||||||
| GGA | coc | CTC | ACC | GGA | GCC | GOG | CTC | GOC AOC | COG | GOC GCT GCT COC | GCC | TOG | CTC | TAC | |||
| gly | pro | leu | thr | gly | ala | ala | leu | ala/Thr | Pro | Ala Ala Ala/Pro | Ala | Ser | Leu | Tyr | |||
| 120 | 130 | 140 | 150 | Notl | 170 | ||||||||||||
| ★ | A | * | * | ★ | |||||||||||||
| GCC | occ | TCG | GCC | CTG | GTC | CTC | ACC | GTC | GGC | CAC | GGC | ACA | AGC GOG | GOC | GCC | GOG | GCC |
| Ala | Pro | Ser | Ala | Leu | Vai | Leu | Thr | Vai | Gly | His | Gly | Thr | Ser Ala | Ala | Ala | Ala | Ala |
| 180 | 190 | 200 | 210 | 220 | |||||||||||||
| * | ★ | * | * | ||||||||||||||
| COG | CTG | CGG | GCC | GTC | ACC | CTG | AAC | TCC | GCC | OOG | AOG | GCC | TOC GGA | AOC | CAT | COG | GCC |
| Pro | Leu | Arg | Ala | Vai | Thr | Leu | Asn | cys | Ala | Pro | Thr Ala | Ser Gly | Thr | His | Pro | Ala | |
| 230 | 240 | 250 | 260 | 270 | 280 | ||||||||||||
| * | * | * | * | * | * | ||||||||||||
| gcn | gcn | CTC | GCC | TCC | GCC | GAC | CTC | OGC | GGG | GTC | GGC | GCT | GAC ATC | GAC | GCC | CTC | AAG |
| Ala | Ala | Leu | Ala | Cys | Ala | Asp | Leu | Arg | Gly | Vai | Gly | Gly | Asp Ile | Asp | Ala | Leu | Lys |
| 290 | 300 | 310 | 320 | 330 | 340 | ||||||||||||
| * | * | * | * | * | * | ||||||||||||
| GOG | OGA | GAC | GGC | GTC | ATC | TCC | AAC | AAG | CTC | TAC GAC | COG | GTC GTC GTC | AOG | GTC | GAC | ||
| Ala | Arg | Asp | Gly | Vai | Ile | Cys | Asn | Lys | Leu | Tyr Asp | Pro | Vai Vai | Vai | Thr | Vai | Asp | |
| 350 | 360 | 370 | 380 | 390 | |||||||||||||
| * | * | * | * | * | |||||||||||||
| GGA | GTC | TCG | CAG | GGC | AAG | CGC | GTC | TCC | TAC | GAA | CGG | AOC | TTC GGC | AAC | GAG | TCC | CTG |
| Gly | Vai | Trp | Gin | Gly | Lys Arg | Vai | Ser | Tyr | Glu | Arg | Thr | Fhe Gly | Asn | Glu | Cys | Vai | |
| 400 | 410 | 420 | 430 | 440 | 450 | ||||||||||||
| * | ★ | * | * | * | * | ||||||||||||
| AAG | AAC | TOC | TAC | GGG | ACC AGC | CTC | TTC | GOG | TTC | TGA | GAGA CCGGGATOGOG GACTCCTOCT | ||||||
| Lys | Asn | Ser | Tyr Gly | Thr | Ser | Leu | Lhe Ala | Lhe | — | ||||||||
| 460 | 470 | 480 | 490 | 500 | 510 | 520 | |||||||||||
| 4 | r | ★ | * | * | * | * |
GCACAOCIGA AGAGGCAOGC AGTTGGGGAG TGOGACTCOC TICTOGOGG TACCCGTOGA TTCGAOGCnA
60Θ · G *
SKB CASE 14324-1 / _
-15Deve entender-se que a sequência anterior é substancialmente correcta, e que não é em nenhum caso limitativa do presente invento. A sequência ilustrada pode, por exemplo es_ tar incorrecta num ou nalguns pares de bases e/ou aminoácidos. Podem também existir ou ser preparadas outras sequências que também codificam o LTI, sequências essas que podem diferir num ou em alguns pares de bases e/ou aminoácidos. Estas outras sequências deverão ser pelo menos cerca de 90% homólogas com a sequência de ADN apresentada. Também a clivagem das sequências pré e pró pode ocorrer na realidade em centros diferentes ou adicionais.
Podem manipular-se as quantidades relativas de pró LTI e de LTI maturo. S,. longisporus cultivado em caldo de tripti. case de soja tamponado com tampão NOPS 100 mM (ácido 4-morfolinopropanossulfónico) (pH 7,0) (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri) durante 48 a 78 horas, origina predominantemente o pró LTI.
Indica-se seguidamente a sequência de ADN da sequência de codificação de LEP-10 e para as mesmas sequências a monta_n te e a jusante. Indica-se também o sinal do centro de clivagem. Como no caso da sequência para o LTI, anteriormente ilus trada, a sequência seguinte é substancialmente correcta e não é limitativa do presente invento.
608
SKB CASE 14324-1
-16350 a
-370
A
-340 *
360
A
390
A
-380
A
| GCA | CGG | GGA | TGT | AGG | GGA | GTC | GGG | CGG | AGG | CCG | CGA | CCG | AGG | CCA | GGG | CGC | GTC | CCG |
| -330 | -320 | -310 | -300 | -290 | -280 | |||||||||||||
| A | A | A | * | A | * | |||||||||||||
| GCG | TGC | ACC | GAC | AGC | AGG | TTG | TCC | ATC | CGC | GCC | GCC | ACC | AGC | TCC | CGG | TCG | CGG | CCC |
| 270 | -260 | -250 | -240 | 230 | ||||||||||||||
| A | * | A | * | A | ||||||||||||||
| AGG | TAG | CCG | GGG | GCT | CCA | CGG | AGT | GCG | TCA | TCA | GGT | CCC | AGC | CGG | TGA | ACC | TCG | CCG |
| -220 | 210 | -200 | -190 | -180 | -170 | |||||||||||||
| A | * | * | A | * | A | |||||||||||||
| GCC | ACC | CCC | GCC | TCG | TCC | TCC | AGG | AAC | GCT | AAT | CAA | GAA | ACG | CCC | AGT | TCC | GGA | CTT |
| -160 | 150 | -140 | -130 | -120 | 110 | |||||||||||||
| A | A | A | A | A | A | |||||||||||||
| GGA | ACG | TTC | TAA | TTC | TGT | GAC | TTC | ACG | CCA | CTG | ATT | CAA | TAC | GCA | AGG | TTA | CCG | AAC |
| -100 | -90 | -80 | -70 | -60 | ||||||||||||||
| A | A | A | A | |||||||||||||||
| ACC | GTG | GGG | TCG | AGA | TGA | GTT | TGC | GTG | CCG | GGA | CTC | GGC | AGA | CTC | GCC | GCT | CCG | GCA |
| -50 | -40 | -30 | -20 | -10 | 1 | |||||||||||||
| A | * | A | A | A | A | |||||||||||||
| CCG | ACC | GGG | TGC | ACC | GGC | ACC | ACC | CTC | GAA | ACG | AGC | GGA | AGG | ATG | CAC | ACA | ATG | CGG |
| Met | Arg | |||||||||||||||||
| 10 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | |||||||||||||
| 1 | r | A | A | A | A | A | ||||||||||||
| AAC ACC GCG | CGC | TGG | GCA | GCG | ACT | CTG | GGC | CTG | ACG | GCC | ACC | GCC | GTC | TGC | GGG | CCC | ||
| Asn Thr Ala | Arg | Trp | Ala | Ala | Thr | Leu Gly | Leu | Thr | Ala | Thr | Ala | Vai | Cys | Gly | Pro |
CTC Leu
GCC Ala *
GGG Gly
GCC Ala Ser
TCC
A
CTC
Leu
GCC
Ala
TCC
Ser
A
CCG i Pro .
GCC Ala
ACC Thr íoo Clivagem ‘.nal TCG
Ser * do s: GCC CCC GCG Ala Pro Ala
110
A
CTC Leu
TAC Tyr
GCC Ala
120 *
CCC Pro
TCG
Ser
GCC
Ala
CTG
Leu
130
A
GTG CTG i Vai Leu
ACC Thr
140
A
GTG
Vai
GGG Gly
CAC His
150
A
GGA i
Gly
GAG G1U
AGC Ser
GCT
Ala
160
A
GCC i Ala
ACC
Thr
GCC
Ala
170
A
GCA
Ala
CCC Pro
CTG
Leu
180
A
CGC GCG
Arg Ala
GTC Vai
190
A
ACC CTG Thr Leu
ACC Thr
TGC Cys
200
A
GCC
Ala
CCG Pro
ACC Thr
210
A
GCC TCC Ala Ser
GGC
Gly
220
A
ACC CAC
Thr His
CCG
Pro
GCG
Ala
230
A
GCC
Ala
GCC
Ala
608
SKB CASE 14324-1
| 240 | 250 * | 260 * | 270 * | 280 * | 290 * | |||||||||||||
| GCG | GCC | TGT | GCC | GAA | CTG | CGC | GCC | GCG | CAC | GGC | GAC | CCG | AGT | GCC | CTG | GCC | GCC | GAG |
| Ala | Ala | Cys | Ala | G1U | Leu | Arg | Ala | Ala | His | Gly | Asp | Pro | Ser | Ala | Leu | Ala | Ala | G1U |
| 300 | 310 | 320 | 330 | 340 | ||||||||||||||
| * | * | * | * | * | ||||||||||||||
| GAC | TCG | GTG | ATG | TGC | ACC | CGG | GAG | TAC | GCC | CCC | GTG | GTC | GTC | ACC | GTC | GAC | GGC | GTC |
| Asp | Ser | Vai | Met | Cys | Thr | Arg | Glu | Tyr | Ala | Pro | Vai | Vai | Vai | Thr | Vai | Asp | Gly | Vai |
| 350 | 360 | 370 | 380 | 390 | 400 | |||||||||||||
| * | * | * | A | * | * | |||||||||||||
| TGG | CAG | GGG | CGG | CGC | CTC | TCC | TAC | GAA | CGC | ACC | TTC | GCC | AAC | GAG | TGC | GTG | AAG | AAC |
| Trp | Gin | Gly | Arg | Arg | Leu | Ser | Tyr | Glu | Arg | Thr | Phe | Ala | Asn | G1U | Cys | Vai | Lys | Asn |
| 410 | 420 | 430 | 440 | 450 | 460 | |||||||||||||
| * | A | * | * | * | * | |||||||||||||
| GCG | GGC | AGC | GCG | AGC | GTC | TTC | ACG | TTC | TGA | GGG | ACC | GGG | ACC | GCC | GGA | CTG | CGC | GTG |
| Ala | Gly | Ser | Ala | Ser | Vai | Phe | Thr | Phe | ——— | |||||||||
| 470 | 480 | 490 | 500 | 510 | ||||||||||||||
| * | * | * | * | * | ||||||||||||||
| ATC | GGC | TGC | TCG | CTA | CTG | GGG | AGT | GCG | AGC | GCC | GCC | GTA | CGG | GTC | CCG | CGG | GCC | CGC |
| 520 * ACC | GGG | GAC | 530 * GGC | GGA | CGG |
| 580 | 590 | ||||
| * | * | ||||
| TCG | GCC | GTT | CGC | GGC | CGG |
| 540 | 550 | |
| * | * | |
| AGT | GGG GCC | GTC CGC CGT TCT |
| 600 | 610 | |
| * | * |
GCC GTC CGC GGC CCT GGC GGA
| 560 | 570 | |||
| * | * | |||
| CCC | GGT | TCA | GGG | GCA CGG |
| 620 | 630 | |||
| * | * | |||
| CCG | GGC | ACG | GTG | GCT GTG |
640 650 * *
TCG CAC CAC GGA TAG CGC CGA CTG
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SKB CASE 14324-1
-18As proteínas LEP-10 e LTI, como foi anteriormente referido, foram originalmente descobertas como produtos do S,. lividans 1326 e do S,. longisporus. Porém é provável que outras estirpes e espécies produzam as mesmas ou substancialmente as mesmas proteínas, i.e., proteínas substancialmente homólogas ( >90%, especialmente >95%) e com substancialmente a mesma especificidade e actividade por um substrato (protease). As proteínas LEP-10 e LTI podem também ser sintetizadas por técnicas convencionais de síntese de proteínas, ou as suas sequências de codificação de ADN podem ser sintetizadas por técnicas convencionais de síntese de ADN. Assim, o presente invento inclui todas as proteínas LEP-10 e LTI e as suas unidades de expressão genética e domínios funcionais.
Podem sintetizar-se sondas de oligonucleotídeo para a detecção de sequências de ADN similares em outras estirpes e espécies, com base nas sequências de LEP-10 e de LTI. Porém, tal como foi anteriormente referido, os resultados da sondagem com estes oligonucleotídeos podem produzir falsos positi vos. Deste modo prefere-se a sondagem, inicial ou secundária, com fragmentos de ADN maiores, p.e., maiores do que cerca de 30 nucleotídeos, e preferivelmente, maiores do que cerca de 50 nucleotídeos. Por estas técnicas de sondagem podem identi. ficar-se genes que codificam os mesmos inibidores ou outros inibidores da família SSI.
Por técnicas de ADN recombinante podem usar-se as sequências de codificação preparadas de acordo com o presente invento, para produzir grandes quantidades de LEP-10 e de LTI. Estas técnicas compreendem, essencialmente a transformação de um hospedeiro, bacteriano ou eucariótico, com uma unidade de expressão genética compreendendo a sequência de codificação de LEP-10 ou de LTI preparada de acordo com a invenção. Para este propósito pode usar-se a unidade de expressão genética nativa num plasmídeo ou num outro vector, ou uma unidade de expressão genética híbrida compreendendo a sequência de codificação do inibidor e uma região reguladora heteróloga. Os inibidores assim preparados são purificados até ao grau de p_u
608
SKB CASE 14324-1
-19reza desejado por técnicas convencionais de isolamento de pro teínas.
Os Exemplos seguintes são ilustrativos e não limitativos do presente invento.
EXEMPLOS
Exemplo 1. LEP-10
Cultivou-se _S. lividans, estirpe 1326 (Agricultural Research Culture Collection, Peoria, Illinois, NRRL 15091) em caldos de SL-glicerol, SL-glucose e YEMES a 2B2C durante aproximadamente 30 horas. Apôs depositar as células por centrifugação a baixa velocidade, concentraram-se os sobrenadantes por precipitação com sulfato de amónio, redissolveram-se e sujeitaram-se a electroforese em geles SDS-PAGE (15%) para separar os produtos proteicos. Apôs coloração com Azul Brilhaji te de Coomassie R-250, identificou-se uma banda densa correspondente a uma proteína com um peso molecular de cerca de 10 000 daltons como tendo sido expressa em certos caldos. 0 meio SL compreende os componentes SL-A e SL-B e uma solução de elementos vestigiais com a seguinte composição:
| SL-A | ||
| (nh4)2so4 | 1,0 | g/i |
| asparagina-L | 2,0 | g/1 |
| k2hpo4 | 9,0 | g/i |
| NaH2P04 | 1,0 | g/l |
| SL-B | ||
| extracto de levedura | 20 | g/i |
| MgCl2 6H20 | 5,0 | g/l |
| CaCl2 H20 | 0,1 | g/i |
| solução de elementos vestigiais | 20 | ml/1 |
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SKB CASE 14324-1
-20Soluçõo de elementos vestiqiais
| ZnCl2 | 40 mg/1 |
| FeCl^ 2H20 | 200 mg/1 |
| CuC12 2H20 | 10 mg/1 |
| MnCl2 4H20 | 10 mg/1 |
| Na2B40? 10H20 | 10 mg/1 |
| (Nh 4)6M°7°24 4H20 | 10 mg/1 |
SL-A é esterilizado em autoclave e o SL-B é esterili zado por filtraçõo antes de serem misturados numa proporção de SL-B:SL-A de 1:10 (v/v). Para preparar SL-glucose e o SL-glicerol adicionam-se respectivamente 1% (p/v) de glucose e de glicerol.
Dos geles, cortaram-se e removeram-se amostras da proteína. A proteína foi reduzida e S-dansilamidoetilada com dansilazridina. Digeriu-se a proteína alquilada com tripsina e recuperaram-se os peptídeos trípticos por HPLC de fase inversa. Os peptídeos individuais foram postos em sequência num sequenciador Beckman, por forma a obter-se a estrutura pri mária com as características anteriormente referidas.
Com base na sequência de aminoácidos prepararam-se séries de sondas de oligonucleotídeo de cadeia simples. A sonda #*263 era uma 24-mer mista com a sequência seguinte:
G
3' CGGAAGCGCTTGCTCACGCAGTTC5'
C T T C
Estas sondas foram usadas para sondar uma biblioteca fago Charon de ADN cromossómico de S.. lividans 1326 preparada substancialmente como ê descrito por Maniatis et al., Molecjj lar Cloning-A Laboratory Manual”, 1982, Cold Spring Harbor Lai boratory.
fago recombinante, Charon 25,5 (Ch25,5), contém ADN cromossómico do Streptomyces lividans 1326 que se hibrida com a sonda mista de oligonucleotídeo =#=263. Esta sonda é comple mentar com as ARN-m de LEP-10. Clonou-se um fragmento BglII-
608
SKB CASE 14324-1
-21-EcoRI (cerca de 18 kb) do Ch 25,5 no centro BamHI-EcoRI do plasmídeo pUC18 por forma a obter-se o plasmídeo pDl.
A partir do pDl isolou-se um fragmento PstI (cerca de 4 kb) que também se hibridou com a sonda de oligonucleotídeo, Este fragmento PstI foi clonado no centro PstI do pBR322 por forma a obter-se o plasmídeo pBR33. 0 fragmento PstI de 4 kb contém um fragmento BamHI-PstI (cerca de 2,97 kb) fragmento este que se híbrida com a sonda de oligonucleotídeo.
Clonaram-se ambos os fragmentos PstI de 4 kb e BamHI-Pstl de 2,97 kb no vector plasmídeo de vaivém pMB157 que é um vector de vaivém de baixo nómero de cópia do E_. coli-Streptomyces compreendendo as funções SCP2 de estabilização e replica ção, as sequências pUC8 e de resistência à tioestreptona e a ampicilina. Os plasmídeos recombinantes pMB157-21 e pMB157-8 (que contém o fragmento BamHI-PstI de 2,97 kb) e o plasmídeo pMB157-22 (que contém o fragmento PstI de 4 kb) foram transformados em protoplastos do S.. albus que se verificou anteriormente não produzir LEP-10. As colónias dos transformantes foram analisadas por imunomancha para determinar a produção de proteína LEP-10. Aplicaram-se filtros de nitrocelulose (0,2yM.m) directamente a placas contendo colónias dos transformantes. Após se removerem os filtros das placas processaram-se os filtros com anticorpo da LEP-10 pelo procedimento de Western Blot. Os transformantes de S.. albus contendo os plasmídeos recombinantes produziram LEP-10 extracelular, tal como foi determinado por este procedimento de imunoblot. De tectou-se também LEP-10 em sobrenadantes de culturas de albus (pMB157-22) e de _S. albus (pMB157-21) cultivados em meio SL-glicerol, por Western Blot de geles SDS-PAGE. Assim, no fragmento BamHI-PstI de 2,97 kb está presente toda a info_r mação necessária para produzir no S.. albus uma proteína LEP-10 extracelular matura.
Identificou-se uma sequência parcial do gene LEP-10 num fragmento Rsal (de cerca de 180 pb) isolado a partir do fago recombinante Ch 25,5. Este fragmento Rsal está presente em ambos os fragmentos PstI de 4 kb e BamHI-PstI de 2,97 kb
608
SKS CASE 14324-1 ff .
-22anteriormente referidos. Este fragmento Rsal contém uma sequ, ência de codificação do terço carboxi-terminal da proteína
LEP-10.
Exemplo 2. LTI
Usando as sondas oligo LEP-10 descritas no Exemplo 1 anterior, identificaram-se regiães de homologia no ADN cromos. sómico do S> longisporus (ATCC 23931) que se verificou anteri ormente produzir uma pequena proteína exportada de cerca de 10 kd, possuindo homologia de sequência de aminoácidos N-terminal com o LEP-10. Os resultados obtidos sobre a sequência de ADN mostraram subsequentemente que estes fragmentos de ADN não codificavam uma proteína do tipo LEP-10.
Foi utilizada uma aproximação alternativa envolvendo a clonação do gene LTI num Streptomyces e a identificação dos clones por rastreio com um anticorpo anti-LTI. 0 anticorpo contra o LTI purificado, foi criado em coelhos e verificou-se que reagia com o LTI mas não com a LEP-10. Verificou-se também que este anticorpo reage com a proteína produzida por colónias de Si. longisporus adsorvidas em filtros de nitrocelulo se de 0,2 yvn após 4 horas de incubação a 2830 mas não com a proteína produzida pelo S> lividans. A detecção foi realçada por detecção do complexo LTI-anticorpo usando IgG de cabra, anti-coelho biotinilada e complexo de estreptavidina-biotina-peroxidase de rábano biotinilado. (um conjunto Vectastain, de Vectastain Laboratories, Burlingame, Califórnia). Para a clonação identificou-se um fragmento BamHI de 2,1 kb no ADN do
S. longisporus usando três sondas com fragmentos LEP-1Q diferentes incluindo o fragmento Rsal. Clonaram-se fragmentos BamHI de 2-2,3 kb no plasmídeo pI0703 (Katz et al., J, Gen. Microbiol, 129:2703-2714 (1983)) (corte - Bglll) e transformaram-se no _S. lividans. 0s transformantes foram rastreados com anticorpo anti-LTI para identificar um clone positivo. (Pela utilização de um vector de baixo número de cópia obteve -se num ensaio idêntico uma frequência mais alta).
Este clone positivo estava num grupo de seis colónias
608
SKB CASE 14324-1
-23e teve de ser recolhido e de novo rastreado. A partir das co lÓnias positivas isolou-se um ADN de plasmídeo que se verificou conter uma inserção de cerca de 2,1 kb. Os sobrenadantes das culturas (caldo de tripticase de soja, 28^0, 48 horas) destes positivos foram manchados em filtros de nitrocelulose tal como anteriormente se descreve e sondados com anticorpo anti-LTI tendo-se verificado serem positivos. A transformação de _S. lividans e de S,. albus, que como se verificou anteriormente não produzem LTI, com ADN plasmídeo, teve como resultado a produção de LTI verificada por análise Western e por inibição da tripsina dos sobrenadantes de S_. albus. As manchas Southern foram sondadas com um fragmento de ADN contendo o fragmento Rsal de LEP-10 e observou-se a hibridação na inserção.
Q LTI ê colhido, a partir do meio condicionado do Streptomyces longisporus, por precipitação com sulfato de amâ nio (65% de saturação). 0 precipitado, que flutua, á recolhi, do por centrifugação que faz com que o precipitado forme um tapete denso flutuando na superfície do líquido. Este tapete é recolhido e de novo suspenso em acetato de amónio 10 mM, pH 6,0, e dialisado contra 50 a 100 volumes do mesmo tampão durante 16 a 18 horas. Recolhe-se a amostra dialisada e remo ve-se por centrifugação a elevada quantidade de material castanho escuro fibroso que permanece insolúvel. Aplica-se o s.o brenadante clarificado a uma coluna de carboximetilcelulose (CM-52, Whatman) equilibrada num tampão de diálise. Após a proteína não ligada ser removida por lavagem, a coluna é desenvolvida com um gradiente linear de acetato de amónio de 10 a 250 mM, pH 6,0. 0 LTI é eluido a aproximadamente 150 mM de acetato de amónio. 0 pico de LTI reunido é dialisado contra acetato de amónio 10 mM, pH 6, e armazenado a 4SC.
Exemplo 3. Expressão e secreção de genes heteróloqos usando as regiães reguladoras de LTI pLTI520 é pUC18 (Yanisch-Perring et al., Gene 33:103 (1985)) contendo toda a sequência de codificação de LTI e ce£ ca de 410 pares de bases a montante, num fragmento Sad-Kpnl
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SKB CASE 14324-1
-24de 920 pares de bases de ADN cromossómico do S.. longisporus.
Ligou-se um fragmento Bani cheio da interleuquina-1 beta (IL-1B) (Myers et al., J. Biol. Chem. (no prelo)) que não tem uma região reguladora, com a sequência LTI no centro Notl (entre as bases 158 e 159 na sequência de ADN para o LTI ante, riormente ilustrada); o centro Notl foi cortado por tratameji to com nuclease de feijão tipo soja (mung bean) antes da li gação.
Inseriu-se no pSK02 (Braivner et al., Gene .40:191 (1986)) um fragmento Xmnl-BamHI do pLTI520, contendo a fusão LTI-IL-1B. 0 centro Xmn está no gene de resistência à ampicilina, em pUC
18. 0 centro BamHI está na região de poli-ligação a montante do lac Z em pUC 18.
derivado pSK02 foi transformado numa estirpe mutante de S. lividans 1326 deficiente em galK, estirpe 12K (Braujner et al., anteriormente citado). Após esporolação inocularam-se os transformantes num caldo de tripticase de soja (TSB) e incubaram-se a 289C durante pelo menos 72 horas.
Os sobrenadantes e extractos celulares foram analisados por SDS-PAGE e por imuno-blotting Western. Estas análises mos. traram a expressão e secreção de duas proteínas que reagem am bas com anti-IL-ΙΒ policlonal. Uma das duas pareceu ser IL-1B matura. A outra tinha uma mobilidade menor, o que é consistente com o que seria de esperar para a IL-1B fundida com 17 aminoácidos de IL-1B matura.
Exemplo 4. Expressão e secreção de genes heterólogos usando as regiões reguladoras de IEP-10
Construíu-se em pUC 18 uma fusão LEP-10-IL-1B. A fusão continha ADN de S_. Lividans desde um centro Hinfl (entre as ba ses -132 e -133 na sequência para a LEP-10, ilustrada anterioj? mente) até um centro cortado Bgll (entre as bases 85 e 86). 0 centro Bgll cortado foi ligado a um centro Aval cheio em pUC 18. Ligou-se então um fragmento de ADN contendo o fragmento Bani IL-1B com um ligante BamHI, a um centro BamHI em pUC 18
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tendo-se obtido a construção que se segue:
_________1___________2___________3___________4_________ | *°CTC GCC t|cc ggg| gat ccg| gca CCT*X* | onde a região 1 é derivada da LEP-10, a região 2 é derivada de pUC 18, a região 3 é do ligante e a região 4 ê a sequência de codificação IL-1B. Foram então inseridas as sequências de manutenção do vector de Streptomyces, pI3102 (Kieser et al., Mol. Gen. Genet. 185:223 (1982)).
Após a transformação do S_. lividans 12K e da cultura dos transformantes em caldo de tripticase de soja, observou-se por imunoblotting de Mester uma proteína extracelular que corresponde aproximadamente à IL-1B matura. Ainda que a análise da sequência N-terminal da proteína excretada não tenha sido realizada, parece que a clivagem pode ocorrer entre o pri meiro resíduo (alanina) e o segundo resíduo (prolina) de IL-1B para remover a sequência de sinal de LEP-10.
Os exemplos 4 e 5 demonstram a utilidade das regiões reguladoras de LEP-10 e de LTI tanto para exprimir produtos genéticos heterólogos em Streptomyces como para exportar produtos genéticos heterólogos que de outro modo não seriam exportados.
A descrição e os exemplos anteriores descrevem completamente o presente invento e as suas concretizações preferidas. A invenção não está porém limitada às concretizações precisas aqui descritas mas inclui também todas as modificações abrangidas pelo âmbito das reivindicações que se seguem.
Claims (8)
1) o isolamento do produto genético de uma cultura de um microrganismo ou de uma célula produtores, formando-se além disso um anti-soro específico,
1 - Processo de clonação e identificação de sequências de ADN que codificam um produto genético exportado, que compreende :
2 - Processo de identificação de sequências de codificação de ADN para inibidores de protease que compreende a hibridação de fragmentos das sequências de codificação LEP-10 ou LTI com fragmentos de ADN cromossómico de um microrganismo ou célula.
2) a clonação de fragmentos de ADN de um microrganis- k mo ou célula produtores numa estirpe de Streptomyces não produtora,
3 - Processo de preparação de uma molécula de ADN recombinante compreendendo a unidade de expressão genética LEP-10 ou LTI, processo que compreende a hibridação de ADN cromossémico com uma sonda baseada na unidade de expressão genética LEP-10 ou LTI para identificar regiões de ADN cromossómi co que compreendem a unidade de expressão genética LEP-10 ou LTI e o isolamento das regiães de ADN cromossómico identifica das, por restrição com uma endonuclease de restrição.
3) o contacto dos transformantes Streptomyces do passo 2 com um substrato adsorvente e a incubação dos transformantes por um período de tempo suficiente para permitir que as proteínas exportadas pelos transformantes se adsorvam no substrato, e
4 - Processo de preparação de uma molécula de ADN recombinante compreendendo a região reguladora LEP-10 ou LTI,
66 608
SKB CASE 14324-1
-27processo que compreende, a hibridação de ADN cromossómico com uma sonda baseada na região reguladora LEP-10 ou LTI para identificar regiões de ADN cromossómico que compreendem a região reguladora LEP-10 ou LTI, e o isolamento das regiões de ADN cromossómico identificadas, por restrição com uma endonuclease de restrição.
4) o teste do substrato por forma a determinar a sua reactividade com o anti-soro do passo 1.
5 - Processo de preparação de uma molécula de ADN recombinante compreendendo a sequência de codificação LEP-10 ou LTI, processo que compreende a hibridação de ADN cromossómico com uma sonda baseada na sequência de codificação LEP-10 ou LTI para identificar regiões de ADN cromossómico que compreendem a sequência de codificação LEP-10 ou LTI, e o isolamento das regiões de ADN cromossómico identificadas, por restrição com uma endonuclease de restrição.
6 - Processo de preparação de uma molécula de ADN recombinante compreendendo a sequência de sinal de exportação de LEP-10 ou de LTI, processo que compreende, a hibridação de ADN cromossómico com uma sonda baseada na região da sequência de sinal de exportação de LEP-10 ou de LTI para identificar regiões de ADN cromossómico que compreendem a sequência de si. nal de exportação de LEP-10 ou de LTI, e o isolamento das regiões de ADN cromossómico identificadas, por restrição com uma endonuclease de restrição.
7 - Processo de preparação de uma molécula de ADN recombinante compreendendo uma sequência de codificação híbrida contendo uma parte da sequência de codificação LEP-10 ou de LTI fundida com uma sequência de codificação heteróloga, processo que compreende a restrição de uma molécula de ADN recom binante, contendo toda ou uma parte da sequência de codificação de LEP-10 ou de LTI num ponto a jusante da porção da sequência de codificação de LEP-10 ou de LTI, e a ligação da di, ta parte de uma sequência de codificação para um polipeptídeo heterólogo.
8 - Processo de preparação de um polipeptídeo em Strepto66 6 08
SKB CASE 14324-1
-28myces que compreende a ligação de um fragmento de ADN que codifica para o polipeptideo com a unidade de expressão genética LTI ou LEP-10 ou com uma sua parte, para preparar uma molé cuia de ADN recombinante, a transformação de organismos Streptomyces com a molécula de ADN recombinante, e a cultura do Streptomyces transformada por forma a que seja expresso o polipeptídeo.
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