PT833646E

PT833646E - Analogos de somatostatina multi-tirosinados

Info

Publication number: PT833646E
Application number: PT96917939T
Authority: PT
Inventors: David Howard Coy; William A Murphy; Eugene A Woltering; M Sue O'dorisio; Thomas M O'dorisio
Original assignee: Univ Tulane; Childrens Hospital Inc; Univ Ohio State Res Found; Louisiana State Univ Medical C
Priority date: 1995-06-05
Filing date: 1996-06-03
Publication date: 2000-04-28
Also published as: EP0833646A4; JPH11507622A; US5597894A; EP0833646B1; DK0833646T3; DE69605419D1; GR3032437T3; AU709506B2; NZ310006A; AU6031796A; WO1996039161A1; ES2140858T3; ATE187075T1; CA2222962A1; DE69605419T2; EP0833646A1; CZ386297A3

Description

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DESCRICÀO “Análogos de somatostatina multi-tirosinados”

Antecedentes do Invento O presente invento refere-se ao diagnóstico e ao tratamento de tumores possuindo receptores de superfície específicos para péptidos.

Apesar dos avanços no diagnóstico e no tratamento do cancro, a cirurgia continua a ser o tratamento a longo prazo mais eficaz e de maior confiança para alguns tipos de cancro. O sucesso da cirurgia é limitado pela localização precisa e completa pré-operatória ou intra-operatória de tumores, ocorrendo uma avaliação imprecisa e incompleta da doença em 20% a 40% dos casos de cancro. Embora estejam disponíveis várias técnicas de formação de imagens pré-operatórias, a sensibilidade destas técnicas é proporcional ao tamanho do tumor. Por exemplo, o limite inferior de resolução em varrimento CT é 0,8 cm a 1,0 cm. A angiografia superselectiva é mais bem sucedida na localização de tumores, mas requer uma perícia técnica altamente experimentada. As técnicas de localização de tumores que não se baseiam em formação de imagens, tais como amostragem venosa portal trans-hepática percutânea (PTPVS), foram utilizadas com sucesso para localizar regionalmente pequenos tumores funcionais não detectados por outros métodos. No entanto, estes métodos de localização de tumores são limitados. Por exemplo, PTPVS não permite a avaliação individual rotineira de positividade ou negatividade nodal e pode não detectar tumores multicêntricos.

Quando falha a localização pré-operatória do tumor, o clínico tem em seguida de recorrer a cirurgia exploratória combinada com localização e reseccionamento intra-operatórios do tumor. A localização intra-operatória agressiva é conseguida com uma combinação de ultra-sons, apalpação e técnicas endoscópicas ou laparoscópicas. Embora estas técnicas permitam a detecção de pequenos tumores não detectados pelas técnicas de localização pré-operatórias disponíveis, pequenos tumores fora dos órgãos inspeccionados podem permanecer não detectados. Para além disso, a morbidez resultante da cirurgia exploratória aumenta à medida que mais tecido é perturbado.

Uma variedade de cancros, incluindo tanto tumores endócrinos como não endócrinos, expressam receptores de somatostatina. Cinco receptores de somatostatina humanos foram identificados e clonados. A expressão destes cinco subtipos de receptor varia com os tipos de tecido. O receptor de somatostatina subtipo 2 é expresso numa grande variedade de tipos de 2 84 102 ΕΡ 0 833 646/ΡΤ tumor. As Tabelas IA e 1B proporcionam um resumo da expressão de receptores de somatostatina tanto em tecidos normais como tumorais.

TABELA IA

Expressão de Subtipos do Receptor de Somatostatina em Tecido Humano Normal

Tecido Humano Normal Subtipo de Receptor Referência Córtex Frontal SST2, SST1, SST3, SST5 Yamada et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89:251-255, 1992; Rohrer et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:4196-4200, 1993 Fígado SST2 (baixa) Yamada et al., supra Pulmão SST1 Rohrer et al., supra Estômago SST1 Yamada et al, supra Intestino (jejuno) SST1 Yamada et al., supra Pâncreas SST1, SST3 Yamada et al., supra Cólon SST1 (baixa) SST2 (baixa) Yamada et al, supra Rim SST2 Yamada et al, supra Exnressão de Subti TABELA 1B nos do Receotor de Somatostatina em Tecido Humano Tumoral Tecido Humano Tumoral Subtipo de Receptor Referência Pulmão SST2 Patel et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 198:605-612. 1994 Carcinóide SST2, SST1, SST3 Patel et al, supra Insulinoma SST3 Reubi et al., Câncer Res., 54:3455-3459. 1994 Que Segrega ACTH SST1, SST2 Reubi et al., supra CLL SST2 Patel et al, supra Neuroblastoma SST2 Patel et al, supra Mama SST2 Patel et al, supra Cólon SST1 Yamada et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89:251-255, 1992 Hepatoma SST2 Yamada et al, supra Prolactinoma Pituitário SST2, SST3 Reubi et al, supra Adenoma Pituitário SST2, SST1.SST3 Patel et al, supra-, Reubi et al., supra Meningioma SST2 Patel et al, supra

84 102 ΕΡ 0 833 646/ΡΤ 3 A somatostatina produzida endogenamente inibe a libertação de vários factores pituitários e intestinais que regulam a proliferação celular, mobilidade celular e/ou secreção incluindo a hormona de crescimento, hormona adrenocorticotropina, prolactina, hormona estimulante da tiróide, insulina, glucagon, motilina, péptido inibidor gástrico (GIP), péptido intestinal vasoactivo (VIP), secretina, colecistoquinina, bombesina, péptido de libertação da gastrina (GRP), gastrina, hormona adrenocorticotrópica (ACTH), hormona de libertação da tiróide (TRH), coleocistoquinina (CCK), aldosterona, polipéptido pancreático (PP), citóquinas (p. ex., interleucinas, interferões), factores de crescimento (p. ex., factor de crescimento epidérmico, factor de crescimento dos nervos) e aminas vasoactivas (p. ex., serotonina). Vários destes factores estão implicados na regulação da proliferação de células normais, bem como na proliferação de células tumorais e/ou metástases. Por exemplo, GRP estimula a proliferação de células epiteliais intestinais normais e malignas, estimula a proliferação de células epiteliais brônquicas normais e é um factor de crescimento autócrino no carcinoma das células pequenas do pulmão. A somatostatina-14 (S-14) e a somatostatina-28 (S-28) são as duas formas principais de somatostatina nativa. S-14 é um péptido de 14 aminoácidos possuindo a sequência Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys (SEQ ID NO: 1). A sequência de aminoácidos de S-14 é altamente conservada entre as espécies de vertebrados. S-14 tem uma estrutura molecular cíclica estabilizada por uma ponte de dissulfureto entre Cys3 e Cys14 (as cisteínas nas posições 3 e 14 a partir do terminal N) e por ligações de hidrogénio e ligações hidrófobas. Quatro aminoácidos dentro da estrutura de anel da somatostatina, Phe7-Trp8-Lys9-Thrl0 (SEQ ID NO: 2), são principalmente responsáveis pela ligação ao receptor e pela actividade biológica, enquanto que os resíduos Trp8-Lys9 são predominantes na ligação ao receptor. S-28 é um péptido de 28 aminoácidos e contém a sequência de aminoácidos de S-14 com 14 aminoácidos adicionais que se prolongam a partir do terminal N. As diferenças estruturais entre S-14 e S-28 influenciam os graus relativos de actividade inibidora nas funções biológicas reguladas por somatostatina. Vários análogos peptídicos de somatostatina foram produzidos por eliminação de aminoácidos que não são absolutamente necessários para a actividade e/ou substituição dos L-aminoácidos nativos pelos isómeros D-aminoácidos correspondentes. Assim, alguns destes análogos são agonistas de receptores de actuação mais prolongada, mais potentes que a somatostatina nativa, devido em parte à resistência dos D-aminoácidos a degradação enzimática. Por exemplo, o análogo de somatostatina sintético acetato de octreotídeo, o qual tem a sequência de aminoácidos D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr(ol) (SEQ ID NO: 3), é 45 a 70 vezes mais potente que a somatostatina nativa na inibição de libertação de factor de crescimento. LANREOTIDE™, um análogo octapeptídico de somatostatina 84 102 ΕΡ 0 833 646/ΡΤ 4

sintético possuindo a sequência de aminoácidos Dp-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr(NH2) (SEQID NO: 4), é 20 a 50 vezes mais potente que a somatostatina nativa. A utilização de análogos de somatostatina em diagnóstico e terapia está limitada pela semi-vida relativamente curta destes análogos in vivo. Para além disso, as técnicas de localização de tumores que utilizam análogos de somatostatina detectáveis marcados estão limitadas pela quantidade de marcação detectável que pode ser associada a cada análogo, a força do sinal gerado por molécula de análogo e a sensibilidade das técnicas de detecção de marcação disponíveis. Existe uma clara necessidade no campo tanto de métodos de diagnóstico como terapêuticos os quais permitam uma identificação altamente específica e sensível de células tumorais, bem como regimes de terapia de cancro menos invasivos.

Resumo do Invento

Verificou-se que os análogos peptídicos de somatostatina podem ser modificados através da adição de prolongamentos de aminoácidos N-terminais sem prejudicar a capacidade do composto para se ligar a receptores de somatostatina. Os prolongamentos N-terminais podem ser lineares ou ramificados e podem ser formulados de forma a incluírem múltiplos resíduos de L-, D- ou desamino-tirosina.

De forma concordante, o invento apresenta métodos e composições para o diagnóstico e tratamento de doenças associadas a (1) expressão anormal de um receptor de somatostatina (p. ex., cancro) ou (2) produção aumentada de um factor(es) regulável(is) por somatostatina (p. ex., acromegalia).

Num aspecto, o invento apresenta um composto com a fórmula: a) (Y)n+1P, b) (Y)n-Ala-Y-P, ou c) (YXpX],., χ

(Y)s[ XJs-i em que P é um análogo peptídico de somatostatina que se liga a um receptor de somatostatina, Y é D-tirosina, L-tirosina ou desamino-tirosina, n é um número inteiro de 1 a 32, inclusive, cada q, independentemente, é um número inteiro de 1 a 32, inclusive, e cada s, independentemente, é um número inteiro de 1 a 32, inclusive, onde q e s podem ser iguais ou diferentes, e 5 84 102 ΕΡ 0 833 646/ΡΤ X tem a fórmula D-NH2-CH(CH2)mNH2-C02H ou L-NH2-CH(CH2)mNH2-C02H, em que m é um número inteiro de 1 a 10, inclusive.

De preferência, P tem a fórmula: a) Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2; b) Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2; ou c) Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr(ol).

Noutras concretizações preferidas, X é lisina. De preferência, o composto contém pelo menos um átomo de halogéneo ligado a uma tirosina (Y na fórmula de cima) do composto. De preferência, o átomo de halogéneo é radioactivo.

Os compostos preferidos têm uma das fórmulas: a) D-Tyr-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH-), b) Tyr-D-Tyr-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH?, c) Tyr-Ala-D-T^yr-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH,, d) Tyr-D-Tyr-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2, e) D-Tyr-Tyr-Tyr-D-Tyr-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2, ou f) D-Tyrx

Lys D-Ty/ \

Lys D-Tyr\

Lys D-Ty/

Lys-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2 D-Tyr^

Lys D-Ty/

Lys D-Tyrx

Lys D-Ty/

Os compostos do invento podem ser misturados com um transportador

84 102 ΕΡ 0 833 646/ΡΤ 6 farmaceuticamente aceitável para preparar uma composição farmacêutica.

Os compostos do invento podem ser utilizados para detectar in vivo um tumor que expresse um receptor de somatostatina: 1) administrando a um doente uma quantidade de um composto do invento marcado radioactivamente eficaz na ligação a receptores de somatostatina em células cancerosas no doente, e 2) detectando a radiação emitida pelo composto marcado radioactivamente ligado às células cancerosas.

Os compostos do invento podem também ser utilizados para diagnosticar uma condição associada a expressão anormal de um receptor de somatostatina e à produção de um marcador bioquímico (p. ex., cancros tais como gastrinoma): 1) administrando a um doente uma quantidade de um composto do invento eficaz na inibição da produção de um marcador bioquímico associado à referida condição; e 2) determinando o nível de marcador bioquímico produzido após administração do composto em relação a um nível de marcador bioquímico produzido antes da administração do composto; uma diminuição no nível de marcador bioquímico (em relação ao nível de marcador bioquímico antes da administração do composto) é indicativa de uma condição associada a expressão anormal de um receptor de somatostatina e/ou é controlável através da administração de somatostatina ou análogo de somatostatina.

Os compostos do invento podem também ser utilizados para tratar um doente possuindo uma condição associada a expressão anormal de um receptor de somatostatina (p. ex., cancro), administrando ao doente uma quantidade de um composto do invento eficaz na ligação a receptores de somatostatina de células que expressem de forma anormal os referidos receptores.

Os compostos do invento podem também ser utilizados para tratar um doente possuindo uma condição associada a uma produção anormalmente aumentada de um factor(es) regulável(is) por somatostatina, administrando ao doente uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto do invento (p. ex., acromegalia).

Os compostos do invento são também úteis para diagnosticar in vitro um tumor associado a expressão anormal de um receptor de somatostatina: a) obtendo a partir de um doente uma amostra de tecido suspeito de expressar de forma anormal um receptor de somatostatina; b) pondo a amostra em contacto com um composto do invento marcado de forma detectável para permitir a ligação do composto aos receptores de somatostatina da amostra; e c) medindo a ligação do marcador à amostra. Um nível de marcador ligado à amostra significativamente superior (p. ex., mais que o dobro) a um nível de marcador ligado

84 102 ΕΡ 0 833 646/ΡΤ 7 a uma amostra de controlo negativo é indicativo de um tumor associado a expressão anormal de um receptor de somatostatina no referido doente.

Num aspecto o invento apresenta um método para detecção in situ de um tumor que expressa um receptor de somatostatina o qual envolve: 1) administração a um doente de uma quantidade de um composto do invento marcado radioactivamente eficaz na ligação a receptores de somatostatina em células cancerosas no doente, e 2) detecção da radiação emitida pelo composto marcado radioactivamente ligado às células cancerosas.

Noutro aspecto, o invento apresenta um método para diagnosticar uma condição associada a expressão anormal de um receptor de somatostatina e à produção de um marcador bioquímico (p. ex., cancros tais como tumores neuroendócrinos e gastrinomas, e condições tais como acromegalia). Este método de diagnóstico envolve: 1) administração a um doente de uma quantidade de um composto do invento eficaz na inibição da produção de um marcador bioquímico associado à referida condição; e 2) determinação do nível de marcador bioquímico produzido após administração do composto em relação ao nível de marcador bioquímico produzido antes da administração do composto. Uma diminuição no nível de marcador bioquímico (em relação ao nível de marcador bioquímico antes da administração do composto) é indicativa de uma condição associada a expressão anormal de um receptor de somatostatina.

Noutro aspecto, o invento apresenta um método para diagnosticar in viíro um tumor associado a expressão anormal de um receptor de somatostatina, o qual envolve: a) obtenção a partir de um doente de uma amostra de tecido suspeito de expressar de forma anormal um receptor de somatostatina; b) pôr em contacto a amostra com um composto marcado de forma detectável de acordo com o invento para permitir a ligação do composto aos receptores de somatostatina da amostra; e c) detecção de um nível de ligação do marcador à amostra. Um nível de ligação do marcador à amostra significativamente superior a um nível de ligação a uma amostra de controlo negativo é indicativo de um tumor associado a expressão anormal de um receptor de somatostatina no referido doente.

Tal como aqui utilizado, "análogo de somatostatina" ou "análogo peptídico de somatostatina" significa um derivado estrutural da somatostatina nativa o qual se liga a um receptor de somatostatina com pelo menos cerca de 5% da avidez e/ou afinidade da somatostatina nativa. Os análogos incluem tanto antagonistas como agonistas de somatostatina. Em geral, os análogos peptídicos de somatostatina: 1) contêm a sequência de aminoácidos Cys-X1-D-Trp-Lys-X2-Cys-Thr ou uma derivada desta com uma substituição por um D-aminoácido (i.e., qualquer um dos aminoácidos pode ser D- em vez de L-), em que

84 102 ΕΡ 0 833 646/ΡΤ 8 X, é de preferência Phe ou Tyr e X2 é de preferência Thr ou Vai; e 2) variam entre cerca de 1000 Da e 15000 Da em peso molecular.

Tal como aqui utilizado, "halogéneo" ou "átomo de halogéneo" significa flúor, cloro, bromo, iodo ou astatina.

Tal como aqui utilizado, "expressão anormal de um receptor de somatostatina" significa expressão de receptores de somatostatina à superfície de um determinado tipo de células normais, a um nível significativamente maior que o nível de expressão à superfície normalmente associado a esse determinado tipo de células normais. Por exemplo, tumores caracterizados como neuroblastomas expressam de forma anormal receptores de somatostatinas, logo as células de um neuroblastoma têm um nível mais elevado de expressão à superfície de receptores de somatostatina que o tecido nervoso do qual derivou o neuroblastoma. Pode ocorrer expressão anormal à superfície da célula através de vários mecanismos tais como regulação superior da transcrição e tradução do ácido nucleico que codifica receptores de somatostatina, regulação superior da apresentação à superfície, e/ou regulação inferior da degradação de receptores e/ou intemalização aumentada.

Tal como aqui utilizado, "marcador bioquímico" significa uma hormona, péptido, proteína ou outra substância biológica associada a um fenómeno biológico específico (p. ex., proliferação celular, mobilidade celular, metástase tumoral) ou tipo celular (p. ex., célula neuroendócrina, célula endócrina, célula tumoral).

Tal como aqui utilizado, "uma condição associada a uma produção anormalmente aumentada de um factor regulável por somatostatina" significa uma condição caracterizada pela produção de um factor(es) regulável(is) por somatostatina, produção essa que é significativamente maior que a produção do mesmo factor na ausência da condição. A acromegalia, a qual está associada a sobre-produção do factor regulável por somatostatina, hormona de crescimento e factor de crescimento semelhante à insulina -1, é um exemplo de uma tal condição.

Tal como aqui utilizado, "factor regulável por somatostatina" significa qualquer hormona, péptido, proteína ou outra substância biológica a qual é diminuída ou inibida na sua expressão e/ou secreção na presença de somatostatina. Exemplos de factores reguláveis por somatostatina incluem, mas não se limitam a, hormona de crescimento, hormona adrenocorticotropina (ACTH), prolactina, hormona estimulante da tiróide, insulina, glucagon, motilina, péptido inibidor gástrico (GIP), péptido intestinal vasoactivo (VIP), secretina, colecistoquinina (CCK), bombesina, hormona de libertação da tiróide (TRH),

84 102 ΕΡ 0 833 646/ΡΤ 9 aldosterona, citóquinas (ρ. ex., interleucinas, interferões), factores de crescimento (p. ex., factor de crescimento epidérmico (EGF), factor de crescimento dos nervos (NGF)), gastrina e péptido de libertação da gastrina (GRP).

Tal como aqui utilizado, "composição farmacêutica" significa uma composição apropriada para administração a um doente para utilização num método de diagnóstico ou tratamento.

Tal como aqui utilizado, "quantidade terapeuticamente eficaz" significa uma quantidade de uma composição eficaz no tratamento de uma condição associada a produção anormalmente aumentada de um factor regulável por somatostatina ou expressão anormal de um receptor de somatostatina, particularmente um tumor possuindo receptores aos quais se pode ligar o péptido multi-tirosinado administrado.

Uma vantagem do invento é a de que múltiplos átomos de radioisótopos podem ser ligados a um único análogo de somatostatina multi-tirosinado (i.e., um composto do invento). Após ligação a um receptor de somatostatina, estes análogos multi-marcados distribuem vários radioisótopos (do mesmo elemento ou de elementos diferentes e/ou do mesmo nível de energia ou de níveis diferentes) por um único receptor, proporcionando assim uma dose de radiação mais potente no local para terapia e um sinal radioactivo mais forte para técnicas de radio localização de diagnóstico possuindo uma sensibilidade mais elevada.

Outra vantagem do invento é a de que os análogos de somatostatina multi-tirosinados têm semi-vidas mais elevadas in vivo em relação aos análogos de somatostatina convencionais, são resistentes a degradação enzimática e têm uma penetração mais elevada na barreira hemato-encefálica.

Outra vantagem do invento é a de que os análogos de somatostatina multi-tirosinados halogenados se ligam de forma irreversível a receptores de somatostatina, permitindo assim a detecção de análogos ligados durante um período de tempo mais longo em relação a análogos que se ligam de forma reversível.

Outras características e vantagens do invento serão aparentes a partir da seguinte descrição das concretizações preferidas deste e a partir das reivindicações. 10 84 102 ΕΡ 0 833 646/ΡΤ

Breve Descrição dos desenhos

As Figs. 1A-D são gráficos que mostram as curvas de ligação a receptores de somatostatina para somatostatina nativa (Fig. 1 A), WOC-2A (Fig. 1B) e WOC-3B (Fig. 1C), bem como uma curva composta (Fig. 1D) que mostra as afinidades relativas de ligação de somatostatina nativa (quadrados a branco), WOC-2A (círculos a cheio), WOC-3B (losangos a branco) e lanreótido (triângulos a branco).

Descrição Detalhada

Os análogos de somatostatina multi-tirosinados do invento ligam-se a receptores de somatostatina com substancialmente a mesma afinidade que a somatostatina nativa. Os análogos de somatostatina multi-tirosinados podem ser modificados por halogenação dos resíduos de tirosina do composto. Tais análogos halogenados do invento ligam-se a receptores de somatostatina com uma afinidade tão elevada que a ligação e praticamente irreversível sob condições fisiológicas. Os análogos multi-tirosinados do invento podem ainda ser modificados através de marcação detectável, p. ex. ligando um radioisótopo (p. ex., 125I, 127I, 123I, 129I, 131I) aos resíduos de tirosina e/ou ligando outros compostos (p. ex., um fluorocromo tal como uma fluoresceína) a um resíduo de lisina do análogo, particularmente um análogo possuindo um prolongamento N-terminal ramificado contendo lisinas.

Os análogos de somatostatina multi-tirosinados e derivados halogenados destes podem ser utilizados numa variedade de métodos de diagnóstico e terapêuticos. Utilizações exemplares dos análogos do invento são resumidas abaixo.

Resumo dos métodos de diagnóstico e terapêuticos do invento I. Diagnóstico e tratamento de condições associadas a expressão anormal de receptores de somatostatina e produção de um marcador bioquímico

Os análogos de somatostatina multi-tirosinados podem ser utilizados para diagnosticar condições associadas a expressão anormal de um receptor de somatostatina e concomitante produção de um marcador bioquímico. Se a administração do análogo multi-tirosinado resultar numa diminuição dos níveis de marcador bioquímico em relação ao nível de marcador bioquímico antes da administração do análogo, então o doente tem uma condição associada a expressão anormal de um receptor de somatostatina. O análogo multi-tirosinado pode ser não modificado ou modificado por halogenação. De preferência, o análogo é halogenado e não radioactivo. 11 84 102 ΕΡ 0 833 646/ΡΤ

Os análogos de somatostatina multi-tirosinados e derivados halogenados destes podem também ser utilizados para tratar doentes possuindo uma condição associada a expressão anormal de um receptor de somatostatina e/ou produção anormalmente aumentada de um factor(es) regulável(is) por somatostatina. O análogo administrado neste método terapêutico pode estar modificado ou não modificado. De preferência o análogo é halogenado e não radioactivo. Π. Diagnóstico e tratamento de tumores que expressam receptores de somatostatina

Derivados marcados radioactivamente dos análogos de somatostatina multi-tirosinados do invento podem ser utilizados na detecção e diagnóstico de tumores que expressam receptores de somatostatina. Estes métodos de diagnóstico podem ser efectuados: 1) in vivo', 2) in situ; ou 3) in vitro.

Os métodos de diagnóstico in vivo envolvem a administração de um análogo multi-tirosinado marcado radioactivamente, de preferência um análogo marcado radioactivamente com ,23I ou 131I, e detecção do tecido que expressa os receptores de somatostatina através de técnicas de formação de imagens in vivo conhecidas na arte (p. ex., métodos cintigráficos médicos nucleares).

Os métodos de diagnóstico in situ envolvem a administração de um análogo multi-tirosinado marcado radioactivamente, de preferência um análogo marcado radioactivamente com I, imediatamente antes, ou durante, a remoção cirúrgica do tumor. O tecido que expressa os receptores de somatostatina é detectado directamente no doente durante a cirurgia e o tecido que possuir uma quantidade significativa de marcação radioactiva ligada é excisado. O método de diagnóstico in vitro é efectuado, por exemplo, numa amostra de tecido de biópsia pondo em contacto a amostra com um análogo multi-tirosinado marcado de forma detectável.

Geralmente, a ligação do análogo a um tecido a um nível superior aos níveis de controlos negativos (p. ex., níveis de análogo que se liga a tecido normal {in vivo) ou uma amostra de tecido normal saturada (in vitro)) é indicativa de um tumor associado a expressão anormal de um receptor de somatostatina. Os doentes que possuem tumores que expressam receptores de somatostatina, tal como determinado pelos métodos acima descritos ou por 12 84 102 ΕΡ 0 833 646/ΡΤ métodos de diagnóstico convencionais, podem ser tratados utilizando um análogo de somatostatina multi-tirosinado marcado radioactivamente, de preferência um análogo marcado radioactivamente com 131I, do invento.

Cada uma destas utilizações para análogos de somatostatina multi-tirosinados é abaixo descrita em pormenor. Será primeiro apresentada uma descrição geral da síntese e modificação dos análogos do invento. Síntese de análogos de somatostatina multi-tirosinados A fórmula dos análogos de somatostatina multi-tirosinados do invento pode ser baseada na sequência de aminoácidos, ou um derivado da sequência de aminoácidos, de qualquer um dos vários análogos peptídicos de somatostatina comercialmente disponíveis ou outros análogos peptídicos de somatostatina conhecidos na arte (ver, por exemplo, os análogos de somatostatina descritos no Pedido PCT WO 91/09056 (1991); Pedido PCT WO 91/0114 (1991); Pedido Publicado EP N° 0505680A1 (1992); Pedido Publicado EP N° 0363589A2 (1990); Pedido EP N° 0203031A2 (1986); Pedido Publicado EP N° 0588754A1; Patente U.S. N° 4904642 (1990); Patente U.S. N° 4871717 (1989); Patente U.S. N° 4853371 (1989); Patente U.S. N° 4725577 (1988); Patente U.S. N° 4684620 (1987); Patente U.S. N° 4650787 (1987); Patente U.S. N° 4603120 (1986); Patente U.S. N° 4585755 (1986); Patente U.S. N° 4522813 (1985); Patente U.S. N° 4486415 (1984); Patente U.S. N° 4485101 (1984); Patente U.S. N° 4435385 (1984); Patente U.S. N° 4395403 (1983); Patente U.S. N° 4369179 (1983); Patente U.S. N° 4360516 (1982); Patente U.S. N° 4358439 (1982); Patente U.S. N° 4328214 (1982); Patente U.S. N° 4316890 (1982); Patente U.S. N° 4310518 (1982); Patente U.S. N° 4291022 (1981); Patente U.S. N° 4238481 (1980); Patente U.S. N° 4235886 (1980); Patente U.S. 4224190 (1980); Patente U.S. N° 4211693 (1980); Patente U.S. N° 4190648 (1980); Patente U.S. N° 4146612 (1979); Patente U.S. N° 4133782 (1979); Van Binst et al, Peptide Res., 5:8 (1992); Prevost et al, Câncer Res., 52:893 (1992); e Catálogo 94-95 de Bachem Califórnia 1993-1994 (1993)).

As composições do invento são geradas por análogos peptídicos de somatostatina que se prolongam a partir do terminal N tais como os exemplificados acima. O prolongamento N-terminal pode ser um prolongamento peptídico linear, ramificado simetricamente ou ramificado assimetricamente. Embora o número total de resíduos de tirosina no prolongamento N-terminal possa variar, este contém pelo menos dois resíduos de tirosina, de preferência pelo menos três resíduos de tirosina, sendo mais preferível pelo menos quatro resíduos de tirosina, sendo ainda mais preferível pelo menos oito resíduos de tirosina, e pode conter até 32 resíduos de tirosina ou mais. 84 102 ΕΡ 0 833 646/ΡΤ 13

Os análogos de somatostatina com prolongamento N-terminal, multi-tirosinados, do invento, têm a fórmula geral: a) (Y)n+1P, b) (Y)n-Ala-Y-P, ou c) (Y)q[ X]q-. χ

(Y)s[ XL, em que a) P é um análogo peptídico de somatostatina que se liga a um receptor de somatostatina; b) Y é D-tirosina, L-tirosina ou desamino-tirosina; c) n é um número inteiro de 1 a 32, inclusive, de preferência de 1 a 16, inclusive, sendo mais preferível de 1 a 3, inclusive; d) cada q, independentemente, é um número inteiro de 1 a 32, inclusive, de preferência de 1 a 16, inclusive, sendo mais preferível de 1 a 4, inclusive; e e) cada s, independentemente, é um número inteiro de 1 a 32, inclusive, de preferência 1 a 16, inclusive, sendo mais preferível de 1 a 4, inclusive; onde q e s podem ser iguais ou diferentes; e f) X tem a fórmula D-NH2-CH(CH2)mNH2-C02H ou L-NH2-CH(CH2)mNH2-C02H, em que m é um número inteiro de 1 a 10, inclusive.

De preferência, o análogo de somatostatina "P" na fórmula acima descrita tem a fórmula: a) Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2 (um derivado de LANREOTIDE™); b) Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2 (um derivado de acetato de octreotídeo); ou c) Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr(ol) (um derivado de acetato de octreotídeo). A capacidade dos análogos de somatostatina multi-tirosinados para se ligarem a receptores de somatostatina e actuarem como agonistas ou antagonistas dos receptores de somatostatina pode ser avaliada in vitro utilizando métodos bem conhecidos na arte (ver, por exemplo, 0'Dorisio, M. S. et al., Cell Growth and Differentiation, 5:1-8, 1994). As actividades dos análogos em tais ensaios in vitro permitem prever as actividades dos análogos in vivo. 14 84 102 ΕΡ 0 833 646/ΡΤ

Modificação de análogos de somatostatina multi-tirosinados

Os análogos de somatostatina multi-tirosinados podem ser modificados através da ligação covalente de um átomo de halogéneo não radioactivo (p. ex., flúor, cloro, bromo, iodo ou astatina), um fluorocromo ou um radioisótopo (de preferência um radioisótopo de halogéneo) a um resíduo de tirosina do prolongamento N-terminal do análogo.

Quando o análogo de somatostatina multi-tirosinado é modificado pela ligação de um átomo de halogéneo não radioactivo a um resíduo de tirosina do prolongamento N-terminal, o halogéneo é de preferência iodo. Os análogos halogenados do invento contêm um halogéneo ligado covalentemente a pelo menos um resíduo de tirosina e de preferência a múltiplos resíduos de tirosina em cada molécula. De preferência, cerca de metade, sendo preferível cerca de três quartos, sendo ainda mais preferível todos os resíduos de tirosina no prolongamento N-terminal do análogo são ligados a um átomo de halogéneo radioactivo ou não radioactivo. Os análogos multi-halogenados do invento podem ter semi-vidas prolongadas em relação a análogos de somatostatina não modificados. Os análogos multi-halogenados podem também ter uma penetração na barreira hemato-encefálica aumentada em relação a análogos de somatostatina não modificados. A halogenação aumenta a lipofilicidade da molécula, a qual por sua vez melhora a penetração na barreira hemato-encefálica (Banks et al, Brain Res. Buli, 15:287-292 (1985)). Os métodos para halogenar péptidos são bem conhecidos na arte (ver, por exemplo, Parker, Radioimmunoassav of Biologicallv Active Compounds. Prentice Hall, (1976), Capítulo 5).

Os análogos de somatostatina multi-tirosinados do invento podem ser marcados de forma detectável ligando um fluorocromo a um resíduo de amina do análogo. Por exemplo, o fluorocromo (p. ex., isotiocianato de fluoresceína) pode ser especificamente ligado a resíduos de lisina do análogo. Análogos de somatostatina multi-fluorescinados, particularmente análogos multi-tirosinados possuindo múltiplas lisinas (p. ex., num prolongamento N-terminal ramificado) são úteis na detecção de expressão à superfície de receptores de somatostatina numa variedade de aplicações de reagentes de diagnóstico e de investigação. Por exemplo, quando o análogo multi-fluorescinado é incubado com uma população mista de células e uma sub-população celular de células que expressam receptores de somatostatina é isolada por FACS (selecção de células activada por fluorescência) utilizando métodos bem conhecidos na arte.

Os radioisótopos para marcação radioactiva dos análogos de somatostatina multi-tirosinados do invento incluem qualquer radioisótopo que possa ser covalentemente ligado a 84 102 ΕΡ 0 833 646/ΡΤ 15

um resíduo de tirosina do análogo. Os radioisótopos podem ser seleccionados a partir de radioisótopos que emitem radiação beta ou gama, de preferência radiação gama. Adicionalmente, ou altemativamente, os análogos de somatostatina multi-tirosinados podem ser modificados de modo a conterem grupos quelantes que, por exemplo, podem ser covalentemente ligados a um resíduo(s) de lisina do análogo. Os grupos quelantes podem então ser modificados de modo a conterem qualquer um de vários radioisótopos, tais como gálio, índio, tecnécio, itérbio, rénio ou tálio (p. ex., 1,67Ga, 1HIn, "mTc, l69Yb, l86Re).

Quando o análogo de somatostatina multi-tirosinado é modificado por anexação de um radioisótopo, os radioisótopos preferíveis são os que possuem uma semi-vida radioactiva que corresponde, ou é superior, à semi-vida biológica do análogo utilizado. Com maior preferência, o radioisótopo é um radioisótopo de um átomo de halogéneo (p. ex., um radioisótopo de flúor, cloro, bromo, iodo e astatina), sendo mais preferível um radioisótopo de iodo, sendo ainda mais preferível 1231, 1241,125I, ,29I ou l31I. De preferência, o radioisótopo tem uma semi-vida de 1 hora a 60 dias, de preferência de 5 horas a 10 dias, sendo mais preferível de 12 horas a 8 dias. O análogo e marcador radioactivo específicos são seleccionados de acordo com o método de diagnóstico ou terapêutico utilizado, dependendo se o método de diagnóstico é efectuado in vivo, in situ ou in vitro, da localização suspeita do tumor (p. ex., fígado, pulmão, pâncreas, cérebro), do metabolismo do análogo seleccionado e do método utilizado para detectar o análogo ligado marcado radioactivamente. Por exemplo, quando o método de diagnóstico é efectuado in situ (i.e., o marcador radioactivo é detectado directamente nos tecidos do doente durante a cirurgia), são preferidos isótopos com baixos níveis de energia, especialmente aqueles isótopos que emitem fotões beta ou gama a níveis de energia inferiores a cerca de 300 kev, de preferência inferiores a cerca de 150 kev, sendo mais preferível inferiores a 50 kev. O marcador radioactivo preferido para diagnóstico in situ é 125I. Se o marcador radioactivo for detectado por cintigrafia médica nuclear (i.e., exame médico nuclear), I é um marcador radioactivo preferido. Quando o análogo é para ser utilizado como terapêutico (p. ex., em radioterapia), 129I e l3II são marcadores radioactivos preferidos.

Os análogos marcados radioactivamente do invento terão pelo menos uma tirosina possuindo um radioisótopo covalentemente ligado. Quando o análogo de somatostatina multi-tirosinado contém múltiplos resíduos de tirosina, o análogo pode ser marcado radioactivamente de tal forma que cerca de um terço dos resíduos de tirosina, de preferência cerca de metade, sendo mais preferível cerca de três quartos, sendo ainda mais preferível todos os resíduos de tirosina no prolongamento N-terminal do análogo estejam ligados ao 16 84 102 ΕΡ 0 833 646/ΡΤ radioisótopo. Os análogos de somatostatina multi-tirosinados marcados radioactivamente podem conter múltiplos radioisótopos ligados a um único análogo, p. ex., pela ligação de radioisótopos a múltiplos resíduos de tirosina e/ou ligação de até dois radioisótopos de halogéneo por resíduo de tirosina, distribuindo assim múltiplos átomos de radioisótopos por um único receptor de somatostatina. Como a tirosina mono-halogenada é geralmente mais estável que a tirosina di-halogenada, são preferidos os análogos de somatostatina multi-tirosinados que contêm resíduos de tirosina mono-halogenados. Os análogos possuindo 1) múltiplos resíduos de tirosina e 2) até dois átomos de radioisótopos de halogéneo ligados a cada tirosina, proporcionam uma elevada razão sinal/ruído para utilização em métodos de detecção, bem como potentes agentes radioterapêuticos para terapias de cancro. Os métodos para marcação radioactiva de péptidos são bem conhecidos na arte.

Composições farmacêuticas contendo análogos de somatostatina multi-tirosinados

As composições farmacêuticas contendo um análogo multi-tirosinado adequadas para utilização nos métodos de diagnóstico e terapêuticos do invento são preparadas de acordo com métodos bem conhecidos na arte. Em geral, as composições farmacêuticas são formulações injectáveis contendo pelo menos um análogo de somatostatina multi-tirosinado e um transportador farmaceuticamente aceitável. O transportador farmaceuticamente aceitável pode ser qualquer transportador conhecido na arte e é seleccionado de acordo com factores tais como a via de administração, o método de diagnóstico ou terapêutico utilizado e o análogo a ser administrado.

Em geral, a concentração de análogo multi-tirosinado na composição farmacêutica é suficiente para distribuir numa única dose uma quantidade do análogo eficaz na ligação a receptores de somatostatina no tecido alvo. Dosagens específicas variarão de acordo com vários factores incluindo o método de diagnóstico ou terapêutico utilizado, o análogo multi-tirosinado utilizado (p. ex., actividade específica, afinidade e avidez de ligação aos receptores de somatostatina, peso molecular, número de átomos de radioisótopo ligados ao análogo), a via de administração, a condição a ser tratada e variáveis específicas do doente tais como idade, peso e gravidade da doença. Por exemplo, as vias de excreção dos análogos marcados radioactivamente afectam a eficácia na localização de pequenos tumores, especialmente no abdómen superior. Em geral, os análogos marcados radioactivamente com 123I, ,25I ou 131I são primariamente excretados através do tracto biliar e subsequentemente pelo intestino.

Uma orientação para as dosagens apropriadas para os métodos de diagnóstico e terapêuticos específicos do invento é proporcionada na descrição de cada método 17 84 102 ΕΡ 0 833 646/ΡΤ apresentada abaixo. Dosagens específicas dos análogos multi-tirosinados podem ser baseadas em dosagens para análogos de somatostatina convencionais tais como LANREOTIDE™ e acetato de octreotídeo (ver, por exemplo, EP 0588754, publicada a 23 de Março, 1994). Quando o análogo é para ser administrado para imitar níveis de somatostatina de tipo selvagem, o análogo é administrado para atingir níveis de circulação de picogramas a nanogramas. As quantidades de dosagem para análogos de somatostatina multi-tirosinados são geralmente mais baixas que as necessárias para análogos de somatostatina convencionais devido à capacidade para ligar múltiplos átomos de halogéneo e radioisótopos ao prolongamento N-terminal dos análogos multi-tirosinados, à afinidade e/ou avidez relativas dos análogos multi-tirosinados para receptores de somatostatina, e/ou à semi-vida mais prolongada dos análogos multi-tirosinados.

As composições farmacêuticas do invento podem conter compostos em adição aos análogos multi-tirosinados. Por exemplo, a composição farmacêutica pode conter compostos para proporcionar alívio de sintomas associados à condição a ser tratada (p. ex., compostos para alívio de dor, anti-inflamatórios, etc.). Quando o análogo multi-tirosinado é marcado radioactivamente, a composição farmacêutica pode conter adicionalmente compostos para aumentar a estabilidade do análogo, p. ex., inibindo a autorradiólise. Tais compostos incluem sequestrantes de radicais livres tais como ácido ascórbico, ácido benzóico, ácido 2,5-di--hidroxibenzóico. A autorradiólise também pode ser impedida por diluição, i.e., armazenamento dos análogos marcados radioactivamente a concentrações mais baixas.

Condições suscentíveis de diagnóstico utilizando análogos de somatostatina multi-tirosinados

Os análogos de somatostatina multi-tirosinados do invento podem ser utilizados no diagnóstico de condições associadas a condições associadas a expressão anormal de um receptor de somatostatina e/ou produção anormal de um factor regulável por somatostatina. Estas duas classes gerais de condições não são exclusivas uma da outra. Por exemplo, vários cancros endócrinos estão associados a produção anormal de factores reguláveis por somatostatina e a expressão anormal de receptores de somatostatina. Pelo contrário, a produção anormal de um factor regulável por somatostatina não acompanha necessariamente todas as condições associadas a expressão anormal de receptores de somatostatina.

As condições associadas a uma produção anormalmente aumentada de um factor regulável por somatostatina incluem qualquer condição caracterizada pela produção de um factor regulável por somatostatina a qual é significativamente maior que a produção do mesmo factor na ausência da condição. Exemplos de tais condições incluem cancro, 18 84 102 ΕΡ 0 833 646/ΡΤ acromegalia e sarcoidose. Os factores reguláveis por somatostatina incluem qualquer hormona, péptido, proteína ou outro produto biológico o qual é diminuído ou inibido na sua expressão e/ou secreção na presença de somatostatina. Exemplos de factores reguláveis por somatostatina incluem hormona de crescimento, hormona adrenocorticotropina (ACTH), prolactina, hormona estimulante da tiróide, insulina, glucagon, motilina, péptido inibidor gástrico (GIP), péptido intestinal vasoactivo (VIP), secretina, colecistoquinina (CCK), bombesina, hormona de libertação da tiróide (TRH), aldosterona, citóquinas (p. ex., interleucinas, interferões), factores de crescimento (p. ex., factor de crescimento epidérmico, factor de crescimento neuronal), gastrina, polipéptido pancreático (PP) e péptido de libertação da gastrina (GRP).

Condições associadas a expressão anormal de um receptor de somatostatina são também susceptíveis de diagnóstico e terapia utilizando os análogos de somatostatina multi-tirosinados do invento. As condições associadas a expressão anormal de um receptor de somatostatina incluem qualquer condição onde um tipo específico de células expressa um receptor de somatostatina a um nível significativamente superior ao nível de expressão normalmente associado a esse tipo celular específico. Exemplos de condições que expressam de forma anormal receptores de somatostatina incluem vários tipos de tumores sólidos ou não sólidos e tumores endócrinos.

Exemplos de tumores que podem ser diagnosticados e tratados de acordo com o invento incluem tumores pituitários; tumores do sistema nervoso central; tumores cerebrais; tumores mamários; tumores ováricos; tumores da próstata; tumores renais; tumores do tracto gastrointestinal (do cólon; pancreáticos; do estômago); tumores pulmonares (p. ex., carcinoma bronquíoloalveolar, carcinoma das células pequenas); mielomas; linfomas (p. ex., linfoma não de Hodgkins e linfoma de Hodgkins); tumores neuroendócrinos (p. ex., carcinóide, VIPoma, insulinoma, glugagonoma, carcinoma da tiróide medular, gastrinoma, feocromocitoma, tumores pituitários); tumores do sistema nervoso (p. ex., neuroblastoma, glioma, meduloblastoma, paraganglioma, tumores neuroectodérmicos primitivos, meningioma, astrocitoma); tumores ósseos (p. ex., sarcoma osteogénico, sarcoma de Ewing); e metástases destes. Outros tumores que expressam receptores de somatostatina são descritos por Krenning et ai, Europ. Nuc. Med., 20:716-731, 1993. Os métodos de diagnóstico do invento podem assim ser utilizados para identificar qualquer tumor primário, multicêntrico ou metastático que expresse um receptor de somatostatina.

Em geral, o análogo de somatostatina multi-tirosinado é seleccionado de acordo com uma variedade de factores tais como o método de diagnóstico utilizado, a capacidade do análogo para se acumular numa população celular alvo definida, p. ex., tipo(s) celular(es), 19 84 102 ΕΡ 0 833 646/ΡΤ tecido(s) ou órgão(s) específico(s) afectado(s), a semi-vida do análogo e a afinidade e/ou avidez de ligação do análogo para um receptor de somatostatina.

Os métodos de diagnóstico do invento podem ser utilizados para identificar um tumor primário que expresse receptores de somatostatina; para identificar metástases de tais tumores; como rastreio de uma recaída (i.e., crescimento de novo do tumor) num doente; ou como rastreio de rotina de tumores que expressem receptores de somatostatina num doente susceptível a desenvolvimento de tumores.

Diagnóstico de condições associadas a produção anormal de um factor regulável nor somatostatina e/ou expressão anormal de um receotor de somatostatina

Os análogos de somatostatina multi-tirosinados do invento podem ser administrados a um doente para determinar se o doente tem uma condição associada a produção anormal de um factor regulável por somatostatina e/ou expressão anormal de um receptor de somatostatina. Em geral, estas condições são diagnosticadas examinando o efeito da administração de um análogo de somatostatina multi-tirosinado não marcado (i.e., não radioactivo) sobre a quantidade de um marcador bioquímico. O análogo administrado para diagnóstico é de preferência um análogo de somatostatina multi-tirosinado não radioactivo, sendo mais preferível um análogo de somatostatina multi-tirosinado halogenado não radioactivo. A quantidade de análogo administrado pode variar de acordo com uma variedade de factores incluindo a actividade biológica e semi-vida do análogo seleccionado, o tipo e localização suspeita do tumor e variáveis dependentes do doente incluindo tamanho, peso, e carga tumoral. A quantidade específica administrada é geralmente de cerca de 0,1 pg a 1000 pg, de preferência cerca de 1 ng a 500 pg, sendo mais preferível cerca de 1 pg a 200 pg, normalmente cerca de 100 pg. A quantidade administrada aumentará com o aumento do peso molecular do análogo multi-tirosinado administrado. O marcador bioquímico pode ser qualquer hormona, péptido, proteína ou outro produto biológico associado a um determinado tipo celular (p. ex., célula endócrina, célula tumoral) ou fenómeno biológico (p. ex., proliferação celular, motilidade celular, metástase tumoral). O marcador bioquímico pode estar presente em qualquer fluído corporal do doente, de preferência urina ou sangue. A sensibilidade do método de diagnóstico pode ser aumentada determinando os níveis de dois ou mais marcadores bioquímicos (p. ex., gastrina e VIP). A detecção de um marcador bioquímico que não é regulado por somatostatina pode servir como um controlo negativo. Uma diminuição significativa na quantidade do marcador 20 84 102 ΕΡ 0 833 646/ΡΤ bioquímico após administração do análogo multi-tirosinado indica que a condição está associada a produção de um factor regulável por somatostatina e/ou expressão de um receptor de somatostatina. De preferência, a diminuição no marcador bioquímico é pelo menos uma diminuição de cerca de 20%, sendo preferível cerca de 30%, sendo ainda mais preferível cerca de 50%. Uma redução dos níveis de marcador bioquímico em resposta à administração de um análogo de somatostatina multi-tirosinado indica que, por exemplo, os análogos se ligarão à superfície das células tumorais para detecção pré-operatória ou intra-operatória e/ou os análogos serão eficazes no tratamento da condição (p. ex., a produção do marcador bioquímico é controlável através da administração de somatostatina ou análogo de somatostatina).

Por exemplo, uma amostra sanguínea (amostra de controlo) é obtida de um doente possuindo um gastrinoma e a quantidade de gastrina é determinada utilizando métodos bem conhecidos na arte. E administrada ao doente uma formulação injectável contendo cerca de 100 pg a 200 pg de um análogo de somatostatina multi-tirosinado. O análogo pode ser administrado por injecção parentérica, de preferência por injecção intravenosa. Uma segunda amostra sanguínea é obtida do doente tão cedo como 30 seg. após a administração do análogo, normalmente 10 min. após a administração, até cerca de 30 min. a 1 hr. após a administração, normalmente não mais que 2 hr. após a administração. O marcador bioquímico pode ser detectado até que os níveis de análogo no sangue sejam zero e que a célula afectada tenha recuperado (normalmente cerca de 30 a 60 min.). A quantidade de gastrina na amostra sanguínea é determinada e comparada com a quantidade de gastrina na amostra de controlo. Se a quantidade de gastrina na amostra obtida após a administração de análogo for significativamente inferior à quantidade de gastrina na amostra de controlo, então o gastrinoma expressa receptores de somatostatina e é susceptível aos métodos de localização de tumores pré-operatórios e intra-operatórios, bem como aos métodos terapêuticos, do invento.

Noutro exemplo, uma amostra sanguínea de controlo é obtida de um doente suspeito de possuir acromegalia. A quantidade de hormona de crescimento (GH) e/ou factor de crescimento semelhante a insulina -1 (IGF-1) presente na amostra de controlo é determinada de acordo com métodos bem conhecidos na arte. São administrados ao doente cerca de 100 pg de um análogo de somatostatina multi-tirosinado por injecção intravenosa e é obtida uma segunda amostra sanguínea cerca de 30 min. após a administração. A quantidade de GH e/ou IGF-1 na segunda amostra sanguínea é determinada e comparada com a quantidade de GH e/ou IGF-1 na amostra de controlo. Se a quantidade de GH e/ou IGF-1 na segunda amostra for significativamente inferior à quantidade de GH e/ou IGF-1 na amostra de controlo, então a condição do doente é susceptível a tratamento com análogos de somatostatina multi-

84 102 ΕΡ 0 833 646/ΡΤ 21 tirosinados.

Diagnóstico pré-operatório de tumores aue expressam de forma anormal receptores de somatostatina

Os análogos peptídicos multi-tirosinados marcados radioactivamente podem ser utilizados num método para detecção e localização pré-operatórias de um tumor que expressa um receptor de somatostatina. Os tumores susceptíveis de detecção utilizando os análogos marcados radioactivamente do invento podem ser identificados determinando se o tumor produz um factor regulável por somatostatina tal como acima descrito. O pré-rastreio de doentes utilizando o método de diagnóstico acima descrito pode ser mais eficaz em termos de custos uma vez que, por exemplo, o método de diagnóstico acima descrito não requer que o análogo seja marcado radioactivamente e requer geralmente dosagens de análogo mais baixas que os métodos de localização de tumores. No entanto, tais ensaios de pré-rastreio não são necessários para nenhum dos métodos de diagnóstico pré-operatórios, intra-operatórios ou pós-operatórios do invento. Para além disso, nem todos os tumores que expressam receptores de somatostatina produzem um factor regulável por somatostatina, ou a identidade do factor regulável por somatostatina pode ser desconhecida. Por isso, pode ser desejável realizar o método de localização de tumores pré-operatório do invento mesmo quando os métodos de diagnóstico para detectar produção de factores reguláveis por somatostatina proporcionam resultados negativos. A ligação de um análogo multi-tirosinado é suficiente para identificar tumores que expressam receptores de somatostatina.

Em geral, o diagnóstico pré-operatório é conseguido pela administração de um análogo de somatostatina multi-tirosinado marcado radioactivamente, de preferência um análogo de somatostatina multi-tirosinado halogenado marcado radioactivamente, ao doente, por injecção parentérica, de preferência por injecção intravenosa. A selecção do análogo multi-tirosinado específico e do marcador radioactivo específico variará de acordo com uma variedade de factores incluindo o tipo e localização do tumor a ser detectado e a técnica de detecção do marcador radioactivo utilizada. De preferência, o marcador radioactivo é um radioisótopo de emissão gama, sendo preferível um radioisótopo de iodo, sendo ainda mais preferível 123I. A dosagem apropriada dos análogos de somatostatina multi-tirosinados marcados variará de acordo com uma variedade de factores incluindo o marcador e o análogo de somatostatina multi-tirosinado utilizados, o tipo e localização do tumor do qual se pretende a imagem e vários factores dependentes do doente tais como a idade e peso do doente e a extensão da doença (p. ex., tamanho e número de tumores). Uma dose adequada para 22 84 102 ΕΡ 0 833 646/ΡΤ injecção é uma quantidade eficaz para permitir a formação de uma imagem através de procedimentos de cintigrafia médica nuclear conhecidos na arte (p. ex., tomografia computorizada, tomografia de emissão de positrões ou tomografia computorizada de emissão de um único fotão). Quando o análogo é marcado radioactivamente com um radioisótopo de emissão gama, a ligação do análogo é normalmente detectada por SPECT. Por exemplo, a quantidade de radioactividade administrada numa única dose pode ter uma actividade de cerca de 10 pCi a 50 mCi, de preferência cerca de 100 pCi a 25 mCi, sendo preferível cerca de 500 pCi a 20 mCi, normalmente cerca de 1 mCi a 10 mCi, usualmente cerca de 10 mCi.

Após a administração do análogo de somatostatina multi-tirosinado marcado radioactivamente, os tumores que expressam receptores de somatostatina podem ser detectados tão cedo como 1 min. após a administração, de preferência cerca de 60 min. após a administração, sendo mais preferível cerca de 1 h. após a administração, até de 12 h. a 96 h. e tão tarde como 2 a 3 semanas ou mais após a administração.

Em geral, a detecção de tumores que expressam receptores de somatostatina é efectuada após se permitir um tempo suficiente para a depuração de análogo multi-tirosinado marcado radioactivamente não ligado ou não ligado especificamente. A depuração de análogo não ligado e/ou não ligado especificamente diminui o sinal radioactivo associado ao tecido normal, proporcionando assim uma razão sinal/ruído mais elevada (i.e., marcador radioactivo ligado a tecido tumoral versus tecido normal (ruído de fundo)). Por isso, a detecção do análogo multi-tirosinado ligado, marcado radioactivamente é de preferência efectuada várias horas (p. ex., 8 h. a 24 h.) a vários dias (p. ex., 2 dias a 7 dias) após a administração. Em geral, a detecção é efectuada 24 h. a 48 h. após a administração. Para além disso, devido à ligação irreversível ou quase irreversível de análogos de somatostatina multi-tirosinados halogenados, o exame médico nuclear para detectar tecido que expressa receptores de somatostatina pode ser efectuado como um seguimento a cirurgia ou a terapia várias semanas após a administração inicial de análogo sem necessidade de administração de análogo adicional.

Os tumores são visualizados como tecido que se liga ao análogo multi-tirosinado marcado radioactivamente a um nível significativamente superior ao nível de ligação do análogo marcado radioactivamente por tecido normal. A razão tumor/tecido normal de distribuição do análogo marcado radioactivamente será geralmente cerca de 2:1, de preferência cerca de 3:1, sendo mais preferível cerca de 4:1 e pode ser até de 6:1 a 12:1 ou superior. O tumor pode também ser detectado pela identificação do tecido no qual o análogo 23 84 102 ΕΡ 0 833 646/ΡΤ marcado radioactivamente se acumula ao longo do tempo. Tal como acima discutido, a detecção da ligação de análogo marcado radioactivamente é de preferência efectuada após se permitir a depuração dos análogos não ligados ou não ligados especificamente do tecido normal. Um tecido possuindo associados níveis mais elevados de marcador radioactivo num ponto temporal mais tardio em relação a um ponto temporal mais inicial (p. ex., 36 h. versus 12 hrs.) é identificado como tecido canceroso que expressa receptores de somatostatina. Após o tumor que expressa receptores de somatostatina ter sido identificado, o tumor pode ser removido por cirurgia. Altemativamente, ou adicionalmente, o doente pode ser tratado através da administração de análogos de somatostatina multi-tirosinados marcados radioactivamente ou não marcados, ou utilizando métodos terapêuticos convencionais.

Diagnóstico intra-operatório (in situ) de tumores que expressam de forma anormal receptores de somatostatina

Os análogos de somatostatina multi-tirosinados podem também ser utilizados para identificar tumores que expressam receptores de somatostatina durante a cirurgia. A localização intra-operatória de tumores pode ser particularmente útil em, por exemplo, identificação de metástases tumorais não detectadas por técnicas de localização de tumores radiográficas convencionais. Os tumores susceptíveis ao método de detecção intra-operatório do invento podem ser identificados determinando se o tumor produz um factor regulável por somatostatina, determinando se o tumor se liga a um análogo multi-tirosinado utilizando o ensaio de diagnóstico e as técnicas de formação de imagens pré-operatórias tal como acima descrito, ou utilizando métodos de diagnóstico convencionais.

Em geral, a detecção de tumores intra-operatória é conseguida administrando um análogo de somatostatina multi-tirosinado marcado radioactivamente ao doente por injecção parentérica, de preferência por injecção intravenosa, e detecção do marcador radioactivo ligado in situ. Quando a localização geral do tumor é conhecida (p. ex., o diagnóstico pré-operatório indicou que o(s) tumor(es) estava(m) num determinado órgão), o análogo marcado radioactivamente pode ser injectado directamente no local envolvido. O tecido associado a expressão anormal de receptores de somatostatina é identificado como um tecido possuindo uma ligação mais elevada de análogo marcado radioactivamente em relação à ligação de análogo marcado radioactivamente ao tecido normal. A ligação dos análogos marcados radioactivamente ao tumor pode ser detectada tão cedo como 1 min. após a injecção e pode continuar a ser monitorizada até à conclusão da cirurgia (normalmente 1 h. a 8 h. após a injecção). A selecção do análogo multi-tirosinado específico e do marcador radioactivo 24 84 102 ΕΡ 0 833 646/ΡΤ específico variará de acordo com uma variedade de factores incluindo o tipo e localização do tumor a ser detectado e a técnica de detecção do marcador radioactivo utilizada. De preferência, o marcador radioactivo é um radioisótopo de emissão beta ou de emissão gama, sendo preferivelmente um radioisótopo de emissão gama, sendo ainda mais preferivelmente um radioisótopo de iodo, e ainda com maior preferência 125I. São preferidos radioisótopos com níveis de energia mais baixos como marcadores radioactivos, especialmente radioisótopos que exibem níveis de energia de emissão de fotões inferiores a cerca de 300 kev, de preferência inferiores a cerca de 150 kev. A dosagem apropriada dos análogos de somatostatina multi-tirosinados marcados radioactivamente variará de acordo com vários factores incluindo o marcador radioactivo e o análogo de somatostatina multi-tirosinado utilizados, o tipo e localização do tumor a ser detectado e vários factores dependentes do doente tais como a extensão da doença (p. ex., tamanho e número de tumores) ou outras condições médicas concomitantes. Uma dose adequada para injecção é uma quantidade eficaz para se ligar ao tecido canceroso e permitir a detecção do marcador radioactivo utilizando uma sonda manual. A quantidade específica de análogo de somatostatina multi-tirosinado marcado radioactivamente administrado para detecção de tumores intra-operatória é de cerca de 10 pCi a 100 mCi, de preferência de cerca de 100 pCi a 50 mCi, sendo mais preferível de cerca de 500 qCi a 40 mCi, usualmente de cerca de 1 mCi a 10 mCi, normalmente menos de 2 mCi. Em geral, cerca de 0,01 mg a 100 mg, normalmente cerca de 0,1 mg a 1,0 mg (Ixl05-lxl06 células) de tecido tumoral marcado radioactivamente por grama de tecido total produz um nível de radiação suficiente para activar o detector manual. O análogo multi-tirosinado marcado radioactivamente pode ser administrado durante a cirurgia ou tão cedo como 30 min., normalmente tão cedo como cerca de 1 h. a 2 h. antes da cirurgia.

Tal como discutido no método de diagnóstico pré-operatório acima descrito, a detecção de análogo ligado é de preferência efectuada após depuração de análogo não ligado ou não ligado especificamente. Assim, a detecção intra-operatória é de preferência efectuada de várias horas (p. ex., 6 h. a 24 h.) até vários dias (p. ex., 2 dias a 8 dias) ou semanas após a administração. Para além disso, quando o tumor que expressa receptores de somatostatina foi identificado utilizando o método de diagnóstico pré-operatório acima descrito, o diagnóstico intra-operatório pode ser efectuado sem a administração de análogo multi-tirosinado marcado radioactivamente adicional.

Os métodos e dispositivos para a detecção de radiação beta e gama são bem conhecidos na arte. A Patente U.S. N° 5008546, aqui incorporada por referência, descreve uma sonda adequada para detecção de radioisótopos de emissão beta. Dispositivos manuais 25 84 102 ΕΡ 0 833 646/ΡΤ adequados para detecção de radioisótopos de emissão gama são descritos nas Patentes U.S. N°s 4801803, 4889991 e 5070878. Podem ser utilizados outros dispositivos de detecção de radiação conforme necessário. As sondas de radiação podem ser utilizadas como parte de um endoscópio, laparoscópio, broncoscópio ou outro instrumento específico. Durante a detecção in situ, o tecido normal, o qual não se liga ao análogo multi-tirosinado marcado radioactivamente, é utilizado como um tecido de "referência" (controlo negativo). Detecção de contagens gama superiores a um número de contagens pré-seleccionado (p. ex., a raiz quadrada de pelo menos dois desvios padrão, de preferência pelo menos três desvios padrão) acima do ruído de fundo (p. ex., acima das contagens médias no tecido de referência) é indicativa de um tecido que se ligou ao análogo marcado radioactivamente em virtude de possuir um número mais elevado de receptores de somatostatina. O tecido marcado radioactivamente é então removido e o método de detecção continua até todo o tecido marcado radioactivamente detectável ser removido.

Por exemplo, quando o doente tem um gastrinoma, 10 pCi a 1 mCi de análogo de somatostatina I-multi-tirosmado são injectados mtravenosamente e as contagens gama são obtidas in situ com um detector gama manual. A detecção de contagens gama é efectuada sobre o pâncreas, estômago, duodeno, intestino delgado proximal, médio e distai, mesentério do intestino delgado, cólon, bexiga, fígado, rins, tiróide, coração e aorta. Subsequentemente, o detector é ligado a um modo de varrimento que permite a "eliminação" de contagens de fundo a partir de um tecido de referência adjacente. As contagens gama durante um período de 1 segundo a 60 segundos, normalmente um período de cerca de 5 segundos, são determinadas sobre um tecido de referência e a unidade de controlo calcula tanto a média como o desvio padrão deste sinal. Quando o detector gama é passado sobre um tecido com contagens gama superiores à raiz quadrada de três desvios padrão acima das contagens médias do tecido de referência é activada uma "sirene". O detector gama manual pode ser utilizado no modo de varrimento para identificar focos únicos de contagens elevadas para remoção.

Diagnóstico pós-operatório (in vitro) de tumores aue expressam de forma anormal receptores de somatostatina O diagnóstico de tumores que expressam de forma anormal receptores de somatostatina pode ser determinado através da ligação de análogos de somatostatina multi-tirosinados marcados de forma detectável a uma amostra de tecido in vitro. Primeiro, é obtida uma amostra de tecido de um doente suspeito de possuir um tumor que expressa de forma anormal um receptor de somatostatina. A amostra de tecido pode ser preparada para incubação com o análogo marcado de forma detectável de acordo com uma variedade de 26 84 102 ΕΡ 0 833 646/ΡΤ métodos bem conhecidos na arte. Por exemplo, o tecido pode ser separado numa suspensão de células individuais e as individuais isoladas podem ser ligadas a um suporte sólido (p. ex., um poço de uma placa de microtítulo). Altemativamente, as células na amostra de tecido são lisadas e é preparada uma fracção proteica composta em primeiro lugar por proteínas membranares da superfície celular de acordo com métodos conhecidos na arte (0’Dorisio et al., Cell Growth and Dijferentiation, 5:1-8 (1994)). A amostra de tecido é então incubada com um análogo de somatostatina multi-tirosinado marcado de forma detectável, de preferência um análogo multi-tirosinado halogenado. Uma amostra de tecido que não contenha qualquer receptor de somatostatina pode servir como controlo negativo. O marcador detectável pode ser qualquer marcador detectável conhecido na arte, de preferência um fluorocromo ou um marcador radioactivo. Quando o marcador detectável é um fluorocromo, o marcador preferido é fluoresceína. Quando o marcador detectável é um marcador radioactivo, o marcador detectável é de preferência um radioisótopo de iodo, mais preferivelmente I. E adicionado ligando de receptores de somatostatina de competição, não marcado para determinar a ligação específica aos receptores. A quantidade de análogo não marcado incubado com as amostras é em quantidades crescentes até níveis em excesso em relação aos necessários para a ligação a receptores de somatostatina na amostra de controlo, de preferência um excesso de cerca de 10 vezes, sendo mais preferível um excesso de cerca de 100 vezes. A incubação é efectuada durante um tempo suficiente para permitir a ligação competitiva dos análogos marcados e não marcados ao receptor de somatostatina nas amostras.

Após a incubação, o material não ligado é removido da amostra por lavagem e o marcador ligado é detectado. Quando o marcador detectável é um marcador radioactivo, a detecção pode ser conseguida com um contador de cintilações. Se o nível de marcador detectável ligado à amostra de teste for significativamente superior ao nível de marcador detectável ligado à amostra negativa e a ligação do péptido marcado for competitivamente inibida pelo péptido não marcado, então a amostra de tecido expressa um receptor de somatostatina. Os resultados do ensaio indicam se 1) o doente é susceptível a diagnóstico por exame, 2) o tumor do doente é susceptível a tratamento com os análogos de somatostatina multi-tirosinados do invento, e 3) a condição do doente pode ser monitorizada utilizando os métodos pré-operatórios acima descritos.

Administração terapêutica de análogos de somatostatina multi-tirosinados

Doentes possuindo uma condição associada a produção anormalmente aumentada de um factor regulável por somatostatina e/ou uma condição associada a expressão anormal de 27 84 102 ΕΡ 0 833 646/ΡΤ um receptor de somatostatina podem ser tratados através da administração de análogos de somatostatina multi-tirosinados. Doentes possuindo uma condição susceptível a tratamento com os análogos do invento podem ser identificados utilizando os métodos de diagnóstico acima descritos, embora isto não seja um pré-requisito necessário para os métodos de tratamento aqui descritos. O método de tratamento do invento pode ser implementado como uma terapia primária ou como uma terapia de seguimento após cirurgia (p. ex., após remoção do tumor).

Os análogos de somatostatina multi-tirosinados para administração como agentes terapêuticos podem ser não marcados, halogenados, fluorescinados ou marcados radioactivamente. A selecção do análogo específico está dependente da condição a ser tratada. Por exemplo, quando a condição está associada apenas a produção anormalmente aumentada de um factor regulável por somatostatina (p. ex., acromegalia, sarcoidose), o análogo é de preferência um análogo de somatostatina multi-tirosinado não marcado, sendo mais preferivelmente um análogo de somatostatina multi-tirosinado halogenado. Quando o doente tem uma condição associada a expressão anormal de um receptor de somatostatina (p. ex., um tumor), o análogo é de preferência um análogo de somatostatina multi-tirosinado marcado radioactivamente, sendo mais preferivelmente um análogo halogenado marcado radioactivamente, sendo ainda mais preferivelmente um análogo de somatostatina multi-tirosinado marcado radioactivamente com 129I ou 13'i. Quando é utilizado um análogo multi-tirosinado marcado radioactivamente, o péptido pode ser marcado antes da administração, p. ex., 24 hr. ou menos antes da administração.

Os análogos de somatostatina multi-tirosinados podem ser administrados através de qualquer via convencional, de preferência por injecção parentérica na forma de uma solução ou suspensão injectável. Os análogos multi-tirosinados podem também ser administrados por infusão, p. ex., uma infusão intravenosa de 30 min. a 60 min. Os análogos de somatostatina multi-tirosinados podem também ser administrados no local do tumor ou próximo deste, p. ex., utilizando um cateter angiográfico intra-arterial ou regional intravenoso inserido numa veia ou artéria que alimente o tumor. A via de administração é seleccionada de acordo com o local do tumor, a afinidade e especificidade do análogo, a semi-vida do análogo multi-tirosinado, a semi-vida de um marcador radioactivo ligado ao análogo e outros factores avaliados por um normal perito na arte.

As dosagens utilizadas no método terapêutico do invento variarão dependendo de uma variedade de factores tais como a condição específica a ser tratada, o marcador radioactivo e o análogo de somatostatina multi-tirosinado utilizados, e variáveis do doente tais como tamanho, peso e gravidade da doença (p. ex., tamanho do tumor e carga tumoral). 28 84 102 ΕΡ 0 833 646/ΡΤ A quantidade de análogo de somatostatina multi-tirosinado para administração pode ser determinada calculando a quantidade de análogo marcado radioactivamente entregue no alvo utilizando o método de diagnóstico in vivo acima descrito. Os métodos para calcular dosagens utilizando técnicas dosimétricas são rotineiros e bem conhecidos na arte (ver, por exemplo, Fisher et al., Câncer, 73:905-911, 1994). Em geral, a dosagem específica entregue é de cerca de 0,1 pg/kg a 500 pg/kg, de preferência cerca de 1 ng/kg a 250 pg/kg, normalmente cerca de 200 ng/kg de análogo de somatostatina multi-tirosinado. Quando o análogo é marcado radioactivamente, o análogo pode ser administrado numa gama de dosagens possuindo uma radioactividade de cerca de 0,1 pCi/kg a 50 mCi/kg de peso corporal, de preferência cerca de 1 pCi/kg a 25 mCi/kg de peso corporal, sendo preferível cerca de 10 pCi/kg a 15 mCi/kg de peso corporal. Geralmente, a quantidade total de análogo de somatostatina multi-tirosinado entregue numa única dose é de cerca de 100 mCi a 2000 mCi, normalmente cerca de 150 mCi a 1500 mCi. A eficácia da terapia pode ser avaliada monitorizando os níveis de um marcador bioquímico associado à condição (p. ex., um factor regulável por somatostatina), por formação de imagem in vivo utilizando análogos de somatostatina multi-tirosinados marcados radioactivamente tal como acima descrito, ou utilizando técnicas radiográficas convencionais. A dosagem de análogo de somatostatina multi-tirosinado pode também ser ajustada conforme apropriado, p. ex., para terapia com análogos multi-tirosinados não radioactivos (i.e., não modificados ou modificados, p. ex., por halogenação) ou para terapia com doses crescentes dos análogos marcados radioactivamente do invento. Síntese de seis exemplos de análogos de somatostatina multi-tirosinados

Foram sintetizados seis exemplos de análogos de somatostatina multi-tirosinados. As fórmulas desses análogos são mostradas na Tabela 2. (Segue Tabela 2) 29 84 102

EP 0 833 646/PT

Tabela 2: Exemplos de Análogos de Somatostatina Multi-tirosinados

Terminal Amino Terminal Carboxi

84 102 ΕΡ 0 833 646/ΡΤ 30

Cada um dos análogos de somatostatina multi-tirosinados acima descritos foi preparado fazendo reagir uma resina de benzidrilamina-poliestireno neutralizada com aminoácidos activados. Especificamente, a resina de benzidrilamina-poliestireno (Advanced ChemTech, Inc.) (1,2 g, 0,5 mmol) na forma de ião cloreto foi colocada no vaso reaccional de um sintetizador de péptidos Advanced ChemTech programado para efectuar os seguintes passos do ciclo reaccional: (1) cloreto de metileno; (2) ácido trifluoroacético a 33% em cloreto de metileno (duas vezes durante 1 h. e 25 min. cada); (3) cloreto de metileno; (4) etanol; (5) cloreto de metileno; (6) trietilamina a 10% em clorofórmio. Os mesmos passos do ciclo reaccional foram utilizados na produção de cada um dos análogos acima descritos. O análogo WOC-2A foi preparado agitando primeiro a resina neutralizada com Boc-O-benzil-treonina e di-isopropilcarbodiimida (1,5 mmol cada) em cloreto de metileno durante 1 h. A resina de aminoácidos resultante foi sujeita ao ciclo de passos (1) a (6) do programa de lavagem de cima. Os seguintes aminoácidos (1,5 mmol) foram, cada um, acoplados sucessivamente através do mesmo procedimento: Boc-S-metilbenzil-Cys, Boc-Val, Boc-N-benziloxicarbonil-lisina, Boc-D-Trp, Boc-O-diclorobenzil-Tyr e Boc-S-metilbenzil-Cys e Boc-O-diclorobenzil-D-Tyr. Após lavagem e secagem, a resina completa possuindo ligado Boc-O-diclorobenzil-D-tirosina-S-metilbenzil-cisteína-O-diclorobenzil--tirosina-D-triptofano-N-benziloxicarbonil-lisina-valina-S-metilbenzil-cisteína-treonina pesava 1,78 g. O análogo WOC-2A foi libertado da resina (1,78 g, 0,5 mmol) misturando a resina de aminoácidos com anisolo (5 ml), ditiotreitol (100 mg) e fluoreto de hidrogénio anidro (35 ml) a 0°C e agitando durante 45 min. O excesso de fluoreto de hidrogénio foi evaporado rapidamente sob uma corrente de azoto seco e o péptido (D-tirosina-cisteína-tirosina-D-triptofano-lisina-valina-cisteína-treonina-NH2) cíclico livre (WOC-2A) foi precipitado e lavado com éter. O péptido em bruto foi então dissolvido em 500 ml de ácido acético a 90% ao qual foi adicionada uma solução concentrada de I2/MeOH até ser observada uma cor castanha permanente. O excesso de I2 foi removido por adição de ácido ascórbico e a solução foi evaporada para um pequeno volume o qual é aplicado numa coluna (2,5 x 90 cm) de Sephadex G-25 a qual é eluída com AcOH a 50%. As fracções contendo um componente principal tal como determinado por absorção de UV e cromatografia em camada fina foram então reunidas, evaporadas para um pequeno volume e aplicadas numa coluna (1,5 x 70 cm) de sílica de octadecilsilano Vydac (10-15 pm). O análogo foi eluído com um gradiente linear de acetonitrilo em ácido trifluoroacético a 0,1% em água. As fracções foram examinadas por 31 84 102 ΕΡ 0 833 646/ΡΤ cromatografía em camada fina e cromatografia líquida de alto rendimento analítica e reunidas para dar o máximo de pureza. Liofilização repetida da solução em água rendeu o produto desejado na forma de um pó branco e fofo. O produto era homogéneo tal como determinado por cromatografía líquida de alta pressão (HPLC) e TLC. A análise de aminoácidos de um hidrolisado ácido e MALD MS confirmaram a composição do octapéptido. O análogo WOC-2B foi preparado agitando primeiro a resina neutralizada com Boc-O-benzil-treonina e di-isopropilcarbodiimida (1,5 mmol cada) em cloreto de metileno durante 1 h. A resina de aminoácidos resultante foi sujeita ao ciclo de passos (1) a (6) do programa de lavagem de cima. Os seguintes aminoácidos (1,5 mmol) foram cada um acoplados sucessivamente através do mesmo procedimento: Boc-S-metilbenzil-Cys, Boc-O-benzil-Thr, Boc-N-benziloxicarbonil-lisina, Boc-D-Trp, Boc-Phe, Boc-S-metilbenzil-Cys, Boc-O-diclorobenzil-D-Tyr e Boc-O-diclorobenzil-Tyr. Após lavagem e secagem, a resina completa possuindo ligado Boc-O-diclorobenzil-tirosina-O-diclorobenzil-D-tirosina-S--metilbenzil-cisteína-fenilalanina-D-triptofano-N-benziloxicarbonil-lisina-O-benzil-treonina--S-metilbenzil-cisteína-O-benziltreonina pesava 1,78 g. O análogo WOC-2B foi libertado da resina (1,78 g, 0,5 mmol) misturando a resina de aminoácidos com anisolo (5 ml), ditiotreitol (100 mg) e fluoreto de hidrogénio anidro (35 ml) a 0°C e agitando durante 45 min. O excesso de fluoreto de hidrogénio foi evaporado rapidamente sob uma corrente de azoto seco e o péptido (tirosina-D-tirosina-cisteína-fenilalanina-D-triptofano-lisina-treonina-cisteína-treonina-NH2) cíclico livre (WOC-2B) foi precipitado e lavado com éter. O péptido em bruto foi então dissolvido em 500 ml de ácido acético a 90% ao qual foi adicionada uma solução concentrada de I2/MeOH até ser observada uma cor castanha permanente. O excesso de I2 foi removido por adição de ácido ascórbico e a solução foi evaporada para um pequeno volume o qual é aplicado numa coluna (2,5 x 90 cm) de Sephadex G-25 a qual é eluída com AcOH a 50%. As fracções contendo um componente principal tal como determinado por absorção de UV e cromatografia em camada fina foram então reunidas, evaporadas para um pequeno volume e aplicadas numa coluna (1,5 x 70 cm) de sílica de octadecilsilano Vydac (10-15 pm). O análogo foi eluído com um gradiente linear de acetonitrilo em ácido trifluoroacético a 0,1% em água. As fracções foram examinadas por cromatografia em camada fina e cromatografia líquida de alto rendimento analítica e reunidas para dar o máximo de pureza. Liofilização repetida da solução a partir de água rendeu o produto desejado na forma de um pó branco e fofo. O produto era homogéneo tal como determinado por cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) e TLC. A análise de 32 84 102 ΕΡ 0 833 646/ΡΤ aminoácidos de um hidrolisado ácido e MALD MS confirmaram a composição do nonapéptido. O análogo (tirosina-alanina-D-tirosina-cisteína-tirosina-D-triptofano-lisina-valina-cisteína-treonina) cíclico (WOC-3A) foi preparado agitando a resina de benzidrilamina-poliestireno neutralizada acima descrita com Boc-O-benzil-treonina e di-isopropilcarbodiimida (1,5 mmol cada) em cloreto de metileno durante 1 h. A resina de aminoácidos resultante foi então sujeita ao ciclo de passos (1) a (6) do programa de lavagem acima descrito. Os seguintes aminoácidos (1,5 mmol cada) foram então acoplados sucessivamente através do mesmo procedimento: Boc-S-metilbenzil-Cys, Boc-Val, Boc-N-benziloxicarbonil-lisina, Boc-D-Trp, Boc-O-diclorobenzil-Tyr, Boc-S-metilbenzil-Cys, Boc-O-diclorobenzil-D-Tyr, Boc-Ala e Boc-O-diclorobenzil-Tyr. Após lavagem e secagem, a resina peptídica resultante de Boc-O-diclorobenzil-tirosina-alanina-O-diclorobenzil-D-tirosina-S-metilbenzil-cisteína-diclorobenzil-tirosina-D-triptofano-N-benziloxicarbonil-lisina-valina-S-metilbenzil-cisteína-O-benzil-treonina-benzidrilamina pesava 2,1 g. A resina de aminoácidos foi então sujeita a clivagem por HF e ciclização com I2 tal como acima descrito. A purificação em coluna tal como descrita rendeu o composto (tirosina-alanina-D-tirosina-cisteína-tirosina-D-triptofano-lisina-valina-cisteína-treonina) cíclico (WOC-3A). WOC-3 era homogéneo tal como determinado por HPLC e TLC. A análise de aminoácidos de um hidrolisado ácido e MALD MS confirmaram a composição do péptido WOC-3A. O análogo (tirosina-D-tirosina-cisteína-tirosina-D-triptofano-lisina-valina-cisteína-treonina) cíclico (WOC-3B) foi preparado agitando a resina de benzidrilamina-poliestireno neutralizada acima descrita com Boc-O-benzil-treonina e di-isopropilcarbodiimida (1,5 mmol cada) em cloreto de metileno durante 1 h. A resina de aminoácidos resultante foi então sujeita ao ciclo de passos (1) a (6) do programa de lavagem acima descrito. Os seguintes aminoácidos (1,5 mmol cada) foram então acoplados sucessivamente através do mesmo procedimento: Boc-S-metilbenzil-Cys, Boc-Val, Boc-N-benziloxicarbonil-lisina, Boc-D-Trp, Boc-O-diclorobenzil-Tyr, Boc-S-metilbenzil-Cys, Boc-O-diclorobenzil-D-Tyr e Boc-O-diclorobenzil-Tyr. Após lavagem e secagem, a resina de aminoácidos foi sujeita a clivagem por HF e ciclização com I2 tal como acima descrito. A purificação em coluna tal como descrita rendeu o composto (tirosina-D-tirosina-cisteína-tirosina-D-triptofano-lisina-valina-cisteína-treonina) cíclico (WOC-3B). WOC-3B era homogéneo tal como determinado por HPLC e TLC. A análise de aminoácidos de um hidrolisado ácido e MALD MS confirmaram a composição do péptido WOC-3B. 33 84 102 ΕΡ 0 833 646/ΡΤ Ο análogo D-tirosina-(tirosina-tirosina-D-tirosina-cisteína-fenilalanina-D-triptofano-lisina-treonina-cisteína-treonina) cíclico (WOC-4) foi preparado agitando a resina de benzidrilamina-poliestireno neutralizada acima descrita com Boc-O-benzil-treonina e di-isopropilcarbodiimida (1,5 mmol cada) em cloreto de metileno durante 1 h. A resina de aminoácidos resultante foi então sujeita ao ciclo de passos (1) a (6) do programa de lavagem acima descrito. Os seguintes aminoácidos (1,5 mmol cada) foram então acoplados sucessivamente através do mesmo procedimento: Boc-S-metilbenzil-Cys, Boc-O-benzil-Thr, Boc-N-benziloxicarbonil-lisina, Boc-D-Trp, Boc-Phe, Boc-S-metilbenzil-Cys, Boc-O-diclorobenzil-D-Tyr, Boc-O-diclorobenzil-Tyr, Boc-O-diclorobenzil-Tyr e Boc-O-diclorobenzil-D-Tyr. Após lavagem e secagem, a resina de aminoácidos foi sujeita a clivagem por HF e ciclização com I2 tal como acima descrito. A purificação em coluna tal como descrita rendeu o péptido (D-tirosina-tirosina-tirosina-D-tirosina-cisteína-fenilalanina-D-triptofano-lisina-treonina-cisteína-treonina) cíclico (WOC-4) que foi libertado da resina por clivagem por HF e ciclização com I2 conforme descrito. A purificação em coluna tal como descrita rendeu o composto WOC-4 homogéneo tal como determinado por HPLC e TLC. A análise de aminoácidos de um hidrolisado ácido e MALD MS confirmaram a composição do péptido WOC-4. O péptido [(D-tirosma)8-(lisina)4-(lisina)2-lisina-cisteína-fenilalanina-D-triptofano-lisina-treonina-cisteína-treonina] cíclico (WOC-8) foi preparado agitando a resina neutralizada acima descrita com Boc-O-benzil-treonina e di-isopropilcarbodiimida (0,75 mmol cada) em cloreto de metileno durante 1 h e a resina de aminoácidos resultante foi então sujeita ao ciclo de passos (1) a (6) do programa de lavagem de cima. Os seguintes aminoácidos (0,75 mmol) foram então acoplados sucessivamente através do mesmo procedimento: Boc-S-metilbenzil-Cys, Boc-O-benzil-Thr, Boc-N-benziloxicarbonil-lisina, Boc-D-Trp, Boc-Phe, Boc-S-metilbenzil-Cys, Boc-D-Phe e Bis-Boc-Lys. A resina foi então desprotegida, neutralizada e acoplada com Boc-Tyr (6 mmol) e DIC (6 mmol) na presença de 1-hidroxibenzotriazolo (6 mmol). Após lavagem e secagem, a resina completa de (Boc-D-tirosina)g-(lisina)4-(lisina)2-lisina-D-fenilalanina-S-metilbenzil-cisteína-fenilalanina-D-tripto-fano-N-benziloxicarbonil-lisina-Boc-O-benzil-Thr-S-metilbenzil-cisteína-O-benzil-treonina-benzidrilamina pesava 1,53 g. O WOC-8 foi libertado da resina por clivagem por HF e ciclização com I2 tal como descrito. A purificação em coluna rendeu WOC-8 homogéneo tal como determinado por HPLC e TLC. A análise de aminoácidos de um hidrolisado ácido e MALD MS confirmaram a composição do péptido WOC-8.

Como é evidente a partir da descrição acima, podem ser incorporados múltiplos

84 102 ΕΡ 0 833 646/ΡΤ 34 resíduos de tirosina no terminal N dos análogos de somatostatina. Os resíduos de tirosina podem ser adicionados ao análogo de modo a formarem uma estrutura de ramificação simétrica, tal como exemplificado pelo composto WOC-8. Altemativamente, os análogos de somatostatina podem ser prolongados no terminal N de uma forma assimétrica (i.e., as variáveis q e s na fórmula de cima não são iguais). Prolongamentoss N-terminais assimetricamente ramificados podem ser produzidas utilizando combinações do derivado de lisina, Na-Boc,Ne-FMOC-Lys. Este derivado de lisina pode ser desprotegido ou na posição Na por tratamento com TFA ou na posição N= por tratamento com soluções de piperidina/DMF. Assim, praticamente qualquer combinação de resíduos de tirosina pode ser adicionada ao terminal N para produzir cadeias de ramificação simétricas ou assimétricas.

Marcacão com iodo radioactivo dos análogos de somatostatina multi-tirosinados WOC-2A. WOC-2B- WOC-3A. WOC-3B. WOC-4 e WOC-8 A marcação radioactiva dos análogos de somatostatina multi-tirosinados pode ser conseguida através de uma variedade de protocolos de marcação radioactiva bem conhecidos na arte. A marcação com iodo radioactivo de WOC-2A, WOC-3A, WOC-3B, WOC-4 e WOC-8 foi conseguida adicionando primeiro tampão fosfato de potássio/sódio 0,5 M, pH 7,0 (0,1 ml) a um tubo de polipropileno de 12 x 75 m contendo 1 mCi de iodeto de sódio I (10 μΐ) e misturando. Subsequentemente, foram adicionados à mistura 5 pg de um análogo de somatostatina multi-tirosinado e 100 μΐ de tampão fosfato de potássio/sódio 0,05 M, pH 7,0 e a solução foi misturada novamente. Imediatamente a seguir a isto, foram adicionados à solução 5,7 pg de cloramina T (10 μΐ) e 60 segundos mais tarde a reacção foi parada adicionando 57 pg de metabissulfito (100 pl). Cada passo foi continuamente agitado para assegurar uma mistura rápida e correcta. Trinta segundos após a adição de metabissulfito de sódio, foram adicionados ao vaso reaccional 2,0 ml de albumina de soro humano a 0,005% (HSA) injectável em ácido acético 0,05 M.

Uma coluna SEP-PAK C-18 (Milipore Corporation, Milford, Mass) foi esterilizada com 5 ml de etanol a 70%, activada com 5 ml de 2-propanol e lavada com 12,5 ml de água purificada por HPLC. A mistura reaccional foi aplicada a esta coluna e a coluna foi lavada com 5 ml de água purificada por HPLC. A coluna foi então subsequentemente lavada com 5 ml de ácido acético 0,05 Μ. O análogo marcado foi eluído com 5 ml de etanol a 96%. O eluato final foi recolhido num tubo de polipropileno de 13 x 100 mm não revestido com HSA . A percentagem da radioactividade total recuperada para cada eluato foi contada com um calibrador de radioisótopos sob uma corrente suave de azoto a 40°C. O análogo marcado 35 84 102 ΕΡ 0 833 646/ΡΤ radioactivamente seco foi reconstituído em 115 μΐ de fosfato de potássio 100 mM, pH 6,9:metanol (40:60) e incubado a 40°C durante 15 min. com agitação em vórtex intermitente para assegurar uma reconstituição completa. O material redissolvido e marcado foi centrifiigado durante dois minutos para remover quaisquer partículas de matéria remanescentes.

Os análogos marcados radioactivamente foram então adicionalmente purificados por cromatografia líquida de alta pressão (HPLC). O sistema de HPLC foi primeiro equilibrado com fosfato de potássio 100 mM, pH 6,9:metanol:água (20:30:50) durante 18 min. a 1,0 ml/min. O análogo marcado radioactivamente reconstituído foi carregado na coluna e purificado a um caudal de 1,0 ml/min. durante 20 min. As condições iniciais da fase móvel foram mantidas durante 1 min. após as injecções de amostra, sendo então mudadas para fosfato de potássio 100 mM, pH 6,9:metanol (40:60) durante 2 min. Foram recolhidas fracções de 0,2 ml em tubos de polipropileno de 13 x 100 mm revestidos com HSA. A radioactividade de cada ffacção foi contada num calibrador de radioisótopos. Os cromatogramas para os detectores de UV e de radioisótopos foram processados e gravados utilizando o Programa de Gestão de Cromatografia MILLENIUM™ 2010. O análogo monoiodado marcado com I purificado foi evaporado até à secura num banho-maria a 40°C utilizando um fluxo suave de azoto. O resíduo de análogo seco, purificado e marcado radioactivamente foi reconstituído em 2,0 ml de cloreto de sódio a 0,9% e ácido acético 0,05 Μ. A solução de análogo foi então passada através de um filtro MILLEX-GV de 0,22 micra de fraca ligação a proteínas revestido com HSA a 2% e lavado com cloreto de sódio a 0,9%. Esta técnica permitiu uma separação rápida do pico específico para o espécimen marcado radioactivamente de resíduos indesejados.

Uma alíquota deste composto esterilizado por filtração foi incubada num digerido de caseína de soja a 35°C durante até 14 dias e meios de tioglicolato a 22°C durante até 14 dias para testar quanto a crescimento bacteriano. O teste de endotoxinas foi efectuado utilizando o estojo E-Toxate (Sigma, St. Louis, MO). As soluções que não demonstraram qualquer crescimento bacteriano às 48 horas e não mostraram qualquer endotoxina detectável foram consideradas seguras para utilização humana.

Toda a actividade dos espécimens (pCi) foi medida num calibrador de doses pelo menos 30 minutos antes da injecção intravenosa. O péptido marcado radioactivamente foi injectado através de uma veia periférica do braço numa linha intravenosa de livre circulação. Uma semana após a marcação, apenas 30% dos compostos peptídicos multi-tirosinados marcados com 131I, WOC-3A e WOC-3B, armazenados em solução salina, se degradaram. 36 84 102 ΕΡ 0 833 646/ΡΤ

Ensaios de ligação a receptores de somatostatina e de actividade biológica A linha celular de neuroblastoma humano IMR32 (ATCC CCL 127), a qual expressa receptores de somatostatina de tipo 2 (SSTR2), foi utilizada nos ensaios de ligação a receptores de somatostatina. As células IMR32 foram mantidas em meios essenciais mínimos (MEM) suplementados com 15% de soro fetal bovino inactivado pelo calor, 100 U/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina e aminoácidos não essenciais. As células em cultura foram colhidas num tampão contendo HEPES 20 raM, MgCl2 2 mM, EDTA 5 mM, 2-mercaptoetanol 1 mM, NaCl 150 mM e 50 pg/ml de fenilmetilsulfonilfluoreto (PMSF), (pH 7,4) a uma concentração de lxlO6 células/ml. As membranas celulares foram preparadas de acordo com o método de 0'Dorisio, M.S. et ai, Cell Growth and Differentiation, 5:1-8, 1994. As fracções membranares foram preparadas por centrifugação diferencial e as membranas foram ressuspensas em tampão e guardadas a -80° para estudos de ligação a receptores.

Os ensaios de ligação foram efectuados de acordo com o método de 0'Dorisio et al., supra. Resumidamente, os ensaios de ligação a receptores de somatostatina foram efectuados em meios contendo HEPES 50 mM, CaCl2 10 mM, MgCl2 5 mM, 50 ng/ml de bacitracina, 200 KlU/ml de Aprotinina, 0,02 pg/ml de PMSF e 0,5% de albumina de soro bovino. Foi determinada a ligação específica tanto de análogos de somatostatina multi-tirosinados marcados com I como de somatostatina nativa (S-14) marcada com I. As fracções membranares de IMR32 (100-150 pg) foram incubadas com análogo multi-tirosinado marcado com I ou I-somatostatma, 0,015 pM, com ou sem concentrações crescentes de ligando não marcado num banho-maria com agitação com temperatura controlada (17°C) durante 30 minutos. A reacção foi parada por centrifugação a 11000 xg durante 3 minutos. O fluído sobrenadante foi aspirado e a radioactividade do ligando ligado na pelete foi quantificada num contador gama. A ligação específica foi calculada utilizando a diferença entre ligação total e não específica (na presença de ligando não marcado 1 μΜ). As constantes de dissociação de equilíbrio (KD) e o número máximo de locais de ligação (Bmàx) foram determinados utilizando sete concentrações de péptido não marcado numa curva de ligação competitiva e calculados utilizando um ajustamento computorizado não linear de mínimos quadrados à equação da lei de massas de Munson e Rodbard, Munson, P.J. et al, Anal. Biochem., 107:220-239, 1980, tal como modificada por McPhearson, G. A., J. of Pharm. Meth., 14:213-228, 1985. Os resultados destes ensaios com WOC-2A, WOC-2B, WOC-3A, WOC-3B, WOC-4 e WOC-8 são mostrados na Tabela 3. As curvas de ligação para somatostatina nativa, WOC-2A e WOC-3B são mostradas nas Figs. ΙΑ, 1B e 1C, respectivamente. A Fig.

84 102 ΕΡ 0 833 646/ΡΤ 37 1D é um gráfico de uma curva composta mostrando as afinidades relativas de somatostatina nativa, WOC-2A e WOC-3B, e do análogo de somatostatina comercialmente disponível LANREOTIDE®. TABELA 3

Libertação de GH (CI50, nM) Ligação a Receptores de Somatostatina (membranas IMR32) (Kd, nM) Somatostatina 0,46 ± 0r,04 (18)* 0,23 ±0,15 LANREOTIDE® 0,40 ±0,10 (3) 1,05 ±0,51 WOC-2A 4,84 ± 0,58 (7) 5,73 ± 0,22 WOC-2B — 1,2 WOC-3A 0,96 ± 0,01 (2) 1,93 ±0,35 WOC-3B 0,66 ± 0,06 (8) 1,14 ±0,28 WOC-4 — 1,0 WOC-8 2,46 ± 0,69 (6) 0,69 ± 0,42

* Número de amostras testadas quanto a libertação de GH A exposição de membranas IMR-32 ao análogo de somatostatina WOC-3A marcado radioactivamente resultou em níveis elevados de ligação total. Quando as membranas que possuíam WOC-3A marcado radioactivamente ligado foram incubadas na presença de um excesso de 10000 vezes de WOC-3A ou de somatostatina nativa não marcados, nenhuma radioactividade foi deslocada. Estes resultados indicam que os análogos multi-tirosinados halogenados se ligam a receptores de somatostatina de uma forma irreversível (ou quase irreversível) e significam que estes análogos de somatostatina podem ser intemalizados na célula.

Os análogos de somatostatina multi-tirosinados foram também testados quanto à sua capacidade para inibirem a libertação de hormona de crescimento (GH) a partir de células pituitárias de rato fortemente dispersas, as quais expressam SSTR2. Pituitárias de ratos macho adultos Charles River CD (Wilmington, MA) mantidos sob condições controladas (com luz entre 0500-1900 hrs), foram dispersas e cultivadas utilizando uma técnica asséptica tal como previamente descrito com modificações (Hoefer et al., Mol. Cell Endocrinol., 35:229, (1984); Ben-Jonathan et al, Methods Enzymol., 103:249. (1983); e Heiman et al., Endocrinolosv, 116:410. (19851.

84 102 ΕΡ 0 833 646/ΡΤ 38

Resumidamente, as pituitárias foram removidas de ratos decapitados, seccionadas e colocadas então num frasco de cintilação líquida siliconizado contendo 2 ml de tripsina a 0,2% (Worthington Biochemicals, Freehold, NJ) em tampão bicarbonato de Krebs-Ringer esterilizado por filtração suplementado com albumina de soro bovino a 1%, glicose 14 mM, solução de vitaminas em meio de Eagle modificado (MEM) e aminoácidos em MEM (Gibco Laboratories, Grand Island, NY) (KRBGA). Todo o material de vidro foi siliconizado tal como descrito por Sayers et al, Endocrinology, 88:1063. (1971). Os fragmentos pituitários foram incubados em banho-maria durante 35 min. a 37°C com agitação. Os conteúdos do frasco foram então vertidos para um frasco de cintilação contendo 2 ml de ADNase a 0,1% (Sigma Chemical Co„ St. Louis, MO) em KRBGA e incubados durante 2 min. a 37°C com agitação. Após a incubação, o tecido foi decantado para um tubo de centrífuga de 15 ml e permitiu-se que assentasse. O meio foi descartado e as secções pituitárias foram lavadas 3 vezes com 1 ml de KRBGA fresco. As células foram dispersas em 2 ml de LBI a 0,05% (inibidor de tripsina de semente de lima, Worthington Biochemicals) puxando suavemente os fragmentos para dentro de uma pipeta de Pasteur polida à chama e siliconizada e expelindo-os. As células dispersas foram filtradas através de uma malha de Nylon de 630 pm de diâmetro (Tetko, Elmsford, NY) para um tubo de centrífuga de 15 ml novo. Foram utilizados mais 2 ml de solução LBI a 0,05% para lavar o primeiro tubo e foram transferidos para o segundo tubo com filtração.

As células dispersas foram ainda diluídas com aproximadamente 15 ml de meio de Eagle modificado por Dulbecco (GIBCO) esterilizado por filtração, suplementado com 2,5% de soro fetal de vitelo (GIBCO), 3% de soro de cavalo (GIBCO), 10% de soro de rato fresco (armazenado em gelo durante não mais que 1 h.) dos dadores de pituitárias, 1% de aminoácidos não essenciais em MEM (GIBCO), gentamicina (10 ng/ml; Sigma) e nistatina (10000 U/ml; GIBCO). As células foram vertidas para um frasco de vidro de extracção de fundo redondo de 50 ml com uma abertura de diâmetro grande, contadas com um hemacitómetro (aproximadamente 2000000 células por pituitária) e plaqueadas ao acaso a uma densidade de 200000 células por poço (placa múltipla Co-star 24; Rochester Scientific Co., Rochester, NY). As células plaqueadas foram mantidas em meio de Dulbecco numa atmosfera humidificada de 95% de ar e 5% de C02 a 37°C durante 4 dias a 5 dias.

Como preparação para um desafio com a hormona, as células foram lavadas 3 vezes com meio 199 (GIBCO) para remover o meio velho e as células em flutuação. Cada dose de somatostatina ou análogo (diluídos em tubos de ensaio siliconizados) foi testada na presença de GRF(1-29)NH2 1 nM em poços triplicados num volume total de 1 ml de meio 199 contendo 1% de BSA (fracção V; Sigma). Após 3 h. a 37°C numa atmosfera de ar/dióxido de

84 102 ΕΡ 0 833 646/ΡΤ 39 carbono (95/5%), ο meio foi removido e armazenado a -20°C até ser ensaiado quanto ao teor em hormona. As CI50 (uma concentração que proporciona uma inibição semi-máxima da libertação de GH) foram calculadas utilizando o programa de computador SigmaPlot (Jandel Scientific, San Rafael, CA).

Os resultados dos ensaios de inibição de libertação de GH são mostrados na Tabela 3. Todos os análogos de somatostatina multi-tirosinados testados inibiram a libertação de GH. A correlação directa entre ligação a receptores de somatostatina e inibição da libertação de hormona de crescimento é discutida em Rayner, Mol. Pharmacol., 43:838-844, 1993.

Os dados acima demostram que os análogos peptídicos multi-tirosinados não só se ligam a receptores de somatostatina, como também mantém a actividade biológica da somatostatina.

Exemplo de diagnóstico in vivo e terapia num doente humano HC é um homem branco de 75 anos diagnosticado com carcinoma bronquíoloalveolar do pulmão há aproximadamente 4 anos. HC foi sujeito a uma lobectomia superior direita e quimioterapia intensa com múltiplos agentes. A sua doença foi progressiva ao longo desses tratamentos. Um exame com pentetreotídeo marcado com U1ln (OCTREOSCAN ) mostrou múltiplos tumores ao longo de ambos os campos pulmonares. Com base nesta verificação, o doente foi colocado a acetato de octreotídeo subcutâneo (2 mg/dia) administrado primeiro através de três injecções separadas espacialmente e subsequentemente administrado por infusão subcutânea contínua através de uma bomba operada por uma bateria. O doente tolerou bem esta terapia e teve inicialmente uma diminuição de 25% no volume do seu tumor. Ao longo dos vários meses seguintes o tumor do doente progrediu apesar desta terapia. A terapia com acetato de octreotídeo foi terminada e uma semana mais tarde o doente foi outra vez sujeito a um exame com mIn-pentetreotídeo (Octreoscan®). Este exame mostrou que HC tinha desenvolvido aproximadamente 15 metástases cerebrais e que o seu tumor pulmonar continuava a dar positivo no exame. Não foram encontrados outros locais adicionais de metástases.

Após cuidadosa consideração e consulta com o médico local do doente e com o seu médico oncologista local, foi decidido que este doente tinha esgotado todas as opções de tratamento convencionais. Como o tumor do doente se ligava a análogos de somatostatina marcados radioactivamente tal como demonstrado pelo exame com mI-pentetreotídeo, a

84 102 ΕΡ 0 833 646/ΡΤ 40 terapia com análogos de somatostatina marcados radioactivamente pode ser eficaz uma vez que estes análogos distribuiriam a radioactividade directamente no tumor. A utilização necessariamente compassiva de análogos de somatostatina marcados radioactivamente foi iniciada imediatamente. O análogo de somatostatina multi-tirosinado WOC-3A foi marcado radioactivamente e a sua ligação a receptores de somatostatina foi testada tal como acima descrito. Foi feito um lote de 131I-WOC-3A (1,6 mCi) (Iso-Tex Corporation, Friendswood, TX) e a sua esterilidade e pirogenicidade foram testadas em Iso-Tex. Foi injectado intravenosamente WOC-3A marcado radioactivamente e foram calculadas a farmacocinética e biodistribuição do composto marcado radioactivamente. A proporção tecido tumoral/normal da distribuição de WOC-3A marcado radioactivamente foi aproximadamente de 3:1 a 6:1.

Após a injecção de 1,6 mCi de I31I-WOC-3A, o doente foi sujeito a três dias de exame médico nuclear utilizando uma máquina fotográfica SPECT de 3 cabeças bem como uma máquina fotográfica ADAC. Adicionalmente, foram obtidas contagens de radiação do corpo inteiro para calcular a perda de radioisótopo pelo corpo inteiro durante o período de três dias. Estes estudos indicaram que uma dose de 1500 mCi pode proporcionar uma dose terapêutica de radiação tumoricida e mesmo assim estar dentro da tolerância do tecido normal quanto a exposição a radiação para todos os tecidos excepto a medula óssea. A medula óssea receberia um excesso de 450 rads (uma dose que requer transplantação de medula óssea em 50% dos doentes). Assim, como preparação para transplantação de medula óssea, o doente foi sujeito a colheita de medula óssea para proporcionar células para re-infusão após terapia com WOC-3 e suficiente depuração do análogo marcado radioactivamente da circulação do doente.

Foram dados ao doente 1610 mCi de uma preparação de análogo de somatostatina marcado radioactivamente por infusão intravenosa durante um período de uma hora. A preparação de análogo continha 582 mCi, 758 mCi de WOC-3 A e 221 mCi de WOC-3B. Para prevenir a acumulação no intestino de análogo marcado com I excretado, foi colocado um tubo Dobhoff no duodeno. O tubo foi lavado com 500 cc/h. de Go-Lytely . Durante todo o tempo da administração de Go-Lytely , o doente esteve sentado numa sanita concebida para descarregar água continuamente para diluir os resíduos radioactivos tão rápido quanto possível. Este tratamento foi efectuado no Medicai Center of Louisiana em New Orleans (Charity Hospital) numa sala dianteira numa secção isolada do hospital. O 131I livre no ar foi extraído do ar utilizando um filtro de carvão em série com um filtro UHEPA. Toda a exposição do pessoal a radiação foi continuamente monitorizada com dosímetros pessoais. A State of Louisiana Nuclear Regulatory Agency forneceu dois observadores para

84 102 ΕΡ 0 833 646/ΡΤ assegurar a segurança do pessoal.

Seis dias após a administração do análogo de somatostatina marcado radioactivamente, as contagens corporais totais do doente tinham diminuído para níveis que permitiam um exame médico nuclear do seu cérebro. A este ponto as contagens no seu peito eram ainda demasiado elevadas para permitir o exame.

Subsequentemente, o doente desenvolveu uma arritmia cardíaca (contracções atriais prematuras com uma rápida resposta ventricular) e foi necessário uma digitalização. O doente foi transferido para a unidade de cuidados intensivos e foi subsequentemente demonstrado que tinha tido um enfarte do miocárdio por enzimas e alterações de EKG. O seu historial médico incluía dois enfartes do miocárdio significativos, tendo sido o mais recente aproximadamente cinco meses antes desta terapia. No sétimo dia após o análogo de somatostatina marcado com I, o doente sofreu uma arritmia cardíaca letal e faleceu. Foi efectuada uma autópsia sete dias após a injecção e foram colhidos tecido normal/tumoral para determinação do número de mCi de I31I em cada grama de tecido. Adicionalmente, foi efectuado um protocolo de autópsia padrão para histologia. Biópsias de cérebro, músculo e tiróide foram sujeitas a autorradiografia para permitir a exposição de grãos de prata a 131I-WOC3. Foi observada deposição de grãos de prata no cérebro, indicando que o 131I-WOC3 penetrou na barreira hemato-encefálica. Foi também observada deposição de grãos de prata na tiróide, mas não foi observada no músculo. Esta última observação indica que a localização de l31I-WOC3 é específica do tecido e se correlaciona com a expressão de receptores de somatostatina específica do tecido.

Conclusões grosseiras na autópsia mostraram uma grave doença das artérias coronárias com artérias coronárias tipo “chaminé” (“store pipe”), várias cicatrizes cardíacas antigas consistentes com antigos enfartes do miocárdio e evidências de um enfarte sub-endocárdico recente. Não foram observadas quaisquer evidências de edema cerebral significativo ou evidências de disfunção de outro órgão. O cérebro normal e os tumores cerebrais eram claramente distintos um do outro e a proporção de mCi/g de tecido em tumor cerebral/cérebro normal era de 12:1. Não foi encontrada radioactividade significativa no coração. A natureza difusa dos tumores pulmonares miliares do paciente tomaram muito difícil a diferenciação entre pulmão normal e pulmão contendo tumores. Assim, foi impossível a determinação de proporções tecido tumoral/normal no pulmão.

Subsequentemente, os espécimes de tecido tumoral e normal foram examinados por 42 84 102 ΕΡ 0 833 646/ΡΤ autorradiografia. Quantidades significativas de radioactividade estavam associadas ao interior do tumor cerebral e uma quantidade limitada de radioactividade estava distribuída pelo interior do tecido cerebral normal. Embora estes resultados não possam ser atribuídos unicamente aos análogos multi-tirosinados devido à presença de LANREOTIDE™ na preparação injectada, as proporções de ligação a tecido tumoral/tecido normal são consistentes com os diagnósticos por exames pré-operatórios utilizando WOC-3A sozinho.

Outras concretizações do invento estão nas seguintes reivindicações.

Lisboa, 21 JÂPÍ. 2000

Por THE ADMINISTRATORS OF THE TULANE EDUCATIONAL FUND; THE OHIO STATE UNIVERSITY RESEARCH FOUNDATION; THE LOUISIANA STATE UNIVERSITY MEDICAL CENTER FOUNDATION e CHILDREN’S HOSPITAL, INC. - O AGENTE OFICIAL -

'ENG.· ANTÓNIO JOÂO DA CUNHA EERREIRA Ag, Of. Pr. Ind.

Rue das Flores, 74 - 4 * 1200 LISSOA

Claims

84 102 ΕΡ 0 833 646/ΡΤ 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Composto possuindo uma fórmula seleccionada de entre o grupo que consiste em: a) (Y)n+1P, b) (Y)n-Ala-Y-P, e C) (Y)q[/X]q.l χ ^X-P (Y)s[>X]s-I em que P é um análogo peptídico de somatostatina que se liga a um receptor de somatostatina, Y é D-tirosina, L-tirosina ou desamino-tirosina, n é um número inteiro de 1 a 32, inclusive, cada q, independentemente, é um número inteiro de 1 a 32, inclusive, cada s, independentemente, é um número inteiro de 1 a 32, inclusive, onde q e s podem ser iguais ou diferentes, e X tem a fórmula D-NH2-CH(CH2)mNH2-C02H ou L-NH2-CH(CH2)mNH2-C02H, em que m é um número inteiro de 1 a 10, inclusive.
2. Composto de acordo com a reivindicação 1, em que P é seleccionado de entre o grupo que consiste em: a) Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2; b) Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2; e c) Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr(ol).
3. Composto de acordo com a reivindicação 1, em que X é lisina.
4. Composto de acordo com a reivindicação 1, em que o composto compreende um átomo de halogéneo ligado a uma D-tirosina, L-tirosina ou desamino-tirosina do composto.
5. Composto de acordo com a reivindicação 4, em que o referido átomo de halogéneo é radioactivo.
6. Composto de acordo com a reivindicação 5, em que ò referido átomo de halogéneo radioactivo é 1231, 124I, l251, 129I ou 131I.
7. Composto possuindo uma fórmula seleccionada de entre o grupo que consiste em: 84 102 ΕΡ 0 833 646/ΡΤ 2/3 I-1 a) D-Tyr-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH^ b) T yr-D-T yr-Cy s-Phe-D-T rp-Lys-Thr-C vs-Thr-NH·), c) Tyr- Ala-D-Tyr-Cys-T yr-D-T rp-Lys-V al-Cys-Thr-NH7, d) Tyr-D-Tyr-Cys-Tyr-D-Tro-Lys-Val-Cys-Thr-NH?, e) D-Tyr-Tyr-Tyr-D-Tyr-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2, f) D-Tyrx LyS D-Tyr \ Lys D-Tyr ^ Lys D-Ty/ Lys-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2 D-Tyr^ Lys D-Tyr7 Lys D-Tyr^ Lys D-Tyr.
8. Composto de acordo com a reivindicação 7, compreendendo ainda um átomo de halogéneo ligado a um resíduo de tirosina.
9. Composto de acordo com a reivindicação 8, em que o resíduo de tirosina é seleccionado de entre o grupo que consiste em L-tirosina, D-tirosina ou desamino-tirosina.
10. Composto de acordo com a reivindicação 8, em que o referido átomo de halogéneo é radioactivo.
11. Composto de acordo com a reivindicação 9, em que o referido átomo de halogéneo radioactivo é seleccionado de entre o grupo que consiste em: 123I, l24I, 125I, 129I e
12. Composição farmacêutica compreendendo: um composto de acordo com a reivindicação 1; e um transportador farmaceuticamente aceitável. 84 102 ΕΡ 0 833 646/ΡΤ 3/3
13. Método para diagnosticar in vitro um tumor associado a expressão anormal de um receptor de somatostatina, compreendendo o referido método os passos de: obtenção de uma amostra de tecido de um doente, sendo o referido tecido suspeito de expressar de forma anormal um receptor de somatostatina; o contacto da referida amostra com um composto de acordo com a reivindicação 1, em que o referido composto é marcado de forma detectável e o referido contacto permite a ligação do composto aos receptores de somatostatina da amostra; e detecção de um nível de ligação do marcador à referida amostra; em que um nível de ligação do marcador à referida amostra significativamente superior a um nível de ligação a uma amostra de controlo negativo é indicativo de um tumor associado a expressão anormal de um receptor de somatostatina no referido doente. Lisboa, 2Z. JM 2Q0.Q Por THE ADMINISTRATORS OF THE TULANE EDUCATIONAL FUND; THE OHIO STATE UNIVERSITY RESEARCH FOUNDATION; THE LOUISIANA STATE UNIVERSITY MEDICAL CENTER FOUNDATION e CHILDREN’S HOSPITAL, INC. - O AGENTE OFICIAL -

ENG.* ANTÓNIO JOÃO DA CUNHA FERREIRA Ag. Of. Pr. Ind. Rua das Flores, 74 - 4.* 1BOO LISBOA