PT839026E - Composicoes micelares de copolimero de blocos de polieter para o direccionamento de agentes biologicos - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "COMPOSIÇÕES MICELARES DE COPOLÍMERO DE BLOCOS DE POLIÉTER PARA O DIRECCIONAMENTO DE AGENTES BIOLÓGICOS" A presente invenção refere-se a melhoramentos em composições farmacêuticas para utilização no direccionamento de agentes biológicos para um tecido particular e a composições que são úteis para administração de agentes biológicos ao cérebro. 0 cérebro é isolado do sangue circulatório porque as células endoteliais que revestem os vasos sanguíneos no cérebro são mais selectivas do que é noutras partes do corpo com respeito a moléculas que são permitidas difundir no espaço intersticial do cérebro. 0 mecanismo que isola o cérebro é frequentemente referido como uma "barreira sangue-cérebro". Como um resultado da barreira sangue-cérebro, os agentes biológicos que se pretendem afectar o cérebro ou uma doença no cérebro têm que ser frequentemente administrados numa dosagem elevada para compensar a barreira de difusão proporcionada pela barreira sangue-cérebro. Os animais aos quais foram administradas doses elevadas estão em risco de experimentarem efeitos colaterais tóxicos ou outros. É assim desejável promover a permeabilidade de agentes quimioterapêuticos através da barreira sangue-cérebro. Ver, Goodman's and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Oitava Edição, pag. 11.

No cérebro e noutros tecidos é frequentemente desejável direccionar um agente biológico para um tecido particular no qual se prevê que o agente actue beneficamente. Este desejo é particularmente verdadeiro para agentes quimioterapêuticos que possuem potencialmente grandes efeitos tóxicos em tecidos não alvo. Por exemplo, a maior parte dos agentes quimioterapêuticos anti-cancro funcionam por envenenamento selectivo de células em replicação. Este mecanismo atinge inevitavelmente as células em replicação rápida, tais como as da medula óssea que dão origem a

um número de importantes células sanguíneas. Se a biodistribuição ϋυ fáraiaco quimioterapêutico é alterada de modo a que concentrações úteis sejam mantidas no tecido canceroso ou no tecido em que o cancro reside enquanto que concentrações à distância do sítio do cancro são reduzidas, o âmbito dos efeitos tóxicos colaterais é qeralmente reduzido.

Adicionalmente, uma vez que cancro, e outros agentes biológicos e antimicrobianos exibem toxicidades, deve ser benéfico se as dosagens forem diminuídas sem afectar adversamente o índice terapêutico.

Os tumores do sistema nervoso central apresentam um desafio terapêutico particularmente difícil. Tais tumores são frequentemente difíceis de excisar cirurgicamente e a excisão cirúrgica pode ter consequências inaceitáveis. Estes tumores podem ser difíceis de tratar com radiação uma vez que são por vezes difíceis de localizar com precisão e estão frequentemente muito próximos de tecidos que são críticos para o bem estar do paciente com o tumor. Tais tumores não podem ser eficazmente tratados por quimioterapias convencionais uma vez que a fracção do agente quimioterapêutico administrado que atingirá o tumor será muito pequena. A dosagem eficaz num tumor não pode ser aumentada por administração de dosagens elevadas ao doente, uma vez que as dosagens convencionais estão geralmente próximas das doses que causam efeitos colaterais inaceitáveis. A W094/08564 descreve uma composição farmacêutica compreendendo um agente anti-neoplásico em micelas de pelo menos um copolímero de blocos de poli(oxietileno)-poli(oxipropileno). A WO95/03829 descreve composições farmacêuticas contendo uma emulsão óleo/água em que é dissolvido, solubilizado ou disperso um fármaco dentro das gotas de óleo que cotão revestidas com anticorpos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Numa realização, a invenção proporciona uma composição 2

u farmacêutica compreendendo: (a) um agente biológico; (b) um copolimero de blocos de poliéter compreendendo um segmento polimérico linear do tipo A ligado numa extremidade com um segmento polimérico linear do tipo B, em que o segmento do tipo A é de carácter relativamente hidrofilico e o segmento do tipo B é de carácter relativamente hidrofóbico; e (c) uma parte de direccionamento acoplada a uma parte lipofilica compreendendo um hidrocarboneto possuindo de 3 a 41 átomos de carbono, mais preferencialmente um hidrocarboneto possuindo de 5 a 25 átomos de carbono, ainda mais preferencialmente, um hidrocarboneto possuindo de 9 a 17 átomos de carbono, e em que a referida composição forma uma micela.

Numa primeira realização preferida, o copolimero de blocos de poliéter é seleccionado do grupo consistindo em polímeros de fórmulas A-B-A' , A-B, B-A-B' , ou MR1) (R2) (R3) (R4) (D (II) (III) (IV) em que A e A' são segmentos poliméricos lineares do tipo A, B e B' são segmentos poliméricos lineares do tipo B, e R1, R2, R3 e R4 são copolímeros de blocos de fórmulas (I), (II) ou (III) ou hidrogénio e L é um grupo de ligação L, com a condição de que não mais do que dois dos R1, R2, R3 ou R4 sejam hidrogénio.

Numa realização preferida, a composição é adaptada para incluir micelas compostas pelo copolimero de bloco ou para formar micelas compostas por copolímeros de bloco durante o processo de administração ou subsequente a estes. Preferencialmente, pelo menos 0,1% do agente biológico é incorporado nas micelas, mais preferencialmente, pelo menos 1% do agente biológico, e ainda mais preferencialmente, pelo menos 5% do agente biológico.

Numa realização preferida, a percentagem hidrófoba do copolimero da composição é pelo menos 50%, mais preferencialmente pelo menos 60%, ainda mais preferencialmente 3 70%.

Numa outra realização preferida, o peso hidrófobo do copolimero é pelo menos 900, mais preferencialmente, pelo menos 1700, ainda mais preferencialmente pelo menos 2000, ainda mais preferencialmente pelo menos 2300.

Em outras realizações preferidas, o peso hidrófoho é pelo menos 2000 e a percentagem hidrófoba é pelo menos 20%, preferencialmente 35%, ou o peso hidrófobo é pelo menos 2300 e a percentagem hidrófoba é pelo menos 20%, preferencialmente 35%.

Ainda noutra realização preferida, o copolimero ou copolimeros da composição possuem uma concentração micelar critica ("CMC") de não mais do que 0,5% peso/volume a 37°C numa solução aquosa isotónica, preferencialmente, não mais do que 0,05% peso/volume, mais preferencialmente, não mais do que 0,01% peso/volume, ainda mais preferencialmente, não mais do que 0,003% peso/volume.

Preferencialmente, os copolimeros da composição são conforme a Fórmula (V) , que é apresentada no texto abaixo. Particularmente preferidos entre estes copolimeros estão aqueles que possuem pesos hidrófobos entre 1500 e 2000, preferencialmente entre 1710 e 1780, e percentagens de hidrofobia entre 85% e 95%, preferencialmente entre 88% e 92%. Também particularmente preferidos entre estes copolimeros estão aqueles que possuem pesos hidrófobos entre 3000 e 3500, preferencialmente entre 3200 e 3300, e percentagens de hidrofobia entre 15% e 25%, preferencialmente entre 18% e 22%. Adicionalmente, particularmente preferidos entre estes polímeros estão aqueles que possuem pesos hidrófobos entre 3500 e 4000, preferencialmente entre 3700 e 3800, e percentagens de hidrofobia entre 25% c 35%, prcfcrencialmente entre 20% e 32%.

Numa realização preferida, o agente biológico da composição é um agente que afecta a função do cérebro ou trata ou previne a doença do cérebro.

Numa segunda realização, a invenção proporciona uma 4 \ι composição farmacêutica compreendendo um agente biológico solubilizado em micelas poliméricas tendo associada a eias uma parte de direccionamento acoplada a uma parte lipofilica compreendendo hidrocarboneto possuindo desde 3 a 41 átomos de carbono, mais preferencialmente um hidrocarboneto possuindo de 5 a 25 átomos de carbono, ainda mais grafarem ri a 1mentp um hidrocarboneto possuindo de 9 até 17 átomos de carbono.

Noutra realização, a invenção proporciona um método para direccionar um agente biológico para um tecido pré-seleccionado. 0 método compreende administrar a composição acima descrita, em que a parte de direccionamento é seleccionada para atingir o tecido, para um animal que possua o tecido pré-seleccionado.

Ainda noutra realização, a invenção proporciona um método para tratar uma doença microbiana ou um tumor do cérebro através da administração de uma composição compreendendo: (a) um agente quimioterapêutico; e (b) um copolimero de blocos de poliéter compreendendo um segmento polimérico linear do tipo A ligado numa extremidade a um segmento polimérico linear do tipo B, em que o segmento do tipo A é de carácter relativamente hidrofilico, cujas unidades de repetição contribuem com uma constante de fragmento média de Hansch-Leo de -0,4 ou menos e possuem contribuições para o peso molecular entre 30 e 500, em que o segmento do tipo B é de carácter relativamente hidrofóbico, cujas unidades de repetição contribuem com uma constante de fragmento médio de Hansch-Leo de -0,4 ou mais e possuem contribuições para o peso molecular entre 30 e 500, em que pelo menos 80% das ligações que unem as unidades de repetição para cada um dos segmentos poliméricos compreendem uma ligação éter. Numa realização preferida, a composição utilizada nosta realização incluirá uma molécula alvo.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS 5

I

As Figs. IA e 1B apresentam a inibição de células MCF7 resistentes à doxorrubicina incubadas com várias concentrações de doxorrubicina e Pluronic L61.

DEFINIÇÕES

DESCRIÇÃO DETALHADA

Os termos ou frases listadas abaixo têm o seguinte significado: • agente biológico um agente biológico que é útil para diagnosticar ou realizar processamento de imagem ou que pode actuar numa célula, órgão ou organismo, incluindo mas não estando limitado a fármacos (produtos farmacêuticos) para criar uma alteração no funcionamento da célula, órgão ou organismo. Esses agentes podem incluir, mas não estão limitados a ácidos nucleicos, polinucleótidos, agentes anti-bacterianos, agentes anti-virais, agentes anti-fúngicos, agentes anti-parasitas, tumoricidas ou agentes anti-cancro, proteínas, toxinas, enzimas, hormonas, neurotransmissores, glicoproteinas, imunoglobulinas, imunomoduladores, corantes, marcadores radioactivos, compostos rádio-opacos, compostos fluorescentes, polissacáridos, moléculas de ligação de receptores celulares, anti-inflamatórios, agentes anti-glaucomas, compostos modriáticos e anestésicos locais. 6 agentes do sistema agentes biológicos que actuam nas células nervoso central do sistema nervoso central ou em doenças do sistema nervoso central. agente quimiotera- um agente biológico que inibe o pêutico crescimento ou diminui a sobrevivência de células neoplásicas ou microbianas patogénicas ou inibe a propagação (que inclui sem limitação replicação, formação do virus ou infecção celular) de um virus. percentagem a percentagem do peso molecular de um co- de hidrofobia polímero de bloco que é constituído por blocos do tipo B. peso hidrófobo a contribuição do peso molecular de um copolímero de bloco de blocos do tipo B. IC50 a concentração à qual é obtida 50% de ci-totoxicidade. A citotoxicidade pode ser medida através do método de Alley et al., Câncer Res., 48:589-601, 1988 ou Scudiero et al., Câncer Res. 48:4827, 1988. Em particular, pode ser medida com base na concentração de fármaco à qual se observa uma redução de 50% na actividade das enzimas mitocondriais. parte lipofilica um substituinte lipofílico que é unido a uma parte de direccionamento e que se partilha na porção lipofilica de micelas de copolímero.

• micróbio

• parte de direccionamento

uma bactéria, micoplasma, levedura ou fungo, vírus ou parasita (tal como um parasita da malária). uma estrutura molecular que é reconhecida por um tecido celular, componente virai ou de substrato tal como um receptor de superfície celular ou molécula aceitadora.

Deve entender-se que as características do copolímero descritas abaixo são adequadas para as composições tanto das realizações de direccionamento da invenção como das realizações de quimioterapia cerebral da invenção.

Crê-se que o mecanismo através do qual a barreira sangue-cérebro funciona seja substancialmente semelhante ao mecanismo através do qual muitas células se tornam resistentes à acção de agentes biológicos. Crê-se que ambos os mecanismos utilizem as proteínas da bomba de membrana que pertencem à família de proteínas da glicoproteína P. Ver, por exemplo, Tatsuta et al., J. Biol. Chem. 267: 20383-20391, e Goldstein et al., Câncer

Treatment Res. 57:101-119. Crê-se que estas bombas actuem através da exportação de agentes biológicos que se difundem numa célula, tal como as células endoteliais que forram os vasos sanguíneos no cérebro. Observações recentes descritas em maior detalhe na Patente U.S. No. 5 817 321, denominada "Composições de Agentes Biológicos", ficheiro de agente No. 313257-104-B, aqui arquivado concorrentemente em 7 de Junho de 1995, demonstram a eficácia dos copolímeros de bloco da invenção no aumento da potência de fármacos quimioterapêuticos e que a reversão da resistência a fármacos está altamente dependente (a) da percentagem de hidrofobia e (b) do peso hidrófobo. A eficiência aumenta ou com um aumento da percentagem (a) ou um aumento do peso (b) , ou ambos. Este aumento da percentagem de hidrofobia e do peso hidrófobo também se correlaciona com as 8 propriedades da formação melhorada de micelas em que a formação das micelas para estes copolimeros ocorre a concentrações mais baixas. Ver, Hurter et al., Macromolecules 26: 5030, 1993; Hurter et al., Macromolecules 26: 5592, 1993; Alexandris et al., Macromolecules 27: 2414, 1994. Embora sem desejar ficar limitado por uma teoria particular, crê-se que essa formação de micelas sirva como um substituto para a medição das propriedades fisicas que conduzem a propriedades melhoradas de distribuição de agente biológico.

Se quando se utiliza doxorrubicina como um agente de modelo biológico, a razão entre (a) a IC50 (uma medida de concentração de citotoxicidade eficaz) para uma composição contendo copolimero e (b) a IC50 para doxorrubicina livre for representada graficamente contra a concentração do copolimero, o gráfico é bifásico, com uma diminuição rápida na razão à medida que as concentrações do copolimero aumentam, mas permanece sob a CMC do copolimero. Acima da CMC é observado um rápido equilíbrio da razão. Ver Figura IA. 0 aumento máximo da actividade do agente biológico ocorre acima da CMC, embora o aumento da actividade se observe a concentrações, para o copolimero Pluronic L61, tão baixas quanto 0,0001% p/v, ou mais baixas. Também se crê que a forma micelar seja importante para a utilização de copolimeros na distribuição de fármacos por outras razões, como será discutido abaixo. A representação esquemática abaixo é útil para se entender a relação entre a percentagem do hidrófobo e o peso do hidrófobo de um copolimero e vários aspectos da presente invenção. Na representação esquemática, o peso do hidrófobo (poli(oxipropileno)) e do copolimero são apresentados dircctamente sob cada copolimero identificado. Estão adjacentes a estes valores os valores de percentagem de hidrófobo para cada copolimero.

[aumento do

Pluronic L61

Pluronic F68 hidrófobo em %] 1450/8800 = 20% [aumento do peso hidrófobo] 1450/1950 = 90%

T

Pluronic F108 3250/16200 = 20%

Pluronic P85 2260/4500 = 50%

Foi determinado que o Pluronic F68 possui apenas uma actividade modesta no aumento da potência dos agentes biológicos. O Pluronic L61, que possui o mesmo peso hidrófobo que o Pluronic F68 mas uma percentagem de hidrófobo muito superior, é geralmente o mais eficaz dos copolimeros de bloco identificados na representação esquemática. O Pluronic F108, que possui a mesma percentagem hidrófoba do que o Pluronic F68 mas um peso hidrófobo muito superior é também um copolimero eficaz, embora muito menos eficaz do que o Pluronic L61. O Pluronic P85 possui um peso hidrófobo superior e uma percentagem hidrófoba maior do que o Pluronic F68, mas a diferença em cada valor é menor do que para os Pluronics F108 e L61, respectivamente. A eficiência do Pluronic P85 no aumento da potência dos agentes biológicos é intermédia entre as eficácias de Pluronic F108 e de Pluronic L61. Esta3 diferenças em eficiência são exemplificadas quando vários copolimeros, a uma concentração acima de CMC, e a doxorrubicina são incubados in vitro com células resistentes ao fármaco. A razão do valor de IC50 para a doxorrubicina na ausência do copolimero em relação à razão na presença de ! W. copolímero é o "índice de reversão de resistência". Os valores do índice de reversão de resistência para vários copolimeros são: índice de reversão de resistência n. a. IC50, ng/mL 60 000 60 000 10 000 2 000 60

Formulação de doxorrubicina Fármaco livre +5% (p/v) Pluronic F68 0,01% (p/v) Pluronic F108 0,01% (p/v) Pluronic P85 0,01% (p/v) Pluronic L61 A importância da forma micelar na distribuição de agentes biológicos é também revelada em experiências in vivo. Na forma micelar, os agentes biológicos estão localizados no núcleo hidrofóbico das micelas, assim mascarados pela capa hidrofílica (composta de segmentos do tipo A) que rodeia as micelas. Esta máscara diminui as interacções com o fígado, proteínas do plasma, outros tecidos não alvo e outras moléculas que se podem ligar ou inactivar o agente ou converter o agente num metabolito tóxico. Por exemplo, o metabolismo rápido de antibióticos de antraciclina pelo fígado conduz à formação de metabolitos cardiotóxicos que são modificados na posição C13. Ver, Mushlin et al., Br. J. Pharmacol. 110: 975-982, 1993. Utilizando a doxorrubicina como um modelo de fármaco, a forma micelar diminui o processamento pelo fígado, diminuiu a conversão em doxorrubicinol e diminui a velocidade a que a concentração de doxorrubicina no sangue diminui. A eficiência de copolimeros na (a) formação de micelas (em que a maior eficiência é medida em CMCs reduzidas) e no (b) tavorecimento de separação de vários agentes biológicos na forma micelar em vez de na forma livre de vários agentes biológicos aumenta de acordo com o mesmo padrão. Assim, a hierarquia da eficiência é novamente L61 > P85 > F108 » F68. Crê-se que a presença de micelas a concentrações mais baixas ajude a 11

assegurar, assumindo que o agente biológico permanece associado com as micelas, que o agente biológico e o copolimero atingem um tecido alvo em simultâneo. Os coeficientes de separação que favorecem a forma micelar ajudam a assegurar que o pressuposto de que o agente biológico permanece associado com as micelas se revele verdadeiro. Também se crê que a forma micelar do agente biológico proteja o agente biológico de ser absorvido por tecidos não alvo, cujos tecidos possam metabolizar o agente biológico num metabolito ineficaz ou tóxico, e da adsorção não especifica a componentes do sangue, componentes celulares e afins. A concentrações elevadas, os copolimeros de bloco podem ser tóxicos para as células do fígado, rins ou outras de um sujeito. Ver, BASF Corp. , Pluronic Material Safety Data Sheet and Drug Master Files. A toxicidade dos copolimeros de bloco aumenta com os parâmetros de hidrofobicidade dos copolimeros de bloco de acordo com o mesmo padrão observado para aumentos na eficiência em potencializar agentes biológicos. Felizmente, a taxa de aumento de potência à medida que estes parâmetros se alteram é muito maior do que o aumento da toxicidade do copolimero. Por exemplo, como ilustrado no Exemplo 20, a LD50 de L61 em murganhos BALB/c é 10 vezes mais baixa do que a LD50 de Pluronic F108. Contudo, a diferença na dosagem terapêutica óptima é melhorada em mais do que 100 vezes para Pluronic L61 vs. Pluronic F108. (Ver Exemplo 14). Assim, o intervalo de concentração no qual a eficiência em potencializar a actividade de um agente biológico pode ser mantida ao mesmo tempo que se evita a toxicidade devido ao copolimero ser aumentado para Pluronic L61 vs. Pluronic F108.

Sem desejar estar ligado a uma teoria particular, crê-se que as composições da invenção reveiLem mecanismos de efluxo mediados por membros da família da glicoproteína P e de outros mecanismos de resistência a fármacos.

As composições da invenção pretendem incluir ou micelas pré-formadas com uma porção substancial do agente biológico 12 ít~ Λ,

T incorporada, ou composições de copolimero que formam micelas com uma porção substancial do agente nelas dissolvido durante o curso da administração do agente biológico a um doente, ou subsequente a este. Para a realização de direccionamento da invenção, a parte de direccionamento ou estará pré-associada a micelas OU será associada a mirei as durante o curso da administração. Blocos particularmente preferidos são aqueles que possuem valores de CMC baixos em soluções isotónicas a temperaturas fisiológicas. Esses copolimeros de bloco mantêm um veiculo de distribuição micelar para agentes biológicos mesmo após diluição substancial num fluido fisiológico tal como o sangue de um sujeito sob tratamento. Esses valores baixos de CMC permitem a utilização de níveis reduzidos de copolimeros de bloco na composição do fármaco da invenção. A invenção é descrita abaixo em relação às constantes de fragmento desenvolvidos por Hansch e Leo. Ver Hansch e Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, Wiley, Nova Iorque, 1979; James, Solubility and Related Properties, Mareei Dekker, Nova Iorque, 1986, pp. 320-325. Estas constantes foram desenvolvidas para utilização na estimativa da contribuição de uma porção de uma molécula para a tendência de uma molécula para se separar entre as fases formadas por misturas de octanol-água. Estas constantes são geralmente referidas como as constantes de separação de fragmentos de Hansch-Leo (de aqui em diante referidas como "constantes de fragmentos de Hansch-Leo"). A revelação completa da Patente U.S. No. 5 817 321, intitulada "Composições de um Agente Biológico", Ficheiro de Agente No. 313257-104-B, arquivado aqui conjuntamente no dia 7 de Junho de 1995 é referida como a revelação completa do Pedido de Patente U.S. No. 08/054 403, arquivada em 28 de Abril de 1993. O número de unidades de repetição dos blocos hidrofílicos totais (tipo A) ou dos blocos hidrofóbicos totais (tipo B) para 13 ί__Ij um copolimero de poliéter estão preferencialmente entre 4 e 400. Mdia preferencialmente, o número de unidades de repetição esta entre 4 e 200, ainda mais preferencialmente, entre 5 e 80. As unidades de repetição que compreendem os blocos, para blocos do tipo A e do tipo B possuem geralmente um peso molecular entre 30 e 500, preferencialmente entre 30 e 100, ainda mais preferencialmente entre 30 e 60. Geralmente, em cada um dos blocos de tipo A ou de tipo B, pelo menos 80% das ligações entre as unidades de repetição são ligações éter, preferencialmente, pelo menos 90% são ligações éter, mais preferencialmente, pelo menos 95% são ligações éter. As ligações éter, para os objectivos desta aplicação, compreendem ligações glicosidicas (i.e., ligações de açúcar). Contudo, num aspecto, são preferidas ligações éter simples.

Preferencialmente, todas as unidades de repetição que compreendem blocos do tipo A possuem uma constante de fragmentos de Hansch-Leo de menos do que -0,4, mais preferencialmente, menos do que -0,5, ainda mais preferencialmente, menos do que -0,7. Preferencialmente, todas as unidades de repetição que compreendem blocos do tipo B possuem uma constante de fragmento de Hansch-Leo de -0,30 ou mais, mais preferencialmente -0,20 ou mais.

Os polímeros de acordo com a primeira realização da invenção são exemplificados pelos copolímeros de bloco possuindo as fórmulas: CH3

HO -ch2ch2o -CHCH20 -ch2ch2o

x L

Jy L 14 (V) CHi

HO

HO -CH2CH20

X L (VI) -chch2o CHi -CHCH20 -ch2ch2o

x L (VII)

|- η r R1 R Ί och2ch2 | | OCHCH _ i L J

r _ (VIII) H OCK2CK2 i OCHCH !i L L R F? J nch2ch2n

I ji li

-H ch3

-chch2o rRl r2 1 1 1 CHCHO CH2CH20 j CHCHO CH2CH20 li 12 Lr1 r2 J j - em que x, y, z, i e j possuem valores consistentes com os parâmetros para copolímeros de poliéter descritos acima, e em que para cada par R1, R2, um é hidrogénio e o outro é um grupo metilo. As fórmulas (V) a (VII) estão sobre-simplifiçadas na medida em que, na prática, a orientação dos radicais de isopropileno no bloco B é aleatória. Esta orientação aleatória está indicada na fórmula (VIII), que está mais completa. Esses compostos de poli (oxietileno)-poli(oxipropileno) foram descritos por Santom, Am. Perfumer Cosmet. 72(4):54-58 (1958); Schmolka, Loc. cit. 82(7):25-30 (1967); Non-ionic Surfactants, Schick, ed. (Dekker, NY, 1967), pp. 300-371. Um número desses compostos está disponível comercialmente com os seus nomes de marca genéricos 15 1 \ι como "poloxamers", "pluronics" e "synperonics". Os polímeros de Pluronic com a fórmula B-A-B são frequentemente referidos como pluronics "revertidos", "pluronicR" ou "meroxapol". 0 polímero "polioxamina" de fórmula (VIII) está disponível a partir da BASF (Wyandotte, MI) sob o nome comercial de Tetronic™. A ordem dos blocos de polioxietileno e de polioxipropileno representada na fórmula (VIII) pode ser invertida, criando o Tetronic R™, também disponível a partir da BASF. Ver, Schmolka, J. Am. Oil Soc., 59:110 (1979). Os copolímeros de blocos de polioxipropileno- polioxietileno também podem ser concebidos com blocos hidrofílicos compreendendo uma mistura aleatória de unidades de repetição de óxido de etileno e de óxido de propileno. Para manter o carácter hidrofílico do bloco, o óxido de etileno deve predominar. De modo semelhante, o bloco hidrofóbico pode ser uma mistura de unidades de repetição de óxido de etileno e de óxido de propileno. Esses copolímeros de bloco estão disponíveis a partir da BASF sob o nome comercial de Pluradot™. São concebidos uma variedade de pluronics para respeitar a seguinte fórmula: #) ch3 — - - HO- ch2ch2o chch2o ch2ch2o _ _ _ J m/2 n m/2 (IX)

Certamente que o técnico da especialidade reconhecerá que os valores de m e de n representam normalmente uma média estatística e que o número de unidades de repetição do primeiro bloco de uma dada molécula não será geralmente o número exacto de unidades de repetição do terceiro bloco. As características de um número de pluronics, descritos em relação à fórmula (IX), são como se segue: 16

[

Copolímero Peso do hidrófobo CMC (% p/v) Percentagem de hidrófobo Pluronic L61 1750 0,0003 90 Pluronic L64 1750 0,002 60 Pluronic F68 1750 4-5 20 Pluronic P05 2250 0,005-0,007 50 Pluronic F127 4000 0,003-0,005 30 Pluronic F108 3250 0,0035-0,007 20

Estes valores de CMC foram determinados através do método da tensão de superfície descrito em Kabanov et al., Macromolecules 28: 2303-2314, 1995.

Copolímeros de bloco específicos adicionais de poli(oxietileno)-poli(oxipropileno) relevantes para a invenção incluem:

Peso do Percentagem de Pluronic Hidrófobo Hidrófobo L31 950 90% F35 950 50% L42 1200 80% L43 1200 70% L44 1200 60% L62 1750 80% L63 1750 70% L64 1750 60% P65 1750 50% L72 2050 80% L75 2050 50% L81 2250 90% L84 2250 60% L87 2250 30% F88 2250 20% L92 2750 80% F98 2750 20% 17 L101 3250 90% Pl 0 3 3250 70% P104 3250 60% P105 3250 50% F108 3250 20% L121 4000 90% L122 4000 80% L123 4000 70% F127 4000 30% 10R5* 1000 50% 10R8 1000 20% 12R3 1200 70% 17R2 17 00 80% 17R1 1700 90% 17R2 1700 80% 17R4 1700 60% 17R8 1700 20% 22R4 2200 60% 25R1 2500 90% 25R2 2500 80% 25R4 2500 60% 25R5 2500 50% 25R8 2500 50% 31R1 3100 90% 31R2 3100 80% 31R4 3100 60% *Todos os copolímeros acima estão em conformidade com a fórmula (IX), este copolimero e os abaixo estão em conformidade com a fórmula (VII). 0 pluronic ligado a diamina de fórmula (VIII) também pode ser um membro da família dos copolímeros de polioxietileno- polioxipropileno ligados a diamina de fórmula: R1 R2I I ch2ch2o

r R3 R4 I -ch2ch2o

R5 R6 I I ch2ch2o -H j

N — R —N (X) em que as linhas a ponteado representam cópias simétricas da extensão de poliéter do segundo azoto, R* um alquileno de 2 a 6 carbonos, um cicloalquileno de 5 a 8 carbonos ou fenileno, para R1 e R2, ou (a) ambos são hidrogénio ou (b) um é hidrogénio e o outro é metilo, para R3 e R4 ou (a) ambos são hidrogénio ou (b) um é hidrogénio e o outro é metilo, se ambos de entre R3 e R4 são hidrogénio, então um de R5 e R6 é hidrogénio e o outro é metilo, e se um de entre R3 e R4 é metilo, então tanto R5 como R6 são hidrogénio. 0 grupo -NH2-CH2CH2-NH2- de fórmula (VIII) e o grupo N-R*-N de fórmula (X) são exemplos de grupos de ligação, L, de fórmula (IV).

Os técnicos reconhecerão, à luz da discussão aqui apresentada, que mesmo quando a prática da invenção está confinada por exemplo a compostos de poli(oxietileno)-poli (oxipropileno), as formas exemplificativas acima também estão confinadas. Uma caracteristica importante é que a constante de fragmentos média de Hansch-Leo dos monómeros é um bloco de tipo A de -0,4 ou menos. Assim, as unidades que constituem o primeiro bloco não precisam de consistir apenas de óxido de etileno. De forma semelhante, nem todos os blocos de tipo B precisam de consistir apenas de unidades de óxido de propileno. Pelo contrário, os blocos podem incorporar outros monómeros para além dos definidos nas fórmulas (V)-(X), desde que os parâmetros da primeira realização sejam mantidos. Assim, no exemplo mais simples, pelo menos um dos monómeros no bloco A pode ser substituído com um grupo do cadeia lateral como 19 previamente descrito.

Noutro aspecto, a invenção refere-se a uma composição de fármaco constituída por um copolímero de bloco de pelo menos uma das fórmulas (I)-(X), em que os blocos de tipo A e de tipo B são substancialmente constituídos de unidades de repetição de fórmula -0-R3, em que R5 é: (1) - (CH2) n-CH (R6)em que n é zero ou um inteiro de 1 a 5 e R6 é hidrogénio, cicloalquilo possuindo 3 a 8 átomos de carbono, alquilo possuindo 1 a 6 átomos de carbono, fenilo, alquilfenilo em que o alquilo possui 1 a 6 átomos de carbono, hidroxilo, hidroxialquilo, em que o alquilo possui 1 a 6 átomos de carbono, alcoxilo possuindo 1 a 6 átomos de carbono, um carbonilo de alquilo possuindo 2 a 7 átomos de carbono, alcoxicarbonilo, em que o alcoxilo possui 1 a 6 átomos de carbono, alcoxicarbonílalquilo, em que o alcoxilo e o alquilo possuem cada um independentemente 1 a 6 átomos de carbono, alquilcarboxialquilo, em que cada alquilo independentemente possui 1 a 6 átomos de carbono, aminoalquilo em que o alquilo possui 1 a 6 átomos de carbono, alquilamina ou dialquilamina, em que cada alquilo independentemente possui 1 a 6 átomos de carbono, mono- ou di-alquilaminoalquilo em que cada alquilo independentemente possui 1 a 6 átomos de carbono, cloro, cloroalquilo em que o alquilo possui de 1 a 6 átomos de carbono, flúor, fluoroalquilo em que o alquilo possui de 1 a 6 átomos de carbono, ciano ou cianoalquilo em que o alquilo possui de 1 a 6 átomos de carbono ou carboxilo; (2) um grupo carbocíclico possuindo 3 ou 8 átomos de carbono em anel, em que o grupo pode ser por exemplo, grupos cicloalquilo ou aromáticos, e que podem incluir alquilo possuindo 1 a 6 átomos de carbono, alcoxilo possuindo 1 a 6 átomos de carbono, alquilamino possuindo 1 a 6 átomos de carbono, dialquilamino em que cada alquilo independentemente possui 1 a 6 átomos de carbono, amino, sulfonilo, hidroxilo, carboxilo, substituições de flúor ou cloro, ou (3) um grupo heterocíclico possuindo 3 a 8 átomos em anel, que pode incluir grupos heterocicloalquilo ou heteroaromáticos, que podem incluir de 1 a 4 heteroátomos seleccionados do grupo consistindo em oxigénio, azoto, enxofre e misturas destes, e que podem incluir alquilo possuindo 1 a 6 átomos de carbono, alcoxilo possuindo 1 a 6 átomos de carbono, alquilamino possuindo 1 a 6 átomos de carbono, dialquilamino em que cada alquilo independentemente possui 1 a 6 átomos de carbono, amino, sulfonilo, hidroxilo, carboxilo, substituições de flúor ou de cloro.

Preferencialmente, n é um inteiro de 1 a 3. Os grupos carbociclicos ou heterociclicos compreendendo R5 possuem preferencialmente de 4 a 7 átomos em anel, mais preferencialmente 5 ou 6. Os heterociclos incluem preferencialmente de 1 a 2 heteroátomos, mais preferencialmente, os heterociclos possuem um heteroátomo. Preferencialmente, o heterociclo é um carbohidrato ou análogo do carbohidrato.

Os especialistas na técnica reconhecerão que os monómeros necessários para produzir estes polímeros estão disponíveis sinteticamente. Ver, Vaughn et al. , J. Am. Oil Chem. Soc. 28: 294, 1951. Em alguns casos, a polimerização dos monómeros necessita da utilização de grupos de protecção adequados, como será reconhecido pelos especialistas na técnica. De um modo geral, os blocos de tipo A e B são pelo menos em 80% compreendidos por unidades de repetição -0R5-, mais preferencialmente pelo menos em 90%, contudo ainda mais preferencialmente em pelo menos 95%.

Noutro aspecto, a invenção refere-se a uma composição de fármaco constituída por um copolímero de bloco de uma das fórmulas (I)-(X) em que os blocos de tipo A e de tipo B consistem essencialmente em unidades de repetição de fórmula -0-R7-, em que R7 é um grupo alquileno de Ci a C6. A estimativa de Hansch-Leo do coeficiente de separação de octanol-água (P) para uma molécula orgânica é calculada pela 21 fórmula:

Log P = Σ anfn + Σ h^F,,, em que os valores de fn são as constantes de fragmentos para os diferentes grupos na molécula, os valores de an são o número de qualquer tipo de grupo na molécula, os valores de Fm são factores para certas caracf.erí sti cas mol er.nl ares tai.s como ligações simples ou ligações duplas, e os valores de bm são o número de qualquer dessas caracteristicas moleculares. Por exemplo, a constante de fragmentos de Hansch-Leo para uma unidade de repetição de óxido de etileno (-CH2CH2O-) deve ser: 2fc + 4f„ + f0 + <4-l)Fb = 2(0,20) + 4(0,23) + (-1,82) + 3(-0,12) = -0,86 A constante de fragmentos de Hansch-Leo para uma unidade de repetição de óxido de propileno (-CH2CH (CH3) 0-) será: 2fc + fcH3 + 3fH + f0 + (4-1) Fb = 2(0,2) + 0,89 + 3(0,23) + (-1,82) + 3(-0,12) = -0,2

Os especialistas na técnica reconhecerão que a abordagem de Hansch-Leo para estimar constantes de separação, em cuja abordagem são aplicadas as constantes de Hansch-Leo, não produzem precisamente a constante de separação empírica. Ver Hansch e Leo, Substituint Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, Wiley, Nova Iorque, 1979; James,

Solubility and Related Properties, Mareei Dekker, Nova Iorque, 1986, pp. 320-325. Contudo, a abordagem é suficientemente precisa para definir as caracteristicas de hidrofobicidade do veículo de distribuição polimérica.

Os copolímeros de bloco utilizados na invenção formam preferencialmente micelas em soluções isotónicas aquosas a uma temperatura fisiológica possuindo diâmetro de 10 nm a 100 nm. As micelas são complexos supramoleculares de certas moléculas anfifílicas que se formam em soluções aquosas devido a separação de microfase das porções não polares dos anfifílicos. As micelas formam-se quando a concentração do anfifílico atinge, para uma dada temperatura, uma CMC que é característica do anfifílico. Fazendo variar os tamanhos dos segmentos hidrofílico e hidrofóbico dos copolímeros de bloco, a tendência dos 22

Γ copolímeros para formar micelas em condições fisiológicas, bem como o tamanho médio das micelas formadas em condições fisiológicas, pode ser variado. Estas tendências também podem ser ajustadas misturando os copolímeros com diferentes misturas de blocos hidrofóbicos e hidrof ílicos. As micelas possuem um núcleo denso formado pelas unidades de repetição insolúveis em água dos blocos B e pelas porções lipofílicas de um agente biológico aí dissolvido, e uma capa hidrofílica formada pelos blocos A e pelas porções hidrofóbicas do agente biológico. As micelas possuem liberdade de translação e de rotação em ambiente aquoso, e os ambientes aquosos contendo as micelas possuem uma viscosidade baixa semelhante à água. A formação das micelas ocorre tipicamente a concentrações de copolímero de 0,001 até 5% (p/v).

Crê-se que o tamanho pequeno das micelas formadas pelos copolímeros de bloco da invenção permita a estas micelas penetrar em capilares pequenos e serem incorporadas pelas células. As micelas também podem incorporar grandes quantidades dos agentes biológicos apropriados. Por exemplo, as micelas formadas por Pluronic L61 podem incorporar pelo menos 1 mg de doxorrubicina por 2 mg de copolímero. A retenção eficaz de um fármaco pelas micelas da invenção pode ser quantificada em termos do coeficiente de separação (P) determinado utilizando a fórmula: P = [Agente]m / [Agente] aq em que [Agente] aq é a concentração de agente biológico num ambiente aquoso fora das micelas e [Agente]m é a concentração do agente nas micelas. Nalguns casos, P é facilmente e rigorosamente estimado com base nas diferentes propriedades de fluorescência de certos agentes quando num ambiente aquoso vs. um ambiente mais hidrofóbico.

Uma porção menor de uma molécula de direccionamento composta por uma parte de direccionamento acoplada a uma parte lipofílica compreendendo um hidrocarboneto possuindo 3 a 41 23 t (— L-1- átomos de carbono é incorporada nas micelas das composições da realização de direccionamento da invenção. Esta porção compreende tipicamente não mais do que 10% p/p dos componentes de copolimero de uma composição. Crê-se que as partes lipofilicas actuem como "âncoras" hidrofóbicas, que são incorporadas não covalentemente nas micelas de copolimero de bloco de modo a que a parte de direccionamento se torne parte de, mas que se estende para além de, a micela. Essas partes de direccionamento são preferencialmente também incorporadas em micelas utilizadas na realização da invenção de quimioterapia do cérebro. Contudo, para a realização de quimioterapia do cérebro a parte lipofílica pode ser qualquer parte lipofilica eficaz para associar não covalentemente a parte de direccionamento com as micelas. Para a realização da quimioterapia do cérebro, a parte lipofílica pode ser, por exemplo uma resíduo de ácido gordo, um lípido, um fosfolípido, ou um polímero natural ou sintético. Devido à disponibilidade e facilidade de utilização, são preferidas as partes lipofilicas . contendo grupos hidrocarboneto tais como resíduos de ácido gordo.

As partes de direccionamento possuem afinidade para um sítio celular, de tecido, virai ou de substrato. Partes de direccionamento típicas incluem sem limitação anticorpos e hormonas com afinidade para uma componente de ligação celular, qualquer molécula contendo uma parte de carbohidrato reconhecida por uma componente de ligação celular e fármacos que se ligam a uma componente de ligação celular. A frase "componente de ligação" inclui tanto a molécula do receptor como a de aceitação. Preferencialmente, a componente de ligação é uma componente de ligação de superfície celular. Podem ser empregues tanto anticorpos policlonais como monoclonais que estão disponíveis comercialmente ou descritos na literatura. Alternativamente, o ligando pode ser uma proteína que ocorre naturalmente, tal como insulina, que se liga a um sítio alvo. Um exemplo não limitante de uma parte de direccionamento é um 24

anticorpo anti-a2GP contra as células da glia cerebral (a2-glicoproteína) que é descrito por Slepnev et al. , Bioconjugate Chem. 3: 273-274, 1992.

Para reter tanto quanto possível a especificidade do polipéptido, são ligados a cada molécula polipeptídica prcfcrcncialmente apenas uma ou duas partes lipofílicas. Esta ligação pode ser alcançada através do método descrito por Kabanov et al., Protein Engineering, 3, 39-42 (1989). Neste método, a parte lipofílica ou um análogo reactivo desta é feita reagir com a parte de direccionamento na presença de um tensioactivo de bis-(2-etilhexil)sulfossuccinato de sódio {AOT®}, octano e uma pequena quantidade de água formam micelas invertidas, isto é micelas com água no seu interior e octano no exterior. Essas micelas invertidas servem como microrreactores permitindo modificação pontual uniforme das moléculas polipeptídicas com partes lipofílicas. Derivados reactivos de ácidos gordos tais como cloreto de estearoílo ou cloreto de lauroílo podem ser feitos reagir com polipéptidos ou outras partes de direccionamento hidrofílicas utilizando este sistema de reacção. Dado que o sistema de reacção permite que o nível de substituição de acilo gordo seja limitado, são geralmente preservadas uma maior actividade biológica e solubilidade da parte de direccionamento.

Para o copolímero de óxido de polietileno-óxido de polipropileno, as propriedades hidrofílicas/hidrofóbicas, e as propriedades de formação das micelas de um copolímero de bloco estão relacionadas com o valor da razão, η. A razão, n, é definida como: η = (IBI/IAI) x (b/a) = <|B|/|A|) x 1,32 em que | tí | e |A| são o número de unidades de repetição nos blocos hidrofóbico e hidrofílico do copolímero, respectivamente, e b e a são os pesos moleculares das respectivas unidades de repetição. 0 valor de n está tipicamente entre 0,2 e 9,0, mais preferencialmente, entre 0,2 e 1,5. Quando são utilizadas 25

misturas de copolímeros de bloco, é utilizado um valor de N que será a média ponderada de n para cada copolimero contribuinte, com os cálculos da média baseados nas porções em peso dos copolímeros componentes. O valor N pode ser utilizado para estimar as propriedades de formação de micelas de uma mistura de copolímeros. Quando são utilizados outros copolímeros para além dos copolímeros de óxido de polietileno-óxido de polipropileno, podem ser desenvolvidas abordagens semelhantes para relacionar as propriedades hidrofóbicas/hidrofílicas de um membro da classe de polímeros com as propriedades de outro membro da classe.

As composições farmacêuticas da invenção podem ser administradas através de uma variedade de vias, incluindo sem limitação por via oral, tópica, rectal, vaginal, por via pulmonar, por exemplo através da utilização de aerossol, ou parentericamente, incluindo, mas não estando limitado a via intramuscular, subcutânea, intraperitoneal, intra-arterial ou intravenosa. As composições podem ser administradas isoladamente, ou podem ser combinadas com um veículo farmaceuticamente aceitável ou um excipiente de acordo com as práticas farmacêuticas convencionais. Para a via oral de administração, as composições podem ser utilizadas sob a forma de comprimidos, cápsulas, drageias, trociscos, pós, xaropes, elixires, soluções aquosas e suspensões, e afins. No caso de comprimidos, podem ser utilizados veículos incluindo lactose, citrato de sódio e sais de ácido fosfórico. São utilizados normalmente nos comprimidos vários desintegradores tais como amido, e agentes lubrificantes tais como estearato de magnésio, laurilsulfato de sódio e talco. Para administração oral sob a forma de cápsulas, são diluentes úteis a lactose e glicóis de polietileno de elevado peso molecular. Ouando são necessárias suspensões aquosas para utilização oral, as composições podem ser combinadas com agentes de emulsificação e suspensão. Se desejável, podem ser adicionados certos agentes adoçantes e/ou aromatizantes. Para administração parentérica, são normalmente 26 preparadas soluções estéreis do conjugado, e os pHs das soluções são ajustados e tamponados adequadamente. Para utilização intravenosa, a concentração total de solutos deve ser controlada de modo a tornar a preparação isotónica. Para administração ocular, podem ser distribuídos unguentos ou líquidos gota-a-gota através de sistemas de distribuição ocular conhecidos na técnica tais como aplicadores ou conta-gotas para aplicação ocular. Estas composições podem incluir mimetizadores mucosos tais como ácido hialurónico, sulfato de condroitina, metilcelulose de hidroxipropilo ou poli(álcool vinílico) , conservantes tais como ácido sórbico, EDTA ou cloreto de benzilcrónio, e as quantidades usuais de diluentes e/ou veículos. Para administração pulmonar, são seleccionados diluentes e/ou veículos apropriados para permitir a formação de um aerossol.

As formas de supositório das composições da invenção são úteis para administrações vaginal, uretral e rectal. Esses supositórios são geralmente fabricados a partir de uma mistura de substâncias que é sólida à temperatura ambiente mas que derrete à temperatura corporal. As substâncias utilizadas normalmente para criar esses veículos incluem óleo de teobroma, gelatina glicerinada, óleos vegetais hidrogenados, misturas de polietilenoglicol de vários pesos moleculares e ésteres de ácido gordo de polietilenoglicol. Ver, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a Ed., Mack Publishing, Easton, PA, 1980, pp. 1530-1533 para maior discussão de formas de dosagem em supositório. Géis análogos ou cremes podem ser utilizados para administração váginal, uretral e rectal.

Os agentes quimioterapêuticos apropriados para utilização nesta invenção incluem, sem limitação, alcaloides vinca tais cnmn vi nc.r i. st ina e vinblastina, antibióticos tipo mitomicina tais como mitomicina C e N-metil mitomicina C, antibióticos tipo bleomicina tais. como bleomicina A2, antifolatos tais como metotrexato, aminopterina, e ácido didesaza-tetrahidrofólico, colchicina, demecolina, etopósido, taxanos tais como paclitaxel A. \ (TaxolR) , antibióticos antraciclina e outros. Os antibióticos aniraciclina exemplificam fármacos possuindo problemas de distribuição devidos a baixa estabilidade, o desenvolvimento de resistência ao fármaco no tecido alvo, ou metabolismo rápido. Estes antibióticos incluem tipicamente um sistema em anel de fusão de aqlicone de tetraciclina ligado na posição 7 a daunosamina. Eles incluem, por exemplo, os compostos representados pela fórmula:

em que R1 é hidroxilo ou metoxilo; R2 é hidrogénio ou hidroxilo; e R3 é etilo, acetilo, hidroxiacetilo, ou um éster de hidroxiacetilo. Crê-se que estes antibióticos de tetraciclina, como muitos agentes anti-neoplásicos, actuem intercalando-se entre as estruturas planares de ΆΠΝ em anel aromático, interferindo assim com a replicação de ADN. Ver, Neidle e Waring, Molecular Aspects of Anti-Cancer Drug Action, Pitman Press, 1983. As células neoplásicas são geralmente particularmente susceptiveis, uma vez que se estão a replicar 28

activamente e assim sintetizam cópias de réplicas do seu ADN. Estes antibióticos de tetraciclina incluem, sem limitação, doxorrubicina, daunorrubicina, carminomicina, epirrubicina, idarrubicina, mitoxantrona, 4-demetoxi-daunomicina, 11-desoxidaunorrubicina, 13-desoxidaunorrubicina, 14-benzoato de adriamicina, 14-octanoato de adriamicina, ou 14-naftalenoacetatn de adriamicina.

Classes preferidas de agentes biológicos (incluindo agentes quimioterapêuticos) incluem agentes anti-neoplásicos, agentes antibacterianos, agentes antiparasiticos, agentes antifúngicos, agentes do SNC, imunomoduladores e citoquinas, toxinas e neuropéptidos. Também são preferidos agentes biológicos para os quais as células alvo tendem a desenvolver mecanismos de resistência. Agentes biológicos particularmente preferidos incluem antraciclinas tais como doxorrubicina, daunorrubicina, epirrubicina, idarrubicina, mitoxantrona ou carminomicina, alcaloides vinca, antibióticos tipo mitomicina, antibióticos tipo bleomicina, antifúngicos de azole tais como fluconazole, antifúngicos de polieno tais como anfotericina B, agentes antineoplásicos relacionados com o taxano tais como paclitaxel e imunomoduladores tais como o factor alfa de necrose de tumor (TNFa), interferões e citoquinas.

Os agentes biológicos preferidos (incluindo agentes de quimioterapêutica) incluem sem limitação agentes antifúngicos adicionais tais como a anfotericina B, flucitosina, cetoconazole, miconazole, itraconazole, griseofulvina, clotrimazole, econazole, terconazole, butoconazole, olamina de ciclopirox, haloprogina, tolnaftato, naftifina, nistatina, natamicina, ácidos undecilénico, ácido benzóico, ácido salicilico, ácido propiónico e ácido caprílico. Estes agentes incluem ainda sem limitação agentes antivirais tais como zidovudina, aciclovir, ganciclovir, vidarabina, idoxuridina, trifluridina, foxcarnet, amantadina, rimantadina e ribavirina. Estes agentes incluem ainda sem limitação agentes 29 ι t antibacterianos tais como compostos relacionados com a penicilina incluindo antibióticos de β-lactamas, penicilinas de largo espectro e penicilinas resistentes à penicilinase (tais como meticilina, nafcilina, oxacilina, cloxacilina, dicloxacilina, amoxicilina, ampicilina, ampicilina-sulbactama, azocilina, bacampicilina, carbcnicilina, indanilo de carbenicilina, ciclacilina, mezlocilina, penicilina G, penicilina V, piperacilina, ticarcilina, imipenem e aztreonamo), cefalosporinas (as cefalosporinas incluem cefalosporinas de primeira geração tais como cefapirina, cefaxolina, cefalexina, cefradina e cefadroxilo; cefalosporinas de segunda geração tais como cefamandole, cefoxitina, cefaclor, cefuroxime, axetilo de cefuroxime, cefonicida, cefotetano e ceforanida; cefalosporinas de terceira geração tais como cefotaxima, ceftizoxima, ceftriaxona, cefoperazona e ceftazidima) , tetraciclinas (tais como demeclocitetraciclina, doxiciclina, metaciclina, minociclina e oxitetraciclina), inibidores da beta-lactamase (tais como ácido clavulânico), aminoglicósidos, (tais como amicacina, gentamicina C, canamicina A, neomicina B, netilmicina, estreptomicina e tobramicina), cloranfenicol, eritromicina, clindamicina, espectinomicina, vancomicina, bacitracina, isoniazida, rifampina, etambutol, ácido aminosalicilico, pirazinamida, etionamida, cicloserina, dapsona, sulfoxona de sódio, clofazimina, sulfonamidas (tais como sulfanilamida, sulfametoxazole, sulfacetamida, sulfadiazina, e sulfisoxazole), trimetoprim-sulfametoxazole, quinolonas (tais como ácido nalixidico, cinoxacina, norfloxacina e ciprofloxacina) , metenamina, nitrofurantoina e fenazopiridina. Esses agentes incluem ainda agentes activos contra infecções de protozoários tais como cloroquina, furoato de diloxanída, emetina ou desidroemetina, 8-hidroxiquinolinas, metronidazole, quinacrina, melarsoprol, nifurtimox, pentamidina, estibogluconato de sódio e suramina.

Uma variedade de agentes do sistema nervoso central são 30

« adequados para utilização na presente composição. Estes incluem neurolépticos tais como as fenotiazinas (tais como compazina, torazina, promazina, cloropromazina, acepromazina, aminopromazina, perazina, procloroperazina, trifluoroperazina, e tioproperazina), alcaloides de rauwolfia (tais como reserpina e deserpina), tioxantenos (tais como cloroprotixeno e tiotixeno), butirofenonas (tais como haloperidol, moperona, trifluoroperidol, timiperona, e droperidol), difenilbutil-piperidinas (tais como pimozida), e benzamidas (tais como sulpirida e tiaprida) ; tranquilizantes tais como derivados do glicerol (tais como mefenesina e metocarbamol), propanodióis (tais como meprobamato) , derivados do difenilmetano (tais como orfenadrina, benzotrapina, e hidroxizina), e benzodiazepinas (tais como clorodiazepóxido e diazepam) ; hipnóticos (tais como zolpdem e butoctamida); bloqueadores β (tais como propranolol, acebutonol, metoprolol, e pindolol); anti-depressivos tais como dibenzazepinas (tais como imipramima), dibenzocicloheptenos (tais como amitriptilina) , e os tetraciclicos (tais como mianserina); inibidores de MAO (tais como fenelzina, iproniazida, e selegelina); psicoestimulantes tais como derivados da feniletilamina (tais como anfetaminas, dexanfetaminas, fenproporex, fentermina, anfepramona, e pemlina) e dimetilaminoetanóis (tais como clofenciclano, ciprodenato, aminorex, e mazindol); compostos que mimam GABA (tais como progabide), alcaloides (tais como co-dergocrina, dihidroergocristina, e vincamina); colinérgicos (tais como citicolina e fisosigmina); vasodilatadores (tais como pentoxifilina); e agentes activos para o cérebro (tais como piritinol e meclofenoxato), bem como misturas de vários desses agente3.

De interesse particular são sedativo-hipnóticos tais como as benzodiazepinas, agentes psicofarmacológicos tais como as fenotiazinas, tioxantenos, butirofenonas, e dibenzoxazepinas, e estimulantes do sistema nervoso central. Dado que a realização 31 1 da invenção do tratamento do cérebro está dirigida a composições que melhoram a capacidade de agentes biológicos, esta realização da invenção pode ser aplicada a uma vasta variedade de agentes do sistema nervoso central através da aplicação dos princípios e procedimentos aqui descritos. A dosagem para um agente biológico numa composição micelar está frequentemente próxima da do agente biológico isoladamente; as dosagens serão estabelecidas pelo profissional médico que as receita tendo em consideração muitos factores incluindo a idade, peso e condição do doente e a farmacocinética do agente. Frequentemente, a quantidade de uma forma micelar de um agente necessário para um tratamento eficaz pode ser menor do que a quantidade necessária utilizando o agente biológico na forma livre. Para a utilização da daunorrubicina no tratamento do cancro, uma dosagem típica será 1 mg por kg de peso corporal. A vinblastina é tipicamente administrada a uma dose desde 0,1 a 0,2 mg por kg de peso corporal.

Geralmente, os agentes biológicos utilizados na invenção são administrados a um animal numa quantidade eficaz. O efeito do copolímero utilizado na composição eficazmente tem de ser tido em consideração na determinação da quantidade eficaz. Geralmente, uma quantidade eficaz é uma quantidade eficaz ou para (1) reduzir os sintomas da doença susceptível de ser tratada ou para (2) induzir uma alteração farmacológica relevante no tratamento da doença susceptível de ser tratada. Para o cancro, uma quantidade eficaz inclui uma quantidade eficaz para: reduzir o tamanho de um tumor; abrandar o crescimento de um tumor; impedir ou inibir metástases; ou aumentar a esperança de vida do animal afectado.

Em muitos casos, os metabolitos de vários agentes biológicos criam ou aumentam os efeitos indesejáveis resultando na administração do agente. Este é certamente o caso dos fármacos à base de antraciclina, em que se crê que os metabolitos conduzam a cardiotoxicidade. Ver, Mushlin et al., 32 íf~ t'-'-' lí '

Br. J. Pharmacol. 110: 975-982, 1993. As composições de copolimero da invenção podem diminuir a taxa de metabolismo para os agentes biológicos, reduzindo assim o potencial para efeitos colaterais danosos. A penetração do cérebro por um agente biológico pode ser medida através de nma variedade de técnicas, como será reconhecido pelos especialistas na técnica. Esses métodos incluem marcação com isótopos, avaliação do comportamento animal em relação aos efeitos de um agente biológico, e medição das dosagens letais para fármacos com efeitos tóxicos que ocorrem no cérebro. Esses métodos incluem ainda a medição das diminuições na dosagem necessária para promover a resposta biológica apropriada. Vários agentes antifúngicos tratam com sucesso infecções fúngicas em humanos. Todavia, a dose terapêutica é frequentemente um compromisso entre atingir níveis de fármaco eficazes e evitar os efeitos colaterais tóxicos. Em anos recentes, o surgimento de resistência a fármacos entre espécies intrinsecamente sensíveis tais como Candida albicans e o aumento da incidência de espécies intrinsecamente resistentes ao fármaco tais como Candida kruset desencadeou uma pesquisa para novos agentes antifúngicos.

Embora o fluconazole possua uma baixa incidência de efeitos colaterais, a incidência de resistência é um problema crescente. São por isso desejáveis para este agente veículos de distribuição que sejam eficazes no aumento da actividade quimioterapêutica e na reversão de resistência desses agentes, bem como para outros agentes antimicrobianos. A invenção é exemplificada através dos seguintes exemplos.

Exemplo 1 - Tamanho de Miceia

Os copolímeros de bloco de poli(oxietileno)-poli(oxipropileno) possuindo as razões de poli(oxipropileno) para poli(oxietileno) indicadas abaixo foram dispersos em meio 33 ^ L, Κ RPMI 1640 nas concentrações indicadas abaixo. As misturas foram incubadas durante 40 minutos a 30UC. 0 diâmetro médio da miceia foi medido por varrimento de luz quasielástica. Ver Kabanov et ai., Macromolecules 28: 2303-2314, 1995. Os resultados foram como se segue: copolimero conc. (% p/v) Diâmetro Médio F-68 1,0% 726,0 nm P-85 1,0% 18,0 nm L-64 1,0% 20,4 nm 1:1,5 P-85:L-64 0,01% 17,0 nm 1:2,5 F-68:L-64 1,0% 33,5 nm

Exemplo 2 - Conjugados de Acilo Gordo

Uma solução de 50 pL de anticorpo anti-012 a 2 mg/mL especifico para a ci2-glicoproteína das células da glia (Chekhomim et al., FEBS Lett. 287: 149-152, 1991) em tampão borato a 0,1 M (pH 8,5) foi misturada em 2 mL de AOT® a 0,1 M {bis(2- etilhexil)sulfossuccinato de sódio, disponível de Serva Chemicals, Alemanha) em octano. A reacção é iniciada através da adição à mistura de um excesso molar em duas vezes (em relação ao polipéptido) de cloreto de ácido esteárico em 0,2 mL de AOT® *41 a 0,1 M em octano. 0 cloreto de ácido esteárico foi obtido a partir de ácido esteárico (disponível de Reakhim, Rússia) como descrito por Kabanov et al., Molek Biologiya (Russo), 22: 473- 484 (ed. inglesa: 382-391), 1988. A reacção foi realizada durante a noite a 25°C. O produto foi precipitado três vezes com acetona fria, dissolvido em meio RPMI 1640 e esterilizado por filtração através de um filtro de 0,22 jjm. (O anticorpo policlonal utilizado nesta experiência também reagiu com a proteína acídica das fibrilhas da glia) .

Exemplo 3 - Partes de direccionamento iodinadas O anticorpo anti-nf.2CP foi marcado com 125T utilizando 34 reagente de Bolton-Hunter no sistema de micelas invertidas de AOT'8’ em octano como descrito em Slepnev V.I. et ai., Bioconjugate Chem., 3, 273-274 (1992). A radioactividade especifica da proteína marcada com 125I varia entre 19 e 21 Ci/mol.

Foram injectados ratos Wistar (80 g em peso corporal, 8 animais/grupo) i.p. (0,1 mL/10 g de peso corporal) com uma composição composta pelo anticorpo anti-a2GP marcado com 125I (1 mCi/mL) dissolvido numa mistura de copolímero Pluronic P85 a 1,5% (p/v) e copolímero Pluronic L64 a 2,5% (p/v) dissolvido em meio RPMI 1640. 0 polipéptido marcado com 125I dissolvido em meio RPMI 1640 foi administrado à mesma concentração. Após três dias os animais foram sacrificados, e foram retiradas amostras de tecido para ensaio de radioactividade para analisar a distribuição no tecido como descrito por Chekhonin et al., FEBS Lett., 287 149-152 (1991). A distribuição da radioactividade foi quantificada por contagem de cintilações em líquido. As experiências foram repetidas pelo menos duas vezes e os resultados foram reprodutíveis com menos de 10% de variação. Os resultados, expressos como a razão entre a radioactividade no cérebro sobre a radioactividade num dado tecido (± D.P.), foi como se segue:

Conteúdo Relativo de Marcador Órgão Micela Controlo Cérebro/coração 1,22±0,91 0,11±0,02 Cérebro/rim 7,42±0,56 0,0510,01 Cérebro/fígado 9,02±0,75 0,0110,00 Cérebro/pulmão 12,1±0,92 0,0410,01 Cérebro/baço 6,48±0,39 0,0110,00 Cérebro/sangue 8,85±0,67 0,0110,00

Exemplo 4 - Quantificação de alterações comportamentais São realizadas avaliações quantitativas de alterações em reacções comportamentais (Ver Theory in Psychopharmacology, 35

S. J. Cooper, Ed., Vol. 1, (Academic Press, Londres, Nova Iorque, 1981)}. Grupos de murganhos DBA/2 machos (do Departamento de Veterinária de Kriukovo da Academia das Ciências Russa, 20-25 g de peso corporal) , (10 animais/ponto de dose) com caracteristicas semelhantes de actividade de movimentação são injcctodoc i.p. com as preparações de teste a doses correspondendo a 0,10 de LD95. As concentrações são ajustadas de modo a que um volume máximo de 0,1 mL seja injectado em cada murganho. A mobilidade do murganho (o número de migrações do murganho numa gaiola) e as caracteristicas de higiene são registadas para cada grupo a intervalos de 30 minutos durante 15 horas utilizando um dispositivo Rhema Labortechnik. As experiências são repetidas três vezes.

Exemplo 5 - Medição da toxicidade É medido o efeito letal acompanhado pelo desenvolvimento de sintomas neurológicos específicos descritos em Theory in Psychopharmacology, S. J. Cooper, Ed., Vol. 1, (Academic Press, Londres, Nova Iorque, 1981). Grupos (10 animais/ponte de dose) de murganhos DBA/2 (18-19 g de peso corporal) são injectados i.p. com as preparações de teste. As concentrações são ajustadas de modo a que um volume máximo de 0,5 mL seja administrado a cada murganho. Para a avaliação quantitativa de acção letal específica, a dose letal (LD95) é calculada utilizando o método próbite com base em 10 pontos de concentração. As experiências são repetidas pelo menos duas vezes e os resultados devem ser reprodutíveis com menos do que 10% de variação.

Exemplo 6A - Formação de micelas

Uma mistura de 1:1,5 de Pluronic P85 e Pluronic L64 possuindo razões individuais de (n) blocos de (oxipropileno) para (oxietileno) de 1,00 e 1,50, respectivamente, e um valor combinado (W) de 1,30, foi diluída com meio RPMI 1640 para uma concentração final de 4,0% a 4°C. A mistura foi incubada durante 36

t- 30 minutos a 37°C e depois esterilizada por filtração através de um filtro de 0,22 μιη. Foi adicionado um volume igual de uma solução de 200 μς de daunorrubicina em meio RPMI 1640 e esta mistura foi incubada durante 30 minutos a 37°C.

Exemplo 6B - Preparação de mlcelas direccionadas para o cérebro São misturados a 37°C volumes iguais da solução de micelas de Pluronic do Exemplo 6A e a solução do anticorpo estearilado do Exemplo 2. Foram misturados a 37°C volumes iguais da solução resultante e uma solução estéril a 6 mg/mL de haloperidol dissolvido em meio RPMI 1640.

Exemplo 7 - Medida comportamental da biodistribuição no cérebro

Foram utilizadas nestas experiências as preparações descritas no Exemplo 6, excepto gue o anticorpo anti-GFAP não estava radioactivo e foi utilizado a uma concentração de 0,4 mg/mL.

As soluções foram administradas i.p. A mortalidade animal foi monitorizada diariamente durante 14 dias. A LD50 e a dosagem máxima tolerada ("MTD", i.e., a dose máxima para a qual não morreram animais entre 6 animais tratados de modo equivalente) foram calculadas através da análise de próbite. Ver, Chan e Hayes em Principies and Methods of Toxicology, Hayes, A. W., ed., Raven Press, Nova Iorque, 1989, pp. 169-189. Quando administrado no veiculo Pluronic, o valor da LD95 de haloperidol foi determinado como sendo de 0,15 mg/kg, sem o veiculo Pluronic o valor da LD95 de haloperidol foi de 75 mg/kg.

Foi injectada uma quantidade perfazendo 10% da LD95 para uma dada composição, i.p em murganhos DBA/2 em 0,5 mL do veículo pluronic (Exemplo 6). Os resultados comportamentais destas injecções (± D.P.), medidos como descrito em Kabanov et al., J. Controlled Release, 22:141 (1992), são como se segue: 37

Comportamento Forma micelar de haloperidol Haloperidol livre Mobilidade horizontal 14,4 ± 64% 204,6 ± 24% Higiene 26,5 ± 76% 1834,8 ± 12,5%

Como pode ser observado pela tabela acima, a forma micelar de haloperidol é marcadamente mais activa do que um quantidade de haloperidol livre normalizada a 10% da quantidade de LD95.

Exemplo 8 - Moléculas de direccionamento específicas e não específicas

Uma composição de direccionamento específica foi preparada como descrito no Exemplo 6. A concentração final do anticorpo anti-GFAP foi de 0,02 mg/mL, e a sua radioactividade específica foi de 20 Ci/mol.

Foi preparada uma não específica utilizando o mesmo procedimento mas substituindo uma preparação de Fab de IgG de murídeo não específica para o anticorpo específico para o cérebro. A concentração final do anticorpo foi de 0,02 mg/mL, e a sua radioactividade específica foi de 20 Ci/mol.

Estas preparações (0,5 mL) foram injectadas i.p. em murganhos DBA/2. As biodistribuições resultantes (± D.P.) foram:

Conteúdo Relativo de Marcador Órgão (% de dose/g de tecido) Micela Controlo Cérebro 53 ± 4,15* 1,4 ± 0,12 Coração 3,2 ± 0,22 3,1 ± 0,21 Rim 4,4 ± 0,31 5,1 ± 0,47 Fígado 4,3 ± 0,26 36,2 ± 1,92 Pulmão 2,2 ± 0,11 4,8 ± 0,42 Baço 4,1 ± 0,33 5,1 ± 0,41 Sangue 3,8 + 0,31 8,7+0,67 38

V

Exemplo 9 - Direccionamento utilizando anticorpo anti-enolase específico para os neurónios

Foi produzida uma composição de direccionamento utilizando o procedimento do Exemplo 6 em que o anticorpo foi um anticorpo monoclonal contra a subunidade γ da enolase neuronal especifica ("MAb anti-NSE", disponível de Centro de Pesquisa Russo, Moscovo, Rússia). A concentração final do anticorpo foi de 0,35 mg/mL, e a sua radioactividade específica foi de 18 Ci/mol. Para experiências controlo, foi utilizada a preparação de anticorpo de murídeo não específica descrita no Exemplo 8.

Essas preparações (0,5 mL) foram injectadas i.p. em murganhos DBA/2. As biodistribuições resultantes (± D.P.) foram:

Conteúdo Relativo de Marcador Órgão (% de dose/g de tecido) Micela Controlo Cérebro 58 ± 5,12* 0,9 ± 0,06 Coração 3,2 ± 0,23 2,8 ± 0,21 Rim 4,3 ± 0,36 5,6 ± 0,52 Fígado 3,8 ± 0,32 31,2 ± 3,05 Pulmão 2,1 ± 0,18 6,4 ± 0,59 Baço 3,9 ± 0,33 4,9 ± 0,37 Sangue 4,1 ± 0,40 7,4 ± 0,71

Exemplo 10 - Direccionamento utilizando insulina

Foi preparada uma molécula de insulina de direccionamento ligando partes estearilo à insulina (disponível de Sigma, St. Louis, MO) utilizando o método do Exemplo G. A molécula de direccionamento foi incorporada numa composição de haloperidol utilizando o método descrito no Exemplo 6. A concentração final de insulina na composição foi de 0,4 mg/mL. a LD95 para esta composição de haloperidol foi determinada como sendo de 3,0 39 mg/kg, utilizando o método no Exemplo 7.

Foi injectada i.p. uma quantidade perfazendo 10% da LD95 para uma dada composição, em murganhos DBA/2 em 0,5 mL (6 murganhos por cada tratamento). Os resultados comportamentais destas injecções (± D.P.), medidas como descrito em Kabanov et al., J. Contisollecl Kelease, 22:141 (1992), são como se segue:

Comportamento Forma micelar de haloperidol Haloperidol livre Mobilidade horizontal 56,1 ± 36% 180,1 ± 26% Higiene 386,6 ± 29% 1656,4 ± 65%

Como pode ser observado a partir da tabela acima, a forma micelar de haloperidol é marcadamente mais activa do que uma quantidade de haloperidol livre normalizada a 10% da quantidade da LD95.

Exemplo 11 - Composições de sulpirida

Foram incorporadas sulpirida e a preparação de anticorpo Fab anti-NSE estearilado do Exemplo 9 em micelas de copolimero de bloco utilizando os métodos descritos no Exemplo 6. A concentração final de Fab anti-NSE na preparação foi de 2,1 mg/mL. Foi preparada uma solução controlo, estéril, de sulpirida em meio RPMI 1640. Os valores da LD95 para as preparações foram determinados como descrito no Exemplo 7. Para a preparação do copolimero de bloco, a LD95 foi 12,1 mg/kg de peso corporal; para a preparação controlo foi de 100 mg/kg de peso corporal.

Exemplo 12 - Composições de trifluoroperazina

Foram incorporados trifluoroperazina e a preparação de anticorpo Fab anti-GFAP tratada com cloreto de estearoilo, nas micelas de copolimero de bloco utilizando os métodos descritos no Exemplo 6. A concentração final de anticorpo na preparação foi de 0,2 mg/mL. Foi preparada uma solução controlo, estéril, de trif luoroperasina em meio RPMI 1640. Os valores da LD95 40

I ! ft

para as preparações foram determinados como descrito no Exemplo 7. Para a preparação do copolímero de bloco a LD95 foi de 0,04 mg/kg de peso corporal; para a preparação controlo foi de 10 mg/kg de peso corporal. A dose neuroléptica mínima (MND) foi determinada para cada preparação. A dose neuroléptica mínima é definida como a dose mínima que provoca um efeito neuroléptico como monitorizado comportamentalmente. Ver, Kabanov et al. , FEBS Lett. 258: 343- 345, 1989. A MND para a preparação contendo o copolímero foi de 0,02 mg/kg, enquanto que a da preparação de controlo foi de 2 mg/kg. A razão de LD95/MND foi de 50 para a preparação de copolímero e de 5 para a preparação de controlo.

Exemplo 13A - Citotoxicidade contra células cancerígenas resistentes

Foi dissolvido Pluronic P85 em meio RPMI 1640 (ICN Biomedicals Inc., Costa Mesa, CA) para uma concentração final de 1% e depois a solução foi esterilizada por filtração para remover contaminação bacteriana ou fúngica. Esta solução de Pluronic P85 foi utilizada para realizar diluições apropriadas de soluções de fármaco estéreis para as experiências de cultura de células descritas abaixo.

Os estudos de citotoxicidade utilizaram a linha SKOV3 de células transformadas (de aqui em diante denominadas "células SK") e a linha celular SKVLB derivada destas (de aqui em diante denominada "células SK-resistentes"). Ambas estas linhas celulares foram fornecidas pelo Dr. V. Ling, Universidade de Toronto. A linha celular SK-resistente é uma linha celular multi-resistente a fármacos derivada da linha celular SK através de cultivo por períodos longos na presença de vinblastina.

Foram realizadas várias diluições de um número de agentes anti-cancerígenos em meio RPMI ou na solução de Pluronic P85 descrita acima. As células foram preparadas para utilização 41 t nestas experiências plaqueando um volume igual de uma suspensão de células (2000-3000 células) nos poços de uma placa de microtitulação de 96 poços (Costar, Cambridge, MA) e cultivadas durante 2 dias. Todas as culturas de células foram realizadas a 37°C e sob uma atmosfera de C02 a 5%. Após isto, foram adicionadoc 100 μΐ; por placa dc meio frcoco (meio RPMI 1640 suplementado com soro de vitela fetal a 10%) . O agente anti-cancerígeno livre ou o copolimero mais diluições do agente anti-cancerígeno foram aplicados aos poços em volumes de 100 μύ. As células foram expostas à forma livre ou micelar de um fármaco durante 2 horas. Após esta incubação, as células foram lavadas três vezes com meio fresco. Depois, as células foram cultivadas em meio fresco durante mais quatro dias. 0 número de células viáveis para cada cultura foi determinado por análise de XTT convencional, que mede a actividade das enzimas mitocondriais. Ver, Scudiero et al., Câncer Res., 48:4827 (1988). Foram adicionados às células 50 μύ por poço de XTT (sal interno de 2,3-bis[2Metoxi-4-nitro-5-sulfofenil]-2H-tetrazólio-5-carboxanilida, Sigma, St. Louis, MO) estéril a 1 mg/mL em RPMI-1640 contendo 5 μΙ,/mL de metassulfato de fenazina a 1,54 mg/mL (Sigma) em PBS. As células foram incubadas durante 16 horas, após as quais foi determinada a absorvência de cada poço a 450 nm. A SEM para qualquer valor determinado (a média de três determinações) estava sempre dentro de 10% do valor. Os valores de IC50 (i.e., a concentração na qual é atingida uma inibição de 50%) foram determinados através da extrapolação a partir de gráficos que representam o número de células viáveis (i.e., a actividade enzimática mitocondrial) versus a concentração de fármaco aplicado às células. Os resultados para as células SK-resistentes foram como se segue: 42

Forma do agente biológico IC50, (ng/mL) 1 Doxorrubicina livre 60 000 Pluronic L61 70 Pluronic P85 1000 Pluronic F108 2000 Pluronic F68 60 000

Exemplo 14 - Titulações do copolimero

Foi utilizada a metodologia do Exemplo 13A excepto em dois detalhes. A primeira diferença foi que foram utilizadas as células MCF7 resistentes à doxorrubicina (células MCF ADR c, que são descritas adiante no Exemplo 21) em vez de células SK. Em segundo, adicionalmente a concentrações variáveis de doxorrubicina, a concentração do polímero também foi variada. A percentagem de inibição com a alteração na concentração da doxorrubicina também foi variada. A percentagem de inibição com alteração na concentração da doxorrubicina é apresentada na Figura IA para culturas mantidas na presença de concentrações variáveis de Pluronic L61. A linha 1 é para a doxorrubicina livre; a linha 2 é para doxorrubicina na presença de Pluronic L61 a 0,61 x 10’6 M; a linha 3 é para doxorrubicina na presença de Pluronic L61 a 0,3 x 10~5 M; a linha 4 é para doxorrubicina na presença de Pluronic L61 a 0,16 x 10~4 M; a linha 5 é para doxorrubicina na presença de Pluronic L61 a 0,8 x 10~4 M; a linha 6 é para doxorrubicina na presença de Pluronic L61 a 0,4 x IO-3 M; e a linha 7 é para doxorrubicina na presença de Pluronic L61 a 0,4 x IO'1 M. Na Figura 1B estes resultados são consolidados de modo a que a figura apresente o valor de IC50 para doxorrubicina aplicado às células na presença da concentração de Pluronic L61 indicada.

Exemplo 15 - Composição parentérica

Foi preparada uma composição adequada para administração parentérica dissolvendo 400 mg de Pluronic P--85 e 600 mg de

Pluronic L-64 em 50 mL de RPMI 1640 a 4°C. A mistura foi incubada durante 30 minutos a 3/°C e depois esterilizada por filtração através de um filtro de 0,22 μιτι. A solução filtrada foi misturada com uma solução de 100 mg de pó de haloperidol liofilizado estéril dissolvido em 50 mL de RPMI e incubada durante 30 minutos α 37°C. A composição pode ser armazenada no escuro à temperatura ambiente durante pelo menos 1 ano no escuro à temperatura ambiente.

Exemplo 16 - Composição parentérica

Outra composição adequada para administração parentérica preparada através da dissolução de 100 mg de ascorbato de sódio em 100 mL de uma solução aquosa de cloreto de sódio a 9%. A metade desta solução foram adicionados a 4°C 400 mg de Pluronic P-85 e 600 mg de Pluronic L-64. A mistura foi incubada durante 30 minutos a 37°C e depois esterilizada por filtração através de um filtro de 0,22 μπι. Separadamente foram dissolvidos 100 mg de pó de haloperidol estéril liofilizado e 50 mg de glucose, na restante solução de ascorbato de sódio-cloreto de sódio e as duas soluções foram misturadas e incubadas durante 30 minutos a 37 °C.

Esta composição pode ser armazenada durante 30 dias no escuro à temperatura ambiente sem perda de actividade ou pode ser liofilizada e armazenada durante pelo menos 1 ano no escuro à temperatura ambiente.

Exemplo 17 - Composição parentérica

Outra composição adequada para administração parentérica preparada através da dissolução de 100 mg de ascorbato de sódio em 100 mL de solução aquosa de cloreto de sódio a 9%. A metade desta solução foram adicionados a 4°C 400 mg de Pluronic P-85 e 600 mg de Pluronic L-64. A mistura foi incubada durante 30 minutos a 37°C. Separadamente foram diooolvido3 100 mg de pó de

ii í haloperidol liofilizado e 50 mg de glucose, na restante solução de ascorbato de sódio-cloreto de sódio e as duas soluções toram misturadas e incubadas durante 30 minutos a 37°C. A mistura combinada foi esterilizada por filtração através de um filtro de 0,22 μηη.

Esta composição pode ser armazenada durante 30 dias no escuro à temperatura ambiente sem perda de actividade ou pode ser 1 j of i 1. .i zada e armazenada durante pelo menos 1 ano no escuro à temperatura ambiente.

Exemplo 18 - Composição parentérica

Uma composição para administração parentérica foi preparada por dissolução de 400 mg de pluronic P-85 e 600 mg de pluronic de L-64 em 50 ml de solução aquosa contendo ascorbato de sódio a 1 mg/mL e cloreto de sódio a 0,9 g/mL. A mistura foi incubada durante 30 min a 37°C. A isto foram adicionados 100 mg de pó de haloperidol liofilizado e 50 mg de glucose dissolvidos em 50 mL de uma solução aquosa contendo ascorbato de sódio a 1 mg/ml e cloreto de sódio a 0,9 g/mL e esta mistura combinada foi incubada durante 30 min a 37°C. A 100 mL desta preparação foram dissolvidos 40 mg de pó de Fab anti-GFAP hidrófobo liofilizado e esta solução foi incubada durante 30 minutos a 37 °C e então esterilizada por filtração através de um filtro de 0,22 μπι. A composição pode ser armazenada durante 30 dias no escuro à temperatura ambiente sem perda de actividade ou pode ser liofilizada e armazenada durante pelo menos 1 ano no escuro à temperatura ambiente.

Exemplo 19

Uma outra composição adequada para administração parentérica é preparada por dissolução de 100 mg de ascorbato de sódio em 100 mL de uma solução de cloreto de sódio a 9%. A esta solução foram adicionados 10 mg de Pluronic L-61 a 4°C. A mistura foi incubada durante 30 minutoo a 37°C c então 45 f, ? I v

esterilizada por filtração através de um filtro de 0,22 μιη. Esta solução é empacotada em conjunto com um recipiente com 10 mg de doxorrubicina.

Exemplo 20 - Toxicidade aguda

Foi tísLudddd a Luxiuidddt; ayuda de Plurunic F108, PSD e Lõl em murganhos BALB/c machos de 5 semanas de idade. Cada grupo experimental de murganhos incluiu 6 murganhos. Foram administradas i.p. várias doses de soluções isotónicas de Pluronic. A mortalidade animal foi monitorizada diariamente durante 14 dias. A LD50 e a dosagem máxima tolerada ("MTD", isto é, a dose com a qual não morre nenhum dos 6 animais equivalentemente tratados) foram calculadas por análise próbite. Ver, Chan e Hayes em Principies and Methods of Toxícology, Hayes, A.W., ed., Raven Press, Nova Iorque, 1989, pág. 169-189. Os resultados foram como se segue:

Pluronic MTD, g/kg LD50, g/kg Pluronic L61 0,1 O co Pluronic P85 0,2 co o Pluronic F108 5,0 9,0

Exemplo 21 — Tratamento experimental de tumor glioma

Os anticorpos (Ab) contra GFPA e a2-glicoproteina foram modificados com resíduos de ácido esteárico como descrito no exemplo 1. Estes foram também covalentemente ligados a Pluronic P85 como descrito por Kabanov et al. J. Controlled Release, 22:141 (1992) . A eficácia terapêutica de doxorrubicina no tratamento de glioma foi explorada. As células C6 de glioma foram inoculadas intracerebralmente em grupos (n=25) de ratos machos Sprague-Dowley (280-300 g) obtidos no Departamento de Maternidade de 46 f ~ Lc, ......Γν \. χ·

Kriukovo da Academia de Ciências Russa. Foram administrados i.p. a 10, 15, 20 e 25 dias após inoculação, (a) 10 mg/kg de doxorrubicina livre, (b) doxorrubicina em Pluronic P85 a 1%, (c) doxorrubicina em Pluronic P85 a 10% contendo 0,1 mg/mL de Ab modificado com cloreto de ácido esteárico e (d) doxorrubicina em Pluronic P85 a 10% contendo 0,1 mg/mL de Ab ligado a Pluronic P85 (volume 1 mL/300 g de peso corporal) . Aos controlos foram administradas injecções i.p. com um igual volume de salino. As observações clinicas foram efectuadas diariamente. Os animais foram pesados semanalmente nos primeiros 2 meses e mensalmente depois. Os sinais vitais foram verificados para assegurar que o animal estava morto e a autópsia foi iniciada dentro dos 5 minutos após a morte do animal. Os resultados da sobrevivência foram analisados para graduar o efeito do fármaco na incidência e latência do tumor. Os resultados foram apresentados como uma taxa da mediana dos tempos de sobrevivência no grupo tratado (T) e controlo (C) . Para a autópsia foram guardados todos os orgãos principais e fixados na sua totalidade. A cauda (utilizada no estudo para identificação animal durante a fase de vida) foi guardada em formalina com os tecidos do animal. Todos os cérebros foram removidos e seccionados em três posições diferentes. Foram colhidas três secções da espinal medula ao nivel cervical, torácico e lombar. As amostras seccionadas foram colocada em cassetes Tissue Tek e processadas num processador de tecidos. As secções de tecido foram cortadas com uma espessura de 4-6 mm utilizando um micrótomo e coradas com hematoxilina-eosina. Os exames histopatológicos dos cérebros estabeleceu: (i) o número total de tumores em animais; (ii) o número de animais possuindo tumores; e (iii) a classificação histopatológica e a graduação de tumores. Os resultados da experiência 3ão 03 seguintes: 47

Grupo animal Média de sobrevivência, dias Ensaio/Controlo x 100% Controlo 11,2 - Doxorrubicina livre 10,5 Doxorrubicina micelar 25,3 226 Doxorrubicina micelar + anticorpos estearilados 41,0 366 Doxorrubicina micelar + anticorpos conj ugados 24,5 218

Os exames histopatológicos também revelaram que 1) a doxorrubicina livre não provocou efeito no tamanho e no número dos tumores em comparação com o controlo; 2) todas as três formulações micelares provocaram uma diminuição significativa no tamanho e número dos tumores; 3) o efeito mais pronunciado foi observado no caso da "doxorrubicina micelar mais anticorpos estearilados, neste caso, praticamente não se observaram tumores.

Lisboa, 27 de Setembro de 2001

o AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUS TRIAL

48

Claims (28)

1. rr*. '4 REIVINDICAÇÕES 1. Composição compreendendo. (a) um agente biológico; (b) um copolimero de bloco de poliéter compreendendo um segmento polimérico linear do tipo A ligado a uma extremidade de um segmento polimérico linear do tipo B, e (c) uma molécula de direccionamento compreendendo uma parte de direccionamento e uma parte lipofílica, em que a parte lipofílica compreende um hidrocarboneto possuindo de 3 a 41 átomos de carbono; e em que a referida composição forma uma micela.
2. 2. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que a parte lipofílica compreende um hidrocarboneto possuindo de 5 a 25 átomos de carbono.
3. 3. Composição de acordo com a reivindicação 2, em que a parte lipofílica compreende um hidrocarboneto possuindo de 9 a 17 átomos de carbono.
4. 4. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que o referido copolimero de bloco de poliéter é seleccionado do grupo de copolímeros de bloco de poliéter consistindo em: A-B-A' , A-B, B-A-B' , e UR1) (R2) (R3) (R4) (IV) (I) (II) (III) (IV) em que A e A' são segmentos polimérico3 lineares do tipo A, em que B e B' são segmentos poliméricos lineares do tipo B, e em que R1, R2, R3, e R4 são (1) copolímeros de bloco de poliéter de fórmulas (I), (II), ou (III) ou (2) hidrogénio e L são um grupo de ligação com a condição de não mais do 1 I J-' U, K 12 que dois de entre R1, R2, R3, ou R4 poderem ser hidrogénio e misturas destes.
5. 5. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que pelo menos 90% das ligações que unem as unidades de repetição p^-TA γλΗλ spQmentn pnl i méri r-.n dn t i pn Ά p segmento polimérico do tipo B compreendem ligações éter.
6. 6. Composição de acordo com a reivindicação 5, em que as unidades de repetição para cada segmento polimérico do tipo A e segmento polimérico do tipo B possuem um peso molecular entre 30 e 100.
7. 7. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que cada segmento polimérico do tipo A e segmento polimérico do tipo B consiste essencialmente em unidades de repetição de fórmula -0-R5, em que R5 é 2 1 - (CH2) n-CH (R6)em que n é zero ou um inteiro de 1 a 5 2 e R6 é hidrogénio, cicloalquilo possuindo 3 a 8 átomos de carbono, alquilo possuindo 1 a 6 átomos de carbono, fenilo, alquilfenilo em que o alquilo possui 1 a 6 átomos de carbono, hidroxilo, hidroxialquilo, em que o alquilo possui 1 a 6 átomos de carbono, alcoxilo 3 possuindo 1 a 6 átomos de carbono, um alquilcarbonilo 4 possuindo 2 a 7 átomos de carbono, alcoxicarbonilo, em que o alcoxilo possui 1 a 6 átomos de carbono, 5 alcoxicarbonilalquilo, em que o alcoxilo e o alquilo cada um independentemente possui 1 a 6 átomos de carbono, alquilcarboxialquilo, em que cada grupo alquilo possui independentemente de 1 a 6 átomos de carbono, aminoalquilo em que o alquilo possui 1 a 6 átomos de carbono, alquilamina ou dialquilamina, em 6 que cada alquilo independentemente possui 1 a 6 átomos i ιτρ- 1—Ci ií ' de carbono, mono- ou di-alquiaminoalquilo em que cada alquilo independentemente possui 1 a 6 átomos de carbono, cloro, cloroalquilo em que o alquilo possui 1 a 6 átomos de carbono, flúor, fluoralquilo, em que o alquilo possui 1 a 6 átomos de carbono, ciano ou cianoalqui1 o em que o alquilo possui 1 a fi átomos de carbono ou carboxilo; (2) um grupo carbocíclico possuindo 3 ou 8 átomos de carbono em anel, que não é substituído ou é substituído com alquilo possuindo 1 a 6 átomos de carbono, alcoxilo possuindo 1 a 6 átomos de carbono, alquilamino possuindo 1 a 6 átomos de carbono, dialquilamino em que cada alquilo independentemente possui 1 a 6 átomos de carbono, amino, sulfonilo, hidroxilo, carboxilo, substituições de flúor ou cloro, ou (3) um grupo heterocí clico de 3 a 8 átomos em anel, e possuindo de 1 a 4 heteroátomos seleccionados independentemente do grupo consistindo em oxigénio, azoto e enxofre e que não é substituído ou é substituído por alquilo possuindo 1 a 6 átomos de carbono, alcoxilo possuindo 1 a 6 átomos de carbono, alquilamino possuindo 1 a 6 átomos de carbono, dialquilamino em que cada alquilo independentemente possui 1 a 6 átomos de carbono, amino, sulfonilo, hidroxilo, carboxilo, substituições de flúor ou de cloro.
8. 8. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que a percentagem de peso hidrófobo do copolímero de bloco de poliéter é pelo menos 50%. 3

   U
9. 9. Composição de acordo com a reivindicação 8, em que a percentagem de peso hidrófobo do copolimero de bloco de poliéter é pelo menos 60%.
10. 10. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que o peso mnl pr.nl ar hi drófobo do copolimero de bloco de poli éter é pelo menos 900.
11. 11. Composição de acordo com a reivindicação 10, em que o peso molecular hidrófobo do copolimero de bloco de poliéter é pelo menos 1700.
12. 12. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que o peso molecular hidrófobo do copolimero de bloco de poliéter é pelo menos 2000 e a percentagem de peso hidrófobo do copolimero de bloco de poliéter é pelo menos de 20%.
13. 13. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que a composição compreende um ou mais dos copolimeros de bloco de poliéter e os copolimeros de bloco de poliéter possuem uma concentração micelar critica ("CMC") de 0,5% p/vol ou menos a 37°C numa solução aquosa isotónica.
14. 14. Composição de acordo com a reivindicação 13, em que os copolimeros de bloco de poliéter possuem uma CMC de 0,05% p/vol ou menos a 37°C numa solução aquosa isotónica.
15. 15. Composição de acordo com a reivindicação 14, em que os copolimeros de bloco de poliéter possuem uma CMC de 0,01% p/vol ou menos a 37°C numa solução aquosa isotónica.
16. 16. Composição de acordo com as reivindicações 1 ou 8 a 15, em que o copolimero de bloco de poliéter está em conformidade com a seguinte fórmula: 4

    ch3 I HO- [CH2CH20] m/2- [CHCH20] n- [CH2CH20] m/2-H em que m e n são inteiros entre 4 e 400.
17. 17. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que o agente biológico é seleccionado do grupo consistindo em fenotiazinas, alcaloides de rauwolfia, tiozantenos difenilbutilpiperidinas, benzamidas, derivados de glicerol, propanodióis, derivados de difenilmetano, benzodiazepinas, hipnóticos, bloqueadores β, dibenzazepinas, dibenzocicloheptenos, tetraciclicos, inibidores de MAO, derivados da feniletilamina, dimetilaminoetanóis, compostos que mimam GABA, alcaloides, colinérgicos, vasodilatadores, agentes activos para o cérebro, agentes quimioterapêuticos e misturas destes.
18. 18. Composição de acordo com a reivindicação 17, em que o agente biológico é um agente quimioterapêutico anti-tumor.
19. 19. Composição de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 18 para utilização num método de tratamento.
20. 20. Utilização de uma composição de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 18 no fabrico de um medicamento para o tratamento do cancro.
21. 21. Utilização de acordo com a reivindicação 20 de uma composição compreendendo: (a) uma qnanti dada aficaz no trafamanto do cancro da nm agente quimioterapêutico; e (b) um copolimero de bloco de poliéter compreendendo um segmento polimérico linear do tipo A, cujas unidades de repetição têm contribuições para o peso molecular entre 30 e 500, ligadas numa 5

    extremidade a um segmento polimérico linear do tipo B, cujas unidades de repetição têm contribuições para o peso molecular entre 30 e 500; e (c) uma molécula de direccionamento compreendendo uma parte de direccionamento e uma parte lipofilica, em qnp a psrtp lipofilica rnmprppndp um hi drorarhonet o possuindo 3 a 41 átomos de carbono; em que a referida composição forma uma micela, no fabrico de um medicamento para o tratamento do cancro.
22. 22. Utilização de acordo com a reivindicação 21, em que a parte lipofilica compreende um hidrocarboneto possuindo de 5 a 25 átomos de carbono.
23. 23. Utilização de acordo com a reivindicação 21, em que o agente quimioterapêutico da composição administrada é um alcaloide vinca, antibiótico tipo mitomicina, antibiótico tipo bleomicina, antifolato, colchicina, demecolina, etopósido, taxano ou antibiótico de antraciclina.
24. 24. Utilização de acordo com a reivindicação 23, em que o agente quimioterapêutico da composição administrada é o antibiótico de antraciclina doxorrubicina, daunorrubicina, carminomicina, epirrubicina, idarrubicina, mitoxantrona, 4-demetoxi-daunomicina, 11-desoxidaunorrubicina, 13- desoxidaunorrubicina, 14-benzoato de adriamicina, 14-octanoato de adriamicina, ou 14-naftalenoacetato de adriamicina.
25. 25. Utilização de acordo com a reivindicação 21, em que o cancro é um cancro do cérebro.
26. 26. Utilização de acordo com a reivindicação 21, em que o cancro é uma leucemia, cancro da mama, cancro do ovário, 6 cancro pancreático, cancro do pulmão, mieloma, melanoma, glioma ou astrocitoma.
27. 27. Utilização de acordo com a reivindicação 21, em que o cancro é linfoma de Hodgkin, linfoma não Hodgkin, linfoma linfocítico agudo, linfoma mielocitico agudo, leucemia não linfática aguda, sarcoma de Karposi, cancro do pulmão de célula pequena, cancro do pulmão de célula não pequena, ou astrocitoma da glia.
28. 28. Utilização de uma composição de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 18 compreendendo: (a) uma quantidade microbianamente eficaz de um agente biológico; e (b) um copolimero de bloco de poliéter compreendendo um segmento polimérico linear do tipo A, cujas unidades de repetição possuem contribuições para o peso molecular entre 30 e 500, unido a uma extremidade de um segmento polimérico linear do tipo B, cujas unidades de repetição possuem contribuições para o peso molecular entre 30 e 500; e (c) uma molécula de direccionamento compreendendo uma parte de direccionamento e uma parte lipofilica, em que a parte lipofilica compreende um hidrocarboneto possuindo 3 a 41 átomos de carbono; em que a referida composição forma uma micela, no fabrico de um medicamento para tratar uma infecção microbiana do cérebro. Lisboa, 27 de Setembro de 2001 0 AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

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