PT78416B - A method of synthesizing cdna clones from phenylalanine hydroxilase and for the use thereof in the diagnosis of classical phenylketonuria - Google Patents
A method of synthesizing cdna clones from phenylalanine hydroxilase and for the use thereof in the diagnosis of classical phenylketonuria Download PDFInfo
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Description
Descrição do objecto do invento
que
HOVARD HUGHES MEDICAL INSTITUTE Instituto Médico norte-americano (Estado Delaware), com sede em Coconut Grove, Florida, Esta dos Unidos da América, pretende obter em Portugal, para: "PROCESSO PARA A SÍNTESE DE CLONES cADN HIDROXILASE FENILALANINA E PARA A SUA UTILIZAÇÃO NO DIAGNUS TICO DE FENILCETONÚRIA CLÁSSICA»
0 presente invento refere-se a um processo para a síntese de clones cADN hidroxilase fenilalanina e para a sua utilização no diagonóstico de fenilcetonuria clássjL ca·
Fenilcetonuria e sua Genética de População
A fenilcetonuria (FCU) é um desarranjo gen<» tico humano provocado por um erro congénito no metabolismo a mino ácido aromático. Observou-se pela primeira vez há cerca de 50 anos que pacientes neste estado tinham excesso de fenilpiruvato na urina (Folling, A., 1934a, Nord. Med. Tidskr. 8, 1054-1059; Folling, A., 1934b, Zitschr. Physlol. Chem, 227. 169-176). Depois disso descobriu-se que fígados desses pacientes eram incapazes de transformar fenilalanina em tirosina, que é o percurso metabólico principal de fenilalanina (Jervis, G.A., 1953, Proc. Soc, Exp. Biol, Med. 82. 514-515; Udenfriend, S. e Bessman, S.P., 1953, J. Biol. Chem . 203. 961-966: Wallace et al., 1957, Proc. Soc. Exp. Biol, Med. £4, 632-633; Mitoma et al., 1957, Proc. Soc. Exp.Biol. Med. ^4,, 634-635) · A FCU clássica é assim caracterizada por
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uma falta de actividade hidroxilase fenilalanina no fígado (Kaufman, S., 1976, em: Advances in Neurochemis t ry. Vol. 2, pp. 1-132, Agranoff, B.W. e Aprieon, M.H., eds., Plenum Press, Nova York e Londres), A falta desta actividade enzi mática provoca hiperfenilalaninemia persistente e os percur sos metabólicos secundários para fenilalanina tornam-se sobreutilizados, Níveis elevados de fenilalanina e seus derivados sSo tóxicos e causam perturbações no metabolismo de tirosina e triptofano (Blau, K., 1979, em: Aromatic Amino Acid Hydroxylase and Mental Disease (Youdim, Μ,Β.H., ed,)pp 79-139, Nova York, Wiley). Menor forraaçSo de catecolaminas, malanina e serotonina é característica em pacientes de FCU n&o tratados, e o sintoma clínico é um enfraquecimento irre versível do desenvolvimento do cérebro, que dá origem a um grave atraso mental das crianças n&o tratadas (Polling, A., 1934a, Nprd. Med. Tidskr. 8, 1054-19591 Folling, A., 1934b Zltschr. Physiol. Chem. 227. 109-176).
A deficiência hidroxilase fenilalanina, in
dependentemente de variações fenotípicas, é transmitida como característica regressiva autossomática. A observaçRo em massa de mais de 5 milhões de recém-nascidos mostrou que a preponderância de fenilcetonúria clássica entre os indivídu os de raça branca varia desde 1/5.400 na Irlanda até l/l6.600 na Suiça (Thalharomer et al.. 1975, Humangenetik 30. 273-286). A frequência colectiva em 8 países da Europa ocidental e nos Estados Unidos é de cerca de 1/8,000 e 2% da populaçSo sSo portadores heterózigos de característica PCU. (Bickel et al. 1973, Acta Paedlat. Scand. 62. 4l3-4l6j Sriver, C.R. e Rosen berg, L.E., 1973, em : Amino Acid Metabollsm and Its Disorders. pp. 290-337, Filadélfia: Saunders, 491 pp.).
Métodos Actuais de Obaervaç&o e Tratamento de Recém-Nascidos
Os pacientes fenilcetonúricos segregam gran
des quantidades de fenilpiruvato na urina, as quais podem ser notadas facilmente pela sua reacçSo com cloreto férrico e foram utilizadas na década de 1950 como ensaio de rastreio
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para o diagonóstico de crianças FCU. Depois disso elaborou-se um método simples e de rastreio em grande escala para uraa determinação semiquantitativa de fenilalanina em pequenas amostras de sangue colhido em crianças recém-nascidas, devidc a Guthrie, R, e Susi, A., 1963, Pediatrics 32. 338-343.Os recém-nascidos FCU identificados por meio deste ensaio podem ser tratados com um lisato de proteina com pequeno conteúdo de fenilalanina (Biochel et;, al., 1954, Acta Paediat. Scand. 43. 64-77; Armstrong, M.D. e Tyler, F.H., 1955, J. Clin. Invés t. 34. 565-5^0)· Este tratamento provoca um nível menor de fenilalanina plasma, desaparecimento de fenilpiruvato na urina, e esta associado com melhor desenvolvimento mental e resultados de comportamento (koch et al..1971. em» Phenylketonuria and Some Other Inborn Errors of Metaboliem (Bickel,H, Hudson, F.P, e Voolf, L.I., eds.) pp, 20-25; Wamberg, 1977, em{ Medico-Social Management of Inherlted Metabolic Disease
(Raine, D.N., ed,), pp. 63-76, MTP Press Ltd., Lancaster,In glaterra; Smith, I. e Wolff, O.H., 1974, Lancet 2. 540-544).
0 diagonóetico precoce de FCU clássica e o seu tratamento não proporcionam, no entanto, coeficientes d« QI e capacidade de aprendizagem uniformemente normais, 0 iní cio de terapêutica dietética pouco depois do nascimento tem enormes implicações psicológicas e sociais para a família do doente (Mikkelson et al.. 1974, Naringsforskning 18. 78-86).
A correcção dietética tem de ser aplicada durante um período de tempo muito grande para ser eficaz, e o termo do tratamento a meio da primeira década parece ser seguido por um declíneo pequeno mas significativo dos coeficientes de QI (Scrivei et. âà· ♦ 1980a, N. Eng. J, Med. 303. 1336; Scriver et al.. 1980b, N, Eng. J. Med, 3Q3. 1934). Verificou-se que a vigilâs cia deste tratamento é muito difícil e só pode eer efectuada nas melhores condições em centros onde exista experiência de regimes deste género.
Neste momento, não exiete metodologia de dia gnóstico pré-natal para identificação de homozigotoe regressivos, e o único ensaio disponível para identificação de he- 3 >
te
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terozigotos é o ensaio de "tolerância de fenilalanina" que não é principalmente quantitativo (Voolf et al.. 1967, Naturt 213. 882-885? Rampini, S,, 1973, Schveiz Med. Vlschr. 103. 537-546? Guttler, F. e Vamberg, E., 1977, Acta Paediat.
Scand. 66. 339-344? Guttler, F. e Hansen, G., 1977*, Ann,
Clln. Biochem. 14. 124-134? Guttler, F. e Hansen, G., 1977b, Clin. Gen, 11. 137-146). Nestas condiçSes, a elaboração de metodologias para o diagonóstico pré-natal e a detecção de heterozigoto no adulto é de uma necessidade premente para a prevenção, mais do que para o tratamento deste desarranjo he reditário.
0 Sistema de Hidroxilasação Fenilalanina
0 sistema de hidroxilasação fenilalanina doa mamíferos é complexo: abrange várias outras enzimas e cofactores, além da hidroxilase fenilalanina propriamente dita (Fig. l). Em presença de oxigénio molecular e do cofactor a ctivo tetrahidrobiopterina, a enzima oxida a fenilalanina pa ra tirosina, e, ao mesmo tempo, transforma o oofactor numa forma dihidrobiopterina quinonóide (Kaufman, S,, 1964, J. Biol. Chem. 248. 540). A dihidrobiopterina quinonóide é subsjs quentemente reduzida para a forma tetrahidrobiopterina por redutase dihidropterldina em presença de NADPH (Kaufman, S,, 1976, em: Advances in Neurochemistry. Vol. 2, pp. 1-132, Agranoff, Β. V. e Aprison, M.H., eds., Plenum Press, Nova York e Londres). Assim, o cofactor pterina funciona cataliticamente durante a hidroxilação de fenilalanina. No início é necessário haver redutase dihidrofolato para transformar a 7,8-dihldrobiopterina natural na sua forma tetrahidro activa Kaufman, S., 1962, em: Oxygeneses (o. Hayashi, ed.) p. 129, Nova York Academic Press). No entanto, esta enzima deixa de
ser necessária depois de feita a redução inicial, porque o cofactor pterina só se recicla entre as formas tetrahidro- e quinonóide dihidro- (Kaufman, S., 1963 Proc. Natl. Acad. Sei USA 50« IO85)· A cadeia de reacçães produz-se toda no fígado que é o único tecido que sustenta actividade de hidroxilasa55.384
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ν
Β'.Ιχ J ç.· κ
ção de fenilalanina significativa no homem,
Fenotipoe Heterogéneos de Deficiência de Hidroxilase
Fenilalanina
Visto que a hidroxilação de fenilalanina é um sistema tão complexo, pode pensar-se que a hiperfenilalaninemia também pode resultar de deficiência nas outras actividades ou cofactores enzimáticos. De facto, têm sido recentemente descritas formas variantes de fenilcetonúria nas quais se demonstrou uma deficiência na redutase dihidropterj. dina enzima (Bartholome, K., 1974, Lancet 2:580} Smlth et al, 1975, Arch. Dis. Child. £0, 864-870j Kaufman et al., 1975b, Pedlat. Res. 2, 632-634). 0 fenotipo FCU também se pode manifestar como resultado de deficiência de redutase dihidrofo lato (Niederwieser, A., 1979, em: Folie Acid in Neurology, Psychiatry and Internai Medicine (Botez, M.I., Reynolds, E. H., eds.) pp, 349-384, Nova York, Ravinj Danks et al.. 1979, Pediatr. Res. 13. 1150-1155) e homeostase da coenzima tetrahidrobiopterina (Danks. D. M., 1978, J. Inherited Met. Dis.
3L, 47-48). No entanto, estes tipos de "fenilcetonuria atípi, ca" constituem uma proporção relativamente pequena de doentes fenilcetonúricos. Uma grande maioria deles continua a ter deficiência de actividade enzimática hidroxilase fenilalanina nas biopsias do fígado, e não há hidroxilação de fenilalanina mesmo em presença de cofactor tetrahidropterina a dicionado (Grimm et al.. 1975, Clin. Chim. Acta 58. 17-2l).
No entanto, a deficiência hidroxilase fenil alanina é um estado heterogéneo, visto que pacientes nesta situação podem variar entre grave (FCU clássica) e moderado (hiperfenilalanemia). A hidroxilase fenilalanina foi purificada a partir de fígados de rato, macaco e humano (Kaufman,
S. e Fisher, D.B,, 1970, J. Biol. Chem. 245. 4745-4750} Gil lam2lâÍ·» 1974, Biochem. J. 139. 731-739? Choo, K.H. e Cotton, R.G.H., 1979, Biochem. J. ΐχ, 921-946} Voo et al.. 1974, Biochem. J. 1^2, 741-749; Choo et al., 1979a, Biochem,
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• 181. 285-294; Choo et al.. 1979b, J. Inherited.Metab.Pis.
, 79-84). É uma enzima multímera com um peso molecular sub unitário de cerca de 50.000 deltons. Observações recentes mostraram que as subunidades ou são iguais ou uma é produto proteolítico da outra (Choo et al., 1979a, Biochem. J. 181,
285-294; Choo et al.. 1979b, J. Inherited Metab. Dis. 2, 79 -84). Hidroxilase fenilalanina proveniente de doentes com fenilcetonúria clássica mostraram ser uma forma estruturalmei, te alterada da enzima com menos de 1 % da actividade normal (Friedman et al.. 1973, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 70. 552-556), o que indica que a fenilcetonúria pode ser o resultado directo de uma mutação no próprio gene hidroxilase fenila lanina. Além disso, a análise de hidroxilase fenilanina em biopsias de fígado de doentes com "hiperfenilalaninemia" mos, trou que continham cerca de 5 # do nível de actividade normal, com uma variação de 1 a 35 (Kaufman et al.. 1975a,New Engl. J. Med. 293. 7β5-79θϊ Kaufman, et al., 1975b, Pediat.
Res. 2, 632-634; Bartholome et al., 1975, Pediat. Res. 2»
899-903). Demonstrou-se ulteriormente que as fracas activldades enzimáticas em casos de hiperfenilalaninemia não eram devidas à presença de 5$ da enzima normal, mas sim à presença de uma hidroxilase alterada com propriedades cinéticas distintas tanto da enzima normal como da enzima proveniente de doentes com FCU clássica (Kaufman, S., 1976, em: Advances in Neurochemistry. Vol. 2, pp, 1-132, Agranoff, B.V. e Aprison, M.H., eds., Plenum Press, Nova York e Londres; Kaufman,
S. e Miistein, S., 1977, Ann. Clin. Lab. Sei. 2, 178-I85).
Em conjunto, estes estudos indicam de maneira clara a presen ça de fenotipos múltiplos de deficiência hidroxilase fenilalanina, a qual poderia ser causada por mutações em várias lo, calizações no gene hidroxilase fenilalanina.
0 presente invento refere-se a. um processo para a síntese de clones cADN hidroxilase fenilalanina, e pa ra a sua utilização no diagnóstico pré-natal do desarranjo genético humano denominado fenilcetonúria (FCU), desarranjo hereditário do metabolismo fenilalanina que provoca atraso
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mental permanente em humanos, e a identificação de portadores da característica heterozigótica.
0 mARN para hidroxilase fenilalanina é purificado a partir de mARNS de fígado de rato completo e o mARN purificado é utilizado para síntese e clonação do seu cABN. Os clones cADN hidroxilase fenilalanina de rato clona do sSo utilizados para identificar os clones cADN correspondentes numa livraria cADN de fígado humano por meio de hibrj, dização cruzada. Os clones cADN hidroxilase fenilalanina hu manos sSo utilizados como sonda de hibridização para analisai fenilcetonúria clássica.
Utiliza-se com vantagem tecnologia ADN recombinante aceite e normalizada, e os componentes, por exemplo os plasmídeos, encontram-se com facilidade no mercado«Os pormenores do presente invento são expostos a seguir.
A Figura 1 é uma representação esquemática do sistema de hidroxilação fenilalanina no rato e no homem.
A Figura 2 é um gel poliacrilamida corado de azul Coomassie que contém várias fracçães de hidroxilase fenilalanina de princípio a fim do processo de purificação.
A Figura 3 é tuna análise Ouchterlony de anti-soro hidroxilase fenilalanina anti-rato de cabra.
A Figura 4 é uma representação esquemática do processo de imunoprecipitação seguido para purificação de mARN hidroxilase fenilalanina proveniente de fígado de rato.
A Figura 5 á uma representação esquemática do processo de tradução desprovida de célula utilizado para detectar a actividade de mARN hidroxilase fenilalanina de fígado de rato.
A Figura 6 apresenta fluorogramas de geles de poliacrilamida que contêm produtos de tradução desprovida de célula dirigida por mARN polissómico de fígado de rato to, tal;’ e mARN hidroxilase fenilalanina de fígado de rato puri- 7 55.3β^
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ficado. Imagem A, produto de traduçSo total; Imagem B, produto de tradução imunoprecipitado utilizando anti-soro hidro.
xilase fenilalanina de fígado anti-rato de cabra.
A Figura 7 apresenta radioautogramas de geles de agarose que contêm ADNs isolados a partir de vários
clones cADN de fígado de rato depois de hibridizaçSo com no
cADN marcado J p sintetizado a partir de mARN (imagem A) hi droxilase fenilalanina polissoraa-enriquecido e mARN (imagem B) polissoma-desprovido.
A Figura 8 e uma representação esquemática de processo de traduçSo com híbrido escolhido para confirmação da identidade de clones cADN hidroxilase fenilalanina de rato.
A Figura 9 apresenta fluorogramas de geles poliacrilamida que contêm produtos de traduçSo desprovida de célula dirigida por mARN escolhido por vários plasmídeos ADN. Imagem A, produtos de traduçSo desprovida de célula totais; Imagem B, produtos de traduçSo desprovida de célula imunopre cipitados com utilizaçSo de anti-soro hidroxilase fenilalani na anti-rato de cabra.
A Figura 10 é um radioautograma de um gel a
garose que contém várias preparaçSes mARN depois de hibridi32
zaçSo com ADN prPH98 marcado P,
A Figura 11 é uma representação esquemática de mapas de restrição simplificados de dois clones cADN hidroxilase fenilalanina de rato com os maiores fragmentos ADN inseridos sobrepostos.
A Figura 12 é um radioautograma de um anel agarose que contém ADN isolado a partir de dois clones de ra to e seis clones humanos cADN hidroxilase fenilalanina depois
de hibridizaçSo com ADN hidroxilase fenilalanina de rato mar
32 “
cada P isolada a partir de ADN prPH98.
, A Figura 13 e uma representação esquemática
de 'doiβ clones cADN hidroxilase fenilalanina humanos com oa
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maiores fragmentos ADN inseridos sobrepostos
A Figura 14 apresenta radioautogramas de ge
les agarose que contem ADN genómico isolado a partir de indi.
víduos de raça branca normais depois de assimilação com vári
as enzimas de restrição «à hibridização cora ADNs phPH72 e phPH 32
73 marcados P. Imagem Λ, Mwpl; e Imagem B, Sphlj e Imagea C, HindIII.
A Figura 15 apresenta radioautogramas de ge
les agarose que contêm ADNs genómicos isolados a partir de
membros de três famílias FCU depois ds hibridização com ADNs 32
phPH72 e phPH73 marcados P. As enzimas de restrição utilizadas nas Imagens A, B e C são MspI, Sphl e HindIII, respe ctivamente. λ direita dos radio-autogramas correspondentes encontra-se a representação esquemática de segregação Mandeliana dos genes FCU nestas famílias.
A Figura 16 apresenta radio-autogramas de geles agarose que contêm ADNs genómicos isolados a partir de membros de mais duas famílias FCU depois de digestão com Hino III e hibridização com ADNs phPH72 e phPH73 marcados ^^P.A segregação Mandeliana dos genes FCU çestas famílias está representada esquematicamente com os radio«autogramas correspondentes.
A Figura 17 é um radio-autograma de um gel agarose que contem ADNs genómicos isolados a partir de membros de uma sexta família FCU depois de assimilação quer com HindIII quer com Sphl e hibridização com ADNs phPH72 e phPH 73 marcados P. (imagem A), A segregação Mandeliana dos ge nes FCU nesta família está representada esquematicamente na imagem B.
Base Molecular e Biológica de Fenilcetonúria Clássica
Uma forma de realização do presente invento consiste em se obterem os organismos seguintes na colecção permanente da American Type Culture Collection (Colecção Ame ricana de Culturas Tipo), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryiand 20852, E.U.A..
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| ATCC | 39329 | E. Coli | RR1 | (prpH9l) |
| ATCC | 39330 | E. Coli | RR1 | (prPH98) |
| ATCC | 39331 | E. Coli | RR1 | (phPH72) |
| ATCC | 39332 | E. Coli | RR1 | (phPH73) |
Os depósitos estão & disposição r,o público depois de ter sido coneedida uma patente ao Titular, o Instituto Médico Howard Hughes, que os descreve. No entanto, deve entender-se que o facto de um depósito estar disponível não constitui uma licença para aplicar o presente invento em derrogação de direitos de patente concedida por acto govemamen tal.
Com aplicação de tecnologia ADN, os genes que codificam as proteínas normais e variantes são clonados, e determinam-se as suas sequências nucleótldas. A comparação das sequências amino ácidas das proteínas completas deduzidas das sequências de gene revela quaisquer substituiçães amino a cidas e estabelece por este meio a base molecular da deficiêg cia ao nível gene. Dentro do fenotipo fenilcetonúrico, podem existir vários alelos genotípicos devidos a polimorfismo genól mico no homem. Estes alelos genotípicos podem ser o resultado de mutaçSes absurdas, substituiçães amino ácido conservadoras! mutaçSes silenciosas clássicas, polimorfismo de divergência de sequência intermediária ou de sequência de flanqueamento, que não se podem manifestar ao nível proteína. Houve presençw e ausência de materiais imuno-reagentes ou biopsias de fígado de doentes com FCU clássica (Choo, et al.. 19792, Biochem. J]
181. 285-294·, Choo, et al.. 1979b, J. Inherited Metab, Dis.
2.» 79-84? Bartholome, K, e Ertel, 1976, Lancet £»862-863?
Bartholorae, K, e Ertel, 1978, Lancet 1:454).
Detecção de Heterozigótico Adulto e |
Diagnóstico Pré-natal de FCU Clássica
Uma vez estabelecida a base bioquímica das lesSes genéticas para FCU clássica, faz-se a identificação de nuoleótidos polimórficos entre os genes normais e as varian10 55.384
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ΡΟ’ΠυΟΛι
tes que provocam o aparecimento e desaparecimento de algune locais de cisSo endonuclease de restriçSo, que podem estar si tuadas ou nSo nos locais das lesões genéticas. Este conjunto de informaç8es é depois catalogado para que as diferenças de tipos de cisSo endonuclease de restriçSo de fragmentos ADN genómicos que contêm sequências gene hidroxilase fenilalanina possam ser utilizadas juntamente com amniocentese como meio de diagnóstico para identificar pré-natalmente os homozigóticos regressivos que estSo predispostos para desenvolvi mento de atraso mental grave.
Facto muitíssimo importante, pode utilizar-se o mesmo método analítico para identificar oe portadores heterozigóticos adultos. Observou-se recentemente que a hete rozigosidade também pode impor um risco ao estado de saúde do paciente (Ford, R.C. e Berman, J.L. , 1977? Lancet 1. 767-770} Thalhammer et al.. 1975, Humangenetik 30. 273-286}
Bessman et al.. 197θ, Proc. Natl. Acad. Sçi. U.S.A. 75. 1562
-I566). Será necessária identificaçSo precose destes indivíduos para a prevençSo deste desarranjo genético.
A fim de isolar o gene hidroxilase fenilala nina cromossomático humano, é preciso dispor-se em primeiro lugar de uma sonda de hibridizaçSo apropriada. Embora a melhor sonda seja um clone cADN de mARN hidroxilase fenilalanina humana, esta nSo é fácil de obter, porque o abastecimento de tecido humano novo necessário para isolar mARNs intactos nSo é seguro. Escolhemos utilizar fígado de rato (embora se possa utilizar tecido de fígado de outro animal) para isolamento de mARN e para a construçSo dos clones cADN correspondentes, que são utilizados depois para identificar clones que contêm o cADN humano correspondente e o gene cromossómico pro veniente de cADN de fígado humano β livrarias ADN genómicas por hibridizaçSo cruzada.
Enriquecimento de Mensageiro ARN Hidroxilase Fenilalanina por ImunoprecipitaçSo Polissomética
, A maior parte dos mensageiros ARNs eucarió- 11 55.384
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ticos não estão presentes em concentrações grandes na célula para clonação directa, e o melhor processo disponível para en riquecer estes mARNs é por meio de imunoprecipitação específi ca dos polissomas envolvidos na síntese das proteínas correspondentes (Palacois et al.. 1973, J. Biol. Chem. 248. 5*»θ) ·
Purificou-se assim hidroxilase fenilalanina para a criaçSo de anticorpos mono-específicos.
PurificaçSo de Hidroxilase Fenilalanina Proveniente de Fígado de Rato
Faz-se a purificação de hidroxilase fenilalanina proveniente de fígado de rato por meio de uma modifica ção do processo de Shiman et al.. 1979» J. Biol. Chem, 254. II3O6. A pureza de proteína foi observada por coloração azul Coomassie de placas de geles poliacrilamida a 10 % (Figura 2), Em resumo, as proteínas de homogenato de fígado de rato total foram clarificadas por meio de centrifugação a alta velocidade. Activou-ss hidroxilase fenilalanina por meio de incubação a 25°C durante 30 minutos antes de fraccionamento por meio de cromatografia de coluna fenil-sefarose. 0 eluato foi ulterior mente purificado por uma coluna DEAE-celulose. A preparação enzima resultante continha duas faixas a 50.000 deltons conforme atrás indicado (Fisher, D.B. e Kaufman, S., 1973, J. BI ol. Chem. 248. 4345-4353; Gillam et al., 197*», Biochem. J.
139. 731-739), « apresentou pureza superior a 95 % com uma
purificação global de cerca de 400 vezes (Figura 2, faixa 6),
Criou-se um anti-corpo contra hidroxilase ff nilalanina de fígado de rato numa cabra e analisou-se por meio de dupla imunodifusão sobre uma placa Ouchterlony. A cavidade central continha anti-soro impuro, com quantidades crescentes de homogenato de fígado de rato impuro e hidroxilase fenilalanina purificada nas cavidades periféricas. Obsei vou-se uma faixa de precipitação contínua, a indicar que o anti-corpo cabra para hidroxilase fenilalanina de fígado de rato e monoespecífico (Figura 3). A fracção IgG do anti-soro éra também capaz de inibir actividade hidroxilase fenilalani- 11 a55.384
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na da uma maneira dependente de dose.
Purificação de Anti-corpo Desprovido de Ribonuclease
para Hidroxilase Fenilalanina
Purificou-se anti-corpo hidroxilase fenilalanina de fígado de rato a partir de anti-soro impuro por meio de cromatografia de afinidade. Juntou-se antigénio purificado com sefarose activada com brometo de cianogénio. A par] tir daí, todos os reagentes e processos foram efectuados a 4O°C. Aplicou-se o anti-soro à resina de afinidade e lavou-se completamente com PBS (10 mM fosfato de sódio, pH 7,4,que contem 0,15 M NaCl). Toda a proteína não específica remanesl cente e vestígios de ribonuclease contaminante foram separados ulteriormente por meio da lavagem da coluna com 3 volumes de 0,2 M KCNS em PBS conforme descrito por Gough, N.M, e Adams, J.M, 1978, Biochemistry. 17 5560. 0 anti-corpo específico foi eluído a partir da resina de afinidade por meio da adição de ácido acético 0,5 M, e foi neutralizado imediatamen] te por meio da adição de hidróxido de amónio. 0 anti-corpo puj rificado foi dialisado extensivamente contra PBS antes de usar. 0 anti-corpo foi experimentado quanto a actividade ribonuclease por meio de incubação do anti-corpo com polissomas nas mesmas condições a utilizar para imunoprecipitação. Os perfis dos polissomas antes e depois do tratamento com anticorpo foram depois comparados por meio de centrifugação gradiente de densidade de sacarose.
Isolamento de Polissomas de. Fígado de Rato
Isolaram-se polissomas de Fígado de Rato uti lizando processos de precipitação de magnésio descritos por Palmiter (1974, Biochemistry. 13. 3606) e modificados por Lee ®t al., 1978, Biol. Che.. 253 3494) conforme adiante descrito, 0 fígado congelado foi puLverizado e preparou-se um ho mogenato de fígado a 10 % num tampão frio que continha triton
X-rlOO a 2% e 1 mg/ml de heparina, utilizando um homogeneíza• ·'?
dor de teflão. 0 homogenato foi imediatamente centrifugado a
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10.000 rpm durante 30 segundos e precipitou-se o produto flutuante, que continha polissomas ligados e livres, por meio do ajustamento da concentração de magnésio para 100 M. Deixou -se que os polissomas se agregassem durante 1 hora sobre ge lo e separaram-se os polissomas precipitados da matéria celular restante por meio de centrifugação através de blocos sacarose 0,5 M em presença de tritão X-100 a 5 % e 0,5 mg/ml de heparina. Dissolveram-se os polissomas resultantes em mM Hepes, pH 7,5, que continham 5 roM MgClg, 0,15 M NaCl e triton X-100 a 0,5 % com a utilização de um homogeneizador de teflão de vidro. 0 material em partículas foi separado por centrifugação e o produto flutuante clarificado que contém os polissomas tem geralmente um coeficiente A260/A280 de 1,5 a 1,8, 0 rendimento foi em geral 5θ unidades A260 de P°ííseonia Por é>ra ma de fígado. Verificaram-se os perfis de sedimentação de po lissoma quanto a quaisquer indícios de degradação ARN por meio de centrifugação gradiente de densidade de sacarose, e a maior parte dos polissomas preparados desta maneira continham mais de 10 unidades ribossoma.
Imunoprecipitação de Polissomas Sintetizadores de Hidroxilase Fenilalanina
Aplicou-se o processo descrito por Gough e Adams (1978, Biochemistry. 17. 5560) e representado na Figura 4. Incubaram-se os polissomas de fígado de rato (2500 unidades A260^ com de aHticorpo desprovido de ribonuclease a
4 C em presença de 100jug /ml de heparina. Os complexos anti-corpo-polissoma resultantes foram incubados com células aureus em presença de 2 mM EGTA, que é um forte inibidor de nucleaees dependentes de cálcio. As células tinham sido lavadas a fundo com três tampães de lavagem diferentes que continham desoxicolato a 0,5 % e 2 mM EGTA antes de usar. Os complexos bactéria-IgG-polissoma foram sedimentados através de gradientes de sacarose descontínuos. As pílulas voltaram a ser suspensas num tampão que continha 5 mM MgCl^ e 2 mM EGTA, efpraw sedimentadas através de sacarose uma segunda vez para
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separar polissomas nSo específicos residuais. Libertou-se depois ARN dos polissomas ligados com um tampão que continha SDS/EDTA e separaram-se as bactérias a partir de centrifugação. 0 produto flutuante resultante foi desproteinizado por meio de extracção cora fenol/clorofórmio, e o ARN foi precipitado com etanol a -20°C, Isolou-se ARN que continha poli(A) por meio de cromatografia de coluna oligo (dT)-celulose. Inclui-se uma lavagem com 0,2 M KC1 intermédia antes da eluição do ARN que continha poli(A) com água.
Avaliação da pureza de mARN hidroxilase Fenilalanina Enriquecida com Polissoma
Experimentaram-se fracçSes ARN que continham
poli (A) eluídas a partir de coluna oligo (dT) celulose, utilizando o sistema de tradução livre de células reticulócitas de coelho dependentes de mARN (Pelham e ãackson, 1976), utili
ram-se aliquotas das misturas de tradução e submeteram-se a electroforese de gel poliacrilamida de acordo com o processo de Laemnli (1970} Náture, 227. 680). Preparam-ββ geles para fluorografia utilizando acentuador NEN e secaram-se sobre papel Whatman 3MM antes de exposição a películas de rais X Kodak. 0 restante da mistura de tradução livre de célula foi imunoprecipitado e os produtos foram também submetidos a electroforese e fluorografia (Figura 5).
A hidroxilase fenilalanina constitui cerca de 0,25 % das proteínas de fígado totais e espera-se que o seu mARN esteja presente em níveis correspondentemente baixos, Quando se analisaram produtos de tradução desprovidos de célv la dirigidos por ARN polissómico de fígado de rato total, poi meio de electroforese de gel SDS e fluorografia, observaram-se faixas de proteína múltiplas sendo a mais proeminente a albumina 69.000 daltons (Figura 6A, Faixa l). Apenas uma poi ção insignificante dos produtos de proteína foram imunoprecipitados com hidroxilase anti-fenilalanina conforme esperado (.Figura 6B, faixa l). Por outro lado, observa-se que um produto de proteina importante sintetizado em resposta à prepari.
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çSo ARN enriquecida com poliaaoraa tem um peso molecular de cerca de 50,000 (Figura 6A, faixas 3-6). Este produto de proteína foi precipitado quantitativamente com hidroxilase anti-fenllalanina (Figura 6B, faixas 3-6). A preparação mARN hidroxilase fenilalanlna enriquecida com polissoma mostra ter mais de 20 'j) de pureza, e, numa só fase, obteve-se num mínimo de enriquecimento de 80 vezes a partir ds mARN de fígado de rato.
Construção de Clones cADN Recombinantes a Partir de
mARN Hidroxilase Fcnllalanina Enriquecida com Polissoma
Síntese Enzimática de ADN Complementar
Incubaram-se 5 Aig de mARN hidroxilase fenil; alanina muito purificada num volume final de 200 >ul a 46° du rante 30 minutos com 80 unidades de transcriptase inversa AMV em presença de 5θ mM Tris-HCl, pH 8,3 5θ mM KCl, 10 mM MgClg, 40 mM 2-mercaptoetanol, 12,5 yug/ml de oligo (dT), 40 ;ag/
/ml de Actinomicina D, e 1 mM cada dos quatro trifosfatos desoxirribonucleósidos. Utilizaram-se 100 uCi de ^“^h7 dCTP co mo pesquisador radioactivo. A reacção foi suspensa pela adição de EDTA a 20 mM, e a mistura foi desproteinizada por meio de extracção com fenol, Cromatografou-se a fase aquosa através de uma coluna Sephadex G-25 pequena. 0 ácido nucleico eluído no volume vazio foi ajustado para conter 0,1 N NaOH e 10 mM EDTA, 0 ARN foi hidrolisado por meio de incubação da mistura a 68° durante 30 minutos. Depois de neutralização da’ mistura com HCl, precipitou-se ADN sintético a partir de etanol. A partir de dCMP radioactivo incorporado, calculou-se que se tinha sintetizado cerca de /ig de cADN, 0 cADN de cordão único foi depois purificado por centrifugação num gradiente sacarose linear a 8-18 °jo em presença de 0,1 M NaOH. Desenvolveu-se o gradiente por meio de centrifugação a 38.000 rpm durante 24 horas num rotor SW40 a 4°C. Juntaram-ss as fracções com ADN maior que 1300 nuclsótidos, neutralizaram• -«e, com 2M NaOAc, pH 5,0 e precipitaram-se com etanol.
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Síntese Enzimática de ADN de Cordão Duplo
0 cADN de cordão único contém um laço terminal em forma de gancho de cabelo na ponta que pode servir como padrão e também como iniciador para síntese de ADN de cordão duplo. A preparação /“nj cADN de cordão único foi assim transformada em cordão duplo por meio de incubação a 46° durante 90 minutos num volume final de 100 ul com 400 unidades/ml de transcriptase inverda em 50 mM Tris-HCl, pH 8,3 ,
10 mM MgClg, 40 mM 2-mercaptoetanol e 1 mM de cada um dos qua tro trifosfatos desoxirribonucleósidos. Desta vez utilizaram-se 25 >uCi de /”JP7 dCTP como pesquisador. Voltou-se a deter a reacção por melo de adição de ADTA e desprotenizou-se por meio de extraeção com fenol. Cromatografou-se a mistura a través de uma coluna Sephadex G-25 pequena e reuniu-se o áci do nucleico eluído no volume vazio. Obteve-se um total de 0,4 /ig de ADN de cordão duplo por este processo.
Tratamento Nuclease Sl de ADN de Cordão Duplo
0 ADN de cordão duplo sintetizado da maneira atrás descrita contém um laço terminal que pode ser aberto por meio de tratamento com nuclease Sl que absorve especifica mente ADN de cordão único* Incubou-se ADN de cordão duplo (2 /ig/rnl) à temperatura ambiente durante 1 hora com 4500 uni dades/ml de nuclease Sl em 0,03 M NaOAc, pH 4,5, 0,3 M NaCl e
4,5 mM ZnSO^. A reacção foi suspensa com EDTA e inactivou-se nuclease Sl por meio de extraeção com fenol. Cromatografou-se a fase aquosa através de uma coluna Sephadex G-25 pequena, e eluiram-se 0,25 ug de ADN de cordão duplo no volume vazio.
Aplicação de cauda em ADN de cordão duplo com dCTP utilizando transferase terminal
Incubou—se o ADN de cordão duplo tratado com Sl com 200 unidades de transferase terminal desoxinucleotidilo de timo de vitela num volume final de 100 ul a 37° durante 5 minutos em presença de 5 uM ^“jH7 dCTP, 0,2 M cacodilatq ••de pojtassio, pH 7,2, lmM CoCl^ e 1 mM de mer capto etanol.
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Juntaram-ββ cerca de 15 dCMPs por ponta ADN, A reacção foi também suspensa com EDTA e inactivou-se a enzima por meio de aquecimento a 68° durante 10 minutos. Cromatografou-se a mistura através de uma coluna Sephadex G-25 pequena.
Recozimento com pBR22 de ponta dG e Transformação de Bactérias
0 vector plasmídeo pBR322 foi linearizado por meio de digestão com Pst I e juntaram-se l4 dGMPs por poi ta ADN utilizando transferase terminal. Misturaram-se quantidades equimolares de ADN sintético com ponta dC β pBR322 com ponta dG em tampão de recozimento (10 M Tris-HCl, pH 7,8, 0,1 M NaCl). A concentração de ADN plasmídeo final foi de 2 /ug/mi. Aqueceu-se a mistura a 68° durante 30 minutos, segui] do-se incubação a 43° durante 3 horas. Deixou-se depois a mij tura arrefecer lentamente até à temperatura ambiente (cerca de 3 horas) e deixou-se ficar à temperatura ambiente até ao dia seguinte.. Em seguida utilizou-se a mistura para a transformação de E. coli RRI de acordo com processos publicados anteriormente.
Identificação de colónias bacterianas portadoras de plasmideos recombinantes
Seleccionaram-se cuidadosamente transformanJ tes bacterianos individuais sobre placa ágar acabada de prepa rar numa disposição quadriculada e deixaram-se crescer ate di mensães suficientes. As colónias foram depois subidas para ci ma de um filtro de nitrocelulose que se deixou correr durante 30 minutos sobre um papel Whatman 3 NM embebido com 0,5 N NaOH, 1,5 NaCl. Durante este período, as bactérias foram lisadas, desnaturaram-se os seus ADNs e ligaram-se eetee à nitrocelulose. Os filtros foram depois neutralizados, cozidoe e deixados hibridizar com £ P7 cADN sintetizado contra 0,5
de preparação mARN hidroxilase fenilalanina purificada. Depois de lavagem a fundo, as colónias bacterianas que conti- 17
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nham ADNs plasmídeos recombinantes foram identificadas por meio de radioautografia.
Identificação de clones cADN hidroxilase fenilalanina
Dado que não existe publicada uma sequência amino ácido para hidroxilase fenilalanina de fígado de rato, a identidade dos clones dADN hidroxilase fenilalanina não pode ser estabelecida por sequênciaçâo ADN. A fidelidade destes clones foi proporcionada por três vias de prova independentes a. hibrldização diferencial; b. tradução de híbrido escolhido e c. análise de mancha Northern.
Selecção de Clones cADN hidroxilase Fenilalanina Candidatos por meio de Hibrldização Diferencial
Prepararam-se ADNs plasmídeos recombinantes pelo processo mini-lisato de Birnboim e Doly (1979, Nucleic Ácid Research. Vol. 1, pp. 1513-1523), assimilaram-se com Bam HI e resolveram-se por meio de electroforese de gel agarose. Transferiu-se o ADN bi-direccionalmente para dois filtros de nitrocelulose de acordo com o processo de Smith e Sum mers (1980, Analytical Biochemistry. Vol. 109, pp. 123-129). Os filtros idênticos foram hibridizados separadamente para duas sondas cADN: as Figuras 7a β 7B representam os
radioautogramas dos filtros depois de hibrldização com /“^2p7 cADNs sintetizados a partir de preparações de mARN enriquecido com polissoma e mARN esgotado, respectivamente. Observaram -se indícios fie hibrldização diferencial com diversos colones faixas 4, 7, 8 e 10), e eles representam canditados para con ter sequências ADN hidroxilase fenilalanina. 0 número de coió nias positivo para esta experiência de hibrldização diferenci al representa cerca de 20 % do número total de recombinantes. Bste número está em boa correlação com a pureza calculada da mARN hidroxilase fenilalanina utilizada para clonação*
Confirmação de Clones Hidroxilase Fenilalanina ·'·. ·’ por meio de Tradução de Híbrido Escolhido_
Os clones recombinantes candidatos foram ullB 2)2). jo<+ SJV/llOO
«s
teriormente analisados por meio de tradução de híbrido escolhido (Figura 8). Plasmídeo ADN isolado a partir destas colónias foi desnaturado e ligado a aminobenziloximetilcelulose, Deixou-se o ADN imobilizado hibridizar com ARN que continha poli(A) de fígado de rato total. 0 ARN eluido a partir daa re sinas foi traduzido in vitro e analisaram-se os produtos de proteina totais por meio de electroforese sobre geles SDS-poliacrilamida, seguida por fluorografia. Nesta experiência, a faixa de 5θ.θθθ daltons endógena ao sistema lisato recticilócito foi retirada fazendo ferver o gel em ácido tricloroacóti co a 10 A Figura 9A, faixa 1, representa produtos sintetizados em resposta a mARN escolhido pelo vector pBR322 ADN de clonaç&o como controlo negativo, 0 perfil é análogo ao do ARN que contém poli(A) de fígado de rato total e muito pouco ou nenhum produto é imunoprecipitável com o anticorpo específico contra hidroxilase fenilalanina (Figura 9B, faixa l). Como controlos positivos para selecçSo de híbrido, incluiram-se na experiência dois clones cADN de rato independentes que codifi cam para duas proteínas de fígado com peso molecular menor, e obtiveram-se duas faixas intensas (Figura 9a, Faixa 2), sem hidroxilase fenilalanina imunoprecipitável conforme esperado
(Figura 9B, faixa 2). Os produtos proteínas sintetizados em resposta a mARNs escolhidos pelos clones candidatos continham no entanto, uma faixa principal em 5θ·θθθ daltons, o que suge ria a presença de hidroxilase fenilalanina (Figura 9A, faixas
3-6). 0 facto de estas faixas de proteína terem sido precipitadas quantitativamente com hidroxilase anti-fenilalanina (Fl gura 9B, faixas 3-6), confirmou que estes clones contêm sequências ADN hidroxilase fenilalanina.
Análise ARN por HibridizaçSo Northern
Extraiu-se ARN que continha poli(A) total de diversos tecidos de ratos e primatas e analisaram-se os seus conteúdos mARN hidroxilase fenilalanina utilizando um clone (prPH98) cADN hidroxilase fenilalanina de fígado de rato como sonda de hibridizaçSo (Figura 10). Obteve-se um sinal de hi- 19 55.
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bridização de cerca de 21S para ARN com conteúdo de poli(A) de fígado de rato (faixa 2), 0 facto de 0,5 ug de preparação mARN hidroxilase fenilalanina enriquecida com polissome ter gerado um sinal muito mais intenso (faixa l) que 5 ug de ARN com conteúdo de poli(A) de fígado de rato total, confirmou a fidelidade do clone cADN. Não ee obteve sinal de hibridização com ARN de coração de rato (faixa 3), indicação da especialidade de tecido da sonda cADN. Sabe-se que o rim de rato conetem actividade hidroxilase fenilalanina e observou-se também uma faixa mARN correspondente (faixa 5). Facto mais importar te, o clone cADN de rato pôde fazer hibridizaçSo cruzada com mARNs hidroxilase fenilalanina de babuino e humano (faixas 6 e 7), o que sugere que os genes humanos correspondentes podem ser clonados utilizando o clone cADN hidroxilase fenilalanine como sonda.
CaracterizaçSo Preliminar de Clones cADN hidroxilase
Fenilalanina de Rato
Analisaram-se clones cADN hidroxilase fenilalanina de rato identificados independentemente por meio de cartografia de restriçSo, Na Figura 11 estSo representados me. pas de restrição parciais dos dois clones cADN hidroxilase fe nilalanina de rato sobrepostos mais extensos, prPHÇl e prPHÇé,
Clonação do cADN Hidroxilase Fenilalanina Humano
Extraiu-se ARN celular total utilizando fenol-SDS proveniente de um espécime de fígado humano patológi co. Preparou-se ARN com conteúdo de poli(A) por meio de cromatografia de coluna oligo (dT)-celulose. Utilizou-se a preparação ARN para a síntese de cADN em condições que facilita rara a produção de cADN com toda a extensão (Monahan et al., 1976, Biochemistry 15. 223-233). A preparação cADN foi sedimentada através de gradiente sacarose alcalino (Monahan et al.. 1976, Biochemistry 15. 223-233), e só se reuniram fraç
ções que continham espécies cADN com 1.000 nucleótidos ou mais. 0 cADN de cordão único passou depois a ser de cordão υ
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duplo com transcrlptase inverea (Monahaç et al., 1976, J. Biol. Chem. 251. 7355-7362). Depois de tratamento nuclease Sl, adicionaram-se porções de polidC sobre os terminais 3’ das mo léculas ADN utilizando transferase terminal (Chandra et al.. I98I, Biochem. Biophys. Res. Commun. 103. 751-75®)· 0 cADN
sintetizado enzimaticamente foi recozido com ADN pBR322 linearizado Pst I que tinha sido acrescentado com poli dG e o ADN foi utilizado para transformação de E. coli RRI conforme atrás descrito para os clones cADN de rato (Chandra et al., 1981, Biochem. Biophys. Res. Commun. 103. 751-758). Estas ex perlências executaram-se de acordo com as indicações para estudo de ADN publicadas pelo Instituto Nacional da Saúde. Esco lheram-se transformantes bacterianos quanto a resistência à tetraciclina e obtiveram-se aproximadamente 40.000 recombinan tes individuais com conteúdo de sequências de cADN de fígado humano. A análise de porções ADN inseridas em 20 colónias escolhidas aleatoriamente por mini-lise (Birnboim, H.C. e Doly,
J., 1979» (Nucleic Acide Res. 2» 1513-1523) e electroforese de gel agarose indicou que mais de 95 % dos transformantes eram de facto recombinantes, e o comprimento médio de ADN humano nestes recombinantes eram de aproximadamente 1,2 kilobase pares.
Utilizando o clone (prPH98) cADN hidroxilase fenilalanina de rato clonado previamente como sonda de hibridlzação específica, analisou-se a livraria cADN de fígado hu| mano constituída por 40.000 transformantes independentes. Isolaram-se ADNs plasmídeos recombinantes a partir das colónias bacterianas que produziram sinais de hibridização fortes. As amostras ADN foram analisadas por hibridização Southern dje pois de assimilação com enzima de restrição Hha I que cindiu o vector plasmídeo ADN em fragmentos pequenos, mas não cortou o ADN inserido em qualquer dos clones. Como controles positl vos da experiência, incluiram-se os dois recombinantes cADN hidroxilase fenilalanina de rato clonados anteriormente, prPK 91 · prPH98, e obtiveram-se sinais de hibridização fortes (Pl Su^a 12, faixas 1 β 2). A especificidade da sonda de hibridi zação foi demonstrada pela falta de hibridização com o vectoi
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ADN pBR322 (Figura 12, faixa 3) e um clone cADN alfa 1-anti-tripsina humano clonado anteriormente (Figura 12, faixa 4). Obtiveram-se sinais de hibridizaçSo específicos a partir dos clones cADN hidroxilase fenilalanina identificados a partir da livraria cADN de fígado humano (Figura 12, faixas 5-1°).
Os comprimentos dos ADN humanos inseridos nestes plasmídeos recombinantes variaram desde 0,3 a 1,4 klj. Análise de sequer cia ADN parcial indicou aquela hamologia de sequência extensiva entre os clones cADN hidroxilase fenilalanina de rato e humanos. Estes clones eram caracterizados por cartografia de restrição, e as estruturas dos dois recombinantes que continham os maiores fragmentos ADN humanos inseridos sobrepostos, phPH72 e phPH73, estão representadas na Figura 13.
EXEMPLO 1
Isolaram-se ADNs genómicos a partir de duas linhas de células FCU obtidas do depositário de célula mutante humana e de dois indivíduos normais. As preparações ADN fo ram assimiladas com diversas enzimas de restrição, seguindo-se hibridização Southern com utilização de dois clones dADN hidroxilase fenilalanina humanos como sondas de hibridização. Obtiveram-se sinais de hibridização iguais a partir de todas as quatro preparações ADN depois de assimilação com enzimas múltiplas, o que indicou que não só o gene hidroxilase fenilalanina ainda estave presente no genómio de células derivadas de pacientes FCU, como também se mantinha inalterada a organização geral. Visto que as sondas cADN tinham um comprimento de apenas 1,4-kb e que o mARN hidroxilase fenilalanina humano é constituído por aproximadamente 2,500 nucleótidos, é ainda possível que tivesse havido uma eliminação ou transposição en zonas do gene hidroxilase fenilalanina que não estão represer tadas nos clones cADN. Por conseguinte, apenas se poderia concluir que a fenilcetonúria clássica, pelo menos nestes dois casos, não é causada por eliminação de todo o gene hidrç xilase fenilalanina completo. Ampliou-se subsequentemente ejs
ta observação para incluir vários indivíduos fenilcetonúricos adicionais nas secções seguintes.
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EXEMPLO 2
Observou-se recentemente que existe um grande número de substituições nucleotídas no genómio de diferentes indivíduos. Estas substituições sSo geralmente sem expres s&o fenotípica, e só podem ser detectadas por enzimas de restrição que cindem ADN nas sequências de reconhecimento respectivae. Estes polimorfismos de local de restrição aleatório provocam uma diferença do comprimento do fragmento ADN, que pode ser detectada facilmente por meio de electroforese de gel agarose seguida por hibridização Southern utilizando sondas de hibridização específicas. 0 polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição tomou-se a partir daí um meio importante para a análise molecular de desarranjos genéticos, humanos, A fim de aplicar esta tecnologia na análise de fenil cetonúria clássica, é imperativo identificar a existência de locais de restrição polimórfica no lugar hidroxilase fenilalanina, ADNs genómicos isolados a partir de 20 indivíduos de raça branca normais aleatórios da zona metropolitana de Houston foram assimilados por uma bateria de enzimas de restrição e os fragmentos ADN resultantes foram analisados por meio de electroforese de gel agarose seguida por hibridização Southern. Embora a maior parte das enzimas de restrição produzissem disposições iguais entre estes indivíduos, identificaram-se 3 enzimas que proporcionaram disposições polimórficas no lugar hidroxilase fenilalanina. A enzima MspI gerou uma faixa de hibridização única em 23-kb nalguns indivíduos e em 19-kh noutros (Figura 14A, faixas 1 e 2), o que indica a exie tência de dois alelos genotípicos. De facto, detectaram-se também heterozigotos que continham ambas as faixas (Figura l4A, faixa 3). As frequências dos alelos associados com as faixas 23-kb e 19-kb sâo 0,444 e 0,55b, respectivamente.
A existência de um segundo sistema alélico no lugar hidroxilase fenilalanina humano foi identificada pe la enzima Sphl. que cindiu os ADNs num fragmento 7,0-kb ou ..9.j'7z-kb em indivíduos diferentes (Figura l4B, faixas 1 e 2).
A presença de ambas as faixas em heterozigotos também foi de«
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tectada (Figura 1B, Faixa 3). 0 fragmento ADN ll,O-kb eetá presente em cada indivíduo e é portanto não alélico. Neste caso, as frequências para os alelos 9,7-kb e 7,°-kb são 0,059 e 0,94l, respectivamente.
A enzima HindIII revelou um sistema 3 alélico. A maior parte dos indivíduos sâo homozigóticos ou heterozigó ticos para as faixas 4,2-kb e 4,0-kb (Figura 1C, 1,
2 e 4), cujas frequências são 0,706 e 0,235, respectivamente. Também se detectou uma faixa 4,4-kb mais rara nalguns indivíduos, com uma frequência de 0,059 (Figura 1C, faixa 3). A existência destes sistemas alélicos permite a análise de fenij cetonúria clássica por meio de polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição.
EXEMPLO 3
Analisaram-se sete famílias dinamarquesas com histórias de fenilcetonúria em uma ou duas crianças, por meio de polimorfismo de comprimento de fragmento de restriçâc, Numa dessas famílias, ambos os progenitores são heterozigóticos para os alelos 23 kb e 19 kb conforme revelado pela enzima MspI (Figura 15A, faixas 1 e 2), Visto que ambos os progenitores sâo heterozigóticos obrigatórios para a característica FCU, cada um tem de conter um gene hidroxilase fenilalanina mutante que pode ser associado com qualquer dos alelos. 0 indivíduo em análise é homozigótico para o alelo 19 kb (Figura 15A, faixa 3), o que indica que os genes mutantes de ambos os progenitores residem nos alelos 19 kb. Um filho não afectado nesta família é homozigótico para o alelo 23 kb (Figura 15A, faixa 4), o que indica que esta pessoa herdou ambos os genes não fenilcetonúricos dos pais e deve ej, tar isento, portanto, de caracteristicas fenilcetonúricas,Está também representado (Figura 15A) ura diagrama que mostra a segregação Mandeliana dos dois alelos nesta família. Estes resultados indicam que o diagonóstico pré-natal de fenilceto nú^ia será possível em futuras gravidezes desta família por meio de análise de ADN isolado a partir de células amnióti24 55.384
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cas de fetos, utilizando a experiência de polimorfismo de eom primento de fragmento de restrição Mspl. Um feto homozigótico para o alelo 19 kb será fenilcetonúrico, um que seja heterozigótico para os dois alelos Mspl será um portador de cara cteríetica e um que seja homozigótico para o alelo 23 kb estará livre da característica FCU.
Os alelos FCU também podem ser identificados por meio de polimorfismo Sphl e HindIII nalgumas famílias. Ambos os progenitores são heterozigóticos para os alelos 9,7 e 7,0 kb numa família destas conforme revelado por Sphl (Figura 15B, faixas 1 e 2). 0 indivíduo examinado nesta família
é homozigótico para o alelo 9,7 kb (Figura 15B, faixa 3), enquanto que um felho não afectado é homozigótico para o alelo 7,0 e é portanto um não portador de características (Figura 15B, faixa 4). Noutra família, os ADN de ambos os progenitores são heterozigóticos para os alelos 4,2 kb e 4,0 kb depois de assimilação pela enzima HindIII (Figura 15c, faixas 1 e 2). 0 indivíduo examinado é homozigótico para o alelo
4,0 kb (Figura 15c, faixa 3). Um filho nSo afectado nesta fa mília e heterozigótico para os dois alelos (Figura 15C, faixa 4) , e é, assim, um portador de característica. Em ambas e_s
tas famílias, parece que a detecção de portador e o diagnóstico pré-natal serão possíveis por simples análise de polimox fismo de comprimento de fragmento de restrição de ADN fetal, utilizando as enzimas respectivas.
EXEMPLO 4
A existência de três sistemas alélicoa reve lada por assimilação HindIII de ADN genómico tornou esta en zima particularmente útil em análise de fenilcetonúria clássica. Numa das famílias dinamarquesas analisadas, o pai era heterozigótico para os alelos 4,4 kb e 4,2 kb (Figura l6A, faixa l) enquanto que a mão era heterozigótica para os aleloí
4,2 kb s 4,0 kb (Figura l6A, faixa 2). 0 indivíduo observado nesta família era heterozigótico para os alelos 4,4 kb e 4,2 kb {Figura 4A, faixa 3). Este indivíduo deve ter herdado o a25 55.384
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leio 4,4 kb do pai e o alelo 4,2 kb da mão que devem ser os alelos mutantes. Um filho não afectado desta família era heterozigótico para os alelos 4,2 kb e 4,0 kb (Figura 1ÓA, faixa 4) pelo que deve ter herdado o alelo 4,0 kb da mão e o alelo 4,2 kb do pai. Visto que ambos os progenitores são hete rozigóticos obrigatórios para a característica FCU, estes dois alelos em ambos os progenitores não devem ser fenilcetonúricos e o descendente em questão deve estar, portanto, iser to da característica FCU.
EXEMPLO 5
Houve dois indivíduos observados numa das famílias dinamarquesas. Esta família é particularmente importante porque a segregação dos alelos FCU em ambos os indivíduos observados tem de ser concordante para que o desarranjo genético seja realmente causado por uma mutação no proprio gene hidroxilase fenilalanina, mas não através de um mecanismo trans-regulador. Encontrou-se polimorfismo HindIII em ambos os progenitores, que são heterozigóticos para os alelos
4,2 kb e 4,0 kb (Figura 16B, faixas 1 e 2) , Um dos observados é homozigótico para o alelo 4,2 kb (Figura 16B, faixa 3), o que indica que os genes FCU nesta família estão associados com os alelos 4,2 kb. Ura segundo indivíduo em observação é também homozigótico para o alelo 4,2 kb (Figura lóB, faixa 4) Visto que a probabilidade de um acontecimento aleatório de genotipos iguais nos dois indivíduos é apenas de X em 4, os resultados indicam que a segregação dos alelos e estado de doença nesta família são de facto concordantes. Esta interpre
tação é ainda reforçada pela observação de que dois descendentes não afectados da mesma família herdaram alelos diferentes dos progenitores. Um descendente era homozigótico para os alelos 4,0 kb (Figura 16B, faixa 5) β estava isento da característica, outro descendente era heterozigótico para os alelos 4,2 kb e 4,0 kb (Figura léB, faixa 6) e deve ser um portador de característica. Observou-se segregação concor dante entre os alelos mutantes e estado de doença noutra família FCU dinamarquesa com dois indivíduos em observação.
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Considerados conjuntamente com a discordância de segregação do indivíduo em observação e descendentes não afectados em todas as famílias analisadas, os dados sugerem fortemente que a fenilcetonúria clássica é de facto causada por mutações sub jacentes no próprio gene hidroxilase fenilalanina, e que o po limorfismo de comprimento de fragmento de restrição no lugar hidroxilasç fenilalanina, revelado pelos clones cADN hidroxilase fenilalanina humanos, pode ser de facto utilizado para diagnóstico pré-natal e detecção de portador de FCU clássica nalgumas famílias.
EXEMPLO 6
A identificação haplotípica de alelos genéticos no homem é um instrumento extremamente importante para análise de desarranjos genéticos humanos. A exploração desta tecnologia na análise de diversas formas de Talmassemias foi bem documentada recentemente. A aplicação de análise haplotípica do gene hidroxilase numa das famílias dinamarquesas está representada na Figura 17. Nesta família, embora ambos oa progenitores fossem heterozigóticos para os alelos 4,2 kb e 4,0 kb HindIII (imagem A, faixas M e F), o indivíduo em observação é também heterozigótico para os dois alelos (imagem A, faixa P). Por conseguinte, o gene mutante nâo pode ser associado com qualquer dos alelos nos dois progenitores apenas pela análise. No entanto, assimilação Sphl do ADN doe progenitores mostrou que a mão era horaozigótica para o alelo 7,0 kb, enquanto que o pai era heterozigótico para os alelos 9,7 kb e 7,0 kb (imagem A, faixas M e F). Visto que o indivíduo observado é homozigótico para o alelo 7,0 kb (Imagem A, faixa P), o gene FCU do pai deve estar associado com o alelo 7,0 kb. Este gene FCU foi transmitido para um dos descendentes não afectados, que era também homozigótico para o alelo HindIII 4,0 kb (Imagem A, faixa S2). 0 gene FCU que herdou
do pai deve ter, portanto, um haplotipo de H4,O/S7,O, em que H e S representam HindIII e Sphl. respectivamente. 0 haplotipo do gene não FCU do pai deve ser, portanto, H4,2/S9,7, Umauvez definidos os haplotipos dos genes hidroxilase fenala- 27
55.384
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nina do pai, os dos genes da m&e podem deduzir-se com facilidade. Visto que o indivíduo observado é heterozigótico para os alelos 4,2 kb e 4,0 kb HindlII (imagem A, faixa Ρ) , deve ter herdado o alelo 4,2 kb HindlII da m&o, o qual deve ser o gene FCU, Visto que a m&o é homozigótica para o alelo 7,0 kb Sphl. o seu gene FCU tem um haplotipo de H4,2/S7,O e o seu gene n&o FCU tem um haplotipo de H4,O/S7,O. Uma vez determinados todos os quatro genes hidroxilase fenilalanina desta fa mília, pode haver um total de quatro combinaçSes possíveis dos haplotipos do gene hidroxilase fenilalanina em todos os filhos desta família, três dos quais est&o representados nos três filhos existentes (Figura 17b). Torna-se evidente que o outro descendente n&o afectado era homozigótico para os alelos 4,0 kb HindlII e heterozigótico para os alelos 9,7 kb e 7,0 kb Sphl (Imagem A, faixa Sl), Este indivíduo herdou o ge ne n&o FCU do haplotipo H4,2/S9,7 proveniente do pai e o gene n&o FCU do haplotipo H4,O/S7,O proveniente da m&· e estava consequentemente isento da característica FCU.
EXEMPLO 7
Numa das famílias, ambos os progenitores eram homozigóticos quando analisados por polimorfismo MspI e Sphl. A análise desta família com HindlII indicou que a pai era heterozigótico para os alelos 4,2 e 4,0 kb, a m&e era homozigó tica para o alelo 4,2 kb e o indivíduo em observaçfio era também homozigótico para o alelo 4,2 kb (dados n&o representados) . Um descendente n&o afectado era heterozigótico para os dois alelos, e, neste caso, nSo se pode determinar se este indivíduo era um portador de característica ou estava isento da característica FCU, por meio de análise de polimorfismo. No entanto, a possibilidade de este indivíduo ser do fenotipo FCU pode ser posto de parte, com base em que o gene n&o FCU do pai foi transmitido para este indivíduo. Por outro lado, se o ADN fetal tiver um genotipo 4,2 kb homozigótico numa gravidez futura, n&o se pode determinar se o feto será um-'port&dor de características ou um indivíduo fenilcetonúri55.384
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co β a exclusão nSo será influenciada. A probabilidade de possível exclusSo de homozigóticos FCU é 5θ Que também será válida para todas as famílias com um progenitor homozigótico e um progenitor heterozigótico.
EXEMPLO 8
Visto que o diagonóstico pré-natal e a detecçSo heterozigótica por polimorfismo de comprimento de fragmento de restriçSo depende estritamente de que um progenitor, pelo menos,seja um haplotipo heterozigótico, é importante estabelecer a heterozigosidade percentual em qualquer indiYÍduo na populaçSo em geral. Visto que há três alelos HindIII. dois alelos MspI e dois alelos Sphl. há um total de 12 alelos geno típicos teóricos do gene hidroxilase fenilalanina humano pela presente análise, cada um com um haplotipo característico (Quadro l). A frequência de cada haplotipo será o produto das frequências alélicaa individuais reveladas pela pelas três en zimas de restrição, A probabilidade de um indivíduo ser homozigótico para qualquer dos haplotipos será o quadrado da frequência de haplotipo, e a soma do quadrado de todas as 12 fre quências haplotipo representa a frequência de indivíduos homo zigóticos na populaçSo. Os restantes indivíduos devem ser heterozigóticos para quaisquer dois dos haplotipos, e a heterozigosidade deve ser a homozigosidade percentual subtraída de 100 $ e é igual a 75 $ neste caso (Quadro l).
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cálculos teóricos baseados nas frequências dos alelos individuais, A possibilidade de desequilíbrio de ligação entre os polimorfismos não foi tida em conta nestes cálculos.
EXEMPLO 9
Na população em geral, as probabilidades de acontecimentos conjugados entre dois heterozigóticos, dois ho. mozigóticos e entre um beterozigótico e um homozigótico são reguladas pelo desenvolvimento binominal (75 % + 25 %) , em que 75 % e 25 % sâo a heterozigosidade percentual e a homozigotisidade percentual, respectivamente. Assim, a probabilidade de dois heterozigóticos se unirem seria (75 %) ou 56,25%. Nestes acontecimentos, se os haplotipos dos genes FCU nos progenitores podem ser identificados por meio de comparação com os haplotipos do indivíduo em observação, pode esperar-se dia gnósticos pré-natal completo por análise de ADN fetal por intermédio de amniocentese. No caso de uma gravidez ter resulta do da união entre dois homozigóticos (6,25 %), não pode haver diagnóstico, e, obviamente, não se pode fazer amniocentese .Fj. nalmente, se um heterozigótico se une com um homozigótico, apenas 50 % dos descendentes resultantes podem ser excluídos de terem fenotipos FCU. Visto que o acontecimento conjugado tem uma probabilidade de 37,5 £>, a probabilidade total de exclusão de homozigóticos regressivos será de 18,75 % (Quadro 2),
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Assim, utilizou-se um clone cADN hidroxilase fenilalanina de rato clonado para identificar os clones cADN humanos correspondentes numa livraria cADN de fígado humano por meio de hibridizaçSo cruzada. Utilizaram-se clones cADN hidroxilase fenilalanina humanos como sonda de hibridizaçSo para analisar fenilcetonúria clássica. Obtiveram-se provas concludentes que demonstram a presença do gene hidroxilase fe nilalanina era ADN celular do fenotipo FCU, o que sugere que a fenilcetonúria clássica nSo é causada por uma eliminação de todo o gene hidroxilase fenilalanina.
Desde a observação inicial de Kan e Dozy (1978, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75 5^31) de que há um polimorfismo de local de restriçSo Hpal na zona lateral 3’ do gene beta-globina humano, que está associado e pode ser utiliza do para diagnóstico de anemia de célula falciforme, o polimor fismo de comprimento de fragmento de restriçSo transformou-se num instrumento extremamente valioso para analisar desarranjos genéticos humanos. Está presentemente determinado que existem mais de 10 enzimas que proporcionam disposiçSes polimórficas a partir dos lugares beta-globina humana 60 kb, e a aplicação destes polimorfismos de enzima para diagnóstico pré! -natal de diversos tipos de beta° e beta* talassemia por aná lise de ligação tem sido bem documentada. Utilizando a sonda cADN hidroxilase fenilalanina humana clonada, identificaram-! -se três enzimas de restrição que proporcionaram dispositivos polimórficos a partir do lugar hidroxilase fenilalanina, dando origem a um total de 12 haplotipos teóricos do gene. Com base numa dimensão de amostra relativamente pequena (20 indivíduos aleatórios) e sem ter em consideração a possibilidade de desequilíbrio de ligação entre estes locais polimórficos, calculou-se que a heterozigosidade percentual na população de raça branca em geral e de 75 %· Este nível elevado de hetero-l zigosidade poderia indicar que se pode efectuar diagnóstico pré-natal para 56,25^. das famílias FCU aleatórias e que se po de fazer exclusSo de homozigóticos regressivos em mais 18,753& dá.Svfamílias. No entanto, estas probabilidades são estimatl- 33 55.384
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vas óptimas no sentido de os haplotipos de todos os quatro ge nes hidroxilase fenilalanina podem não ser identificáveis numa família em particular, apenas por meio de comparação com o indivíduo em observação. Um exemplo típico é proporcionado na família representada na Figura 4. Se não dispuséssemos do des. cendente informador S2, não teria sido possível um diagnóstico completo. Desta maneira, a probabilidade real de diagnóstÁ co e exclusão pode depender tambám da disponibilidade de descendentes adicionais ou avós, a fim de estabelecer fase para o haplotipo do gene. Por conseguinte, em condiçães ideais, po. dera proporcionar-se serviços genéticos para um máximo de 75 % das famílias FCU aleatórias na população de raça branca em ge ral. No entanto, estes números só podem melhorar no futuro com a identificação de alelos adicionais por polimorfismo de restrição, quando mais ADN do gene hidroxilase fenilalanina humano for clonado e utilizado como sondas de hibridização.
0 presente invento portanto, é bem adequado e apropriado para alcançar os objectos e fins e tem as vanta· gens mencionadas e outras que lhe sâo inerentes.
0 depósito do primeiro pedido para o invento acima descrito foi efectuado nos Estados Unidos da América em 14 de Abril de 1983 sob ο N8 484.816
-
Claims (11)
- REIVINDICAÇÕES1» - Processo para a síntese de clones cADN a partir de mARN hidroxilase fenilalanina de tecido de fígado caracterizado pelo facto de compreender,isolamento e purificação de hidroxilase fenilalanina do tecido de fígado,obtenção e isolamento de anticorpos à hidroxilase fenilalanina purificada,obtenção de mARN hidroxilase fenilalanina en riquecida com polissoma por meio de imunoprecipitaçfto de po55.384SJW/llOO1lissomas de fígado utilizando os anticorpos, esíntese enzimática de clones cADN reconíbinan tes a partir de mARN hidroxilase fenilalanina enriquecida com polissoma.
- 2* - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o tecido de fígado eer tecido de fígado humano.
- 3* - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o tecido de fígado eer tecido de fígado animal.
- 4* - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o tecido de fígado ser tecido de fígado de rato.
- 5- - Processo de acordo com as reivindicaçães anteriores utilizado no diagnóstico pró-natal de fenilcetonúria, caracterizado pelo fattp de compreenderelaboração de mapa genético por meio de utilização de clones cADN hidroxilase fenilalanina humanos como sondas.
- 6* - Processo de acordo com a reivindicação 5, utilizado no diagonóstico prenatal de fenilcetonúria, cararacterizado pelo facto de compreendercisão de ADN fetal com enzimas,cisão de ADN de pais disponível com ae referidas enzimascisão de ADN de irmãos não atacados disponível com as referidas enzimas,cisão de ADN de irmãos anteriormente atacados disponível com as referidas enzimas, ecomparação do polimorfismos dos ADNs cind
- i7* - Processo de acordo com as reivindica- 35 55.384SJW/llOOções anteriores, utilizada na construção de um arquivo de cADN humana a partir do qual possam ser identificados e isolados clones cADN hidroxilase fenilalanina humanos, utilizando um clone cADN hidroxilase fenilalanina animal correspondeu te, por hibridação cruzada, caracterizado pelo facto de compreender,a síntese de clones cADN a partir do mARN de fígado humano completo,a inserção do clone cADN sintetizado em ADNplasmídeo,a introdução do ADN plasmídeo recombinante resultante numa bactéria adequada para construir o arquivo cADN de fígado humano,a hibridação de clones cADN animal marcados com os clones cADN do arquivo de fígado humano, ea determinação de sinais positivos,
- 8* - Processo de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de se preparar E. Coli Rftl(prPH9l) que tem o número de registo de depósito ATCC 39329.
- 9* - Processo de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de se preparar E. Coli RRl (prPH98) que tem o núrnero de registo de depósito ATCC 39330.
- 10* - Processo de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de se preparar E. CojA RRl (phPH72) que tem o número de registo de depósito ATCC 39331.
- 11» - Processo de acordo cora as reivindicações anteriores caracterizado pelo facto de se preparar E, Coli RRl (phPH73) que tem o número de registo de depósito- 36 55.384SJV/1100ATCC 39332.
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PT78416A PT78416B (en) | 1983-04-14 | 1984-04-12 | A method of synthesizing cdna clones from phenylalanine hydroxilase and for the use thereof in the diagnosis of classical phenylketonuria |
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