PT789716E - Anticorpos contra proteinas alogenicas e xenogenicas sua utilizacao no diagnostico e na terapia e metodos para a sua determinacao - Google Patents

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DESCRIÇÃO “ANTICORPOS CONTRA PROTEÍNAS ALOGÉNICAS E XENOGÉNICAS, SUA UTILIZAÇÃO NO DIAGNÓSTICO E NA TERAPIA E MÉTODOS PARA A SUA DETERMINAÇÃO” A presente invenção diz respeito a métodos de diagnóstico para a detecção de anticorpos naturais que reconhecem proteínas extraíveis a partir de órgãos de mamíferos tendo um peso molecular de cerca de 14 Kda dotadas com actividade antitumor quando administradas a espécies xenogénicas. A invenção refere-se igualmente aos referidos anticorpos naturais em forma purificada e à sua utilização no diagnóstico e em terapêutica. A patente de invenção W092/10197 descreve substâncias proteicas susceptíveis de serem obtidas mediante extracção a partir de órgãos, de mamíferos, particularmente o fígado, com ácido perclónco e soluções hipertónicas de soro fisiológico.

Uma das referidas substâncias com um peso molecular de cerca de 14 Kda foi isolada e parcialmente sequenciada (pedido de patente, de invenção italiana n° MI 94001469) e tomou-se a proteína principal responsável pelas propriedades biológicas observadas, em particular actividade antitumor e capacidade para produzir, quando administrada a animais de uma espécie diferente daquela de que foi extraída, anticorpos susceptíveis de reconhecer antigéneos tumorais. O referido pedido de patente de invenção italiana descreve igualmente

dois anticorpos monoclonais, segregados pelos hibridomas depositados na European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Proton Down, Salisbury, UK com os números 930806103 e 930806104, e que reconhecem epítopes comuns aos antigénios do tumor e à referida proteína de 14 Kda a partir de fígado de cabra (no seguimento referido como UK 114) utilizados como antigénios na preparação do hibridoma.

Descobriu-se agora que os anticorpos naturais que reconhecem tanto proteínas alogénicas e xenogénicas susceptíveis de ser extraídos a partir de órgãos (em particular do fígado) dotados com as propriedades descritas anteriormente e presentes em cerca de 93 % de tumores sólidos humanos, circulam no soro de mamíferos. Os referidos anticorpos, normalmente presentes num título baixo (< 1/100) no soro de animais e seres humanos saudáveis, podem ser estimulados por injecção do antigénio correspondente, provocando um aumento notável do título e da capacidade no soro para produzir efeitos citotóxicos contra células cancerosas.

Independentemente das interpretações possíveis dos resultados observados e do significado da presença de anticorpos naturais anti-UK 114, interpretações essas que são irrelevantes para a validade da presente invenção, os referidos anticorpos e as suas detecções são úteis para fins de diagnóstico, prognóstico e terapêutico.

Numa primeira forma de realização, a presente invenção diz respeito, por consequência, a um processo para a detecção imunológica de anticorpos naturais anti-UK 114. A invenção refere-se igualmente aos anticorpos purificados anti-UK 114 e à sua utilização em diagnóstico, terapêutica e imunocitoquímica. Os processos

para a detecção dos anticorpos naturais são de tipo convencional e podem basear-se em reacções de tipo directo, competitivo ou “sanduíche”. Os protocolos podem utilizar quer suportes sólidos ou técnicas de imunoprecipitação. Os anticorpos e/ou os antigénios de tipo UK 114 utilizados nos imunoensaios serão marcados apropriadamente com enzimas (por exemplo nas técnicas ELISA) ou com compostos, corantes ou pigmentos radioactivos ou fluorescentes, etc. O sinal do imunocomplexo pode eventualmente ser eliminado por meio do sistema biotina-avidina. A escolha da configuração do processo e dos materiais relacionados encontra-se dentro dos conhecimentos normais de um técnico da especialidade.

Descobriu-se também que os anticorpos anti-UK 114 presentes no soro de pacientes tratados com as proteínas descritas na patente de invenção W092/10197 ou com UK 114 purificado são dotadas com in vitro e in vivo de actividade citotóxica e citolítica contra células de tumor humano. A invenção, numa outra forma de realização, proporciona também uma composição citolítica e citotóxica que compreende anticorpos monoclonais ou policlonais ou soro hiperimune, produzido mediante imunização de animais ou de seres humanos com proteínas susceptíveis de ser extraídas a partir de fígado de cabra com ácido perclórico e reconhecidas pelos anticorpos monoclonais segregados pelos hibridomas depositados na ECACC sob os números de admissão 930806103 ou 930806104.

In vivo, a actividade citotóxica atinge um pico alguns dias após a administração do antigénio (UK 114 ou UK 101) e diminui lentamente nas semanas subsequentes. O título de anticorpos anti-UK 114 do tipo IgG, pelo contrário, 4 aumenta lentamente com o tempo, conforme avaliado por um ensaio ELISA. Pode presumir-se, por consequência, que o primeiro pico de citotoxicidade é devido aos anticorpos de tipo IgM, e/ou a outros componentes do soro até agora não identificados. E de qualquer forma evidente a importância dos processos que permitem a determinação de anticorpos e/ou a citotoxicidade de modo que a terapia pode ser seguida de maneira apropriada. A administração dos anticorpos, quer naturais ou monoclonais, de acordo com a presente invenção pode ser realizada parentericamente em doses suficientes para se conseguir um efeito citotóxico. Os métodos de administração apropriados são substancialmente idênticos aos já conhecidos para a administração de vacinas, anticorpos ou soro hiperimune. A presente invenção e os exemplos 2-4 seguintes proporcionam ainda linhas de orientação para as aplicações terapêuticas e de diagnóstico dos anticorpos descritos anteriormente.

Os exemplos seguintes ilustram ainda a invenção.

Exemplo 1

Adicionam-se 2,5 % de SDS e 5 % de mercaptoetanol a 100 μΐ de extracto perclórico de fígado de cabra (W092/10197; UK 101). Aquecem-se as amostras à temperatura de 100°C durante 5 minutos e analisam-se 4 μΐ em SDS-PAGE utilizando o aparelho PHAST SYSTEM (Pharmacia) com um gradiente de políacrilamida/gel de 8/25 (Pharmacia). Como alternativa, podem utilizar-se geles homogéneos mesmo para densidade elevada. As proteínas separadas foram transferidas electroforeticamente utilizando o aparelho de Phast-Transfer 5

(Pharmacia). Equilibrou-se previamente a membrana de nitrocelulose (0,22 μ) em tampão de Tris (25 mM) glicina (192 mM) a que se adicionou 20 % de metanol. Realizou-se a experiência a 5V x 20 min. (1 A/cm2). Incubou-se então a membrana, após uma passagem de saturação, para impedir a ligação não específica com o soro em exame.

Detecta-se a ligação do anticorpo eventualmente presente com um segundo A b anti-humano, marcado apropriadamente por métodos colorimétricos, radio-imunométricos ou quimioluminescentes.

Exemplo 2

Ensaios imunossorventes de ligação com a enzima (ELISA) para a detecção de anticorpos a UK 114.

Utilizaram-se os tampões seguintes : (A) bicarbonato de sódio 50 mM pH 8,5, (B) fosfato de sódio 50 mM pH 7,2, (C) fosfato de sódio 50 mM pH 7,4, 0,1 % (p/v) de NaN3, (D) fosfato de potássio 40 mM pH 7,4, 150 mM de NaCl, 0,02 % (p/v) de NaN3, 0,05 (v/v) de Tween 20, (E) fosfato de sódio 50 mM pH 7,4, 0,1 % (p/v) de NaN3, 0,1 % (p/v) de BSA, (F) fosfato de sódio 50 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, 0,1 % (p/v) de NaN3, 0,5 % (p/v) de BSA isenta de protease, 0,05 % (v/v) de Tween 20,0 %, (v/v) de cabra normal.

Misturaram-se 3,5 ml de UK 114 (3,5 mg) em tampão A com 9 μΐ de 6 NHS-LC Biotina (S.p.A., Milão) a 2 mg/ml em sulfóxido de dimetilo. Incubou-se a mistura à temperatura de 22°C durante 3 horas e dialisou-se durante 24 horas à temperatura de 4°C contra diversas modificações de tampão B em tubo de diálise Spectrapor 6 (fracção de 3500 D).

Revestiram-se cavidades de microtitulação com 100 pl a BSA-biotina (5 pg/ml em tampão C) durante 24 horas à temperatura de 4°C, lavaram-se em seguida e trataram-se com 100 μΐ de estreptavidina (5 pg/ml em tampão E). Após uma segunda incubação durante a noite à temperatura de 4°C lavaram-se as cavidades e trataram-se com 100 μΐ de UK 114-biotma para uma concentração diferente (2, 1 e 0,5 pg/ml em tampão E) durante 24 horas à temperatura de 4°C. Após lavagem bloquearam-se as cavidades.

Obtiveram-se cavidades de antigénio não revestidas seguindo a mesma técnica com a excepção de se utilizar uma terceira fase de incubação utilizando tampão E em vez da solução de UK 114-biotina.

Realizou-se a fase de lavagem mediante adição de 300 μΐ / cavidade de tampão D três vezes. Efectuou-se o bloqueio mediante adição de 300 μΐ de tampão C contendo 10 % de sacarose e diferentes agentes de bloqueio : 1 % e 5 % de albumina de soro bovino, 1 % de glicina, 1 % de BSA a que se adicionou 3 % de polivimlpirrolidona, 5 % de soro normal de cabra. Decorridos 30 minutos à temperatura ambiente eliminou-se a solução de bloqueio e secaram-se as cavidades numa câmara de vazio após o que se armazenaram embrulhadas em folha de polietileno e alumínio à temperatura de 4°C até utilização. 7íi

Processo ELISA

Diluíram-se amostras de soro e controlo negativo a 1:21 com tampão F antes de serem ensaiadas. Adicionaram-se 100 μΐ de amostras e soluções padrão (1, 2, 4 e 8 U/mL em tampão F) a cavidades revestidas e incubaram-se durante uma hora à temperatura ambiente num agitador horizontal (400 - 500 rpm). Lavaram-se então as cavidades 4 vezes com 300 pL de tampão D após o que se adicionaram 10 pL de uma solução a 1:3000 de IgG de cabra anti-humano com o anticorpo marcado com peroxidase de rábano dissolvido em tampão de Stabilgen. Após uma hora de incubação à temperatura ambiente no agitador horizontal (400 - 500 rpm) lavaram-se as placas e revelaram-se utilizando 100 pl de Blue Star Solution (H2O2/TMB). Após incubação à temperatura ambiente (18 - 24°C) durante 15 minutos, interrompeu-se a reacção mediante adição de 100 pl de H2S04 1 M e leu-se a densidade óptica (DO) utilizando um fotómetro de comprimento de onda dual a 450 nm a 630 nm como comprimento de onda de referência.

Diluíram-se ainda os espécimes com DO superior a 8 U/mL convencional antes de serem analisados. A concentração de espécime foi calculada a partir da curva padrão. Determinação do Titulo em Pacientes Submetidos a Imunoterapia A avaliação do título de anticorpo UK 114 que foi realizada em pacientes submetidos a terapia UK 101 mostra uma resposta do anticorpo superior ao valor inicial em 28 % dos pacientes com cancro da mama e 46 % dos pacientes com cancro do cólon logo após 15 dias de administração de UK 101 (4 injecções subcutâneas). Após 40 dias a contar do início da terapia com UK 101, pode 8 8

detectar-se o aumento do título de anticorpo UK 114 em 63 % e 97 % dos pacientes com cancro do cólon e da mama, respectivamente (figuras 1 e 2).

Exemplo 3

Efeito citotóxico de anticorpos anti-UK 114 sobre linhas de células de tumor.

Para os estudos citotóxicos utilizaram-se as linhas de célula de tumor KATO-III (carcinoma gástrico) e o NICH (carcinoma das células pequenas do pulmão), respectivamente positivas e negativas para o manchamento da superfície mediante imunofluorescência indirecta com o anticorpo monoclonal segregado a partir do hibridoma P3D1DII depositado a partir de ECACC sob o número 930806103 e anticorpo policlonal de coelho anti-UK 114 (rAb). Avaliou-se a citotoxicidade como a percentagem de libertação de 51 Cr a partir das linhas de células incubadas para um período variável de tempo com uma concentração diferente de mAb P3D1DII Rb anti-UK 114 Ab ou com um anticorpo monoclonal ou policlonal não relacionado como controlo, na presença de uma fonte de complemento heterólogo (cobaia) ou homólogo ou na presença de monócitos humanos purificados. Descobriu-se que tanto o mAb P3D1DII como o anti-UK 114 rAb mas não os anticorpos de controlo não relacionados induzem na KATO-III uma citotoxicidade dependente do complemento, que se encontrava ausente quando se utilizava soro deficiente em C9 ou activada pelo calor como uma fonte de complemento. Restabeleceu-se a citotoxicidade quando o soro deficiente em C9 foi reconstituído com C9 purificado. Além disso, o Rb anti-UK 114 Ab mas não o Rb Ab não relacionado induziram a citotoxicidade dependente do anticorpo (ADCC) 9 quando se utilizou a KATO-III como alvo. A pré-absorção de anti-UK 114 Ab com o antigénio purificado vai abolir a citotoxicidade induzida pela anticorpo. Pelo contrário, não se observou qualquer citotoxicidade de complemento ou ADCC para o NICH. Esses resultados sugerem que os anticorpos anti-UK 114 têm um complemento potencial e uma citotoxicidade dependente do anticorpo-célula para as linhas de células de tumor com a expressão de superfície do antigéneo UK 114.

Exemplo 4

Citotoxicidade in vivo de anticorpos anti-UK 114 no murganho nu xenoenxertado com linhas de células de tumor humano.

Desafiaram-se murganhos nus c.s. com células de adenocarcinoma do cólon humano 1 x ΙΟ6 HT29. Oito horas mais tarde receberam uma injecção no sítio do tumor de ou 0,2 ml de um soro hiperimune de coelho anti-UK 114 (1/12 do título) produzido por coelhos imunizados com UK 114. Repetiu-se o tratamento no 7o, 11°, 14°, 18°, 21° e 25° dias após o desafio. Tratou-se de maneira análoga um outro grupo de murganhos com soro a partir de pacientes com tumor que responderam clinicamente à administração de UK 114 e produziram anti-UK 114 Ab.

Um grupo testemunha recebeu apenas o veículo. Os grupos tratados mostraram um aumento estatisticamente significativo de esperança de vida e um decréscimo da tomada de tumores. A latência do tumor foi também prolongada de maneira assinalável nos grupos tratados em comparação com o grupo testemunha. A título de exemplo, os resultados obtidos com o anti-soro de coelho e com o soro 10 humano encontram-se referidos no quadro seguinte.

Tratamento Tomada de Latência Sobrevivência Tumor (dias) (dias) Controlo 12/12 9 30 Soro de coelho anti-UK 114 2/12 28 84 Soro Humano anti-UK 114 5/20 23 67

Lisboa, 30 de Junho de 2000

Rua do Salitre, 195, r/e-Rrt. 1250 LISBOA

Claims (4)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a detecção imunológica de anticorpos naturais que reconhecem uma proteína susceptível de ser extraída a partir de órgãos de mamíferos reconhecidos pelos anticorpos monoclonais segregados pelos hibridomas depositados na ECACC sob os números de admissão 930806103 ou 930806104 e presentes em cerca de 93 % de tumores sólidos humanos que compreende a detecção de um imunocomplexo entre os referidos anticorpos naturais e as referidas proteínas eventualmente marcadas.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se detectar o imunocomplexo com um segundo anticorpo marcado anti-espécies.

3. Anticorpos naturais que reconhecem proteínas susceptíveis de ser extraídas a partir de órgãos de mamíferos reconhecidos pelos anticorpos monoclonais segregados pelos hibridomas depositados na ECACC sob os números de admissão 930806103 ou 930806104 e presentes em cerca de 93 % de tumores sólidos humanos.

4. Composições citotóxicas que compreendem anticorpos.de soro hiper-imune, produzidas mediante imunização de animais ou seres humanos com proteínas susceptíveis de ser extraídas a partir de fígado de cabra com ácido perclórico e reconhecidos por anticorpos monoclonais segregados pelos hibridomas depositados na ECACC sob os números de admissão 930806103 ou 930806104.

Rua do Saístre, !5-5, r/e-Drt. 1250 LISBOA Lisboa, 30 de Jun 1 RESUMO “ANTICORPOS CONTRA PROTEÍNAS ALOGÉNICAS E XENOGÉNICAS, SUA UTILIZAÇÃO NO DIAGNÓSTICO E NA TERAPIA E MÉTODOS PARA A SUA DETERMINAÇÃO” A presente invenção diz respeito a métodos de diagnóstico para a detecçao de anticorpos naturais que reconhecem proteínas susceptíveis de ser extraídas a partir de órgãos de mamíferos tendo um peso molecular de cerca de 14 Kda dotados com actividade antitumoral quando administrados a espécies xenogénicas. Lisboa, 30 de Juribo de 2000 O Agente Oficiai da Proprâadads Industjal

JOSE DE^AMP^íO AÍO.P.L Rua do Salitre, r/c-Drt. 1250 LISSGA