PT84289B - Processo para a preparacao de um complexo antibiotico contendo grividomicina i e ii - Google Patents

Description

Memória descritiva referente à patente de invenção de H030HST AKTIENGESELLSCHAFT, alemã (Inventores: Dr. Christoper Milton Mathew Franco, Dr. Triptikumar Mukh.opadhyay, Dr. Bimal Naresh Ganguli, Dr. Richard Helmut Rupp, residentes na índia, Dr. fíans-Wolfram Fehlhaber, residen te na República Federal Alemã), industrial e comercial, com sede em D-6230 Frankfurt/Main 80, República Federal Alemã, para PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UM COMPLEXO ANTIBIÓTICO CONTENDO GRIVIDOMICINA I Ε II

MEMÓRIA DESCRITIVA

A presente invenção refere-se ao novo microorganismo estreptomices - espécie Y-8240155, a um processo para a preparação de novos antibióticos do tipo estreptogramina a partir desta estirpe e/ou dos seus mutantes e variantes bem como à utilização dos novos antibióticos como medicamentos e ingredientes para melhoramento das rações alimentares e acele ração do crescimento de animais de utilidade doméstica, especialmente de porcos, vacas e aves.

microorganismo - estirpe Ϊ-8240155 obteve-se a partir de uma amostra de solo recolhida em Panchgani, Maha- 1 -

rashtra, índia, utilizando um meio de cultura a pH 6, 5 a 8, 5.

Podem obter-se variantes e mutantes da estirpe Y-8240155 por métodos conhecidos, p. ex. utilizando um agente mutagénico co mo a N-metil-N-nitro-N’-nitrosoguanidina.

microorganismo estreptomices sp. Y-8240155 pertence à ordem dos actinomicetais, à familia dos estreptomicetaceae e ao género dos estreptomices. Conhecem-se e encontram -se descritos na literatura vários tipos de estreptomices res ponsaveis pela produção de antibióticos do tipo estreptogrami na (J. Antibiotics 32:575-83, 1979; GB-A 1 575 533). 0 estre_£ tomices sp. Y-8240155 e considerado como uma nova estirpe, uma vez que, como se verifica na descrição seguinte, ele se distingue das estirpes conhecidas em algumas das suas proprie. dades morfológicas e fisiológicas. É também considerado por isso como uma nova estirpe pois dá origem, como se verifica na descrição seguinte, a novos antibióticos designados por grividomicina I, II e III. A estirpe estreptomices - espécie Y-8240155 foi registada a 15 de Janeiro de 1986 por ocasião da Deutsche Sammlung von Microorganismen” em Gõttingen, sob o número de entrada (registo) DSM 3640.

Na cultura do estroptomices sp. Y-8240155 (DSM 3640) obtêm-se, para além da conhecida neoviridogriseina IV (US-A 3 023 204), novos antibióticos que são adequados, entre outros fins, para, na forma de aditivos alimentares, acelerar 0 crescimento de animais de utilidade doméstica.

Os novos antibióticos correspondem à formula geral I

Si

Η

G GH7 \ / 3	Rq i2
CH	CH
1	/\
CH9 1	CHo 1	CH., 1
- GH - GO	- N ---	- C H - CO

h-ch₃

I

GHo

I ²

GO

- CH - NH - CO - CH - 1T —^R4

H3	CH-R, 1 1
	CH-CHo í
	gh3	I

na qual os grupos R^ a R^

Grividomicina I (II)

Grividomicina III possuem os seguintes significados

E1	R^	r3	R4
CH3	OH	H	CH3
ch3	OH	CH3	H

A grividomicina I e II existe tereómeros com a mesma formula química.

como um par de dias

Os novos antibióticos de acordo com a invenção são activos contra numerosos microorganismos como, entre outros, bactérias e micoplasmas gram-positivos. A tais microorganismos pertencem as espécies estafilococus aureus, estreptococus piogen.es, diplococus pneumoniae, micoplasma gallinarum e micoplasma pulmonis. Os novos antibióticos de acordo com a invenção são ainda activos no caso de estirpes que se tornam resistentes contra outros antibióticos.

- 3 i

Os novos compostos de acordo com a invenção podem ser utilizados como medicamentos ou como aditivos em rações alimentares em qualquer forma biodesponivel, quer isoladamente quer em combinação uns com os outros, ou com as conhecidas neoviridogriseínas I, II, III e/ou com neoviridogriseina TV e/ou antibióticos do tipo estreptogramina do grupo A como a griseoviridina.

meio de cultura utilizado para a obtenção do mi croorganismo consiste em fontes de carbono e de azoto, sais nutrientes inorgânicos e meios de solidificação. Como fontes de carbono citam-se a glucose, o amido, a dextrina, a gliceri na, a sacarose ou o melaço. Fontes de azoto apropriadas são peptona, extracto de levedura, caldo, extracto de malte ou ca seína. Um meio de solidificação apropriado é por exemplo o agar. Como sais nutrientes inorgânicos citam-se sais de sódio, de potássio, de magnésio, de cálcio ou fosfatos ou sulfatos.

As novas grividomicinas I, II e III são estreptogramino-antibioticos. As últimas pertencem ao grupo dos compostos despsipeptídicos e dividem-se em dois grupos principais - A e B - (D. Vazquez, Antibiotic III, Ifechanism of action. of antimicrobial and antitumor agents” Springer - Verlag Berlim-Heidelberg-New York, 1975, pags. 521-534) e formam-se como complexos destes dois últimos a partir de microorganismos. Os antibióticos dos grupos A e B actuam sobre posições estreitamente relacionadas das subunidad.es dos ribosomas-50-S. Uma vez que a ligação dos antibióticos do grupo A é mais forte em presença de antibióticos do grupo B, os antibióticos do grupo A apresentam um sinergismo apreciável com antibióticos do grupo B, na sua acção contra bactérias gram-positivas. Ao grupo A pertencem os seguintes antibióticos: griveoviridi na, micamicina A, osteogricina A, virginiamicina pristina micina 11^, sinergistina A^, osteogricina G, virginiamicina pristinamicina IIB, dihidroosteogricina A, Madumicina I e

II. 0 grupo B divide-se nos subgrupos viridogriseina (neoviri dogriseína) e vernamicina B (micamicina B). Os representantes

do subgrupo viridogriseína (neoviridogriseína) correspondem à fórmula I com os seguintes significados para R^, e R^:

E1	Rg	Rj (B4=OH3)	Designação
CH,	OH	CH,	viridogriseína I	)
		✓	etamicina, P 1370	A (
			neoviridogriseína	IV J
H	OH	0H3	viridogriseína II
gh3	H	G2H5	neoviridogriseína	I
ch3	H	ch3	neoviridogriseína	II
CH3	OH	G2^5	neoviridogriseína	III

São já conhecidos da DE-A 2 752 163 a neoviridogriseína (NVG) I, II e III, bem como um processo para a sua preparação utilizando a estirpe estreptomices - espécie P 8648 (PERM-P 3562) e ainda a sua utilização como medicamento ou aditivo alimentar para rações. A neoviridogriseína IV e co nhecida da US-A 3,023,204 como antibiótico de efeito contra actinomicetes, bactérias, rickettsies” e virus, especialmente no tratamento da mastite.

subgrupo vernamicina B (micamicina B) é representado pela fórmula II

- 5 t

possuindo	R^, Rg, Ry e X os seguintes significados:
R1	r2	R^	Σ R4 0 / -C-GH - N - \	Designação 'ostreogricina B micamicina B estreptogramina B
°2a5	®3	h(ch3)2	HtT HXJ Π TJ < bílg bUg 5 ) 0=G - GH2 | (ácido 4-0- ’ xopipecolí nico) z acido 4-0-	sinergistina B-l vernamicina B2 kpristinamicina 'ostreogricina
ch3	ch3	1T(GH2)2	xopipecolí GgH^ ' nico ácido 4-0- >	pristinamicina 1 vernamicina B^ 'ostreogricina B2
o2h5	ch3	NHCH3	xopipecoli Gglíg | nico	pristinamicina 1-g vernamicina B
c2h5	ch3	N(CH3)2	ácido 3-hi UgHçj droxi-4-oxo pipecolíni- co	ostreogricina B3
02h5	®3	H	prolina CgH^	patricina A
°2H5	ch3	H	ácido pipe- CgHe z colinico	patricina B
CH,	ch3	nhch3	ácido 4-oxopipe colinico	vernamicina B
02h5	oh3	U(CH3)2	ácido aspa- CgH^ ragínico	vernamicina G
°2H5	ch3	H	ácido 4-oxo GgH^ pipecolínico	virginiamicina S
CgHj	H	H	ácido 4-h.i- G^H^	π s °2

âroxipipec£ línico

G2H5	CH,	H	ácido 3-hi droxi-4-οxopipecolí nico	°6h5	virginiamicina
ch3	oh3	H	ácido 4-0xopipecoli nico	°6H5	!!	S4
	ch3	H	ácido 4-hi droxipipecolínico	ch3	Π	s5
	Devido as	suas propriedades fisico·	-químicas	e espectros
cópicas, os	s novos antibióticos	acima mencionados,	obtidos a

partir de estreptomices -espécie Y-8240155» pertencem ao subgrupo das viridogriseínas do grupo das estreptograminas B, z

mas distinguem-se das neoviridogriseinas I, II, III e IV conhecidas, pelo seu cromatograma em camada fina (ver figura 1 dos desenhos anexos), pelo seu cromatograma liquido de alta performance, pelas suas propriedades fisico-químicas e pelas suas propriedades espectroscópicas. 0 sistema de solventes utilizado para a crornatografia em camada fina (GGF) foi metanol a 3 % em clorofórmio, e a revelação efectuou-se a 366/254 nm.

microorganismo de acordo com a invenção forma micélios aéreos alongados e incolores a partir de micélios de substrato ramificados. Sobre os micélios aéreos formam-se cadeias de esporos em forma de espiral. Não se observa a formação de esporos em remoinho nem de ascoesporos. Descrevem-se em seguida as propriedades dos microorganismos na cultura em vários meios de agar:

1. Agar de extracto de levedura-extracto de malte

Crescimento: bom

Micélio aéreo: abundante, esbranquiçado,tipo algodão avelu dado, eventualmente com gotas de água ã su- 7 - perficie

Face inferior: castanho clara

Pigmento solúvel: nenhum

2. Agar de farinha d.e aveia

Crescimento:

Micélio aéreo:

Face inferior:

Pigmento solúvel:

bom bom, esbranquiçado, aveludado amarelo pálida a castanho clara nenhum

3. Agar de sais inorgânicos-amido

Crescimento:

Micélio aéreo:

Face inferior:

bom bom, branco castanho clara

Pigmento solúvel: nenhum Hidrólise do amido: positiva

4. Agar de glicerina-asparagina

Crescimento:

Micélio aéreo:

Face inferior:

Pigmento solúvel:

moderado fraco ou nenhum; quando presente é branco amarelo clara nenhum

5. Agar de tirosina bom

Crescimento:

Micélio aéreo:

Face inferior:

Pigmento solúvel: forma-se um pigmento castanho, escuro moderado, branco castanha

6. Agar de sacarose-nitrato

Crescimento:

Micélio aereo:

Face inferior:

Pigmento solúvel moderado nenhum amarelo pálida nenhum

7. Agar de glucose-asparagina

Crescimento:

moderado

- 8 Micélio aereo:

Face inferior:

z

Pigmento solúvel:

8. Agar nutriente

Crescimento:

Micélio aéreo:

Face inferior:

Pigmento solúvel:

fraco, branco amarelo pálida nenhum moderado nenhum castanho clara castanho pálido

9. Agar de peptona - extracto de levedura - ferro

Crescimento:

Micelio aereo:

moderado nenhum

Face inferior: castanha z

Pigmento solúvel: castanho.

A gama de temperatura óptima para o crescimento do microorganismo de acordo com a invenção oscila entre 25 e 35°C. A estirpe fluidiza gelatina em muito pequena extensão num meio de glucose-peptona-gelatina, hidrolisa o amido em agar de sal inorgânico-amido e peptonisa o leite magro.

Verifica-se a formação de um pigmento escuro em agar de tirosina, em agar de peptona-extracto de levedura-fer ro e em caldo de triptona-extracto de levedura.

esquema de assimilaçao das fontes de carbono âeste microorganismo é o seguinte (em meio de Pridham-Gottlieb):

Positivo: D-xilose, D-glucose, L-arabinose,

I-inositol, ramnose, rafinose, D-manite

Fracamente positivo: sacarose, D-frutose

Com vista a formação de estreptogramino-antibioti cos conhecidos como a micamicina A e B, a virginiamicina, a ostreogricina, a etamicina, a vernamicina, a viridogriseína,

a griseoviridina e a pristinamicina, devem comparar-se os mi croorganismos conhecidos seguintes com o estreptomices -espe cie Y-8240155:

estreptomices sp. P 8648 estreptomices griseus NRL 2426 estreptomices griseoviridus NRL 2427 estreptomices sp., precursor da etamicina estreptomices estrentornices ►i.

estreptomices estreptomices estreptomices estreptomices conganensis ostreogrisius mitaquensis loidensis griseoroseus lavendulae.

Os dados publicados sobre a cultura e as propriedades fisiológicas do microorganismo citado mostram diferenças claras entre o microorganismo de acordo com a invenção e os microorganismos conhecidos acima mencionados. Por exemplo, o estreptomices griseus NRRL 2426 distingue-se por pertencer à série amarela, secção dos rectiflexíveis e não formar pigmentos escuros, enquanto que o microorganismo de acordo com a invenção pertence a série branca, secção dos espirais e forma um pigmento escuro. 0 estreptomices griseovirides W1 2427 pode distinguir-se do microorganismo de acordo com a invenção pelas propriedades de cultura em agar de extracto de levedura -extracto de malte, agar de farinha de aveia, glicerina, agar de asparagina e pela formação de um pigmento escuro. 0 estrejo tornices sp. P 8648 apresenta claras diferenças do microorganis. mo de acordo com a invenção no seu esquema de assimilação das fontes de carbono e nas suas propriedades de cultura sobre agar de Czapek, sais inorgânicos, agar de amido e agar de farinha de aveia. Além disso, a estirpe P 8648 não forma pigmen to escuro enquanto que a estirpe Y-8240155 forma esse pigmento. Na tabela 1 seguinte apresentam-se os resultados de uma comparação taxonómica entre as duas estirpes:

Tabela 1

Estreptomices sp.P 8648 (Dados publicados)

Estreptomices sp.

Y-8240155

Côr do mice	So dificilmente se for-	Porma-se moderado a
lio aéreo	ma um micélio aéreo	abundantemente um mi
	branco a acinzentado so.	célio aéreo branco
	bre a maior parte dos	sobre a maior parte
	meios ISP. Porma-se abundantemente um micélio aéreo branco sobre agar de extracto de leve dura-extracto de malte	dos meios ISP
Cor do micá	Amarelo pálido ou amare.	Amarelo pálido a cas
lio substra	lo claro a verde acasta	tanho claro ou casta
to	nhado sobre a maior par	nho sobre a maior
	te dos meios ISP	parte dos meios ISP
Pigmento so.	Não se forma pigmento	Porma-se pigmento es
lúvel	escuro. Normalmente não	curo. Em casos raros
	se observa qualquer ou-	forma-se com dificul
	tro pigmento, mas em ca	dade um pigmento cas
	sos raros há formação dificil de um pigmento amarelo	tanho
Utilização	L-arabinose-	L-arabinose +
das fontes	I-inositol-	I-inositol +
de carbono	rafinose-	rafinose +

Como é evidente pelos dados acabados de apresentar, verificaram-se diferenças acentuadas entre 0 estreptomices sp. P 8648 e 0 estreptomices de acordo com a invenção, nas propriedades fisiológicas e de cultura e no esquema de utilização das fontes de carbono. Além disso, 0 microorganismo

de acordo com a invenção da origem, durante a sua fermentação, principalmente a neoviridogriseína TV (viridogriseína I) e ainda a grividomicina I, II e III e a griseoviridina, enquanto que o estreptomices sp. P 8648 só dá origem à formação de neoviridogriseína I, II, III, de viridogriseína (neoviridogri seína IV) e de griseoviridina, mas não de grividomicina I, II e III. Além disso, a quantidade de griseoviridina no produto de fermentação do novo micro organismo è muito pequena (^2 $), enquanto que as espécies conhecidas estreptomices sp. P 8646, estreptomices griseus WRL 2426 e S. griseoviridis MHRL 2427 quase sempre dão origem a uma quantidade apreciável de griseoviridina ( > 20 . Com base nos resultados anteriores 0 microorganismo de acordo com a invenção é considerado como um novo tipo de estreptomices.

Um assunto da presente invenção é ainda um proces so para a preparacao de compostos pertencentes a classe dos estreptogramino-antibiéticos, que se caracteriza por se culti var estreptomices sp. Y-8240155 (DSM 3640) ou os seus variantes e mutantes naturais e artificiais por fermentação a um pH entre 6,5 e 8,5 e a uma temperatura entre 20 e 40°C sob condi ções aerébicas hum meio nutriente contendo fontes de carbono e de azoto, sais nutrientes inorgânicos e oligoelementos, e se isolarem os compostos pelos métodos usuais a partir do cal do de cultura.

As fontes de carbono utilizadas no meio nutriente para a produção dos novos antibióticos podem ser glucose, ami do, dextrina, glicerina, sacarose, melaço e óleo. Fontes de a zoto apropriadas, utilizadas no meio nutriente para a produção dos novos antibióticos são farinha de feijão de soja, extracto de levedura, caldo, extracto de malte, gérmen de milho, peptona ou caseína. Sais nutrientes inorgânicos apropriados sao cloreto de sódio, sulfato de magnésio, sulfato de amónio e carbonato de cálcio. Como oligoelementos interessam ferro, manganês, cobre, zinco e cobalto.

estreptomices sp. Y-8240155 (DSM 3640) cultiva-se de preferência a 25-30° Ge a pH 6, 5 - 7,0. 3 vantajosa interromper a fermentação apos 40 a 50 horas pois obtem-se mais altos rendimentos dos compostos. A fermentação é, de pre ferência, uma fermentação por submersão.

decurso da fermentação e a formação dos compostos estreptogramínicos podem controlar-se pelo efeito antibacteriano do liquido de cultura e do micélio contra o estafi lococus aureus 209 P.

Na cultura fermentativa de estreptomices sp. Ί-8240155 DSM 3640 forma-se principalmente neoviridogriseína IV e, como produtos secundários, grividomicina I, II e III e neoviridogriseína II, e ainda, eventualmente, griseoviridina e neoviridogriseína I e III, As quantidades relativas dos com ponentes individuais podem oscilar numa larga gama conforme a composição do meio de cultura. 3m geral, o produto de fermentação isolado contem cerca de 90 % ou mais de NTVG TV, enquanto que os restantes componentes em conjunto não constituem mais do que 10 °J>, Os produtos de fermentação podem isolar-se a pH 4,5 a 7,5 - de preferência a plí 6, 5 - a partir do filtra d.o de cultura, como uma mistura, utilizando métodos usuais co mo extracção com solventes imisciveis em água como por exemplo clorofórmio, cloreto de rnetileno, n-butanol, acetato de etilo ou acetato de butilo (de preferência acetato de etilo). As grividomicinas I, II e III podem ser separadas das neoviri dogriseinas I, II, III e IV e da griseoviridina, por meio de métodos cromatográficos de rotina. Tais métodos podem ser cr o.

Z ZV matografia em coluna de silica gel por gravitaçao, ou de pres. são média, cromatografia em Sephadex^-LH-20, cromatografia de gotas em contra-corrente com um sistema de solventes apropriado, cromatografia liquida de alta performance preparativa sobre LiChrosorb^-RP 18 ou cromatografia em camada fina.

A partir do micelio pode obter-se o complexo anti biótico activo, por extracção do bolo micelar com um solvente

- 13 orgânico, de preferência acetona. Concentra-se o extracto de acetona, ajusta-se o pH da camada aquosa a 4, 5 - 7, 5 - de pre ferência a 6,5 - e extrai-se com solventes orgânicos imiscíveis em água como clorofórmio, cloreto de metileno, n-butanol, acetato de etilo ou acetato de butilo, sendo o acetato de eti lo preferido como solvente. 0 extracto de micelio em acetato de etilo e o filtrado de cultura tratam-se em conjunto ou separadamente .

As grividomicinas I, II e III são sólidos pulverentos incolores e amorfos, e são solúveis em metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, n-butan.ol, acetato de etilo, acetato de n-butilo, acetona, etilmetilcetona, metilisobutilcetona, benzeno, tolueno, cloreto de metileno, clorofórmio, dimetilformamida e sulfóxido dimetílico, e dificilmente solúveis ou insolúveis em hexano, éter de petróleo (40-60), éter dietílico e água. Possuem os seguintes pontos de fusão:

Grividomicina I: 141 - 145°C

Grividomicina II: 153 - 157°C

Grividomicina III: 197 - 198°C peso molecular das três grividomicinas é de 864.

Os dados espectroscópicos apresentam-se nas figuras anexas da seguinte maneira:

Pig. 2 Espectro de IV da grividomicina III (em KBr)

Pig. 3 Espectro de massa da grividomicina III

Pig. 4 Espectro de IV da grividomicina II (em KBr)

Pig. 5 Espectro de massa da grividomicina II

Pig. 6 Espectro de IV da grividomicina I (em KBr)

Pig. 7 Espectro de massa da grividomicina I

No crornatograma de camada fina (placas de silica gel pre-preparadas) as grividomicinas I, II e III apresentam os seguintes valores de R^:

^Ef ^Rf

	Metanol em cio rofórmio	Metanol em ace tato de etilo
3 %	7,5 %	5 %	10 %
Grividomicina	III	0,18	0, 41	0,15	0,25
Grividomicina	II	0,23	0, 48	0,21	0, 34
Grividomicina	I	0,29	0, 59	0,28	0, 40

Na crornatografia líquida de alta performance (HPLG) analítica as grividomicinas I, II e III apresentam os seguintes tempos de retenção:

Enchimento da coluna: LiChrosorb^-RP-18/7 μ- tamanho das partículas /“0,4 x (25+3)cm_<_7

Caudal: 1 ml min.

Revelação: a 305 nm

Solvente: acetonitrilo / 25 mM acetato de amónio / acetato de etilo (150:100:3)

Tempo de Retenção

Grividomicina III

Grividomicina II1

Grividomicina I J

7, 0 min

6, 8 min (não conseguiu separar-se a mistu ra no sistema de solventes acima mencionado).

Acção antjbacteriana

As grividomicinas I, II e III são agentes anti mi crobiano activos contra bactérias, micoplasmas e actinomicetes, em testes de laboratório. Elas apresentam uni efeito in vitro contra as estirpes sensíveis e resistentes de estafilococus aureus bem como contra estirpes de estreptococus pj^ogenes, diplococus pneumoniae, sarcina lutea, bacillus subtilis, micoplasma gallinarum e micoplasma pulmonis. Calculou-se a concentração mínima de inibição dos novos antibióticos em vá- 15 -

rios microorganismos. Os resultados apresentam-se na tabela seguinte em comparação com a NVG II e com a NVG IV.

Tabela II

Organismo testado Valor de MHK pg ml”\_7

	WG II	1TVG IV	Grivi do I	Grivi do II	Gri- vido III
S. aureus 209 p	0.4	1.6	6.4	0.4	6.4
S. aureus 3066 Meth.^	0.4	1.6	25	3.2	3-2
S. aureus R 85 Tet&	0.4	1.6	25	6.4	6.4
S. aureus R 85/M Sm^	1.6	6.4	>50	50.0	50.0
S. aureus 712 Hetlí^	0.2	1.6	25	12.5	25.0
S. aureus 789 Meth.^	0.8	3.2	25	12.5	50.0
Str. faecalis 02D0DU1 Mac	12,5	12.5	>50	50.0	>50.0
Str. faecalis UD8b	6.4	25	>50	>50.0	50.0
Str. faecalis Eder Mac^	25	25	>50	50.0	>50 o0
Micrococcus luteus	0.4	1 · 6	12.5	0.4	6.2
Sarcina lutea	0.4	1.6	12.5	3.2	12.5
Bacillus subtilis	0.2	0.4	3.2	1.6	12.5
E. coli 9632	>50	>50	>50	>50.0	>50.0
E. coli Ess 2231	>50	>50	>50	>50.0	>50.0
Alkaligenes faecalis	>50	>50	>50	>50.0	>50.0
Ps. aeru^inosa M 35	>50	>50	>50	>50.0	>50.0

Meth.R = resistente a meticilina; Tet^ = resistente à tetraciclina; Em¹· = resistente a eritromicina; Mac = resistente a macrolido-antibióticos.

Acção promotora do crescimento complexo de antibióticos de acordo com a invenção efectivamente obtido - constituído por neoviridogriseína IV como componente principal e pelas novas grividomicinas I,

II e III como produtos secundários - apresenta um característico efeito promotor do crescimento em ensaios de alimentação em animais, p. ex. em aves de engorda, porcos, vitelas de engorda, carneiros e coelhos. 0 mesmo se verifica também para os componentes individuais, especialmente para a neoviridogri seína IV, para a qual ainda não se tinha descrito um efeito promotor do crescimento. Também a capacidade de postura das aves, especialmente o peso dos ovos e a produção de leite das vacas leiteiras, ovelhas e cabras, e positivamente influencia da pelo complexo de antibióticos ou pelos seus componentes in dividuais.

Para a obtenção do efeito utilizam-se concentrações de 2-100 ppm, de preferência de 2-50 ppm, e em particular de 2-20 ppm, em relação mação de base. As concentrações são proporcionalmente mais elevadas, quando os antibióticos se administram como aditivos de rações complementares.

A invenção á ilustrada pelos exemplos seguintes:

Exemplo I

Obtenção do estreptomices Y-8240155 a partir de uma amostra de solo (a) Preparação de um meio nutriente

glucose	1,0	g
glicerina	1,0	g
L-arginina	0,3	g
k2hpo4	0,3	8
MgS04.7H20	0,2	g
NaGl	0,3	,σ» o
Extracto de	levedura 2,0	,0* o
Pe2(S04)3	10	mg
CuSO4.5H2O	1	mg
ZnS04.7H20	1	mg

	MnS04.7H20 Agar água destilada pH	1 mg 15,0 g 1 litro 6,5
Meio 2 :	glicose	2,0 g
	L-asparagina	1, 0 g
	k2hpo4	g
	MgSO4.7H2O	o, 5 g
	Extracto de solo	200 ml
	agar	15,0 g
	água destilada	800 ml
	pH	8,0
Meio 3:	amido	10,0 g
	caseína	0» 3 g
	oo3	2,0 g
	NaCl	2,0 g
	K2HK>4	2, 0 g
	MgS04.7H20	0,05 g
	CaGO3	0,02 g
	PeS04	0,01 g
	agar	15,0 g
	água destilada	1 litro
	pH	7,2-7,5
	Esterilizaram-se os	meios a 121°0 durante meia ho
ra.
(b) Preparação da suspensão	de solo

Suspendeu-se 1 g de terra em água destilada e agi tou-se bem. Deixou-se decantar a terra e usou-se a camada superior para a inoculação de cada um dos meios de isolamento a cima mencionados.

(c) Inoculação do meio de isolamento

Inoculou-se 1 ml da suspensão de terra em caixas de Petri contendo 50 ml de qualquer um dos meios de isolamento nutrientes acima mencionados.

(d) Isolamento do estreptomices sp. Y-8240155

Incubou-se a caixa de Petri inoculada ao longo de duas semanas a 30°C e isolou-se o estreptomices sp. Y-8240155 a partir dos microorganismos desenvolvidos.

Exemplo II

Cultura do estreptomices sp. Y-8240155 (DS1I 3640) para a preparação fermentativa do complexo de antibióticos

Cultivou-se o estreptomices sp. Y-8240155 sobre agar de levedura-malte com a seguinte composição:

extracto de malte	10,0 g
extracto de levedura	4, 0 g
glucose	4,0 g
agar	15,0 g
agua destilada	1 litro
pH	7,0
Distribuiu-se o meio por	recipientes

esterilizou-se durante 30 minutos a 121°C. Arrefeceram-se os recipientes em posição inclinada para a preparação do agar em posição inclinada. Inocularam-se os agares com a cultura e in cubaram-se durante 10 a 15 dias a 25°C, apos o que se verificou um bom crescimento e formação de esporos. Utilizou-se uma suspensão de esporos de um dos agares inclinados, em agua des. tilada, para a inoculação de cinco balões de Erlenmeyer de 500 ml contendo cada um 100 ml do meio cie cultura inoculado ou de um balão de kitasato de 5 litros contendo 1 litro do mesmo meio de cultura inoculado.

Composição do meio de cultura inoculado glucose 15, 0 g farinha de feijão de soja 15,0 g

agua de germen de milho	5,0 g
CaCO3	2,0 g
HaCl	5,0 g
água destilada	1 litro
pH	7,0

Distribuiram-se porçoes de 100 ml do meio acima mencionado em balões de Erlenmeyer de 500 ml ou porções de 1 litro em balões de kitasato de 5 1 e esterilizaram-se durante 30 minutos a 121°C. Arrefeceram-se os balões, incubaram-se com suspensões de esporos e agitaram-se durante 72 horas a 30°C com uma velocidade de 240 r.p.m. num agitador de rotação com uma oscilaçao de 3,6 cm (1 polegada e meia). 0 crescimento resultante utilizou-se para a inoculação de dois fermentadores de vidro de 15 1 contendo cada um 10 1 de um meio de cultura a inocular a S - 10 % em volume, para a preparação da segunda fase da cultura inoculada. A fermentação realizou-se a 27°C (+ 1°C), sob agitação a 160-180 r.p.m. e com um arejamento de 6-7 Ipm, durante 24 horas. Utilizou-se a segunda fase da cultura inoculada, assim obtida e bem desenvolvida, para a inoculação do meio de preparação.

Composição, do meio de preparaçao

glucose	15,0 g
amido solúvel	20,0 g
farinha de soja	3,0 g
peptona	3,0 g
CaCO3	2,0 g
ITaCl	2,0 g
água de gérmen de milho	2,0 g
(!H4)2so4	0, 5 g
agua destilada	1 litro
plí	7,0

Adicionou-se desmophen^ para evitar à mistura no fermentador 0,025 # cie a formaçao de espumas.

Colocaram-se 280 1 do meio acima referido num fer mentador de 390 1. Esterilizou-se o meio durante 28 minutos a 121°C por meio de vapor indirecto e directo. Arrefeceu-se o fermentador e inoculou-se com a segunda fase da cultura de inoculação (7 % v/v). A fermentação realizou-se a 27°C (+.1°C), sob agitação a 100-120 r.p.m., durante 40-44 horas. Procedeu-se ao arejamento com uma quantidade de 170 litros por minuto. No fim da fermentação, após 40 a 44 horas, a concentração de antibiótico era de 40-60 mg por litro e o pH do líquido de cultura oscilava na zona 6,5 - 7,0. 0 peso de micélio húmido e ra de 5-6 (percentagem em volume).

caldo de cultura recolhido, contendo o complexo de antibióticos, centrifugou-se para separar o micélio do líquido de cultura. Trataram-se então estas duas fracçães segun do o esquema sequencial descrito no diagrama seguinte:

F	Diaf iltrado de cultura	grania I Hicelio
	1. pH ajustado a 6, 5	1. Extracção com acetona
	2. Extracção com acetato	2. Concentração
	de etilo	3. Diluição do concentrado
	3. Destilação do solvente	com agua
	sob pressão reduzida	4. pH ajustado a 6,5
		5. Extracção com acetato
		de etilo
		6. Evaporação do solvente
		sob pressão reduzida
*
s	xtracto concentrado	Extracto concentrado

^Complexo de antibióticos bruto cromatografia flash em coluna (silica gel)

1-2$ de metanol em clorofórmio 2-100$ de metanol em clorofor

Neoviridogriseína I, II, III, IV e outros antibióticos como componentes secundários

Cromatografia flash em coluna (silica gel)

2-100$ de metanol em clorofórmio

1-2$ de metanol em clorofórmio ,

Neoviridogriseína I, 11, 111 e IV

Cromatografia em Sephadex^-LH-20, oloroformio/metanol(1:1)

Ψ

Neoviridogriseina (cristalização de xano)(60 mg/1)

Grividomicina I, 11 e e Griseoviridina (1,5 1»1)

111 mg

Grividomicina I e

I, II, Hl e IV cloroformio/heII

Grividomicina III

0rornatografia liquida média pressão (silica $ de metanol em acetao de etilo de gel)

Griseoviridina

1. Cromatografia em silica gel (30 p)

2. Eluição com CHCl^ -> CHCl^íKeOH (96:4)

4? ' --------------------^{1 2}-------4,

Grividomicina I Grividomicina II

Camposioão aproximada dos antibióticos em percentagem

Weoviridogriseina	Grividomicina	Griseoviridina
I II III IV	I II III
0,02 2 0,01 95,6	0, 07 0,1 0,2	2,0

A homogeneidade das grividomicinas I, II e III comprovou-se por meio dos seus cr ornato gramas em camada fina sobre sílica gel com 7»5 % de metanol em clorofórmio como eluente bem como por meio de cromatografia líquida de alta pressão sobre LiChrosorb^ RP-18 com acetonitrilo/acetato de amónio 25 mM/acetato de etilo na razão 150:100:3 como eluente.

Rggaaplo III

Cultura do estreptomices sp. Y-8240155 para a preparação fermentativa dos complexos de antibióticos

Repetiu-se o processo operatório do Exemplo 2 com seguintes alterações:

.....-^a.ga£

Jf amido (solúvel)	10,0 g
	1,0 g
MgS04.7H20	1,0 g
NaCl	1,0 g
»^2S04	2,0 g
OaC03	2,0 g
FeS04.7H20	0,1 mg
MnClg^HgO	0,1 mg
ZnS04.7H20	0,1 mg
agar	15,0 g
água destilada	1 litro

7,2

QpWAeigão ,dq.meio_de .fermentação, glucose 20,0 g farinha de feijão de soja 10,0 g

CaC03	0,2	g
CaClgàêHgO	0,1	mg
água destilada	1	litro
pH	7,0

Recolheu-se o produto da fermentação decorridas

40-44 horas. 0 caldo de cultura tratou-se como no Exemplo II.

Repetiu-se o processo operatório do Exemplo II com as seguintes alterações:

Composição do meio de cultura a inocular

amido		20,0	g
farinha de feijão	de
soja		25,0	g
glucose		5,0	g
Κ^ΗΜ>4		1,0	g
MgBC4-7H20		0,5	g
peptona		1,0	g
CaCtg		1,0	g
NaCl		3,0	g
água destilada		1	litro
pH		7,0
Composição do meio de	fermentação
dextrina		20,0	g
farinha de feijão	de
soja		10,0	g
extraoto de levedura	1,0	g
Εθ304.7Η20		0,1	g
água destilada		1	litro
pH		7,0

Terminada a fermentação (44-48 horas) a concentra çao de antibióticos era de 40-60 mg 1*“\ o pH da solução de cultura era de 6,8 e o volume de micélio (húmido) era de 8 %

em volume. Centrifugou-se o caldo de cultura recolhido, conten do o complexo de antibióticos, para separar o micélio do líquido de cultura. Estas duas fracções trataram-se segundo o diagrama de fluxo seguinte.

- 25 Diagrama II

Filtrado de cultura (180 1) Micélio (11 kg)

I lavagem duas vezes com 20 1 ψ de água

-----Solução de lavagem

Cromatografia em Diaion HP-20

1. Água (10 1)

2. Solução de NaCl 2M (20 1) 3* Água (20 1)

4. Acetona a 25% em água (20 1)

5. Eluição com acetona a 100% (30 1)

6. Concentração do eluido, em vácuo v

Complexo de antibióticos concentrado (49 g)

1. Dissolução em CHCl^

2. Precipitação com éter de petróleo ▼

Complexo de antibióticos desengordurado (16,5 g)

Cromatografia em silica gel

1. Eluição com CHC1₃ CHClyMeOH __(95:5)

HVG IV (4,S g) + NV? TV + vestígios d® HVG II Grividomicina I, II e III í-------------------¹

Cromatografia em silica gel (30 μ)

JSTVG IV Grividomicina

I (5»545 g) (34 mg)

1. Eluição com CHCl-j CHCl^MeOH (96:4)

I 1

Grividomicina

Grividomicina

II III (0,36 g) (0,69 g)

- 26 ’S

final a composição do complexo de antibióticos foi a seguinte:

Neoviridogriseína Grividomicina

II	IV	I	II III
0,1 %	90,2 %	0,3	$ 3,3 % 6,1 %
Não	se conseguiu	identificar	griseoviridina nem
IVG I ou III.

Exemplo V

Como exemplo representativo, não limitante, utili zou-se o complexo de antibióticos composto por MVG IV e pelas grividomioinas I, II e III na proporção de 95:5, num ensaio de alimentação de 180 pintainhos de Broiler, machos. Os pintos tinham 1 dia de idade, tinham um peso inicial médio de 39> 6 g ® dividiram-se em 5 grupos de 36 pintos cada, como se indica a seguir.

ensaio de alimentação realizou-se durante 42 4ias.

Substância Concen ganho tração de peso	ganho de peso em %	consumo de comi da g	consumo de comi da %	utili zação de co mida
	ppm	em g
Controle	•M	1354	100	2903	100	100
IÍV0 IV: Mistura de grividomibinas	5	1399	103,4	2817	97,0	93,9
IfVG IV: Mistura de grividomioinas	10	1361	100,6	2759	95,0	94,5
			- 27 -

ivg iví

Mistura de grividomieinas 20 1410 104,1 2853 98,0 94,4

Os resultados do ensaio mostram um melhor aprovei tamento da alimentação e um maior aumento de peso corporal em o emparação com o grupo de controle ao qual não foi administra do qualquer aditivo alimentar.

.Exemplo

Para este ensaio de alimentação utilizou-se uma solução de cultura seca por aerosol, contendo até 0,2 % do complexo antibióticos (isto é, 2 ghg”¹). A composição do complexo era NVG TV: Grividomicina: NVG II na proporção de 96: *3:1.

ensaio de alimentação decorreu de forma análoga à ja descrita no exemplo V, com as seguintes alterações: Distribuiram-se 160 pintos de Broiler, machos, de 1 dia de idade, com um peso inicial de 37,2 g, em 5 grupos de 32 animais cada, como se apresenta a seguir:

Substancia concen	ganho de peso em g	ganho de peso em %	consumo consumo de comida de comi	utili zação de co mida !
	tração ppm
g	da %
Controle	-	1355	100	2558	100	100
BVG IVí Mistura de
grividcmicinas	5	1446	106,9	2734	106,9	100
ÍTG IVí Mistura de grividomieinas	10	1441	106,4	2683	104,9	98,6
fVG IV: Mistura de
grivldomicinas	20	1452	107,2	2724	106,5	99,4

- 29 ;*3j

Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES ffij

   t.

   bióticos

   Processo para a preparação de um complexo de anti

   I contendo grividomicinas e II de fórmula Ia z®3 grlvidomlclna III de fórmula Tb

   Ia

   CH, CH, < / OH 1 CH CH 1 / \ CBL CH₉ 1 d | ch_q 1 ^d GH-CO-HH-CH-CO - K — — CH-CO | CH-CH, | J | N-CH | 1 0 | çh₂ co | 1 CO CH-UH-CO-CH--NH-CO-CH | ----NH

   neoviridogriseína IV, neoviridogriseína II e, conforme o caso, griseoviridina, neoviridogriseína I e III, caracterizado por se cultivar o microorganismo estreptomices sp. Y-8240155 (DSM 364O) ou um dos seus mutantes ou variantes, a um pH de 6, 5 a

   8,5 e a uma temperatura entre 20 e 40°C sob condições aeróbicas, num meio de cultura contendo fontes de carbono e de azoto* sais inorgânicos nutrientes e oligoelementos até se obter uma acção antibiótica efectiva, e se isolar 0 produto de fermentação a partir do meio de cultura por métodos em si conhecidos .

   - 2* Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado por se cultivar o microorganismo a um pH de 6, 5 a 7,0 e a uma temperatura de 25 a 35°C, durante cerca de 40 a 50 ho ras ·

   - 3® Processo para a separação do complexo de antibióticos obtido de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por

   a) se extrair o filtrado de cultura a um pH de 4,5 a 7,5 com um solvente orgânico imiscível em água

   b) se extraia em primeiro lugar o mioelio com acetona e se ex trair o extracto de acetona a um pH de 4, 5 a 7, 5 com um solvente orgânico imiscível em água e se separarem os extractos reunidos.

   - 4» Processo para a preparação de grividomicina I de fórmula Ia, caracterizado por se cultivar o microorganismo es treptomices sp. Y-8240155 (DSM 3640) ou um dos seus mutantes ou variantes a um pH de 6, 5 a 8, 5 e a uma temperatura entre 20 e 4O®0» sob condiçoes aerobicas, num meio de cultura contendo fontes de carbono e de azoto, sais nutrientes inorgânicos e oligoelementos, até se obter uma acção antibiótica efec tiva, se separar o produto de fermentação a partir do meio de cultura e se isolar daí a grividomicina I.

   - 5« Processo para a preparação de grividomicina II de fórmula lb, caracterizado por se cultivar o microorganismo es treptomices sp. Y-8240155 (DSM 3640) ou um dos seus mutantes ou variantes a um pH de 6, 5 a 8, 5 e a uma temperatura entre 20 e 40®C sob condições aeróbicas, num meio de cultura conten do fontes de carbono e de azoto, sais nutrientes inorgânicos e oligoelementos, até se obter uma acção antibiótica efectiva, se separar o produto de fermentação a partir do meio de cultu ra e se isolar daí a grividomicina II.

   - 32 - 6β Processo para a preparação de grividomicina III de fórmula Ic, caracterizado por se cultivar o micr©organismo estreptomices sp. Y-8240155 (DSM 3640) ou um dos seus mutantes ou variantes a um pH de 6, 5 a 8, 5 e a uma temperatura entre 20 e 40°0 sob condições aeróbicas, num meio de cultura contendo fontes de carbono e de azoto, sais nutrientes inorgê nlcos e oligoelementos, até se obter uma acção antibiótica efectiva, se separar 0 produto de fermentação a partir do meio de cultura e se isolar daí a grividomicina III.

   A requerente declara que 0 primeiro pedido desta patente foi depositado na República Federal Alemã em 14 de Fe vereiro de 1986, sob ο η^δ P 36 04 678.7.

   Lisboa, 13 de Fevereiro de 1987

   0 AGENTE OFICIAL OA PROPRIEDAOE INDUZI RIAi

   - 33 «PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UM COMPLEXO ANTIBIÓTICO CONTENDO GRIVIDOMICINA I

   B II

   RESUMO

   A invenção refere-se a gSe de um complexo de antibióticos II d® fórmula Ia um processo para a prepara contendo grividomicina I e

   Ia grividomicina III de fórmula Ib

   I

   N-CH_q ι j

   CO

   NH lb neoviridogriseína IV, neoviridogriseína II e, conforme o caso, griseoviridina, neovirido griseína I e III, que compreende cul tivar-se o micro organismo estreptomices sp. Y-82 40155 (DSM 3640) ou um dos seus mutantes ou variantes, a um pH de 6, 5 a

   8,5 © a uma temperatura entre 20 e 40°C sob condições aeróbieae, num meio de cultura contendo fontes de carbono e de azoto, aais inorgânicos nutrientes e oligoelementos até se obter uma acção antibiótica efectiva, e se isolar 0 produto de fermentação a partir do meio de cultura por métodos em si conheoidoe.