PT85412B

PT85412B - Processo para a preparacao de esteres do acido 4-(2,3-epoxipropoxi)-fenilacetico e do acido 4-(2-hidroxi-3-isopropilamino-propoxi)-fenilacetico e/ou de atenolol sob forma estereoespecifica

Info

Publication number: PT85412B
Application number: PT85412A
Authority: PT
Inventors: Arthur Friedrich Marx; Hein Simon Koger; Mauro Attilio Bertola; Gareth Thomas Phillips
Original assignee: Shell Int Research; Gist Brocades Nv
Priority date: 1986-07-28
Filing date: 1987-07-27
Publication date: 1990-06-29
Also published as: GB8618324D0; HUT44623A; FI873267A; FI873267A0; ES2042540T3; NO168371C; DK383287D0; IL83334A; PT85412A; DK383287A; NO168371B; NO873136L; NO873136D0; IL83334A0; KR880001803A; AU595052B2; HU201352B; GR3004616T3; NZ221152A; ATE76062T1

Description

MEMÓRIA DESCRITIVA

A presente invenção refere-se a um processo para a preparação de atenolol (4-(2-hidroxi-3-isopropil aminopropoxi)-fenilacetamida) sob forma estereospecífica e de sais desse produto farmaceuticamente aceitáveis, por exemplo sais de adição de ãcido bem como para a produção de ésteres de ãcido

N.

4-(2,3-epoxipropoxi)-fenilacético e do ãcido 4-(2-hidroxi-3-isopropilamino-propoxi)-fenilacético sob forma estereospecífica.

Muitos compostos biologicamente activos são sintetizados sob a forma duma mistura de estereoisómeros. Estas misturas são frequentemente usadas sob essa forma em aplicações agrícolas e farmacêuticas. Normalmente a maior parte da actividade biológica desejada reside num único estereoisõmero, de maneira que quando a mistura contém dois ou mais estereoisóme ros, a potência da mistura ê reduzida. A razão principal para se continuarem a usar as misturas de estereoisómeros ê porque o cus to da separação dos estereoisómeros excede a potencial vantagem de um possível aumento da actividade. De qualquer modo, ê manifesto que os farmacologistas modernos estão-se a tornar gradualmente mais atentos a outras implicações de administração de misturas em que um ou mais estereoisómeros têm que ser encarados não só como meras impurezas, as quais podem não ter o efeito terapêutico desejado, mas que podem para além disso ter outros efej tos fisiológicos indesejados, incluindo toxicidade.

Alguns exemplos são citados em seguida para ilustrar a associação da actividade biológica com um único estereoisõmero.

Dentro da ãrea farmacêutica, a maior parte dos agentes bloqueadores beta-adrenérgicos são apresentados como misturas apesar de a actividade residir num só estereoisómero. Num exemplo, um produto farmacêutico conhecido por labe talol tem uma acção bloquadora alfa-adrenérgica e uma acção bloqueadora beta-adrenérgica as quais tem sido demonstrado serem im putãveis a dois pares de isõmeros da mistura de quatro.

N. Toda et al. descreveram em J. Pharmacol. Exp. Ther. 207 (1978) 311 que (-)-metoprolol ê 270 a 380 vezes mais potente que (+)-metoprolol na acção de atenuar a resposta de músculos do ãtrio e da traqueia de coelho ao isoproterenol (um estimulador dos beta-adenorecetores).

Hoje em dia as vias de síntese para os estereoisómeros bloqueadores beta implicam geralmente resoluções químicas ou sínteses químicas bastante demoradas a partir de percursores estereoisõmêricos, as quais são descritos, por exemplo, na Patente Norte Americana 4 408 063 e em J. Org. Chem. 41 (1976) 3121 por L.M. Weinstok et al.. Estes processos para a preparação de modo análogo do enantiõmero S (estereoisõmero opti camente activo) de metoprolol não são vantajosos economicamente. Por conseguinte um objectivo da presente invenção é fornecer um processo eficiente para a preparação de certos estereoisómeros que possa ser levado a cabo à escala industrial de uma forma eco nomicamente atractiva.

A capacidade de microorganismos para converterem alcenos de cadeia curta (C2~C₄) estereoespecifica mente nos epoxialcanos correspondentes num bioreactor de gãs/sõlido ou de duas fases líquidas foi demonstrado por J. Tramper et al. (3rd European Congress on Biotechnology, Munchen, 10-14 Septembro 1984). Outro exemplo de uma preparação microbiolôgica de epoxialcanos ê revelado na Patente Norte Americana 4 106 986 des crevendo a conversão de 1-alcenos de cadeia linear (C2^_C₂q) em 1,2-epoxialcanos. No pedido de Patente Europeia EP-A-0099609 são dados exemplos da conversão de propeno e de 1-octeno nos seus epoxialcanos correspondentes. No entanto, a conversão dos alcanos substituídos como 4-aliloxifenilaoetatos, não pode de maneira alguma ser deduzida a partir destes processos conhecidos, os quais são só aplicáveis a alcenos lineares e por vezes a alcenos ramificados.

O pedido de Patente Europeia EP-A-0166527 descreve um processo para a preparação de epoxidos e, mais particularmente, de éteres 2,3-epoxipropílicos a partir dos éteres alilicos correspondentes por acção de microorganismos. Contudo, nesta publicação a epoxidação sé ê demonstrada para oito éteres fenilalilicos, dos quais sõ três podem conduzir a bloqueadores adrenégicos beta.

Além disso, a pureza õptica dos com postos epoxi era baixa, variando entre 71% e 79% dependendo do epõxido e do microorganismo utilizado. Por isso, o produto resul tante ainda necessita de ser separado nos dois enantiõmeros.

A presente invenção fornece um processo de epoxidação estereo-selectiva, o qual compreende submeter um éster de ácido 4-aliloxifenilacético ã acção de um micro-

organismo com capacidade para epoxidação estereo-selectiva de forma a produzir o correspondente éster de ãcido 4-(2,3-epoxipro poxi)-fenil-acético, o qual se apresenta predominantemente na configuração S.

Por predominantemente na configura ção S pretende-se significar que mais de 50% em peso do composto epoxipropoxi resultante tem a configuração S e na pratica, a. nossa invenção possibilita que pelo menos 70% em peso, de preferência pelo menos 80% em peso e de modo particular pelo menos 90% em peso do composto epoxipropoxi a ser produzido tenha a con figuração S.

composto epoxipropoxi tendo predo minantemente a configuração S pode ser convertido em atenolol por métodos conhecidos em si, os quais mantêm a configuração S desejada na cadeia lateral de propoxi. Apesar de, em principio, qualquer éster de ãcido 4-aliloxifenilacético poder ser usado no processo da presente invenção, considerações praticas indicam que o éster serã normalmente um éster alquílico inferior contendo até 6 e normalmente até 4 átomos de carbono e que são preferi dos ésteres de metilo ou etilo. O éster do ãcido epoxipropoxifenilacético pode então ser feito reagir com isopropilamina para dar o éster de ãcido 4-(2-hidroxi-3-isopropilamino-propoxi)-fenilacêtico correspondente a este éster por sua vez pode ser trans formado na respectiva amida por reacção com amónia para formar atenolol. O atenolol resultante pode ser convertido, se desejado, em sais farmaceuticamente aceitáveis por reacção com o ãcido ade quado por métodos conhecidos em si.

De preferência o processo é realiza do de tal maneira, por meio da selecção de microorganismos adequados, que pelo menos 70%, de preferência 80% e ainda de modo mais preferível pelo menos 90% em peso do etenolol ê formado na configuração S.

Pela expressão microorganismos que possuem capacidade para epoxidação estereo-selectiva entendem-se, por exemplo, bactérias, leveduras ou fungos. As bactérias . adequadas são, por exemplo, microorganismos pertencendo ao género Pseudomonas.

• II I I WIIIWI Ι··Ι—ΜΜ——

A

Também são englobados na referida definição microorganismos que obtiveram a capacidade para epoxidação estereo-selectiva por meio da introdução de novo material genético. Isto pode ser realizado por transferência do gene cionado, que codifica para um polipeptídeo responsável pela epoxida ção estereo-selectiva, por exemplo, para uma enzima, de um micro organismo adequado para outro microorganismo, particularmente pa ra Echerichia coli. Outros microorganismos podem ser pertencentes aos gêneros Pseudomonas, Mycobacterium, Streptomyces, Saccha romyces, Kluyveromyces, Bacillus, Nocardia, Rhodococcus, Escheri chia e Corynebacterium. Os genes clonados podem ser seleccionados pela sua capacidade para codificar para uma enzima apta para epoxidação estereo-selectiva de um éster de ácido 4-aliloxifenil acético.

Em alternativa, poderão ser seleccionados por hibridação cruzada com um gene previamente seleccio nado, codificando para uma enzima para a epoxidação estereo-selectiva.

Os microorganismos podem de modo vantajoso ser imobilizados, por exemplo, num gel polimêrico. Isto pode ser feito com células vivas, células mortas e/ou células inactivas, em alternativa com enzimas adequadas derivadas destas células, as quais podem ser purificadas até um certo grau se uma actividade especifica mais elevada for necessária. Por isso, pelo termo microorganismos ou substâncias dai derivadas entendem -se os microorganismos, mortos, vivos ou inactivos e extractos destes opcionalmente concentrados e/ou purificados. Podem ser usados, por exemplo, enzimas opcionalmente em combinação com, por exemplo, cofactores artificiais ou naturais. Células não activas de forma fermentativa poderão ser utilizadas para a epoxidação do éster de ácido 4-aliloxifenilacético. Verificou-se que as enzimas derivadas de células vivas ou células mortas podem produzir o isómero S em condições adequadas. Os microorganismos ou substâncias daí derivadas poderão ser usadas várias vezes e são, geralmente, activos durante pelo menos 2 semanas. Mesmo sem um co-substrato (por exemplo glucose) os microorganismos podem manter-se activos. 0 enriquecimento do éster do ácido 4-(2,3-epoxi propoxi)-fenilacético em isõmero S pode ter lugar em tampões ade quados bem como em sais fisiológicos. Verificou-se que, depois de armazenadas, as células induzidas são directamente capazes de produzir o enriquecimento em isõmero-S.

As bactérias particularmente preferidas para a epoxidação de 4-aliloxifenilacetatos incluem Pseudo monas oleovoram (uma estirpe desta espécie foi depositada na ATCC sob o numero de acesso 29347 em 21 de Junho de 1976), ou uma sua variante ou mutante.

Ao praticar uma concretização prefe rida do processo da presente invenção, um microorganismo que tenha a capacidade para converter 4-aliloxifenilacetatos em 4-(2,J3 -epoxipropoxi)-fenilacetatos, tendo pelo menos 70% e preferivelmente pelo menos 80% ou, de modo especialmente preferido, pelo menos 90% em peso da configuração S pode ser seleccionado a partir dos microorganismos mencionados, e pode ser cultivado durante 0,5 a 10 dias. Daqui em diante as células podem ser suspensas num meio nutriente líquido e o 4-aliloxifenilacetato ê submetido ã acção das células. Em alternativa, as células podem ser mortas, por exemplo por suspensão num meio lisogénico, e o 4-aliloxifenilacetato ê submetido à acção das substâncias derivadas das células .

Após esta cultura, durante cerca de 0,5 a 10 dias, as células poderão ser isoladas do meio de cultura antes de serem suspensas no meio nutriente líquido ou num meio lisogénico. Para crescimento dos microorganismos utilizados para a epoxidação estereo-selectiva do 4-aliloxifenilacetato, po dem ser utilizados meios de cultura usuais contendo uma fonte de carbono assimilável (por exemplo glucose, glicerol, lactato, hidrocarbonetos como hexano (C6), etc.), uma fonte de nitrogénio (por exemplo sulfato de amõnio, nitrato de amónio, cloreto de amónio, etc.), e uma fonte de nutrientes inorgânicos (por exemplo fosfato, magnésio, potássio, zinco, ferro e outros metais em quantidades residuais).

Um meio de cultura preferido ê um meio PSX, opcionalmente enriquecido com um ou mais aditivos. Opcionalmente pode ser adicionado ao meio de cultura um indutor (por exemplo dietoximetano). Uma temperatura de 0 a 459C e um pH de 3,5 a 9 são mantidos de preferência durante o crescimento dos microorganismos. De preferência os microorganismos são feitos crescer a uma temperatura de 20 a 379C e a um pH de 5 a 8.

As condições aerõbicas requeridas durante o crescimento dos microorganismos podem ser conseguidas de acordo com qualquer dos procedimentos habituais, desde que o fornecimento de oxigénio seja suficiente para as necessidades me tabõlicas dos microorganismos. Isto ê realizado de forma mais conveniente mediante o fornecimento de oxigénio, preferivelmente sob a forma de ar.

Durante a conversão do 4-aliloxifenilacetato em 4-(2,3-epoxipropoxi)-fenilacetato, os microorganiss mos podem ser mantidos num estádio de crescimento usando um meio de cultura habitual acima referido. Os microorganismos poderão ser suplementados com um co-substrato.

Durante a conversão de 4-aliloxifenilacetato em 4-(2,3-epoxipropoxi)-fenilacetato os microorganismos podem ser mantidos num estádio de crescimento ou num estádio substancialmente de não crescimento utilizando um meio de cultura mínimo. Como meio de cultura mínimo pode ser utilizado um meio de cultura usual contendo uma fonte de carbono assimilável quando requerido (por exemplo glucose, etanol, hidrocarbonetos como hexano (C6), etc.), uma fonte de nitrogénio quando requerido (por exemplo sulfato de aménio, nitrato de amónio, cloreto de amónio, etc.) e uma fonte de nutrientes inorgânicos quando reque rido (por exemplo fosfato, magnésio, potássio, zinco, ferro e ou tros metais em quantidades residuais). Os microorganismos podem ser mantidos no estádio de não crescimento, por exemplo, por exclusão da fonte de carbono assimilável ou da fonte de nitrogénio. Um meio de cultura preferido é um meio PSX, opcionalmente enriquecido com um ou com vários aditivos. Ê mantida de preferência uma temperatura de 0 a 459C e é preferivelmente mantido um pH de 3,5 a 9 durante este estádio. De preferência os microorganismos são mantidos ã temperatura de 30 a 459C e a pH de 5 a 8. As condições aerõbicas requeridas durante este estádio podem ser conse guidas de acordo com os procedimentos acima mencionados, contan-

to que o fornecimento de oxigénio seja suficiente para ir de encontro ãs necessidades metabólicas dos microorganismos mas também para converter o 4-aliloxifenilacetato em 4-(2,3-epoxipropoxi)fenilacetato.

4-(2,3-epoxipropoxi)-fenilacetato produzido pelos microorganismos mencionados acima pode ser recuperado e purificado de acordo com os procedimentos habituais.

R-(-)-4-(2,3-epoxipropoxi)-fenilacetato, o S -(+)-4-(2,3-epoxipropoxi)-fenilacetato ou misturas destes compostos produzidos de acordo com a presente invenção po dem ser convertidos em R -(+)-atenolol, em S -(-)atenolol ou nas misturas destes compostos, respectivamente, pelas reacções quími cas com isopropilamina e amónia realizadas sucessivamente. Um exemplo da reacção para formar agentes bloqueadores de receptores beta adrenérgicos com a configuração (S) absoluta a partir de éteres aril-glicidílicos com a configuração (S) absoluta ê descrito na publicação de pedido de Patente Alemã DE-A-2453324. A conversão química de S ou de R 4-(2-hidroxi-3-isopropilaminopropoxi)-fenilacetato de metilo em S ou R atenolol foi levada a efeito utilizando tanto amónia aquosa como amoníaco anidro. As condições anteriores, embora dessem origem a S-atenolol a partir de S -4-(2-hidroxi-3-isopropilaminopropoxi)-fenilacetato de meti lo em baixo rendimento, deram uma alta proporção do ácido livre proveniente da hidrólise do éster, enquanto que o uso de amoníaco anidro fornecia o produto requerido em bom rendimento. Ê possível converter atenolol nos seus sais farmaceuticamente aceitáveis, como seja um sal de adição do ácido.

Por conseguinte, um processo para a produção de atenolol de acordo com a presente invenção compreende a reacção de 4-(2-hidroxi-3-isopropilaminopropoxi)-fenilaceta to de metilo com amónia e pelo menos a separação parcial do atenolol e/ou a conversão do etanolol num seu sal farmaceuticamente aceitável.

Podem ser usadas vantajosamente em produtos farmacêuticos especialmente misturas com uma quantidade . predominante do composto S(-) -atenolol. De preferência podem ser usados em produtos farmacêuticos os compostos que contenham

pelo menos 80% e de modo mais preferível pelo menos 90% em peso na configuração S.

Podem ser obtidas produtividades de cerca de 25 mg/g/h em 3 h e níveis de produto de 1,3 g/1 utilizando Pseudomonas oleovorans para epoxidar 4-aliloxifenilacetato. Além disso são possíveis produtividades mais altas utilizando 4-aliloxifenilacetato como substrato com glucose como co-substrato, e foram alcançadas produtividades de mais de 94 mg/g/h e níveis de produto de 4,1 g/1 em 3 h. Os produtos resultantes eram enantiomericamente puros no limite dos erros experimentais.

A pureza õptica tal como serã mencionado nesta especificação ê representada em excesso enantiomêrico em percentagem: S-R/S+R.

A presente invenção serã ilustrada mais em pormenor por intermédio dos Exemplos seguintes sem restringir o seu âmbito a estes Exemplos.

EXEMPLO 1

Transformação de 4-aliloxifenilacetato de metilo em 4-(2,3-epoxi propoxi)-fenilacetato de metilo, usando Pseudomonas oleovorans ATCC 29347.

Uma cultura prê-cultivada de Pseudo monas oleovorans ATCC 29347 foi utilizada para inocular um meio PSX a pH 7,0 contendo 0,75% de glicerol e 0,05% de dietoximetano. O meio PSX contêm: KH₂PC>₄(8,92 g/1), Na₂HPO₄ (2,94 g/1), (ΝΗ₄)₂~ HPO₄ (1,0 g/1), (NH₄)₂SO₄ (0,2 g/1), KC1 (0,2 g/1), citrato tris sõdico (0,294 g/1), CaSO₄.2H₂O (0,005 g/1), MgSO₄.7H₂O (0,2 g/1), e solução de elementos residuais PS II (10 ml/1). (A solução de elementos residuais contêm: (NH₄)₂SC>₄. FeSO₄· 6H₂O (0,25 g/1), ZnSO₄. 7H₂O (0,05 g/1), MnCl₂· 4H₂O (0,03 g/1), CuSO₄· 5H₂O (0,015 g/1), CoCl₂· 6H₂O (0,015 g/1), H₃BO₄ (0,005 g/1), Na₂Mo0₄. 2H₂O (0,0055 g/1), Kl (0,01 g/1), HC1 para pH 3).

A cultura (15 litros) foi desenvol, vida a 309C durante 24 h. As células foram recuperadas, ressus* pendidas em meio PSX (1,5 litros) contendo 0,5% de glucose. FoQ

ram incubadas aliquotas de 100 ml com 2,5% de 4-aliloxifenilacetato de metilo durante um período máximo de 6 horas. Foram extra idas amostras (1 ml) com diclorometano a determinados intervalos de tempo e analisado o conteúdo de S -(+)-4-(2,3-epoxipropoxi)-fenilacetato de metilo (V) por cromatografia em fase gasosa (glc).

Análise por cromatografia em fase gasosa

A análise foi levada a efeito num instrumento Varian 3700 utilizando uma coluna de OV1 3% em WHP 100-120 (50 cm x 2 mm)

Condições: N₂ a 309C por minuto, de tector de ionização de chama 2809C, injector a 2009C. Programado a 120-1909C a 109/min. O tempo de retenção do 4-aliloxifenilacetato de metilo é de 1,5 min e o do 4-(2,3-epoxipropoxi)-fenilace tato de metilo é de 3,1 min.

Os resultados são dados no Quadro L

QUADRO 1

Conversão de 4-aliloxifenilacetato de metilo em S-(+)-4-(2,3-epo xipropoxi)-fenilacetato de metilo utilizando Pseudomonas oleovorans ATCC29347

Biomassa	S-(+)-4-(2	,3-epoxipropoxi)fenilacetato de meti
g/i	lo	mg/g/h (g/1)
	t = 1 h	t = 3 h	t = 4 h	t = 6 h
16,3	48 (0,8)	78 (3,8)	71 (4,6)	58 (5,6)
14,6	77 (1,1)	94 (4,1)	72 (4,2)	49 (4,3)
15,5	53 (0,8)	69 (3,2)	68 (4,2)	55 (5,1)

EXEMPLO 2 • Transformação de 4-aliloxifenilacetato de metilo em S-(+)-4-(2,/ . -epoxipropoxi)-fenilacetato de metilo utilizando Pseudomonas olec

Ί n

vorans ATCC 29347 e a sua subsequente conversão em S -(-)-4-(2-hidroxi-3-isopropilaminopropoxi)-fenil-acetato de metilo.

Inoculou-se com uma cultura líquida prê-cultivada de Pseudomonas oleovorans ATCC 2937 um volume de 15 1 de meio de sais minerais PSX a pH 7,0, contendo 0,75% de glicerol e 0,05% de dietoximetano e incubou-se durante 24 h a 309C num agitador orbital. As células foram separadas por centri fugação e ressuspendidas em meio PSX a pH 7,5 (1,5 1). Foram colocadas aliquotas de 100 ml em balões de agitação de 2,0 1 e incubadas com 0,5% de glucose e 2,5% de 4-aliloxifenilacetato de metilo durante 6 h a 379C. Após 6 h as células foram extraídas com diclorometano (2,5 1), secou-se o extracto sobre sulfato de sódio anidro e removeu-se o solvente por evaporação obtendo-se 42,7 g do produto contendo 26% de S -(+)-4-(2,3-epoxipropoxi)-fe nilacetato de metilo. O isolado bruto foi purificado em gel de sílica (550 g), eluído com êter/hexano: 4/6 obtendo-se 4-(2,3-epoxipropoxi)-fenilacetato de metilo (11,04 g) , 25 = +8,279 (c = 1,39, EtOH) . Por pmr (CDC1.-J obtiveram-se sinais a á 2,72/

O ^J O /2,90 (2d, 2H, -CH — CH₂) , 3,32 (m, 1H, -CH CH₂) ,

3,95/4,18 (2d, 2H, OCH₂), 6,88/7,2 (2d, 4H, aromático), 3,57 (5, 2H, CH₂ CO), 3,68 (s, 3H, OCHg). Eu (hfc)3 pmr não separação dos sinais a 2,72/2,90 indicando a presença de um sõ enantiomero. E. I. espectro de massa m/z 222.

As análises de pmr foram efectuadas utilizando um instrumento Brucker WM. As medidas ópticas foram levadas a cabo utilisando um polarímetro Optical Activity Ltd. AA 100.

Síntese de S -(-)-4-(2-hidroxi-3-isopropilaminopropoxi)fenil-ace tato de metilo

Foi adicionada isopropilamina (37 ml, 405 mmole) a uma solução de S-(+)-4-(2,3-epoxipropoxi)fenilacetato de metilo (6,0 g, 27 mmole). A mistura reaccional foi a’ gitada durante 24 h a 229C. 0 reagente e o solvente em excesso • foram removidos por evaporação e o resíduo oleoso foi dissolvido

I _ Ί 1

em diclorometano (100 ml). 0 diclorometano foi lavado com HC1

0,2 N (2 x 75 ml), as fases ácidas foram combinadas e lavadas com diclorometano (2 x 50 ml) e transformadas em bases com NaOH 2 N. Foi extraído o precipitado com diclorometano (5 x 100 ml), o extracto foi seco sobre sulfato de sõdio anidro e o solvente evapo rado até se obter um produto semi-sõlldo (8,73 g) . O produto foi recristalisado a partir de acetato de etilo/hexano para se obter S - (-)-4- (2-hidroxi-3-isopropilaminopropoxi)-fenilacetato de metilo (6,08 g) sob a forma de cristais brancos, p.f. 87,5-89,59C (não corrigido), /c</_D25 = -4,89 (C=l,01, EtOH), pmr (CDCl^ deu sinais a ó = 1,08 (d, 6H, CH(CH₃)₂), 2,82 (m 1H, CH₃(CH₃)₂), 2,7/2,88 (m, 2H, CH₂NH), 3,98 (m, 1H, CHOH), 3,94 (m, 2H, OCH₂), 6,88/7,2 (2d, 4H, Ar), 3,55 (S, 2H, CH₂CO), 3,68 (S, 3H, OCH₃). E.I. espectro de massa m/z = 282 (m+1).

Determinação da pureza enantiomêrica

Síntese dos derivados de 2-oxazolidona de 4-(2-hidroxi-3-isopropilamino-propoxi)-fenilacetato de metilo (ver J. Hermansson, J. Chromatography p. 379, 325 (1985).

Foi colocado num balão de reacção de 1,0 ml de (+)- ou (-)-4-(2-hidroxi-3-isopropilaminopropoxi)fe nilacetato de metilo e dissolvido em éter dietílico seco (0,5 ml). Foi adicionado ã mistura NaOH 0,5 N (0,05 ml) e agitado ã temperatura ambiente durante 1 minuto. Foi adicionado fosgénio ã mistura (0,05 ml de uma solução em tolueno a 120 mg/ml) e agitada à temperatura ambiente durante mais 1 h. Permitiu-se ãs fases separarem-se, removeu-se a fase etérea e lavou-se a fase aquosa com éter dietílico seco (3 x 0,5 ml). As fases etéreas foram com binadas e o solvente removido por evaporação com Ν₂· O resíduo foi dissolvido em clorofõrmio/hexano (5/95, 2,0 ml) antes de ser analisado por HPLC.

A pureza enantiõmerica do S-(-)-4-(2-hidroxi-3-isopropilaminopropoxi)-fenilacetato de metilo foi confirmada seguindo a sua conversão no derivado de oxazolidona, o qual foi analisado utilisando um sistema de HPLC Gilson (método de detecção espectrofotométrica) numa coluna quiral Spherisorb S5 (cheia de UMIST, N-formil-L-isoleucina ligado a sílica por li gações covalentes, /D,25 m x 4,5 mm7, separação de fase) utilisando uma fase movei de propano-2-01/diclorometano/hexano (0,75/ /15/84,25; v/v/v). Composto detectado a 229 nm.

As analises do S-(-)-4-(2-hidroxi-3-isopropilaminopropoxi)fenil-acetato mostraram que o composto é enantiomericamente puro (tempo de retenção 12,6 min) dentro do erro experimental (o tempo de retenção do isómero R foi de 11,9 min) .

Sintese de S-(-)-4-(2-hidroxi-3-isopropilaminopropoxi)-fenilacetamida (Atenolol).

Foi dissolvido em metanol (5,0 ml) S-(-)-4-(2-hidroxi-3-isopropilaminopropoxi)-fenilacetato de meti lo (500 mg, 1,8 mmole). Adicionou-se amónia (1,0 ml, solução aquosa a 35%) e permitiu-se ã reacção continuar a 229C durante 8 dias. 0 reagente e o solvente em excesso foram removidos por eva poração a pressão reduzida e o resíduo foi dissolvido em dicloro metano (10 ml). A solução foi lavada com NaHCO^ a 1% (2 x 10 ml) para remover o ãcido e as lavagens com soluções básicas foram combinadas e lavadas com diclorometano (3 x 10 ml). As fases orgânicas foram combinadas, secas sobre sulfato de sódio anidro e o solvente evaporado obtendo-se o produto bruto (0,27 g) contendo a amina e o material de partida. 0 produto bruto foi purifica do sobre alumina neutra (15 g) usando um gradiente de eluição de diclorometano/metanol. Foram separados o 4-(2-hidroxi-3-isopropílaminopropoxi)fenilacetato de metilo e o atenolol e analisados num Lichrosorb RP8 (0,25 x 4,5 mm, Hichrom) utilisando uma fase móvel de acetato de amónia a 2% (pH 3,7) em metanol num sistema HPLC Gilson (sistema de detecção espectrofotomêtrica). Foram detectados compostos a 254 nm. Os tempos de retenção foram de 6,5 min e 3,2 min respectivamente. As fracções que se verificou conter S-(-)-Atenolol (por HPLC) foram combinadas e o solvente evaporado para dar um produto o qual por recristalização a partir de acetato de etilo/hexano deu S-(-)Atenolol (50 mg, 0,19 mmole) p.f. 149,5-1519C (não corrigido), /o<7_D25 = -2,829 (c = 0,332, EtOH) pmr (CDCln) deu sinais a £ 1,08 (d, 6H, CHÍCH^Jg), 2,82

(m, IH, CH(CH₃)₂), 2,7/2,88 (m, IH, CH₂NH), 3,98 (m IH, CHOH), 3,98 (m, 2H, 0¾) , 6,92/7,2 (2d, 4H, Ar) 3,52 (5, 2H₂, CH₂CO) , 5,38 (5, 2H, CONH₂). EI espectro de massa m/z = 267 (m+1). Determinação da pureza enantimérica.

Derivatização diastereomêrica do atenolol com anidrido de ácido (R,R)-0,O-dibenzoil-tertárico.

Colocou-se num balão de reacção de 1,0 ml de (+) ou de (-)-atenolol (2,5 mg). Adicionou-se ácido trâ. cloroacético (0,3 ml, de uma solução de ácido tricloroacético (61 mg) em diolorometano seco (6 ml)) e a mistura foi agitada du rante 5 minutos à temperatura ambiente. Adicionou-se anidrido de ácido dibenzoil-tartãrico (7 mg) e a mistura foi agitada a 509C durante 3 h. Removeu-se um volume de 0,2 ml de mistura reaccional, o solvente foi evaporado e o resídmo foi dissolvido em 1,0 ml de metanol para análise por HPLC.

A análise foi efectuada num Spherisorb RP 18 (0,25 m x 4,9 mm), utilizando uma fase móvel de 2% de acetato de amónio (pH 3,7) em metanol (35/65, v/v) num sistema de HPLC Gilson utilizando métodos de detecção espectrofotomêtrica. Os compostos foram detectados a 254 nm.

Comprovou-se uma pureza enantioméri ca de 100% por meio de cromatografia do derivado diastereomérico formado com anidrido do ácido (R,R)-0,0-dibenzoil-tartãrico. O atenolol racêmico ê separado igualmente nos seus pares diastereo méricos quando analisado da mesma maneira com tempos de retenção de 4,4 min e 6,7 min para os enantiõmeros R e S respectivamente.

EXEMPLO 3

Sintese de S-(-)-4-(2-hidroxi-3-isopropilaminopropoxi)-fenil-ace tamida /(S)-atenolol/

Foram misturados 1,83 g de (S)-(-)-4-(2-hidroxi-3-isopropil-aminopropiloxi)-fenil-acetato de metilo com 8 ml de amoníaco anidro 11 N em metanol e selou-se a mis_ 1 Λ _

tura num tubo de vidro com um agitador magnético arrefecendo numa mistura de gelo seco e acetona. Em seguida, o tubo foi coloca do num banho de õleo de 509C e agitado durante três dias.

tubo foi então arrefecido numa mistura de gelo seco-acetona e aberto e o conteúdo foi evaporado para dar 1,74 g de um sólido amarelo. Este foi cristalizado a partir de 80 ml de acetato de etilo quente dando 1,38 g de (S)-atenolol; p.f. 150-151,59; = -5,29 (c = 1; etanol).

A pureza enantiomérica foi determinada de acordo com o método de determinação descrito no Exemplo 2 e foi confirmada a 100% por meio de cromatografia do derivado diastereoisómerico formado com anidrido de acido (R,R)-0,0-diben zoil-tartarico. O atenolol racêmico é separado igualmente nos seus pares diastereoisómericos quando analisado do mesmo modo.

Claims

REIVINDICAÇÕES

- 1* Processo de epoxidação estereoespecifica caracterizado por se submeter um éster do ácido 4-aliloxÀ fenilacético à acção dum microorganismo dotado da capacidade de epoxidação estereoespecifica de modo a produzir o correspondente éster do ãcido 4-(2,3-epoxipropoxi)-fenilacético predominante na configuração S.

Processo de acordo com a reivindica ção 1, caracterizado por se obter um éster do ãcido epoxipropoxi fenilacético com um conteúdo superior a 80% em peso da configura ção S.

Processo de acordo com a reivindica ção 2, caracterizado por se obter um éster do ãcido epoxipropoxi fenilacético com um conteúdo superior a 90% em peso da configura ção S.

Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado por o microorganismo mencionado ser uma bactéria, uma levedura ou um fungo.

Processo de acordo com a reivindica ção 4, caracterizado por o microorganismo ser uma bactéria pertencente ao género Pseudomonas.

Processo de acordo com a reivindica ção 5 caracterizado por o microorganismo ser Pseudomonas oleovorana.

- 7- -

Processo de acordo com a reivindica ção 6, caracterizado por o microorganismo ser Pseudomonas oleovo rans (ATCC 29347) ou um mutante ou variante deste.

- 8- -

Processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores caracterizado por se fazer reagir o êss ter de ácido 4-(2,3-epoxipropoxi)-fenilacêtico com isopropilamina sob condições em que se mantêm de forma substancial a configu ração S de modo a formar o éster do ácido 4-(2-hidroxi-3-isopropilaminopropoxi)-fenilacêtico correspondente.

Processo de acordo com a reivindica ção 8, caracterizado por o éster ser o éster metílico.

Processo de acordo com a reivindica ção 8, caracterizado por se fazer reagir o éster do ãcido 4—(2— -hidroxi-3-isopropilaminopropoxi)-fenilacêtico com amónia sob con dições em que se mantém de forma substancial a configuração S de modo a formar a 4-(2-hidroxi-3-isopropilaminopropoxi)-fenilaceta mida (atenolol).

Processo de acordo com a reivindica ção 10 caracterizado por o éster ser o éster metílico.

Processo de acordo com qualquer das reivindicações 10 ou 11, caracterizado por se fazer reagir o ate nolol com um ãcido apropriado para formar um sal farmaceuticamen te aceitável.

posição farmacêutica caracterizado por se incorporar como ingrediente activo um éster do acido 4-(2,3-epoxipropoxi)-fenilacético do acido 4-(2-hidroxi-3-isopropilamino-propoxi)-fenilacêtico e/ou de atenolol ou um sal farmaceuticamente aceitável deste com posto quando preparados de acordo com o processo de qualquer das reivindicações anteriores.

ção 13,

Processo caracterizado por o éster ser de acordo com a reivindica um éster metílico.

Processo de acordo com qualquer das reivindicações 13 ou 14, caracterizado por o composto usado como ingrediente activo ter um conteúdo de pelo menos 80% em peso da configuração S.

- 16- Processo de acordo com a reivindica ção 15, caracterizado por o composto usado como ingrediente acti vo ter um conteúdo de pelo menos 90% em peso da configuração S.

Ί Λ

Os requerentes declaram que o primeiro pedido desta patente foi apresentado na Grã Bretanha em 28 de Julho de 1986 sob o n9. 8618324.