NO841471L - Fenylalanin-hydroksylase-cdna-kloner, deres fremstilling og anvendelse - Google Patents

Abstract

Fenylalaninhydroksylase-cDNA-kloner, fremgangsmåter for deres fremstilling og anvendelsen av disse klonene ved diagnosen av den genetiske sykdom hos mennesker klassisk fenylketonuri (PKU), en arvelig sykdom i fenyl-alaninmetabolismen som forårsaker permanent mental hemming hos mennesker, og identifiseringen av heterozygotiske bærere av egenskapen.

Description

Fenylketonuri og dens befolkningsgenetikk.

Fenylketonuri (PKU) er en genetisk sykdom hos mennesker forårsaket av en medfødt feil i metabolismen for aromatiske amino-syrer. Det ble først funnet for ca. 50 år siden at pasienter,

med denne tilstand hadde overskudd av fenylpyruvat i urinen (Følling, A., 1934a, Nord. Med. Tidskr. 8, 1064-1059; Følling,

A., 1934b, Zitschr. Physiol. Chem. 227, 169-176). Deretter ble det oppdaget at leveren hos slike pasienter ikke var istand til å omdanne fenylalanin til tyrosin som er det metabolske hoved-sporet for fenylalanin (Jervis, G.A., 1953, Proe. Soc. Exp.

Biol. Med. 82, 514-515; Udenfriend, S. og Bessman, S.P., 1953,

J. Biol. Chem. 203, 961-966; Wallace et al., 1957, Proe. Soc.

Exp. Biol. Med. 94, 632-633; Mitoma et al., 1957, Proe. Sco.

Exp. Biol. Med. 94, 634-635). Klassisk PKU er således kjenne-tegnet ved en mangel på fenylalaninhydroksylase-aktivitet i leveren (Kaufman, S. 1976, I: Advances in Neurochemistry, Vol.

2, s. 1-132, Agranoff, B.W. og Aprison, M.H., eds., Plenum Press, New York og London). Mangelen på denne enzymatiske aktivitet forårsaker vedvarende hyperfenylalaninemi og mindre viktige metabolske spor for fenylalanin blir altfor mye utnyttet. Høye ni-våer med fenylalanin og dets derivater er giftige og forårsaker forstyrrelser i tyrosin- og tryptofan-metabolisme (Blau, K.,

1979, I: Aromatic Amino Acid Hydroxylase and Mental Disease (Youdim, B.M.H., ed.) s. 79-139, New York, Wiley). Nedsatt dannelse av katekolaminer, malanin og serotonin er typisk for ubehandlede PKU-pasienter, og det kliniske symptomet er en irreversibel forringelse av hjerneutvikling som resulterer i alvorlig mental hemming av de ubehandlede barna (Følling, A., 1934a, Nord. Med. Tidskr. 8, 1054-1959; Følling, A., 1934b, Zitschr. Physiol. Chem. 227, 169-176).

Fenylalaninhydroksylase-mangel, uansett fenotype variasjo-ner, overføres som et autosomalt recessivt trekk. Omfattende undersøkelser av over 5 millioner nyfødte har vist at forekoms-ten av klassisk fenylketonuri blant hvite individer varierer fra 1/5.400 i Eire til 1/16.600 i Sveits (Thalhammer et al, 1975, Humangenetik 30, 273-286). Felles-sekvensen i 8 Vest-europeiske land og i U.S.A. er ca. 1/8.000, og 2% av befolkningen er heterozygote-bærere av PKU-trekket. (Bickel et al, 1973, Acta Paediat. Scand. 62, 413-416; Scriver, CR. og Rosenberg, L.E., 1973, I: Amino Acid Metabolism and Its Disorders, s. 290-337, Philadelphia: Saunders, 491 s.).

Nåværende fremgangsmåter for undersøkelse og behandling

av nyfødte

Fenylketonuri-pasienter utskiller store mengder fenylpyruvat i urinen, noe som lett kan påvises ved dens reaksjon med jern-(Ill)klorid og som ble brukt i 1950-årene som en undersøkelses-prøve for diagnose av PKU-barn. En enkel og masseundersøkende metode for en semi-kvatitativ bestemmelse av fenylalanin i små blodprøver fra nyfødte barn ble senere utviklet av Guthrie, R.

og Susi, A., 1963, Pediatrics 32, 338-343. Nyfødte PKU-barn identifisert ved hjelp av prøven kan behandles med et spesielt proteinlysat som har lavt fenylalanin-innhold (Bickel et al, 1954, Acta Paediat. Scand. 43, 64-77; Armstrong, M.D. og Tyler, F.H., 1955, J. Clin. Invest. 34, 565-580). Denne behandlingen forårsaker et redusert plasmanivå av fenylalanin, bortfall av fenylpyruvat i urin og er forbundet med en forbedring i mental utvikling og adferdsmessig opptreden (Koch et al, I: Phenyl-ketonuria and Some Other Inborn Errors of Metabolism (Bickel, H., Hudson, F.P. og Woolf, L.I., eds.) s. 20-25; Wamberg, 1977, I: Medico-Social Management of Inherited Metabolic Disease (Raine, D.N., ed.), s. 63-78, MTP Press Ltd., Lancaster, England;

Smith, I. og Wolff, O.H., 1974, Lancet 2, 540-544).

Tidlig diagnose av klassisk PKU og behandling gir imidlertid det ikke enhetlige normale IQ-resultater og læreevne. Opp-starting av dietbehandling på et tidlig tidspunkt etter fødselen har store psykologiske og sosiale implikasjoner for pasientens familie (Mikkelson et al, 1974, Næringsforskning 18, 78-86). Dietjusteringen må gjennomføres i en lang tidsperiode for å være effektiv, og avslutningen av behandling ved midten av det første tiåret etterfølges åpenbart av en liten men vesentlig redukjon i IQ-poeng (Scriver et al, 1980a, N. Eng. J. Med. 303, 1336; Scriver, et al, 1980b, N. Eng. J. Med. 303, 1394). Overvåkning av dnene behandlingen er påvist å være svært vanskelig og kan best utføres kun ved senteret som er øvet i slike behandlinger.

For tiden finnes det ikke noen prenatal diagnostisk metode for identifikasjon av recessive homozygoter, og den eneste prøven som er tilgjengelig for identifisering av heterozygoter er "fenylalanin-toleranse"-prøven som ikke er særlig kvantitativ (Woolf et al, 1967, Nature 213, 882-885; Rampini,S., 1973, Schweiz Med. Wschr. 103, 537-546; Guttler, F. og Wamberg, E., 1977, Acta Paeeiat. Scand. 66, 339-344; Guttler, F. og Hansen, G., 1977a, Ann. Clin. Biochem. 14, 124-134; Guttler, F. og Hansen, G., 1977b, Clin. Gen. 11, 137-146). Det er følgelig et fortvilt behov for utvikling av metoder for prenatal diagnose og påvisning av voksne heterozygoter for prevensjon, heller enn behandling, av denne arvelige sykdommen.

Systemet for hydroksylasevirkning på fenylalanin

Systemet for hydroksylasevirkning på fenylalanin hos patte-dyr er komplekst: det omfatter flere andre enzymer og kofaktorer i tillegg til fenylalaninhydroksylase selv (fig. 1). I nærvær av molekylært oksygen og den aktive kofaktoren tetrahydrobipterin oksyderer enzymet fenylalanin til tyrosin og omdanner samtidig kofaktoren til en kinonoid dihydrobiopterin form (Kaufman, S., 1964, J. Biol. CHem. 248, 540). Det kinonoide dihydrobiopterinet reduseres deretter til tetrahydrobiopterinformen ved hjelp av dihydropteridinreduktase i nærvær av NADPH (Kaufman, S., 1976, i: Advances in Neurochemistry, Vol. 2, s. 1-132, Agranoff, B.W. og Aprison, M.H., eds., Plenum Press, New York og London). Følge-lig virker pterin-kofaktoren katalytisk under fenylalaninhydrok-syleringen. Dihydrofolat-reduktase kreves først for å omdanne det naturlig forekommende 7, 8-dihydrobiopterinet til dets aktive tetrahydroform (Kaufman, S., 1962, i: Oxygeneses (0. Hayashi, ed.) s. 129, New York, Academic Press). Dette enzymet trengs imidlertid ikke lengre etter at den første reduksjonen har skjedd ettersom pterin-kofaktoren bare resirkuleres mellom tetrahydro-og kinonoid-dihydroformene (Kaufman, S., 1963, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 50, 1085). Hele kjeden av reaksjoner skjer i leveren som er det eneste vevet som gir vesentlig fenylalanin-hydroksy-lerende virkning hos menneske.

Heterogene fenotyper med fenylalanin- hydroksylase- mangel

Ettersom fenylalanin hydroksylering er et et slikt komplekst system, er det mulig at det hyperfenylalaninemi også kan skyldes mangler ved de øvrige enzymene eller kofaktorene. Faktisk er variantformer av fenylketonuri nylig blitt beskrevet hvor det er påvist en mangel på enzymet dihydropteridinreduktase (Bartholome, K., 1974, Lancet 2:580; Smith et al, 1975, Arch. Dis. Child. 50, 864-870; Kaufman et al, 1975a, New Engl. J. Med. 293, 785-790; Kaufman et al, 1975b, Pediat. Res. 9, 632-634). PKU-fenotypen kan også gi seg utslag som et resultat av dihydrofolatreduktase-mangel (Niderwieser, A., 1979, i: Folie Acid in Neurology, Psychiatry and Internal Medicine (Botez, M.I., Reynolds, E.H., eds.) s. 349-384, New York, Ravin; Danks et al, 1979, Pediatr. Res. 13, 1150-1155) og homeostase av tetrahydrobiopterin-koenzy-mets (Danks, D.M., 1978, J. Inherited Met. Dis. 1, 47-48). Likevel utgjør disse typene av "atypisk fenylketonuri" en for-holdsvis liten del av fenylketonuri-pasientene. Et stort fler- . tall av dem mangler fremdeles enzymatisk fenylalaninhydroksylase-aktivitet i lever-biopsiene, og hydroksylering av fenylalanin oppstår ikke selv i nærvær av tilsatt tetrahydropteridin-kofak-tor (Grimm et al, 1975, Clin. Chim. Acta 58, 17-21).

Fenylalaninhydroksylase-mangel er imidlertid en heterogen tilstand ettersom pasienter med denne tilstanden kan variere fra alvorlig (klassisk PKU) til moderat (hyperfenylalaninemi). Fenylalaninhydroksylase er blitt renset fra levere fra rotte, apekatt og menneske (Kaufman, S. og Fisher, D.B., 1970, J. Biol. Chem. 245, 4745-4750; Gillam et al, 1974, Biochem. J. 139, 731-739; Choo, K.H. og Cotton, R.G.H., 1979, Biochem. J. 17, 921-946; Woo et al, 1974, Biochem. J. 139, 741-749; Choo et al, 1979a, Biochem. J. 181, 285-294; Choo et al, 1979b, J. Inherited Metab. Dis. 2, 79-84). Det er et multimert enzym med en molekylvekt for under enhetene på ca. 50.000 dalton. Nyere bevis har vist at underenhetene enten er identiske eller at én er et pro-teolytisk produkt av det andre (Choo et al, 1979a, Biochem. J. 181, 285-294; Choo et al, 1979b, J. Inherited Metab. Dis. 2, 79-84). Fenylalaninhydroksylase fra pasienter med klassisk fenylketonuri er påvist å være en strukturelt endret form av enzymet med mindre enn 1% av den normale aktiviteten (Friedman et al, 1973, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 70, 552-556), hvilket indikerer at fenylketonuri kan være det direkte resultatet av en mutasjon i selve fenylalaninhydroksylasegenet. Videre har analyse av fenylalaninhydroksylase-aktiviteten i lever-biopsier fra pasienter med "hyperfenylalaninemi" vist at de inneholdt ca. 5% av det normale aktivitetsnivået, med en variasjon fra 1 til 35% (Kaufman et al, 1975a, New Engl. J. Med. 293, 785-790; Kaufman, et al, 1975b, Pediat. Res. 9, 632-634; Bartholome et al, 1975, Pediat. Res. 9, 899-903). Det er senere blitt påvist at de lave enzymatiske aktivitetene i tilfeller med hyperfenylalaninemi ikke skyldtes tilstedeværelsen av 5% av det normale enzymet, men heller tilstedeværelsen av en endret hydroksylase med kinetiske egenskaper som adskiller seg fra både det normale enzymet og enzymet fra pasienter med klassisk PKU (Kaufman, S., 1976, i: Advances in Neurochemsitry, Vol. 2, s. 1-132, Agranoff, B.W. og Aprison, M.H., eds., Plenum Press, New York og London; Kaufman, S. og Milstein, S., 1977, Ann. Clin. Lab. Sei. 2, 178-185). Disse undersøkelsene indikerer tilsammen klart tilstedeværelsen av multiple fenotyper av fenylalaninhydroksylase-mangel, noe som kan være forårsaket av mutasjoner på forskjellige steder i fenylalaninhydroksylasegenet.

Foreliggende oppfinnelse er rettet på fenylalaninhydroksylase-cDNA-kloner, fremgangsmåter for fremstilling av disse og anvendelsen av disse klonene i den prenatale diagnose av den genetiske sykdom hos mennesker, fenylketonuri (PKU), en arvelig sykdom i fenylalaninmetabolisme som forårsaker permanent mental hemming hos mennesker, og identifiseringen av heterozygotiske bærere av dette trekket.

mRNA-en for fenylalaninhydroksylase renses fra den samlede mengde med mRNA-er fra rottelever og den rensede mRNS brukes til syntese og kloning av dens cDNA. De klonede rotte-fenylalaninhydroksylase-cDNA-klonene brukes til å identifisere de tilsvarende cDNA-klonene i en samling av human lever-cDNA ved kryss-hybridisering. De humane fenylalaninhydroksylase-cDNA-klonene brukes som en hybridiserings-sonde for å analysere klassisk fenylketonuri.

Fortrinnsvis anvedes det vanlig, godkjent rekombinant DNA-teknologi og bestanddelene, slik som plasmidene, etc., er lett tilgjengelige på markedet. Detaljer ved oppfinnelsen er gjengitt nedenunder. Figur 1 er en skjematisk fremstilling av systemet for fenyl-alaninhydroksylering hos rotter og mennesker. Figur 2 er en "Coomassie blue"-farvet polyakrylamidgel som inneholder forskjellige fraksjoner av rotte-fenylalaninhydroksylase gjennom fremgangsmåten for rensing. Figur 3 er en "Ouchterlony"-analyse av antiserum fra geit mot anti-rotte-fenylalaninhydroksylase. Figur 4 er en skjematisk fremstilling av fremgangsmåten for immunoutfelling som anvendes til rensing av fenylalaninhydroksylase-mRNA fra rottelever. Figur 5 er en skjematisk fremstilling av fremgangsmåten for celle-fri translasjon som anvendes for å påvise virkningen av fenylalaninhydroksylase-mRNA fra rottelever. Figur 6 er fluorogrammer av polyakrylamidgeler som Inneholder celle-frie translasjonsprodukter styrt av den totale mengde polysomal mRNA fra rottelever og renset fenylalaninhydroksylase-mRNA fra rottelever. Plate A, alt translasjonsprodukt; Plate B, immunoutfelt translasjonsprodukt under anvendelse av anti-rottelever-fenylalaninhydroksylase-antiserum fra geit. Figur 7 er radioautogrammer av agarosegeler som inneholder DNA-er isolert fra forskjellige rottelever-cDNA-kloner etter hybridisering med<32>P-merket cDNA syntetisert fra polysom-anriket fenylalaninhydroksylase-mRNA (Plate A) og polysom-uttømt mRNA (Plate B). Figur 8 er en skjematisk fremstilling av hydrid-utvalgt translasjonsfremgangsmåte for bekreftelse av identiteten av rotte-fenylalaninhydroksylase-cDNA-kloner. Figur 9 er fluorogrammer av polyakrylamidgeler som inneholder celle-frie translasjonsprodukter styrt med mRNA valgt ut ved hjelp av forskjellige plasmid-DNA. Plate A: total mengde celle-frie translasjonsprodukter; Plate B: immunoutfelte celle-frie translasjonsprodukter under anvendelse av anti-rotte-fenylalaninhydroksylase-antiserum fra geit. Figur 10 er et radioautogram av en agarosegel som inneholder forskjellige mRNA-preparater etter hybridisering med<32>P-merket prPH98-DNA. Figur 11 er en skjematisk fremstilling av forenklede restrik-sjonskart over to rotte-fenylalaninhydroskylase-cDNA-kloner med de største overlappende innførte DNA-fragmentene. Figur 12 er et radioautogram av en agarosegel som inneholder DNA isolert fra to rotte- og seks humane fenylalaninhydroksylase-32 cDNA-kloner etter hybridisering med P-merket rotte-fenylalaninhydroksylase-DNA isolert fra prPH98-DNA. Figur 13 er en skjematisk fremstilling av to humane fenyl alaninhydroksylase-cDNA-kloner med de største overlappende inn-førte humane DNA-fragmenter. Figur 14 er radioautogrammer av agarosegeler som inneholder genom-DNA isolert fra normale hvite individer etter spalting med forskjellige restriksjonsenzymer og hybridisering med 3 2P-merket phPH72- og phPH73-DNA-er. Plate A: Mspl, plate B: SphI og plate C: Hindlll. Figur 15 er radioautogrammer av agarosegeler som inneholder genom-DNA-er isolert fra medlemmer av tre PKU-familier etter 32 hybridisering med P-merkede phPH72- og phPH73-DNA-er. Restriksjonsenzymene som ble anvendt i platene A, B og C, er henholdsvis Mspl, SphI og Hindlll. Skjematisk fremstilling av Mandelian-segregering av PKU-genene i disse familiene er illustrert til høyre i de tilsvarende radioautogrammene. Figur 16 er radioautogrammer av agarosegeler som inneholder genom-DNA-er isolert fra medlemmer av to ytterligere PKU-familier etter spalting med Hindlll og hybridisering med<32>P-merkede phPH72- og phPH73-DNA-er. Mandelian-segregeringen av PKU-genene i disse familiene er vist skjematisk med de tilsvarende radioautogrammer . Figur 17 er et radioautogram av en agarosegel som inneholder genom-DNA-er isolert fra medlemmer av en sjette PKU-familie etter spalting med enten Hindlll eller SphI og hybridisering med 32

P-merkede phPH72- og phPH73-DNA-er (plate A). Mandelian-segregeringen av PKU-genene i denne familie er vist skjematisk i plate B.

Molekylær og biologisk basis for klassisk fenylketonuri

De følgende organismene er tilgjengelige fra den permanente samlingen i American Type Culture Collection. 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, U.S.A.

Deponeringene er tilgjengelige for almenheten etter meddelel-sen av et patent til søkeren, Howard Hughes Medical Institute, som har tilveiebragt dem. Det skal imidlertid forstås at tilgjengeligheten av en deponering ikke utgjør en lisens for å praktisere oppfinnelsen ved forringelse av patentrettigheter bevilget ved offentlig handling.

Ved hjelp av rekombinant DNA-teknologi klones genene som koder for de normale og variantproteinene, og deres nukleotid-sekvenser bestemmes. Sammenligning av aminosyresekvensene for hele proteinene utledet av gensekvensene avslører alle aminosyresubstitusjoner og fastslår derved den molekylære basis for mangelen på gennivået. Hos fenylketonuri-fenotypen kan det foreligge en rekke genotype-alleler på grunn av genom-polymorfisme hos menneske. Disse genotype-allelene kan være resultatet av menings-løse mutasjoner, konserverende aminosyresubstitusjoner, klassiske hvilende mutasjoner, mellomliggende sekvens-divergens og sekvens-polymorfisme i endene, som ikke behøver å gi seg utslag på pro-teinnivået. Eksistensen av immunoreaktive materialer var til stede og fraværende i lever-biopsier fra pasienter med klassisk PKU (Choo, et al, 1979a, Biochem. J. 181, 285-294; Choo, et al, 1979b, J. Inherited Metab. Dis. 2, 79-84; Bartholome, K. og Ertel, 1976, Lancet 2:862-863; Bartholome, K. og Ertel, 1978, Lancet 1:454).

Heterozygot-påvisning hos voksne og prenatal diagnose av klassisk PKU

Etter å ha fastslått det biokjemiske grunnlaget for de genetiske skadene ved klassisk PKU, gjøres identifikasjonen av polymorfe nukleotider hos de normale og variantgenene som gir opphav til fremkomsten og bortfallet av visse spaltingsseter for restrik-sjonsendonuklease, som kan være eller behøver ikke å være lokali-sert på stedene for de genetiske skadene. Denne informasjonsmas-sen katalogiseres så slik at forskjellene i restriksjonsendonukle-ase-spaltingsmønstre av genom-DNA-fragmenter som inneholder fenylalaninhydroksylase-gensekvenser kan brukes i kombinasjon med amniosyntese som et diagnostisk redskap for prenatalt å identifisere de recessive homozygotene som er forhåndsdisponert for utvikling av alvorlig mental hemming.

Det er svært viktig at den smame analytiske fremgangsmåten kan brukes for å identifisere de voksne heterozygot-bærerne.

Det er nylig blitt vist at heterozygositet også kan medføre en risiko for pasientens helsetilstand (Ford, R.C. og Berman, J.L., 1977; Lancet 1, 767-770; Thalhammer et al, 1975, Humangenetik 30, 273-286; Bessman et al, 1978, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 75, 1562-1566. Tidlig identifisering av disse individene vil være nødvendig for forhindring av denne genetiske sykdommen.

For å kunne isolere det kromosomale fenylalaninhydroksylase-genet hos menneske må en passende hybridiseringssonde først være tilgjengelig. Selv om den beste sonde er en cDNA-klon av human fenylalaninhydroksylase-mRNA, erdenne ikke lett tilgjengelig ettersom tilførselen av friskt humanvev som trengs for å isolere intakt mRNA-er ikke er å stole på. Vi har valgt å bruke rottelever (selv om levervev fra andre dyr kan brukes) for mRNA-isolering og for konstruksjon av de tilsvarende cDNA-klonene, som så brukes til å identifisere kloner som inneholder den tilsvarende human-cDNA og kromosomalt gen fra menneskelever-cDNA og genom-DNA-samlinger ved kryss-hybridisering.

Anrikning av fenylalaninhydroksylase-mRNA ved hjelp av polysom- immunoutfelling

De fleste eukaryote mRNA-er er ikke til stede i tilstrekke-lig høye konsentrasjoner i cellen til å styre kloning, og den best tilgjengelige fremgangsmåte for å anrike disse mRNA-ene er ved spesifikt å immunoutfelle polysomene som deltar i synte-sen av de tilsvarende proteinene (Palacois et al, 1973, J. Biol. Chem. 248, 540). Fenylalaninhydroksylase ble så renset for genereringen av mono-spesifikke antistoffer.

Rensing av fenylalaninhydroksylase fra rotte- lever

Rensing av fenylalaninhydroksylase fra rottelever ble utført ved en modifikasjon av fremgangsmåten ifølge Shiman et al, 1979, J. Biol. Chem. 254, 11306. Proteinrenhet ble overvåket ved hjelp av "Coomassie blue"-farving av 10% polyakrylamid-platege-ler (fig. 2). I korte trekk ble proteinene i hele rottelever-homogenatet klaret ved hjelp av sentrifugering ved høy hastighet. Fenylalaninhydroksylase ble aktivert ved inkubering ved 25°C i 30 minutter før fraksjonering med fenyl-sefarose-kolonnekromatografi. Eluatet ble ytterligere renset ved hjelp av en DEAE-cellulosekolonne. Det resulterende enzympreparatet inneholdt 2 bånd ved 50.000 dalton som tidligere rapportert (Fisher, D.B. og Kaufman, S., 1973, J. Biol. Chem. 248, 4345-4353; Gillam et al, 1974, Biochem. J. 139, 731-739), og syntes å være mer enn 95% ren med en total rensing på ca. 400 ganger (fig. 2, felt 6).

Antistoff mot rottelever-fenylalaninhydroksylase ble frembragt i en geit og analysert ved hjelp av dobbel immunodiffusjon på en Ouchterlony-plate. Sentrumsbrønnen inneholdt rått anti-serum med økende mengder rått rotteleverhomogenat og renset fenylalaninhydroksylase i periferi-brønnene. Det ble observert et kontinuerlig utfellingsbånd som indikerte at geit-antistoffet mot rottelever-fenylalaninhydroksylase er mono-spesifikt (fig.3). IgG-fraksjonen av anti-serumet var også i stand til å inhibere fenylalaninhydroksylaseaktivitet på en dose-avhengig måte.

Rensing av ribonuklease-fritt antistoff mot

fenylalaninhydroksylase

Antistoff mot rottelever-fenylalaninhydroksylase ble renset fra rått anti-serum ved affinitetskromatografi. Renset antigen ble bundet til cyanbromid-aktivert sefarose. Deretter ble alle reagenser og fremgangsmåter utført ved 4°C. Anti-serumet ble tilført affinitets-harpiksen og ble vasket grundig med PBS (10 mM natriumfosfat, pH 7,4, som inneholdt 0,15 M NaCl). Alt gjenværende ikke-spesifikt protein og spormengder av forurensende ribonuklease ble videre fjernet ved å vaske kolonnen med 3 volumdeler 0,2 M KCNS i PBS slik som skissert av Gough, N.M. og Adams, J.M., 1978, Biochemistry, 17, 5560. Det spesifikke antistoffet ble eluert

fra affinitets-harpiksen ved tilsetning av 0,5 M eddiksyre og ble nøytralisert umiddelbart ved tilsetningen av ammoniumhydroksyd. Det rensede antistoffet ble dialysert grundig mot PBS før bruk. Antistoffet ble prøvet med hensyn på ribonuklease-aktivitet ved

å inkubere antistoffet med polysomer under de samme betingelsene som skal brukes ved immunoutfelling. Profilene for polysomene før og etter antistoff-behandlingen ble så sammenlignet ved hjelp av sukrosedensitets-gradientsentrifugering.

Isolering av rottelever- polysomer

Rottelever-polysomer ble isolert ved å bruke magnesium-ut-fellingsfremgangsmåtene beskrevet av Palmiter (1974, Biochemistry, 13, 3606) og modifisert av Lee et al, (1978, J, Biol. Che., 253, 3494) slik som skissert nedenunder. Den frosne leveren ble pul-verisert og et 10% leverhomogenat ble fremstilt i en kald puffer som inneholdt 2% triton X-100 og 1 mg/ml heparin ved å bruke en teflon-homogenisator. Homogenatet ble umiddelbart sentrifugert ved 10.000 rpm i 30 sekunder og supernatanten som inneholdt både bundne og frie polysomer ble utfelt ved å justere magnesiumkon-sentrasjonen til 100 mM. Polysomene fikk aggregere i en time på is og de utfelte polysomene ble separert fra det gjenværende cellulære stoffet ved sentrifugering gjennom 0,5 M sukrose-puter i nærvær av 0,5% triton X-100 og 0,5 mg/ml heparin. De resulterende polysomer ble oppløst i 10 mM Hepes, pH 7,5, som inneholdt 5 mM MgCl2, 0,15 M NaCl og 0,5% triton X-100 ved hjelp av en tef-lonbelagt glass-homogenisator. Det partikkelformede stoffet ble fjernet ved sentrifugering og den klargjorte supernatanten som inneholdt polysomene har vanligvis et A260/A280-forhold på 1,5 til 1,8. Utbyttet har vanligvis vært 50 A260-enheter med polysom pr. gram lever. Polysom-sedimehteringsprofilene ble kontrol-lert for eventuelle tegn på RNA-degradering ved hjelp av sukrosedensitets-gradientsentrifugering, og mesteparten av polysomene fremstilt på denne måten inneholdt mer enn 10 ribosom-eneheter.

Immunoutfelling av fenylalaninhydroksylase-

syntetiserende polysomer

Fremgangsmåten som ble anvendt var den som er beskrevet av Gough og Adams (1978, Biochemistry, 17, 5560) og som er illustrert i fig. 4. Rottelever-polysomene (2500 A260-enheter) ble inkubert med 3 mg ribonuklease-fritt antistoff ved 4°C i nærvær av 100 ug/ml heparin. De resulterende antistoff-polysom-komplek-sene ble inkubert med celler av S. aureus i nærvær av 2 mM EGTA, som er en sterk inhibitor av kalsium-avhengig nukleaser. Cellene var blitt vasket grundig med tre forskjellige vaske-puffere som inneholdt 0,5% deoksycholat og 2mM EGTA før bruk. Bakterie-IgG-polysom-kompleksene ble utsedimentert gjennom avbrutte sukrose-gradienter. Pelletene ble på nytt suspendert i en puffer som inneholdt 5 mM MgCl2og 2 mM EGTA, og sedimentert gjennom sukrose for andre gang for å fjerne rest av ikke-spesifikke polysomer. RNA ble så frigjort fra de bundne polysomene med en puffer som inneholdt SDS/EDTA og bakteriene ble fjernet ved sentrifugering. Den resulterende supernatnat ble deproteinisert ved ekstraksjon med fenol/kloroform, og RNA ble utfelt med etanol ved -20°C. Poly(A)-holdig RNA ble isolert ved hjelp av kolonnekromatografi

med oligo(dT)-cellulose. En mellomliggende vasking med 0,2 M

KC1 var inkludert før elueringen av den poly(A)-holdige RNA med vann.

Renhetsfastsettelse av polysom-anriket

fenylalaninhydroksylase- mRNA

Poly(A)-holdige RNA-fraksjoner eluert fra kolonnen med

oligo (dT)-cellulose ble analysert ved å bruke det mRNA-avhengige kanin-retikulocytt-cellefrie translasjonssystemet (Pelham og Jackson, 1976), under anvendelse av ( 3 5S)-metionin som den radioaktive sporingsisotop. Alikvoter fra translasjonsblandingene ble denaturert og utsatt for polyakrylamidgel elektroforese ifølge fremgangsmåten til Laemnli (1970, Nature, 227, 680). Det ble fremstilt gleer for fluorografi ved å bruke NEN-fremmer og de ble tørket på "Whatman 3MM"-papir før eksponering mot Kodak rønt-genfilmer. Det gjenværende av den cellefrie translasjonsblandin-gen ble immunoutfelt og produktene ble også utsatt for elektroforese og fluorografi (fig. 5).

Fenylalaninhydroksylase utgjør ca. 0,25% av alle leverproteiner og dens mRNA antas å være til stede i tilsvarende lave ni-våer. Når cellefrie translasjonsprodukter styrt av den totale mengde polysomal rottelever-RNA ble analysert ved hjelp av SDS-gelelektroforese og fluorografi, ble det observert flere protein-bånd, idet det mest fremtredende var albuminet med 69.000 dalton (fig. 6A, felt 1). Bare en mindre del av proteinproduktene ble immunoytfelt med anti-fenylalaninhydroksylase som forventet (fig. 6B, felt 1). På den annen side er det åpenbart at et vesentlig proteinprodukt syntetisert som respons på det polysomanrikede RNA-preparatet har en molekylvekt på ca. 50.000 (fig. 6A, feltene 3-6). Dette proteinproduktet ble kvantitativt utfelt med anti-fenylalaninhydroksylase (fig. 6B, feltene 3-6). Det polysomanrikede fenylalaninhydroksylase-mRNA-preparatet synes å ha en renhet i overkant av 20%, og det ble oppnådd minst en 80 gangers anrikning fra den totale mengde rottelever-mRNA i ett enkelt trinn.

Konstruksjon av rekombinante cDNA-kloner fra polysom-

anriket fenylalaninhydroksylase- mRNA

Enzymatisk syntese av komplementær DNA

Fem ug av den høyrensede fenylalaninhydroksylase-mRNA ble inkubert i et sluttvolum på 200 ul ved 46°C i 30 minutter med 80 enheter av AMV revers-transkriptase i nærvær av 50 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KC1, 10 mM MgCl2, 40 mM 2-merkaptoetanol, 12,5 ug/ml oligo (dT), 40 yg/ml aktinomycin D, og 1 mM hver av de 4 deoksyribonukleosidtrifosfåtene. 100 yCi ( H)dCTP ble brukt som radioaktiv sporingsisotop. Reaksjonen ble stanset ved tilsetningen av EDTA til 20 mM, og blandingen ble av-proteinisert ved ekstraksjon med fenol. Den vandige fasen ble kromatografert gjennom en liten "Sephadex G-25"-kolonne. Den eluerte nukleinsyren i væskevolumet som kom ut av kolonnen, ble justert til å inneholde 0,1 N NaOH og 10 mM EDTA. RNA-en ble hydrolysert ved å inkubere blandingen ved 68°C i 30 minutter. Etter nøytralise-ring av blandingen med HC1, ble syntetisk DNA utfelt fra etanol. Ut fra den innlemmede radioaktive dCMP ble det beregnet at ca. 1 ug cDNA var syntetisert. Den enkjedete cDNA ble så renset ved sentrifugering på en 8-18% lineær sukrosegradient i nærvær av 0,1 M NAOH. Gradienten ble fremkalt ved sentrifugering ved 38.000 rpm i 24 timer i en SW40-sentrifuge ved 4°C. Fraksjonene som inneholdt DNA større enn 1300 nukleotider, ble slått sammen, nøytralisert med 2M NaOAc, pH 5,0 og utfelt med etanol.

Enzymatisk syntese av dobbeltkjedet DNA

Enkj edet cDNA inneholder en avsluttende "hårnåls"-sløyfe

i enden som kan tjene som en templett så svei som en primer for syntese av dobbeltkjedet DNA. Det enkjedete ( 3H)cDNA-preparatet ble således gjort dobbeltkjedet ved inkubering ved 46°C i 90 minutter i et sluttvolum på 100 yl med 400 enheter/ml revers-transkriptase i 50 mM Tris-HCl, pH 8,3, 10 mM MgCl2, 40 mM 2-merkaptoetanol og 1 mM hver av de 4 deoksyribonukleosidtrifosfa-32

tene. Denne gangen ble 25 yCi ( P)dCTP brukt som sporingsisotop. Reaksjonen ble igjen stoppet ved tilsetning av EDTA og

avproteinisert ved fenilekstraksjon. Blandingen ble kromatografert gjennom en liten kolonne med "Sephadex G-25" og nukleinsyren som er eluert i væskevolumet som kommer ut, ble slått sammen. I alt ble det erholdt 0,4 yg dobbeltkjedet DNA ved hjelp av denne fremgangsmåten.

S1 nuklease- behandling av dobbeltkjedet DNA

Den dobbeltkjedete DNA syntetisert på den ovenfor beskrevne måte inneholder en endesløyfe som kan åpnes ved behandling med S1 nuklease som spesifikt spalter enkj edet DNA. Den dobbeltkjedete DNA (2 yg/ml) ble inkubert ved romtemperatur i 1 time med 4.500 enehet/ml S1 nuklease i 0,03 M NaOAc, pH 4,5, 0,3 M NaCl og 4,5 mM ZnSO^. Reaksjonen ble stanset med EDTA og S1 nuklease ble inaktivert ved fenolekstraksjon. Den vandige fase ble kromatografert gjennom en liten kolonne med "Sephadex G-25" og 0,25 yg av dobbeltkjedete DNA ble eluert i det væskevolumet som kom ut.

Binding av dCTP til enden av dobbeltkjedet DNA med ende- transferase

Den S1-behandlete dobbeltkjedete DNA ble inkubert med 200 enheter deoksynukleotidyl ende-transferase fra kalvebrissel i et sluttvolum på 100 yl ved 37°C i 5 minutter i nærvær av 5 ym (<3>H) dCTP, 0,2 M kaliumcacodylat, pH 7,2, 1 mM CoCl2og 1 mM merkaptoetanol. Omtrent 15 dCMP-er ble tilsatt pr. DNA-ende. Reaksjonen ble igjen stanset med EDTA og enzymet ble inaktivert ved oppvar-ming ved 68°C i 10 minutter. Blandingen ble kromatografert gjennom en liten kolonne med "Sephadex G-25".

Ny sammenbinding med pBR322 med dG anbragt i enden

og transformasjon av bakterier

Plasmid-vektoren pBR322 ble gjort rettkjedet ved spalting med Pst I og 14 dGMP-er ble tilsatt pr. DNA-enden under anvendelse av ende-transferase. Ekvimolare mengder syntetisk DNA med dC i enden og pBR322 med dG i enden ble blandet i en sammenbindings-puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,8, 0,1 MNaCl). Sluttkonsentrasjo-nene for plasmid-DNA var 2 yg/ml. Blandingen ble oppvarmet ved 68°C i 30 minutter etterfulgt av inkubering ved 43°C i 3 timer. Blandingen fikk så avkjøles sakte til romtemperatur (ca. 3 timer) og hensatt ved romtemperatur over natten. Blandingen ble så anvendt til transformasjon av E. coli RRI ifølge tidligere publi-serte fremgangsmåter.

Identifikasjon av abkteriekolonier som bærer

rekombinante plasmider

Individuelle bakterietransformanter ble plassert for hånden på en plate med frisk agar i et rutenett-mønster og fikk vokse til tilstrekkelige størrelser. Koloniene ble så flyttet over på et nitrocellulosefilter som fikk flyte i 30 minutter på et "Whatman 3MM"-papir gjennomfuktet med 0,5 N NaOH, 1,5 NaCl. I løpet av denne perioden ble bakteriene lysert, deres DNA-er denaturert og ble bundet til nitrocellulosen. Filtrene ble så nøytralisert,

t32j

oppvarmet og fikk hybridisere med l gcDNA syntetisert mot 0,5

yg av det rensede fenylalaninhydroksylase-mRNA-preparatet. Etter grundig vasking, ble bakteriekoloniene som inneholdt det rekombinante plasmid-DNA-er identifisert ved radioautografi.

Identifikasjon av fenylalaninhydroksylase- cDNA- kloner

I mangel av en publisert aminosyresekvens for rottelever-fenylalaninhydroksylase, kan identiteten til fenylalaninhydroksylase-cDNA-klonene ikke fastslås ved hjelp av DNA-sekvensering. Den fullstendig korrekte gjengivelsen av disse klonene ble tilveiebragt ved hjelp av 3 uavhengige beviskjeder: a. differensiell hybridisering, b. hybrid-utvalgt translasjon og c. "Northern blot"-analyse.

Utvelgelse av fenylalaninhydroksylase-cDNA-kandidatkloner ved hjelp av differensiell hybridisering

Rekombinante plasmid-DNA-er ble fremstilt ved hjelp av mini-lysat-fremgangsmåten til Birnboim og Doly (1979, Nucleic Acid Research, Vol. 1, s. 1513-1523), spaltet med Barn HI og adskilt ved hjelp av agarosegel-elektroforese. DNA-en ble overført i to retninger på to nitrocellulosefiltre ifølge fremgangsmåten til Smith og Summers (1980, Analytical Biochemistry, Vol. 109, s. 123-129). De like filtrene ble hybridisert hver for seg til to

32

( P)cDNA-sonder: fig. 7A og 7B viser radioautogrammene av filtrene etter hybridisering med ( 3 2P)cDNA-er syntetisert fra polysom-anriket mRNA- og -uttømt mRNA-preparater. Det ble observert forskjeller i hybridiseringssignaler hos flere kloner (feltene 4, 7, 8 og 10), og de utgjorde kandidater som kan inneholde fenylalaninhydroksylase-DNA-sekvenser. Antallet kolonier som var positive i denne differensial-hybridiseringsprøven utgjorde ca. 20% av det totale antall rekombinanter. Dette antallet svarer godt til den beregnde renheten av fenylalaninhydroksylase-mRNA brukt til kloningen.

Stadfestelse av fenylalaninhydroksylase-kloner ved

hjelp av hybrid- utvalgt translasjon

Rekombinante kandidatkloner ble ytterligere analysert ved hjelp av hybrid-utvalgt translasjon (fig. 8). Plasmid-DNA isolert fra disse koloniene ble denaturert og bundet til amino-benzyloksymetylcellulose. Den immobiliserte DNA fikk hybridisere med komplett poly(A)-holdig RNA fra rottelever. RNA eluert fra harpiksene ble oversatt in vitro og de samlede proteinproduktene ble analysert ved hjelp av elektroforese på SDS-polyakryl-amid-geler etterfulgt av fluorografi. I dette eksperiemntet ble båndet med 50.000 dalton som stammer fra retikulocytlysat-systemet fjernet ved koking av gelen i 10% trikloreddiksyre. Produk-ter syntetisert som respons på mRNA valgt av DNA fra klonings-vektoren pBR322 som den negative kontroll, er vist i fig. 9A, felt 1. Profilen svarer til den for komplett poly(A)-holdig RNA fra rottelever og svært lite, om noe, av produktet lar seg immunoutfelle med det spesifikke antistoffet mot fenylalaninhydroksylase (fig. 9B, felt 1). Som positive kontroller for hybridut-velgelse, ble det innlemmet i prøven to uavhengige rotte-cDNA-kloner som koder for 2 leverproteiner med mindre molekylvekt, og det ble erholdt to sterke bånd (fig. 9A, felt 2) uten noe immuno-utf ellbart fenylalaninhydroksylase som forventet (fig. 9B, felt 2). Proteinprodukter syntetisert som respons på mRNA-er utvalgt av kandidatklonene inneholdt imidlertid et hovedbånd ved 50.000 dalton, hvilket antyder tilstedeværelsen av fenylalaninhydroksylase (fig. 9A, feltene 3-6). At disse proteinbåndene ble utfelt kvantitativt med anti-fenylalaninhydroksylase (fig. 9B, feltene 3-6) bekreftet at disse klonene inneholder fenylalaninhydroksylase -DNA- sekvenser .

RNA- analyse ved " Northern"- hybridisering

All poly(A)-holdig RNA ble ekstrahert fra forskjellige rotte-og primatvev og deres fenylalaninhydroksylase-mRNA-innhold ble analysert ved å bruke en rottelever-fenylalaninhydroksylase-cDNA-klon (prPH98) som hybridiserings-sonde (fig. 10). Man fikk et hybridiseringssignal på ca. 21S for komplett poly(A)-holdig RNA fra rottelever (felt 2). Det faktum at 0,5 yg av det polysom-an-rikede fenylalaninhydroksylase-mRNA-preparatet som var frembragt ga et mye sterkere signal (felt 1) enn 5 yg av komplett poly(A)- holdig RNA fra rottelever, ga ytterligere støtte for den helt korrekte gjengivelsen av cDNA-klonen. Man fikk ikke noe hybridiseringssignal med RNA fra rottehjerte (felt 3), hvilket indikerer vev-spesifisiteten til cDNA-sonden. Rottenyren er kjent for å inneholde fenylalaninhydroksylase-aktivitet og et tilsvarende mRNA-bånd ble også funnet (felt 5). Viktigere er det at rotte-cDNA-klonen var i stand til kryss-hybridisering med fenylalaninhydroksylase-mRNA-er fra bavian og menneske (feltene 6 og 7), hvilket antyder at de tilsvarende humangenene kan klones ved å bruke rotte-fenylalaninhydroksylase-cDNA-klonen som en sonde.

Foreløbig karakterisering av rotte-fenylalaninhydroksylase-cDNA- klonene

Uavhengig identifiserte rotte-fenylalaninhydroksylase-cDNA-kloner ble analysert ved restriksjonskartlegging. Delvise rest-riksjonskart over de to lengste overlappende rotte-felylalanin-hydroksylase-cDNA-klonene, prPH91 og prPH98, er vist i fig. 11.

Kloning av den humane fenylalaninhydroksylase- cDNA

Samlet cellulær RNA ble ekstrahert ved å bruke fenol-SDS fra en patologisk menneskeleverprøve. Poly(A)-holdig RNA ble fremstilt ved kromatografering på oligo (dT)-cellulosekolonne. RNA-preparatet ble brukt til cDNA-syntese under betingelser som fa-voriserte produksjon av cDNA i full lengde (Monahan et al, 1976, Biochemistry 15, 223-233). cDNA-preparatet ble sedimentert ved hjelp av en alkalisk sukrosegradient (Monahan et al, 1976, Biochemistry 15, 223-233) og de eneste fraksjonene som inneholdt cDNA-arter med 1000 nukleotider eller mere ble slått sammen.

Den enkjedete cDNA ble deretter gjort dobbeltkjedet med revers-transkriptase (Monahan et el, 1976, J. Biol. Chem. 251, 7355-7362). Etter behandling med S1 nuklease, ble tråder av polydC tilsatt til 3'-endene i DNA-molekylene under anvendelse av ende-transferase (Chandra et al, 1981, Biochem. Biophys. Res. Commun. 103, 751-758). Den enzymatisk syntetiserte cDNA ble bundet sammen med pBR322-DNA som var gjort rettkjedet med Pst I, og som var blitt påhengt poly dG, og DNA-en ble brukt til transformasjon av E. coli RR1 slik som beskrevet ovenfor for rotte-cDNA-klonene (Chandra et al, 1981, Biochem. Biophys. Res. Commun. 1 03, 751 - 758). Disse eksperimentene ble utført i henhold til retnings- linjene for rekombinant DNA-forskning fra National Institute of Health. Bakterietransformanter ble valgt ut etter resistens mot tetracyklin og det ble erholdt ca. 40.000 individuelle rekombinanter som inneholdt cDNA-sekvenser fra menneskelever. Analyse av innførte DNA-lengder i 20 tilfeldig utvalgte kolonier ved hjelp av mini-lysering (Birnboim, H.C. og Doly, J., 1979, Nucleic Acids res. 7, 1513-1523) og agarosegel-elektroforese har indikert at mer enn 95% av transformantene virkelig var rekombinanter, og gjennomsnittslengden av human DNA i disse rekombinantene var ca. 1,2 kilobasepar.

Ved å bruke den tidligere klonede rotte-fenylalaninhydroksylase-cDNA-klonen (prPH98) som en spesifikk hybridiseringssonde, ble samlingen av cDNA fra menneskelever som omfatter 40.000 uavhengige transformanter, undersøkt. Rekombinante plasmid-DNA-er ble isolert fra bakteriekolonien som ga sterke hybridiseringssignaler. DNA-prøvene ble analysert ved hjelp av "Southern"-hybridisering etter spalting med restriksjonsenzymet Hhal som spaltet plasmidvektor-DNA-en i små fragmenter, men ikke kuttet den innførte human-DNA i noen av klonene. Som positive kontroller for eksperimentet, ble de to tidligere klonede rotte-fenylalaninhydroksylase-cDNA-rekombinantene, prPH91 og prPH98, tatt med og man fikk sterke hybridiseringssignaler (fig. 12, feltene 1 og 2). Hybridiseringssondens spesifisitet er blitt demonstrert gjennom mangelen på hybridisering med vektor-DNA-pBR322 (fig. 12, felt 3) og en tidligere klonet human a 1-antitrypsin-cDNA-klon (fig. 12, felt 4). Spesifikke hybridiseringssignaler ble erholdt fra fenylalaninhydroksylase-cDNA-klonene identifisert ved hjelp av samlingen av lever-cDNA fra menneske (fig. 12, feltene 5-10). Lengden av den innførte human-DNA i disse rekombinant plasmidene varierte fra 0,3-1,4 kb. Delvis DNA-sekvensanalyse har indikert en utstrakt sekvenshomologi mellom fenylalaninhydroksylase-cDNA-klonene fra rotte og fra menneske. Disse klonene blekarakterisert vedhjelp av restriksjonskartlegging, og strukturen til de 2 rekombinantene som inneholdt de største overlappende, innførte human-DNA-fragmentene, phPH72 og phPH73, er vist i fig. 13.

Eksempel 1

Genom-DNA-er isolert fra 2 PKU-cellelinjer erholdt fra samlingen med mutante humanceller og fra 2 normale individer. DNA-

preparatene ble spaltet med en rekke restriksjonsenzymer etterfulgt av "Southern"-hybridisering under anvendelse av de to human-fenylalaninhydroksylase-cDNA-klonene som hybridiseringssonder. Man fikk identiske hybridiseringssignaler fra alle 4 DNA-preparatene etter spalting med multiple enzymer, hvilket indikerte at fenylalainhydroksylase-genet ikke bare fremdeles er til stede i genomet til celler avledet fra PKU-pasienter, men at den totale organiseringen av genet også forblir uendret. Ettersom cDNA-sondene bare var 1,4 kb i lengde og at den humane fenylalaninhydroksylase-mRNA består av ca. 2500 nukleotider, er det fremdeles mulig at der kan være en utstrykning eller en omordning i områder av fenylalaninhydroksylase-genet som ikke er representert i cDNA-klonene. Følgelig kunne det bare konkluderes med at klassisk fenylketonuri, i det minste i disse 2 tilfellene, ikke er forårsaket av utslettelse av hele fenylalaninhydroksylase-genet. Denne observasjonen har senere blitt utvidet til å omfat-te flere ytterligere fenylketonuri-individer analysert i de etter-følgende avsnitt.

Eksempel 2

Det er nylig blitt fastslått at det foreligger et høyt antall nukleotidsubstitusjoner i genomet hos forskjellige individer. Disse substitusjonene er vanligvis uten fenotypisk ekspresjon og kan bare påvises ved hjelp av restriksjonsenzymer som spalter DNA i de respektive gjenkjenningssekvensene. Disse tilfeldige restriksjonssete-polymorfismene resulterer i en forskjell i DNA-fragmentlengde som lett kan påvises ved hjelp av elektroforese på agarosegel etterfulgt av "Southern"-hybridisering under anvendelse av spesifikke hybridiseringssonder. Restriksjonsfragmentlengde-polymorfisme er senere blitt et virkningsfult redskap for molekylær analyse av genetiske sykdommer hos mennesker. For å anvende denne teknologien for å analysere klassisk fenylketonuri, er det absolutt nødvendig å identifisere tilstedeværelsen av polymorfe restriksjonsseter i fenylalaninhydroksylase-stedet. Genom-DNA-er isolert fra 20 tilfeldige normale hvite individer i Houston-området ble spaltet med en rekke restriksjonsenzymer og de resulterende DNA-fragmenter ble analysert ved hjelp av elektroforese på agarosegel etterfulgt av "Southern"-hybridisering.

Selv om de fleste restriksjonsenzymene ga identiske mønstre hos disse individene, ble det identifisert 3 enzymer som ga polymorfe mønstre i polyfenylhydroksylase-stedet. Enzymet Mspl ga et enkelt hybridiseringsbånd ved 23 kb hos noen individer og et 19 kb hos andre (fig. 14A, feltene 1 og 2), noe som indikerte tilstedeværelsen av 2 genotype-alleler. Faktisk er også heterozygoter som inneholdt begge båndene blitt påvist (fig. 14A, felt 3). Frekvensene for allelene forbundet med 23 kb og 19 kb båndene er henholdsvis 0,444 og 0,556.

Tilstedeværelsen av et annet allelisk system i fenylalaninhydroksylase-stedet hos menneseker er blitt identifisert ved hjelp av enzymet SphI, som spalter DNA-ene i enten et 7,0 kb eller et 9,7 kb fragment hos forskjellige individer (fig. 14B, feltene 1

og 2). Tilstedeværelsen av begge båndene i heterozygoter er også blitt påvist (fig. 1B, felt 3). Det 11,0 kb store DNA-frag-mentet er tilstede hos alle individene og er derfor ikke-allelisk. I dette tilfellet er frekvensene for 9,7 kb og 7,0 kb allelene henholdsvis 0,059 og 0,941.

Enzymet Hindlll har avslørt et tredje allelisk system.

De fleste individer er enten homozygote eller heterozygote med hensyn til 4,2 kb og 4,0 kb båndene (fig. 1C, 1, 2 og 4), som har frekvenser på henholdsvis 0,706 og 0,235. Det er også blitt påvist et sjeldnere 4,4 kb bånd hos enkelte individer med en frekvens på 0,059 (fig. 1C, felt 3). Eksistensen av disse alleliske systemene muliggjør analysen av klassisk fenylketonuri ved hjelp av restriksjonsfragmentlengde-polymorfisme.

Eksempel 3

Syv danske familier med tilfeller av klassisk fenylketonuri hos 1 eller 2 barn ble analysert ved hjelp av restriksjonsfragmentlengde-polymorf isme . I én slik familie.: er begge foreldrene heterozygotisk for 23 kb og 19 kb-allelene slik det ble avslørt ved hjelp av enzymet Mspl (fig. 15A, feltene 1 og 2). Ettersom begge foreldrene er obligat heterozygoter for PKU-trekket, må hver inneholde et mutant fenylalaninhydroksylasegen som kan være forbundet med hvilket som helst av de to allelene. Probanden er homozygot for 19 kb-allelet (fig. 15A, felt 3), hvilket indikerer at mutant-genene hos begge foreldrene befinner seg i 19 kb-allelene. En upåvirket søsken i denne familien er homozygot for 23 kb-allelet (fig. 15A, felt 4), hvilket indikerer at denne personen har arvet begge ikke-fenylketonuri-gener fra foreldrene og bør derfor være fri for fenylketonuri-trekket. Et diagram som illustrerer Mandelian-segregeringen av de 2 allelene i denne familien, er også vist (fig. 15A). Disse resultatene indikerer at prenatal diagnose for klassisk fenylketonuri vil være mulig ved fremtidige svangerskap i denne familien ved analyse av DNA isolert fra amniotiske celler fra fostere ved å bruke Mspl-restriksjonsfragmentlengde-polymorfismeprøven. Et foster som er homozygotisk for 19 kb-allelet vil være fenylketonurisk, et som er heterozygotisk for 2 Mspl-allelene vil være en bærer av egenskapen og en som er homozygotisk for 23 kb-allelet vil være fri for PKU-egenskapen.

PKU-allelene kan også identifiseres ved hjelp av SphI og Hindlll-Polymorfisme i noen familier. Begge foreldrene er heterozygotisk for 9,7 og 7,0 kb-allelene i en slik familie, slik det er avslørt ved hjelp av SphI(fig. 15B, feltene 1 og 2). Probanden i denne familien er homozygotisk for 9,7 kb-allelet (fig. 15B, felt 3), mens en upåvirket søsken er homozygotisk for 7,0 kb-allelet og er derfor ikke en bærer av egenskapen (fig. 15B, felt 4). I en annen familie er begge foreldrenes DNA heterozygotisk for 4,2 kb og 4,0 kb-allelene etter spalting med enzymet Hindlll (fig. 15C, feltene 1 og 2). Probanden er homozygotisk for 4,0 kb-allelet (fig. 15C, felt 3). En upåvirket søsken i denne familien er heterozygotisk for de 2 allelene (fig. 15C, felt 4) og er følgelig en bærer av egenskapen. I begge disse familiene er det åpenbart at bærerpåvisning og prenatal diagnose vil være mulig ved hjelp av enkel restriksjonsfragmentlengde-polymorfismeanalyse av DNA fra fostere ved å bruke de respektive enzymene.

Eksempel 4

Tilstedeværelsen av 3 alleliske systemer slik det ble av-slørt ved hjelp av Hindlll-spalting av genom-DNA har gjort dette enzymet spesielt nyttig ved analyse av klassisk fenylketonuri.

I en av de danske familiene som ble analysert, var faren heterozygotisk for 4,4 kb og 4,2 kb-allelene (fig. 16A, felt 1), mens moren var heterozygotisk for 4,2 kb og 4,0 kb-allelene (fig. 16A, felt 2). Probanden i denne familien var heterozygotisk for 4,4 kb og 4,2 kb-allelene (fig. 4A, felt 3). Dette individet må ha arvet 4,4 kb-allelet fra faren og 4,2 kb-allelet fra moren som må være mutant-allelene. En upåvirket søsken i denne familien var heterozygotisk for 4,2 kb og 4,0 kb-allelene (fig. 16A, felt 4), som må ha arvet 4,0 allelet fra moren og 4,2 kb allelet fra faren. Ettersom begge foreldrene er obligat heterozygotiske for pKU-egenskapen, må disse to ellelene i begge foreldrene ikke være fenylketonuriske og søskenen må derfor være fri for PKU-egenskapen.

Eksempel 5

Det var 2 probander i én av de danske familiene. Denne familien er særlig viktig ved det at segregeringen av PKU-allelene i begge probandene må være overensstemmende dersom den genetiske sykdommen virkelig er forårsaket av en mutasjon i fenylalaninhydroksylase-genet selv, men ikke gjennom en trans-regulerende mekanisme. Hindlll-polymorfisme er blitt påvist i begge foreldrene som er heterozygotisk for 4,2 kb og 4,0 kb-allelene (fig. 16B, feltene 1 og 2). Én av probandene er homozygotisk for 4,2 kb-allelet (fig. 16B, felt 3), hvilket indikerer at PKU-genene i denne familien er forbundet med 4,2 kb-allelene. En anne proband er også homozygotisk for 4,2 kb-allelet (fig.

16B, felt 4). Ettersom sannsynligheten for. en tilfeldig fore-komst av identiske genotyper hos de to probandene bare er T av 4, indikerer resultatene at segregeringen av allelene og sykdoms-tilstanden i denne familien virkelig er sammenfallende. Denne fortolkningen styrkes ytterligere ved den observasjon at 2 ikke-påvirkede søsken i den samme familien har arvet forskjellige alleler fra foreldrene. En søsken var homozygotisk for 4,0 kb-allelene (fig. 16B, felt 5) som var fri for egenskapen, en annen søsken var heterozygot for 4,2 kb og 4,0 kb-allelen (fig. 16B, felt 6) som må være en bærer av egenskapen. Sammenfallende segre-gering mellom mutant-allelene og sykdomstilstand er blitt observert i en annen dansk PKU-familie med 2 probander. Sett i sam-menheng med den ikke-sammenfallende segregeringen av probanden og ikke-påvirkede søsken i alle de analyserte familiene, antyder dataene sterkt at klassisk fenylketonuri virkelig forårsakes av underliggende mutasjoner i selve fenylalaninhydroksylase-genet, og reaksjonsfragmentlengde-polymorfisme i fenylalaninhydroksylase-stedet avslørt ved hjelp av de humane fenylalaninhydroksy-

lase-cDNA-klonene virkelig kan brukes til prenatal diagnose og påvisning av bærer av klassisk PKU i visse familier.

Eksempel 6

Haplotype-identifisering av genetiske alleler hos mennesker er et svært virkningsfult redskap for analyse av genetiske sykdommer hos menneske. Utviklingen av denne teknologien ved analyse av forskjellige former for Thalmassemias er nylig blitt godt dokumentert. Anvendelsen av haplotype-analyse av fenylalaninhydroksylase-genet i én av de danske familiene er vist i fig. 17. I denne familien er, selv om begge foreldrene var heterozygotisk for 4,2 kb og 4,0 kb Hindlll-allelene (plate A, feltene M og F), også probanden heterozygotisk for de 2 allelene (plate A, felt P). Følgelig kan mutantgenene ikke forbindes med noen av allelene hos begge foreldrene ved hjelp av analysen alene. Sphl-spalting av foreldrenes DNA har imidlertid vist at moren var homozygotisk for 7,0 kb-allele, mens faren var heterozygotisk for 9,7 kb og 7,0 kb-allelene (plate A, feltene M og F). Ettersom probanden er homozygotisk for 7,0 kb-allele (plate A, felt P),

må farens PKU-gen være forbundet med 7,0 kb-allelet. Dette PKU-genet er blitt overført til én av de ikke-påvirkede søsknene som også var homozygotiske for 4,0 kb Hindlll-allelet (plate A, felt Sa), PKU-genet som han arvet fra faren må derfor ha en haplotype av H4,0/S7,0, hvor H og S representerer henholdsvis Hindlll og SphI..Haplotypen av farens ikke-PKU-gen må derfor være H4,2/S-9,7. Når først haplotypene av farens fenylalaninhydroksylase-gener er definert, kan morens gener lett utledes. Ettersom probanden er heterozygotisk for 4,2 kb og 4,0 kb Hindlll-allelene (Plate A, felt P), må hun ha arvet 4,2 kb Hindlll-allelet fra moren, som må være PKU-genet. Ettersom moren er homozygotisk for 7,0 kb Spkl-allelet, har hennes PKU-gen en haplotype H4,2/S-7,0 og hennes ikke-PKU-gen har en haplotype H4,0/S7,0. Når først haplotypene av alle 4 fenylalaninhydroksylase-genene i denne familien er fastslått, kan det i alt være fire mulige kombinasjoner av fenylalaninhydroksylase-genenes haplotyper i alle barne i denne familien, hvorav tre er representert i de tre eksisterende barn (fig. 17b). Det synes åpenbart at den andre ikke-påvirkede søsken var homozygotisk for 4,0 kb Hindlll-allelene og heterozygotisk for 9,7 kb og 7,0 kb Sphl-allelene (plate A, felt S1).

Dette individet har arvet ikke-PKU-genet av H4,2/S9,7-haplotypen fra faren og ikke-PKU-genet av H4,0/S7,O-haplotypen fra moren og var følgelig fri for PKU-egenskapen.

Eksempel 7

I en av familiene var begge foreldrene homozygoter når de ble analysert ved hjelp av Mspl og Sphl-polymorfisme. Analyse av denne familien med Hindlll har indikert at faren var heterozygotisk for 4,2 kb og 4,0 kb-allelene, moren var homozygotisk for 4,2 kb-allelet og probanden var også homozygotisk for 4,2 kb-allelet (data ikke vist). En upåvirket søsken var heterozygotisk for de to allelene og i dette tilfellet, kan man bestemme hvorvidt dette individet var en bærer av egenskapen eller var fri for PKU-egenskapen, ved hjelp av polymorfisme-analyse. Muligheten for at dette individet var av PKU-fenotypen kan imidlertid utelukkes på grunnlag av at farens ikke-PKU-gen er blitt overført til dette individet. Dersom på den annen side foster-DNA-en har en homozygotisk 4,2 kb genotype i et fremtidig svangerskap, kan man ikke bestemme hvorvidt fosteret vil være en bærer av egenskapen eller være et fenylketonurisk individ og utelukkelse kan ikke påvirkes av dette. Sannsynligheten for mulig utelukkelse av PKU-homozygoter i denne familien er 50%, noe som også vil være tilfelle for alle familier med en homozygotisk og en heterozygotisk foreldre.

Eksempel 8

Ettersom prenatal diagnose og heterozygot-påvisning ved hjelp av restriksjonsfragmentlengde-polymorfisme avhenger strengt av at minst én foreldre er en haplotype heterozygot, er det viktig å fastslå den prosentvise heterozygositet hos ethvert bestemt individ i den alminnelige befolkning. Ettersom det er 3 Hindlll-alleler, 2 Mspl-alleler og 2 Sphl-alleler, er det i alt 12 teoretiske genotype-alleler av det humane fenylalaninhydroksylase-genet ved den foreliggende analyse, hvert med en karakteristisk haplotype (tabell 1). Frekvensen for hver av haplotypene vil være produktet av de individuelle allaliske frekvensene slik de av-sløres ved hjelp av de 3 restriksjonsenzymene. Sannsynligheten for at et individ er homozygotisk for ett av haplotypene vil være kvadratet av haplotype-frekvensen, og summen av kvadratet av alle 12 haplotype-frekvensene vil utgjøre frekvensen av homozygotiske individer i.befolkningen. Resten av individene må være heterozygotiske for 2 av haplotypene, og prosent heterozygositet skulle være prosenten homozygositet trukket fra 100% og er i dette tilfellet 75% (tabell 1).

Eksempel 9

I den alminnelige befolkning er sannsynlighetene for at parring skalskje mellom 2 heterozygoter, 2 homozygoter og mellom en heterozygot og en homozygot styrt av kvadratet med to ledd (75% + 25%) 2, hvor 75% og 25% er henholdsvis prosent heterozygositet og prosent homozygositet. Følgelig vil sannsynligheten for at 2 heterozygoter parrer seg være (75%) 2eller 56,25%. Dersom haplotypene av PKU-genene hos foreldrene kan identifiseres ved sammenligning med probandens haplotyper, kan i disse tilfellene fullstendig prenatal diagnose forventes ved analyse av foster-DNA gjennom amniocentese. I det tilfellet at svangerskapet har resultert fra parring mellom 2 homozygoter (6,25%), kan det ikke skje noen diagnose og amniocentese bør åpenbart ikke utføres. Dersom en heterozygot parrer seg med en homozygot, kan bare 50% av det resulterende avkom utelukkes fra å ha PKU-fenotyper. Ettersom dette parringstilfellet har en sannsynlighet på 37,5%, vil den totale sannsynlighet for å kunne ekskludere recessive homozygoter være 18,75% (tabell 2).

En klonet rotte-fenylalaninhycroksylase-cDNA-klon har således blitt brukt til å identifisere de tilsvarende humane cDNA-klonene i en samling av human lever-cDNA ved hjelp av kryss-hybridisering. De humane fenylalaninhydroksylase-cDNA-klonene er blitt anvendt som en hybridiseringssonde for å analysere klassisk fenylketonuri. Det er oppnådd avgjørende bevis som på-viser tilstedeværelsen av fenylalaninhydroksylase-genet i cellulær DNA hos PKU-fenotypen, noe som tyder på at klassisk fenylketonuri ikke er forårsaket av en utsletting av hele fenylalaninhydroksylase-genet.

Ettersom den opprinnelige observasjon av Kan og Dozy (1978, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 75, 5631) at det foreligger en Hpal-restriksjonssete-polymorfisme i det 3'-tilgrensende område i det humane 3-globin-genet som er forbundet med og kan brukes til diagnose av sigdcelle-anemi, har restriksjonsfragmentlengde-polymorfisme utviklet seg til et svært virkningsfult redskap for å analysere genetiske sykdommer hos menneske. Det er nå blitt fastslått at det er mer enn 10 enzymer som vil gi polymorfe former fra 60 kb humant 3-globin-stedet, og anvendelsen av disse enzym-polymorfismene for prenatal diagnose av forskjellige slag av 3°- og 0+-thalassemi ved koplings-analyse er blitt godt dokumentert. Ved å bruke klonet human-fenylalaninhydroksylase-cDNA-sonde er 3 restriksjonsenzymer blitt identifisert som gir polymorfe former fra fenylalaninhydroksylase-stedet, resulterende i i alt 12 teoretiske haplotyper av genet. Basert på en heller liten prøve-størrelse (20 tilfeldige individer) og uten å ta i betraktning muligheten for bindings-ulikevekt mellom disse polymorfe stedene, er det blitt beregnet at den prosentvise heterozygositet i den alminnelige befolkning av hvite individer er 75%. Dette høye nivået av heterozygositet ville tyde på at prenatal diagnose kan utføres hos 56,25% av de tilfeldige PKU-familiene og utelukkelse av recessive homozygoter kan oppnås hos ytterligere 18,75% av familiene. Disse sannsynlighetene er imidlertid optimale estimater ved det at haplotypene for alle 4 fenylalaninhydroksylase-genene i en bestemt familie ikke behøver å være identifiserbare ved sammenligning med probanden alene.

Et typisk eksempel er gitt ved familien vist i fig. 4. Uten tilgjengeligheten av den informative søsken S2, ville ikke fullstendig diagnose vært mulig. Den virkelige sannsynlighet for diagnose og utelukkelse ville følgelig avhenge også av tilgjengeligheten av ytterligere søsken eller besteforeldre for å fastslå fase for haplotypene av genet. Følgelig kan det undet ideel-le betingelser gis genetisk service for opptil i alt 75% av de tilfeldige PKU-familiene i den alminnelige befolkning av hvite individer. Disse tallene kan imidlertid i fremtiden bare for-bedres ved identifikasjon av ytterligere alleler ved hjelp av restriksjonspolymorfisme når mer DNA i det humane fenylalaninhydroksylase-genet blir klonet og brukt som hybridiseringssonde.

Foreliggende oppfinnelse er derfor velegnet og tilpasset for å oppnå formålene og resultatene, og har de nevnte fordeler så vel som andre iboende fordeler.

Claims (15)

1. Fremgangsmåte for å syntetisere cDNA-kloner fra fenylalaninhydroksylase-mRNA fra levervev, karakterisert v e d å isolere og rense fenylalaninhydroksylase fra levervevet, oppnå og isolere antistoffer mot den rensede fenylalaninhydroksylase, tilveiebringe polysomanriket fenylalaninhydroksylase-mRNA ved hjelp av immunoutfelling av leverpolysomer under anvendelse av antistoffene, og enzymatisk syntetisere rekombinante cDNA-kloner fra den polysomanrikede fenylalaninhydroksylase-mRNA.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at levervevet er humant levervev.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at levervevet er dyre-levervev.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1 , karakterisert ved at levervevet er rottelevervev.

5. Fenylalaninhydroksylase-cDNA-klon.

6. Human fenylalaninhydroksylase-cDNA-klon.

7. Dyre-fenylalaninhydroksylase-cDNA-klon.

8. Rottelever-fenylalaninhydroksylase-cDNA-klon.

9. En merket fenylalaninhydroksylase-cDNA-klon.

10. En merket human fenylalaninhydroksylase-cDNA-klon.

11. En merket dyre-fenylalaninhydroksylase-cDNA-klon.

12. En merket rotte-fenylalaninhydroksylase-cDNA-klon.

13. Fremgangsmåte fer å diagnostisere fenylketonuri prenatalt, karakterisert ved gen-kartlegging under anvendelse av humane fenylalaninhydroksylase-cDNA-kloner som sonder.

14. Fremgangsmåte for å diagnostisere fenylketonuri prenatalt, karakterisert ved å spalte foster-DNA med enzymer, spalte tilgjengelige foreldres DNA med enzymene, spalte DNA fra tilgjengelige ikke-påvirkede søsken med enzymene, spalte DNA fra tilgjengelige tidligere påvirkede søsken med enzymene, og sammenligne polymorfismen av de spaltede DNA-er.

15. Fremgangsmåte for å konstruere en samling med human cDNA hvorfra human fenylalaninhydroksylase-cDNA-kloner kan identifiseres og isoleres ved å bruke en tilsvarende dyre-fenylalaninhydroksylase-cDNA-klon ved hjelp av kryss-hybridisering, karakterisert ved å syntetisere cDNA-kloner fra den komplette human lever-mRNA, innføre den syntetiserte cDNA-klon i plasmid-DNA, innføre den resulterende rekombinante plasmid-DNA i en passende bakterie for å konstruere samlingen av human lever-cDNA, hybridisere merkede dyre-cDNA-kloner med kloner fra samlingen av human lever-cDNA, og bestemme positive signaler.