HU197772B - Microbiological process for producing streptogramin-type antibiotics and fodder additives containing same - Google Patents

Description

A találmány új streptogramin típusú antibiotikumok előállítására vonatkozik mikrobiológiai módszerrel. A találmány továbbá az új antibiotikumokat tartalmazó takarmány adalékok, valamint gyógyszerkészítmények előállítására vonatkozik. Az antibiotikumok előállítására a Streptomyces Y-8240155 törzset használjuk fel. A találmány szerinti takarmányadalékok a haszonállatok, különösen sertés, szarvasmarha és szárnyasok esetén a tápanyagok hasznosítását javítják, a növekedést gyorsítják.

Az Y-8240155 mikroorganizmust talajmintából (Panchgani, Maharashtra, India) tápközeg felhasználásával, 6,5—8,5 közötti pH-érték között nyertük ki. A mikroorganizmus mutánsai'és variánsai ismert módon, például mutagén, így N-metil-N-nitro-N’nitrozo-guanidin alkalmazásával állíthatók elő.

A Streptomyces sp. Y-8240155 mikroorganizmus az Actinomycetales rendbe, a Streptomycetaceae családba és a Streptomyces nem zetséghez tartozik. Streptogramin típusú antibiotikumokat képező Streptomyces törzsek az irodalomból már ismertek (J. Antibiotics 32:575—583, 1979; 1 575 .533 sz. brit szabadalmi leírás). A Streptomyces sp. Y—8240155 azért tekinthető új törzsnek, mert — ahogy az alábbiakban részletezzük — egyes morfológiai és fiziológiai tulajdonságaiban, valamirtt a tenyésztésekor tanúsított viselkedésében az ismert törzsektől különbözik. Üj törzsként tekinthető továbbá azért is, mert új, I-,

II- és III-grividomicinnek nevezett antibiotikumokat képez. A Streptomyces species Y-8240155 törzset 1986. január 15-én a Német Mikroorganizmus-Gyűjteményben letétbe helyeztük, DSM 3640 szám alatt.

A Streptomyces DSM 3640 törzs tenyésztése során az ismert IV-neoviridogrizein (3 023 204 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás) mellett új antibiotikumok keletkeznek, amelyek egyebek között takarmány adalék formájában haszonállatok növekedésének serkentésére alkalmasak.

Az új antibiotikumok az (I) általános képletnek felelnek meg, ahol R,, R₂, R₃ és R₄ jelentése az alábbi:

I- és Il-grividomicin III-grividomicin

A. I- és Il-grividomicin kémiai képlete azonos; diasztereoizomer párról van szó.

Az új antibiotikumok számos mikroorganizmus, ezen belül Gram-pozitív baktériumok és mikroplazmák ellen hatékony. Ide tartoznak például Staphylococcus aureus, Streptococcus pygenes., Diplococcus pneumoniae, Mycoplasma gallinarum és Mycoplasma pulmonis. Az új antibiotikumok olyan törzsek ellen hatékonyak, amelyek egyéb antibiotikumokkal szemben rezisztensek.

Az új vegyületek gyógyszerkészítmények hatóanyagaként vagy takarmány adalékként tetszőleges felszívódó formában egyenként vagy egymással kombinálva vagy az ismert I-, II-, III- és/vagy IV-neoviridogrizeinnel és/vagy A-csoportbeii streptograminszerű antibiotikummal, így grizeoviridinnel kombinálva alkalmazható.

A mikroorganizmus izolálásához használt tápközeg szén- és nitrogénforrást, szervetlen tápsókat és szilárdító anyagot tartalmaz. Szénforrásként glükóz, keményítő, dextrin, glicerin, szacharóz vagy melasz alkalmazható, nitrogénforrásként pedig pepton, élesztőkivonat, húsleves, malátakivonat vagy kazein jöhet számításba, szilárdító anyagként például agart használhatunk. A szervetlen tápsók lehetnek például nátrium-, kálium-, ch₃ -OH -h -ch₃ ch₃ -oh -ch₃ -h magnézium-, kálciumsók, vagy foszfátok vagy szulfátok.

Az új I-, II- és III-grividomicin antibiotikumok streptogramin-antibiotikumok. Az utóbbiak a depszi-peptid-vegyületek csoportjába tartoznak, és két fő csoportba sorolhatók, az A- és a B-csoportba (D. Vazquez, Antibiotic III, „Mechanism of action of antimicrobial and antitumor agents”, Springer-Verlag Berlin-Heidelberg-New York 1975, 521 — 534. old.). A mikroorganizmusok az A- és B-csoport komplexét termelik. Az A- és a B-csoportbeli antibiotikumok 50S-riboszómák alegységein lévő igen hasonló pontokra hatnak. Tekintve, hogy az A-antibiotikumok kötődése B-antibiotikumok jelenlétében erősödik, Gram-pozitív baktériumok elleni hatás szempontjából az A- és a B-csoport közötti szinergetikus hatásról lehet beszélni. Az A-csoporthoz az alábbi antibiotikumok tartoznak: grizeoviridin, A-mikamicin, A-oszteogricin, M,-virginiamicin, IlA-prisztinamicin, A_rszinergisztin; G-oszteogricin, M₂-virginiamicin, IIB-Prisztinamicin, A-dihidro-oszteogricin, I- és Ib -madumicin. A B-csoport a viridogrizein (neoviridogrizein) és a B-vernamicin (B-mikamicin) alcsoportokból áll. A viridogrizein (neoviridogrizein) alcsoport képviselői az (I) általános képletnek felelnek meg, az alábbi szu bsztituens-jelentésekkel:

-2197772

R1	r2	R3	(R^= CH-j) elnevezés
-CHj	-OH	-ch3	I-viridogrizin
			etamicin, F 1370 A
			IV-neoviridogrizein
-H	-OH	-CH3	Il-viridogrizein
-CH-j	-H	C2H5	I-neoviridogrizein
-CH3	-H	-ch3	II-neiviridogrizein
-CH3	-OH	-c2h5	Ill-neoviridogrizein

Az I-, II- és Ill-neoviridogrizein (NVG), valamint a Streptomyces P 8648 (FERM-P 3562) törzs felhasználásával történő előállítása, továbbá gyógyszer hatóanyagaként! és takarmány adalékkénti alkalmazása a 2 725 163 sz. NSZK-beli közrebocsátási iratból ismert. A IV-neoviridogrizein Actinomycetes, baktériumok, rickettsziák és vírusok ellen hatásos, főleg masztitisz kezelésére alkalmas antibiotikumként a 3 023 204 sz. amerikai egyesült ²⁰ államokbeli szabadalmi leírásból ismert.

A B-vernamicin (B-mikamicin) alcsoportot a (II) képlet ábrázolja, ahol R,, R₂, R₃, R₄ és X jelentése az alábbi.

Rí	r2	r3	X R	k	elnevezés
-c2h5	-ch3	-n(ch3)2	a) kepletü cső- - port (4-oxopipekolinsav-maradék	C6H5	B-osztreogricin B-mikamic in B-streptogramin 1-1-szinergisztin Β-2-vernamic in
					I -prisztinamicin A
-ch3	-ch3	-n(ch3)2	4-oxopipekolinsav-	-C6Hs	1c-prisz tinamic in
			-maradék		osztreogricin B-1Β-1-vernamicin
-c2h5	-ch3'	-nhch3	4-oxopipekolinsav-	-c6h5	Β-2-osztreogricin
			-maradék		1B-prisztinamicin B-vernamicin
_C2H5	-ch3	-n(ch3)2	3-hidroxi-4-oxo- pipekolinsav-ma- radék	-c6h5	Β-3-osztreogric in
-c2h5	-ch3	-H	prolin-maradék	-c6h5	A-patric in
-c2h5	-ch3	-H	pipekolinsav-ma- radék		B-patric in
-ch3	-ch3	-nhch3	4-oxopipekolinsav-maradék	-C6H5	B-vernamicin
-c2h5	-ch3	-n(ch3)2	aszparaginsav-maradék	-c6h5	C-vernamicin

-3197772

T áblázat /folytatás/

Rí	r2	r3	X Ru		elnevezés
C2H5	ch3		4-oxopipekolinsav-	C6H5	S-virginiamicin
			-maradék
C2H5	H	H	4-h idrcx i-p ipeko-	C6H5	S2-virginiamicin
			1 insav-maradék
c2h5	ch3	H	3-hidrcxi-4-oxopi-	C6H5	S5 -virginiamicin
			pekolinsav-maradek
ch3	ch3	H	4-oxopipekolinsav-	C6H5	S4 -virg iniamicin
			-maradék
c2h5	ch3	H	4-hidrcxipipeko1 · /,	ch3	S^-virginiamicin

Fizikai-kémiai és spektroszkópiai adataik alapján az új antibiotikumok a streptogramin B-csoport viridogrizein alcsoportjához tartoznak, vékonyréteg-kromatogramjuk azonban az I-, II-, III- és IV-neoviridiogrizinétől különbözik (lásd 1. ábra). A nagynyomású folyadékkromatogramban és a fizikai-kémiai és spektroszkópiai tulajdonságokban szintén különbségek vannak. A vékonyréteg-kromatográíiához 3% metanolt tartalmazó kloroformot használunk, a kimutatás 366 nm/ /254 nm-nél történt.

Az alkalmazott mikroorganizmus hoszszúkás színtelen lég-micéliumot képez elágazó szubsztrátum-micéliumokból. A lég-micéliumokon spirál alakú spóraláncok helyezkednek el. Sem örvény-, sem aszkospóraképződés nincs. Különböző agar-táptalajokon a mikroorganizmus az alábbi tulajdonságokat mutatja.

1. Élesztőkivonat-malátakivonat agar

Növekedés: jó

Lég-micélium: dús, fehéres, bársonyos-pamutszerű, a felületen néha vízcseppecskék vannak

Hátsó oldal: világos barna

Oldható pigment: nincs

2. Zabliszt agar

Növekedés: jó

Lég-micélium: jó, fehéres, bársonyos Hátsó oldal: enyhén sárga és világos baina közötti árnyalat

Oldható pigment: nincs

3. Szervetlen sókat tartalmazó keményítő agar

Növekedés:

Lég-micélium:

Hátsó oldal:

Oldható pigment: Keményítő-hidrolízis: pozitív

4. Glicerin-aszparagin-agar jo jó, fehér világos barna nincs

Növekedés: Lég-micélium:

Hátsó oldal: Oldható pigment: 4 mérsékelt gyenge vagy nincs; van, akkor fehér világos sárga nincs ha

5. Tirozin-agar

Növekedés: jó

Lég-micelium: kevés, fehér

Hátsó oldal: barna

Oldható pigment: barna, sötét

6. Szacharóz-nitrát-agar

Növekedés: mérsékelt

Lég-micélium: nincs

Hátsó oldal: enyhén sárga

Oldható pigment: nincs

7. Glükóz-aszparagin-agar

Növekedés: mérsékelt

Lég-micélium: nincs

Hátsó oldal: jiincs

Oldható pigment: nincs

8. Tápagar

Növekedés: mérsékelt

Lég-micélium: nincs

Hátsó oldal: világos barna

Oldható pigment: enyhén barna

9. Pepton-élesztőkivonat-vas-agar

Növekedés: Lég-micélium: Hátsó oldal: Oldható pigment: Az alkalmazott mérsékelt nincs barna barna törzs optimális növekedési hőmérséklete 25°C és 35°C között van. A mikroorganizmus glükóz-pepton-zselatin-agaron a zselatint kis mértékben folyósítja, szervetlen sókat tartalmazó keményítő-agaron a keményítőt hidrolizálja, sovány tejet peptonizál. Sötét pigment képződését tirozin-agar, pepton-élesztőkivonat-vas-agar és tripton-élesztőkivonat-húsleves esetén figyeltük meg. A mikroorganizmus szénforrás hasznosítása (Pridham-Gottlieb-féle közegben) az alábbi:

pozitív D-xilóz, D-glükóz, L-arabinóz,

I-inozit, ramnóz, raffinóz, D-mannit;

enyhén pozitív szacharóz, D-fruktóz

Az ismert streptogramin antibiotikumok, így A-mikamicin és B-mikamicin, virginiamicinek, osztreogrizinek, etamicin, vernamicin, viridogrizein, grizeoviridin és prisztina-4197772 micinek képződésére való tekintettel a Streptomyces species Y-8240155 törzset célszerűen az alábbi mikroorganizmusokkal hasonlítjuk össze:

Streptomyces sp. P8648

Streptomyces griseus NRL 2426 Streptomyces griseoviridus NRL 2427 Streptomyces sp., amely etamicint képez Streptomyces conganensis Streptomyces ostreogrisius Streptomyces mitakensis

Streptomyces loidensis

Streptomyces griseoroseus

Streptomyces lavendulae.

A fenti mikroorganizmusok tenyésztésével, fiziológiai tulajdonságaival kapcsolatban nyilvánosságra került adatok szerint észrevehető különbség van az ismert Streptomyces törzsek és az új törzs között. így a Streptomyces griseus NRRL 2426 a sárga sorozat Rectiflexibiles szekciójához tartozik, sötét pigmentet nem képez, míg az új törzs a fe5 hér sorozat Spiráles szekciójához tartozik és sötét pigmentet képez. A Streptomyces griseovirides NRRL 2427 az élesztőkivonat/malátakivonat agaron, zablisztagaron, glicerin/ /aszparagin-agaron mutatott tenyésztési tu10 lajdonságokban és sötét pigment képződésében különbözik az új törzstől. A Streptomyces sp. P8648 szénforrás asszimiláló képessége, Czapek-agaron, zablisztagaron, szervetlen sókat tartalmazó keményítőagaron mutatott viselkedése más, mint az új törzsé. A P 8648 törzs sötét pigmentet sem képez, az új törzs azonban igen. A két törzs taxonómiai összehasonlításának eredményét az I. táblázatban foglaljuk össze.

Tulaj donsag

Streptomyces sp. P8648 (nyilvánosságra került adatok)

Streptomyces sp. Y-8240155

A légmicélium

A szubsztrátum» / -1 · / -raiceliuni színe ο 1 dh a t ő p igmen t szénforrás hasznosítása fehér, esetleg szürkés fehér légmicélium, a legtöbb ISP-közegen csak gyéren képződik. Fehér légmicélium élesztők ivonat/malátákivonat agaron dúsan képződik.

enyhe sárga, illetve világossárga, szürkebarna a legtöbb ISPközegen nincs sötét pigment: általában további pigment sincs: ritka esetban kevés sa'rga pigment

L-arabinőz I-inozit raffinoz fehér légmicélium, a legtöbb ISP-közegen mérsékelten vagy dúsan képződik enyhén sárga, világosbarna vagy barna a legtöbb ISPközegen sötét pigment képződik, ritka esetekben barna pigmentből kevés képződik

L-arabinőz +

I-inozit + raffinoz +

A fenti táblázat mutatja, hogy az új törzs és a Str. sp. P8648 törzs között a fiziológiai és tenyésztési tulajdonságokban, valamint a szénforrás hasznosításában szembetűnő különbségek állnak fenn. Ezen túlmenően fermentálása során az új törzs főleg IV-neoviridogrizeint (I-viridogrizeint), emellett még I-, II- és III-grividomicint és grizeoviridint termel, míg Streptomyces sp. P8648 csak az I-, II- és III-neoviridogrizeint, viridogrizeint (IV-neoviridogrizeint) és grizeoviridint képez, I-, II- és III-grividomicint azonban nem. Az új mikroorganizmus fermentációs termékében a grizeoviridin részaránya csak csekély (=2%), míg az ismert mikroorganizmusok (Streptomyces sp. P 8646, Streptomyces grizeus NRRL 2426 és S. grizeoviridis NRRL

6Q 2427) kivétel nélkül tekintélyes mennyiségű (a 20%-ot meghaladó) grizeoviridint képeznek. A fentiek értelmében az új törzs új Streptomyces fajtának tekinthető.

A találmány tárgya tehát eljárás a streptogramin antibiotikumok osztályába tartozó vegyületek előállítására. A találmány sze5

-5197772 rint a Streptomyces DSM 3640 törzset vagy e törzs természetes vagy mesterséges variánsait és mutánsait 6,5 és 8,5 közötti pH érték mellett 20—40°C-on aerob körülmények között szén- és nitrogénforrásokat, szervetlen sókat és nyomelemeket tartalmazó tápközegben fermentáljuk, majd a vegyületeket ismert módon a tenyészléből elkülönítjük.

Az új antibiotikumok előállításához használt tápközeg szénforrása glükóz, keményítő, dextrin, glicerin, szacharóz, melasz vagy olaj lehet, nitrogénforrásként például szójaliszt, élesztőkivonat, húsleves, malátakivonat, kukoricalekvár, pepton vagy kazein jöhet számításba. Szervetlen tápközegként nátrium-kloridot, magnézium-szulfátot, ammónium-szulfátot és kalcium-karbonátot, nyomelemként vas-, mangán-, réz-, cink- és kobaltsókat adagolhatunk.

A Streptomyces sp. DSM 3640 törzset előnyösen 25—30°C-on és 6,5—7,0 pH érték mellett tenyésztjük. A fermentálást előnyösen a 40—50. óra után szakítjuk meg, mert ilyenkor a kívánt vegyületek hozama a legmagasabb. A fermentálást előnyösen süllyesztett tenyészetben végezzük.

A fermentálás lefolyását és a streptogramin vegyületek képződését úgy követhetjük, hogy a tenyészlé és a micélium Staphylococcus aureus 209 P-re kifejtett antibakteriális hatását figyeljük.

A Streptomyces DSM 3640 fermentálása során főleg IV-neoviridogrizein, emellett I-, II- és Ill-grividomicin és II-neoviridogrizein, valamint adóit esetben 1- és III-neoviridogrizein képződik. Az egyes antibiotikumok részaránya a tápközeg összetételétől függően széles tartományon belül változhat. Általában az elkülönített fermentációs termék mintegy 90% vagy ennél több IV-NVG-t tartalmaz, a többi alkotó együttesen nem tesznek ki 10%-nál többet. A fermentálás termékeit elegy formájában hagyományos módszerekkel, például vízzel nem elegyedő oldószerrel végzett extrahálás útján különítjük el, oldószerként kloroformot, diklór-metánt, n-butanolt, etil-acetátot alkalmazhatunk. Az etil-acetátot előnyben részesítjük. Az I-, IIés III-grividomicint kromatográfiai rutin módszerekkel választhatjuk el az I-, II-, III- és

IV-neovirídogrizeinek és a grizeoviridin mellőlAz ilyen módszerek például: gravitációs, közepes nyomású oszlopkromatográfia Kieselgélen Sephadex^(R)-LH-20-kromatográfia, alkalmas oldószereleggyel végzett ellenáramú csepp-kromatográfia, preparatív nagyteljesítményű folyadékkromatográfia LiChrosorb^{1 J}-RP-18 adszorbensen vagy vékonyréteg-kromatográfia.

A micéliumból az antibiotikumokat szerves oldószerrel, előnyösen acetonnal extrahálva nyerhetjük ki. Az acetonos extraktumot betöményítjük, a vizes fázis pH-ját 4,5 és 7,5 közötti, előnyösen 6,5 értékre állítjuk, és a vizes részt vízzel nem elegyedő oldószerrel, így kloroformmal, diklór-metánnal, n-butanolt, etil-acetáttal vagy butil-acetáttal, előnyösen etil-acetáttal extraháljuk. A micéliumból nyert etil-acetátos . extraktumot kü20 lön dolgozhatjuk fel, de egyesíthetjük a tenyészlé szürletével is.

Az I-, II- és III-grividomicinek színtelen, amorf porszerű termékek, oldhatók az alábbi oldószerekben: metanol, etanol, n-propa25 nol, izopropanol, n-butanol, etil-acetát, n-butil-acetát, aceton, etil-metil-keton, benzol, toluol-, diklór-metán, kloroform, dimetil-formamid és dimetil-szulfoxid; nehezen oldódók vagy oldhatatlanok az alábbi oldószerekben: hexán, petroléter (40—60), dietil-éter és víz. Olvadáspontjaik az alábbiak:

I- grividomicin 141 — 145°C

II- grividomicin 153—157°C

III- grividomicin 197—198°C

A három grividomicin móltömege 864.

A csatolt rajzok a vegyületek spektroszkópiai adatait mutatják az alábbi sorrendben: 2. ábra: Ill-grividomicin KBr-ban felvett 1R-színképe,

3. ábra: Ill-grividomicin tömegspektruma,

4. ábra: II-grividomicin KBr-ban felvett IR-színképe,

5. ábra: II-grividomicin tömegspektruma,

6. ábra: I-grividomicin KBr-ban felvett IR-színképe, ⁴⁵ 7. ábra: I-grividomicin tömegspektruma.

Készen vett Kieseigél-lemezzel végzett vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálat az alábbi Rf-értéket adja:

metanol formban 3 % loro- metanol etilacetátban ,5¾ 5 % 10 h

Ill-crividomicin	0,18	0,41	0,15	0,25
II-grividomicin	0,23	0,4E	0,32	0,34
I-grividomicin	0,29	0,55	0,28	0,40

-6197772 nagyteljesítményű folyadékkromatogelemzés (LiChrosortr LrP-18/7 mikA ráfiás ron szemcseméret, oszlop 0,4X (25+3)cm, átfolyási sebesség: 1 ml/perc, mérés 305 nm hullámhossznál, oldószer: acetonitril: 25 mmólos ammónium-acetát-oldat: ecetsav — 150: :100:3) az alábbi retenziós időértéket adja: III-grividomicin: 7,0 perc

II-grividomicin

6,8 perc

I-grividomicin

A fent megadott oldószerrendszerben a két vegyületet nem sikerült szétválasztani.

A baktérium elleni hatás

Laboratóriumi kísérletek bizonyították, hogy az I-, II- és III-grividomicin baktériumok, mikoplazmák és sugárgombák ellen ha5 tékony. A Staphylococcus aureus rezisztens és érzékeny, valamint a Streptococcus pyogenes, Diplococcus Pneumoniae, Sarcina Lutea, Bacillus subtilis, Mycoplasma gallinarium és Mycoplasma pulmonis törzsei elleni hatás szemléltetésére a II- táblázatban a minimális gátló koncentrációt adjuk meg a II-NVG és a IV-NVG értékeivel összehasonlítva.

II. táblázat

Mikroorganizmus	NVG II	minimális gátló koncentráció ug/ml
NVG IV	grivido- grivido	g r i v i d omicin M
micin 1	micin II
S. aureus 209 P	0.4	1.6	6.4	0.4	6.4
S. aureus 3066 Meth.R	0.4	1.6	25	3.2	3.2
S. aureus R 85 TetR	0.4	1.6	25	6.4	6.4
S. aureus R 85/M EmR	1.6	6.4	50	50.0	50.0
S. aureus 712 MethR	0.2	1.6	25	12.5	25.0
S. aureus 789 MethR	0.B	3.2	25	12.5	50.0
Str. faecalis 02D0DU1 MacR	12.5	12.5	50	50.0	50.0
Str. faecalis UD8b	6.4	25	50	50.0	50.0
Str. faecalis Eder MacR	25	25	50	50.0	50.0
Micrococcus luteus	0.4	1.6	12.5	0.4	6.2
Sarcina lutea	0,4	1.6	12.5	3.2	12.5
Bacillus subtilis	0.2	0.4	3.2	1.6	12.5
E. coli 9632	50	50	50	50.0	50.0
E, coli Ess 2231	50	50	50	50.0	50.0
Alkaligenes faecalis	50	50	50	50.0	50.0
Ps. aeruginosa M 35	50	50	50	50.0	50.0

Meth c R Em meticillin eritromicin rezisztens rezisztens

Tét = tetraciklin rezisztens p

Mac = makrolid-antibiotikumokkal szemben rezisztens

A növekedést serkentő hatás

A találmány szerint előállított antibiotikumkomplex — amely főkomponensként IV-neoviridogrizeint és emellett az új I-, II- és

III-grividomicin antibiotikumokat tartalmazza— különböző állatokkal, így hízószárnyassal, sertésekkel, húsmarhákkal, birkákkal és házínyúllal végzett etetési kísérletekben szignifikáns növekedésserkentő hatást mutatott.

Ez főleg a IV-neoviridogrizeinre érvényes, amelynek növekedésserkentő hatása mindezideig nem volt ismert. A szárnyasok ese⁶⁰ tén a tojáshozam, főleg az egyes tojások tömege emelkedik, szarvasmarhák, birkák és kecskék esetén a tejhozam növekszik.

A fenti hatás eléréséhez 2—100 ppm, előnyösen 2—50 ppm koncentrációban alkalmaz65 zuk az antibiotikumokat a takarmányra vo7

-7197772

13
natkoztatva. Amennyiben az	antibiotikumo-
kát takarmány adalékként a főtakarmány mellett alkalmazzuk, a koncentrációk ennek meg-
felelően magasabbak.
A találmányt az alábbi példákkal részle-
tesebben ismertetjük.
1. példa A Streptomyces Y-8240155	törzs kinyeré-
se talajmintából a) Tápközeg előállítása 1. közeg; glükóz	1,0 g
glicerin	1,0 g
L-arginin	0,3 g
k2hpo4	0,3 g
MgSO4.7H2O	0,2 g
NaCl	0,3 g
élesztőkivonat	2,0 g
Fe(SO4)3	10 mg
CaSO4.5H2O	1 mg
ZnSO4.7H2O	1 mg
MnSO4.7H2O	1 mg
agar	15,0 g
desztillált víz	1 liter
pH	6,5
2. közeg: glükóz	2,0 g
L-aszparagin	1,0 g
k2hpo4	0,5 g
MgSO4.7H2O	0,5 g
talajkivonat	200 ml
agar	15,0 g
desztillált víz	800 ml
pH	8,0
3. közeg: keményítő	10,0 g
kazein	0,3 g
kno3	2,0 g
NaCI	2,0 g
K2HPO4	2,0 g
MgSO4.7H2O	0,05 g
CaCO3	0,02 g
FeSO4	0,01 g
agar	15,0 g
desztillált víz	1 liter
PH	7,2-7,5
A fenti tápközegeket 121°C-on 30 percen át

sterilizáljuk.

(b) A talajszuszpenzió előállítása g földet desztillált vízben szuszpendálunk, és a szuszpenziót jól felrázzuk. Miután a föld leülepedett, a felülúszó részt a fenti öszszetéteiü elkülönítő közegek oltására használjuk fel.

(c) Az elkülönítő közeg oltása

A fenti összetételű közegek petricsészékben lévő 50—50 ml-jéhez 1 ml (b) szerint kapott felülúszó részt adunk.

(d) Streptomyces sp. Y8240155 elkülönítése

A beoltott petricsészét 30°C-on két héten át inkubáljuk, és a növekvő telepekből a Streptomyces sp. Y-8240155 törzset kinyerjük.

2. példa

A Streptomyces sp. Y-8240155 (DSM 3640) fermentálása antibiotikumok előállítása céljából

14

A mikroorganizmust az alábbi összeté-

telű ferde élesztő/maláta-agaron tenyészt-

jük:

malátakivonat 10,0 g

élesztőkivonat 4,0 g

glükóz 4,0 g

agar 15,0 g

desztillált víz 1 liter

pH 7,0

A közeget kémcsövekbe töltjük és 121 °C-

on 30 percen át sterilizáljuk. A kémcsöveket megdöntjük, és így hagyjuk kihűlni. A ferdeagar felületeket az oltótenyészettel oltjuk, majd a kémcsöveket 10—15 napon keresztül 25°C-on inkubáljuk. Az idő elteltével a micélium dús, a spóraképződés gazdag. Egy ferde agar desztillált vízzel végzett lemosása utján kapott spóraszuszpenziót öt Erlenmeyer-lombik oltására használunk fel; mindegyik lombik 500 ml térfogatú, és 100 ml oltótenyészet-közeget tartalmaz. Az öt lombik helyett 5 literes szívópalackot is beolthatunk, amely 1 liter közeget tartalmaz.

Oltótenyészet-közeg összetétele

glükóz	15,0 g
szójaliszt	15,0 g
kukoricalekvár	5,0 g
CaCO3	2,0 g
NaCl	5,0 g
desztillált víz	1 liter
PH	7,0
Az 500 ml-es	Erlenmeyer-lombikokba

100—100 ml-t, az 5 literes palackokba 1 — 1 litert töltünk, majd az edényeket l2l°C-on 30 percen át sterilizáljuk. Lehűlés után a közeget spóra-szuszpenzióval oltjuk, majd 240 perc^-1 frekvenciájú rotációs rázógépen (amelynek kilengése 3,8 cm = 1,5 hüvelyk) 30°C-on 72 órán keresztül rázzuk. A kapott tenyészetet arra használjuk fel, hogy az oltótenyészet második lépésének előállítása érdekében két db. 15 literes üvegfermentorban lévő 10—10 liter fenti összetételű közeget beoltunk, 8—10 tf% tenyészetet alkalmazva a közeg térfogatára számítva. Az üvegfermentoros tenyészeteket 27°C-on (± 1°C)

160—180 perc^-1 fordulatszámmal végzett keverés közben 6—7 liter/perc térfogatú levegőztetés mellett 24 órán át fermentáljuk. Az oltótenyészet dúsan növekedett második lépését a termelő közeg oltására alkalmazzuk.

A termelő közeg összetétele

glükóz	15,0 g
oldható keményítő	20,0 g
szójaliszt	3,0 g
pepton	3,0 g
CaCO3	2,0 g
NaCl	2,0 g
kukoricalekvár	2,0 g
(NH4)2SO4	0,5 g
desztillált víz	1 liter
PH	7,tP
A fermentorba 0,025 tf%	desmophem }

habzásgátlót is adagolunk.

-8197772

A fenti összetételű közeg 280 l-jét 390 liter térfogatú fermentorba töltjük és 28 percen keresztül direkt és indirekt gőzzel 121°Con sterilezzük. A fermentort hűtjük, majd az oitótenyészet második lépésének 7 tf%-nyi mennyiségével oltjuk. A fermentor tartalmát 27°C ± l°C-on 100—120 perc^-1 fordulatszámú keverővei végzett keverés mellett 40— 44 órán keresztül fermentáljuk, a levegőzteneoviridogrizen *

I II III IV

0,02 2 0,01 95,6 tés 170 liter/perc. 40—44 óra fermentálás után az antibiotikum-koncentráció 40—60 mg/ /1, és a tenyészlé pH-értéke 6,5—7,0.

A tenyészetet centrifugáljuk, micélium 5 és szürlet külön kerül feldolgozásra a mellékelt I. szemléltető tábla szerint. A kinyert antibiotikumok hozzávetőleges összetétele (százalékban) az alábbi:

grividomicin^* grizeoviridin

I II III

0,07 0,1 0,2 2,0 * Az I-IV. neoviridogrizein fizikai állandóit a példaresz végén közöljük. ** A grividomicin I, II, III fizikai állandói a leíró részben megadottak.

Az I-, II- és Ill-grividomicin homogenitását Kieselgélen 7,5% metanolt tartalmazó kloroformmal készített vékonyréteg-kromatogramjuk alapján, valamint nagynyomású folyadékkromatgráfiás módszerrel (LiChrosorb^(K) RP-18, acetonitril:25 mmólos ammónium-acetát:ecetsav = 150:100:3) vizsgáljuk.

3. példa

Streptomyces sp. Y-8240155 fermentálása antibiotikum komplex előállítása céljából

A 2. példa szerint járunk el azzal a különbséggel, hogy az alábbi tápközegeket alkalmazzuk.

Az agar táptalaj összetétele oldható keményítő 10 0 g

K₂HPO₄ 1,0 g

MgSO₄.7H₂O 1,0 g

NaCl 1,0 g (NH₄)₂SO₄ 2,0 g

CaCO₃ 2,0 g

FeSO₄.7H₂O 0,1 mg

MnCl₂.4H₂O 0,1 mg

ZnSO₄.7H₂O 0,1 mg agar 15,0 g desztillált víz 1 liter pH „ 7,2

A termelő közeg összetétele glükóz 20,0 g szójaliszt 10,0 g

CaCO₃ 0,2 g

COC1₂.6H₂O 0,1 mg desztillált víz 1 liter

PH 7,0

Az oltóanyag tápközegének összetétele

keményítő	20,0 g
szójaliszt	25,0 g
glükóz	5,0 g
k2hpo4	·,θ g
MgSO4.7H2O	0,5 g
pepton	1,0 g
CaCl2	3,0 g
NaCl	3,0 g
desztillált víz	1 liter
pH	7,0
A termelő közeg összetétele
dextrin	20,0 g
szójaliszt	10,0 g
élesztőkivonat	1,0 g
FeSO4.7H2O	0,1 g
desztillált víz	1 liter
PH	7,0

A fermentálás végén (44—48 óra) az antibiotikum-koncentráció 40—60 mg/1, a tenyészlé pH-ja 6,8 és a micélium mennyisége (nedvesen) 8 tf%. A micéliumot centrifugálással elválasztjuk. A feldolgozás a csatolt II. szemléltető tábla szerint történik.

Az antibiotikum-komplex összetétele az alábbi:

leoviridogrizeinek II IV 0,1% 90,2%

A. komplexben sem III-neoviridogrizein grividomicinek I II III

0,3 3,3% 6,1% grizeoviridin, sem I- és nem volt kimutatható.

A tenyészetet 40—44 órán át fermentáljuk. A feldolgozást a 2. példa szerint végezzük.

4. példa

A 2. példa szerint járunk el, az alábbi eltérésekkel.

5. példa

IV-NVG és I-, II- és Ill-grividomicin 95:5 arányú antibiotikum-keverékét etetési kísérlet keretében 180 db hímnemű naposcsibénél ⁶⁰ alkalmaztuk. A csibék egynaposak voltak, átlagos kezdeti tömegük 39,6 g volt. öt csoportot képeztünk, mindegyikben 36 csibével. Az etetést kísérletet 42 napon át folytattuk, az eredményeket az alábbi táblázatban ad65 juk meg.

-9197772

18

Kezelés	ppm	tömegnövekedés	tapfelvétel értékesítés
g	%	g	%	%
kontrol		1354	100	2903	100	100
IV-NVG: grividomicin keveréke	5	1399	103,4	2817	97,0	93,9
IV-NVG: grividomicin keveréke	10	1361	100,6	2759	95,0	94,5
IV-NVG: grividomicin	20	1410	104, 1	2853	98,0	94,4

6. példa

A kísérlethez porlasztva szárított tenyészlét használtunk, amely 0,2% antibiotikum-komplexet tartalmazott (azaz 2 g/kg). A komplex összetétele: IV-NVG:grividomicin:

II-NVG=96:3:1. Az etetési kísérletet az 5. pél20 dában leírtak szerint végeztük, az alábbi eltérésekkel: 160 hímnemű naposcsibét 5 csoportba osztottuk, kezdeti átlagtömegük 37,2 g volt.

Kezelés	ppm	tömegnövekedé s	tápf elvétel	értékesítés %
g	%	g	%
kontrol		1355	100	2558	100	100
IV-NVG:
grividomicin:	II-NVG
keveréke	5	1448	106,9	2734	106,9	100
IV-NVG:
grividomicin:	II-NVG
kevereke	10	1441	106,4	2683	104.9	98,6
IV-NVG:
grividomicin:	II-NVG
keveréke	20	1452	107,2	2724	106,5	99,4

Neoviridogrizein 1

Fehér por, vízben nehezen oldódó, op.: 143°C [a]p³= +13° (c=l, metanol)

UV_müX 305 nm (metanolban)

Neoviridogrizein II

Fehér por, vízben nehezen oldódó, op.: 145°C, [a] ²³ =—39,3°C (c=l, metanol)

UV_max 305 nm (metanol), 340 nm (0,1 n NaOH-metanol)

Neoviridogrizein III

Fehér por, vízben nehezen oldódó, op.: 152°C [a]²³= -(-73,7° (c=l, metanol)

UV_max305nm (metanol), 340 nm (0,1 n NaOHmétanol)

Neoviridogrizein IV (etamicin) hidroklorid-sója op.: 163—170°C

-10197772

I. szemléltet® tábla

A tenyészet szürlete

Micélium

1. pH beállítása 6,5-re

2. etil-acetáttal extrahálni

3. oldápzer ledes.zt illálása csökkentett nyomáson feldúsított ext raktum

1. acetonnal extrahálni

2. betöményiteni

3. vízzel végzett hígítás

4. pH beállítása 6,5-re

5. extrahálás etilacetáttal

6. oldószer ledesztillálása csökkentett nyemásen feldúsított ext raktum nyers antibiotikum-komplex z\

1-2 % metanol kloroformban

I

I-, II-, III-, IV-neoviridogrizin és egyéb antibiotikumok

Flash-oszlop kromatográfia (Kieselgél)

2-160 % metanol kloroformban

Flash-oszlop kromatográfia (Kieselgél)

1-2 % Metanol kló ro fo rmba π

I-, /ΐ-, III- és IVneovi ri dogrizei n

Sephadex^^R^-LH-20 kromatográfia, kloroform és metanol 1:1

I-, II-, III- és IVneovi ridog rizei n (kloroform/hexánból kristályosítva) (60 mg/1)

2-100 % metanol kloroformban

I-, II- és III-grividomicin és grizeoviridin (1,5 mg/liter) középnyomású folyadékkromatográ fia (Kieselgél) % metanol etil-acetátban

I- és II-grividomicin III-grividomicin grizeoviridin

1. kromatográfia K^eselgélen (30/U)

2. eluálás CHCljCHC1 :MeOH (96:4)

I-g rividomicin

II-grividomicin

-11197772

-21 22

II·. szemléltető tábla

A tenyészet szürlete (180 1) Micélium (11 kg)

2x20 1 vízzel mosni —--j---mosó folyadék diaion HP-20 kromatográ fia

1. víz (10 liter)

2. 2M NaCl-oldat (20 liter)

3. víz (20 liter)

4. 25 % vizes aceton (20 liter)

5. eluálás tiszta acetonnal (30 liter)

6. az eluátum betöményitése ,, vákuumban feldúsított antibiotikum-komplex (49 g)

1. oldás kloroformban , 2. kicsapás petroléterrel zsirmeritesitett antibiotikum-komplex (16,5 g) kromatográfálás (Kieselgél) eluálás CHC1 CHCl_:Me0H (95:5) ^ó

IV-NVG (4,48 g) IV-NVG + + II-NVG nyomokban I-, II- és III-grividomicin

kromatografálás Kieselgélen (30^.u) eluálás CHC1 CHC1 _:MeOH (96:4) ^{5 5}

IV-NVG I-grividomicin II-grividomicin III-grividomicin (5,546 g) (34 mg) (0,36 g) (0,69 g)

Claims (4)

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás antibiotikum-komplex és kívánt esetben komponenseinek, az (la) képletű diasztereomer 1- és II-grividomicin, (Ib) képletű Ill-grividomicin, II- és IV-neoviridogrizein és adott esetben grizeoviridin, valamint I- és Ill-neoviridogrizein előállítására, azzal jellemezve, hogy a Streptomyces sp. DSM 3640 törzset vagy valamely mutánsát vagy variánsát 20°C és 40°C közötti hőmérsékleten 6,5—8,5 pH érték mellett, szénforrást és nitrogénforrást, szervetlen tápsókat és nyomelemeket tartalmazó tápközegben aerob körülmények között fermentáljuk, majd a fermentációs terméket ismert módon a tenyészetből elválasztjuk, és kívánt esetben a tárgyi kör szerinti antibiotikum-komponenseket szétválasztjuk.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a mikroorganizmust 6,5 és 7,0 közötti pH mellett 25—35°C-on 40—50 órán át fermentáljuk.

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tenyészet szurletét 4,5— 7,5 közötti pH érték mellett vízzel nem elegyedő szerves oldószerrel extraháljuk, a mi5 céliumot acetonnal, majd acetonos extraktumot 4,5 és 7,5 közötti pH mellett vízzel nem elegyedő oldószerrel extraháljuk, és az egyesített extraktumokat feldolgozzuk.

4. Eljárás (la) képletű I- és Il-grividomi10 eint, (Ib) képletű III-grividomicint, IV-neoviridogrizeint, II-neoviridogrizeint és adott esetben grizeoviridint, I- és Ill-neoviridogrizeint tartalmazó takarmányadalékek előállítására, azzal jellemezve, hogy a Strepto15 myces sp. DSM 3640 törzset vagy valamely mutánsát vagy variánsát 20°C és 40°C közötti hőmérsékleten 6,5—8,5 pH-érték mellett, szénforrást és nitrogénforrást, szervetlen tápsókat és nyomelemeket tartalmazó táp20 közegben aerob körülmények között fermentáljuk, majd a tenyészléből elkülönített és szárított micéliumot vagy a tenyészléből elkülönített antibiotikum-komplexet a szokásos hordozó- és segédanyagokkal összekever25 ve takarmányadalékká alakítjuk.