PT779367E

PT779367E - Dispositivo de teste compreendendo um corante de acoplamento estavel para a determinacao fotometrica de analitos

Info

Publication number: PT779367E
Application number: PT96309124T
Authority: PT
Inventors: Yeung S Yu
Original assignee: Lifescan Inc
Priority date: 1995-12-15
Filing date: 1996-12-13
Publication date: 2002-02-28
Also published as: CN1113104C; AU7406896A; CA2192744C; KR100433601B1; AU723150B2; DK0779367T3; EP0779367A1; ATE207542T1; US5922530A; TW508436B; NO965369D0; JPH09184839A; DE69616243D1; CN1162739A; DE69616243T2; NO323420B1; MX9606509A; ES2166429T3; CA2192744A1; NO965369L

Description

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DESCRIÇÃO "DISPOSITIVO DE TESTE COMPREENDENDO UM CORANTE DE ACOPLAMENTO ESTÁVEL PARA A DETERMINAÇÃO FOTOMÉTRICA DE ANALITOS"

ÁREA TÉCNICA A presente invenção relaciona-se com um dispositivo e método de teste para a determinação colorimétrica de componentes químicos o bioquímicos (analitos) csm fluidos aquosos, tais como sangue inteiro, e, mais particularmente, com um corante de acoplamento para utilização nesse dispositivo e nesse método.

ESTADO DA TÉCNICA A quantificação de componentes químicos e bioquímicos em fluidos aquoso corados, em particular, fluidos biológicos corados tais como sangue inteiro e urina e derivados de fluidos biológicos tais como soro e plasma, tem importância crescente. Existem aplicações importantes em diagnóstico e tratamento médico e na quantificação da exposição a fármacos terapêuticos, intoxicantes, produtos químicos perigosos, e outros semelhantes. Nalguns casos, as quantidades de materiais a determinar ou são tão ínfimas - na gama de um miligrana ou menos por decilitro -ou tão difíceis de determinar com exactidão que o aparelho utilizado é complexo e útil só para os técnicos de laboratório especializados. Neste caso, os resultados geralmente não estão disponíveis senão algumas horas ou dias após a amostragem. Noutros casos, a ênfase é colocada na aptidão de operadores leigos para realizar o ensaio em rotina, rapidamente, e com reprodutibilidade fora de um ambiente laboratorial com apresentação da informação de forma rápida ou imediata. 1

Λ

Um teste médico comum é a medição de níveis de glucose no sangue de diabéticos. Os ensinamentos correntes aconselham os doentes diabéticos a medir o seu nível de glucose no sangue desde duas até sete vezes por dia, dependendo da natureza e da gravidade dos seus casos particulares. Com base no esquem observado de> níveis de glucose determinados, o doente e o médico em conjunto fazem ajustes na dieta, exercício, e administração de insulina para gerir melhor a doença. Claramente, esta informação deve estar imediatamente disponível para o doente. São conhecidos na arte muitos métodos de teste de glucose no sangue e artigos de teste; todos eles sofrem de uma variedade de limitações. Um grande melhoramento está descrito e reivindicado nas Patentes U.S. 4.935.346, 5.049.487, 5.059.394 e 5.17 9.005 por R. Phillips et al. e concedidas ao mesmo requerente que o do presente pedido. 0 método descrito e reivindicado nestas patentes envolve a obtenção de uma leitura de reflectância de uma superfície numa matriz inerte porosa impregnada com um reagente que interactuará com o analito para produzir um produto de reacção que absorve radiação quando o fluido a ser analisado é aplicado noutra superfície migra através da matriz até à superfície a ser lida. O reagente inclui glucose oxidase, uma enzima que consome glucose na amostra para produzir peróxido de hidrogénio quem na presença de outra enzima, peroxidase de rábano, oxida um corante de acoplamento compreendendo cloridrato de hidrazona de 3-metil-2-benzotiazolinona (MBTH) e ácido 3-dimetilaminobenzóico (DMAB) para dar um corante azul. As determinações de reflectância são então realizadas a dois comprimentos de onda separados. A concentração de glucose no sangue é determinada com base na intensidade da cor do corante com o auxílio de um espectrofotómetro LED.

No US-A-5 453 360 é descrito um corante de acoplamento compreendendo hidrazona de 3-metil-2-benzotiazolinona na forma 2 \ 7 \ \

/ livre (ΜΒΤΗ) e 8-anilino-l-naftalenossulfonato (ANS), na forma de ácido ou de sal para ser utilizado em vez do corante de acoplamento MBTH-DMAB tal como descrito acima. 0 corante de acoplamento ΜΒΤΗ-ANS é menos solúvel por oxidação e, assim, proporciona um ponto final mais estável, com desvanecimento mínimo do corante, em comparação com o corante de acoplamento MBTH-DMAB oxidado.

Embora estes sistemas do estado da técnica tenham sido efectivamente utilizados para produzir dispositivos de teste úteis para a determinação da presença ou quantidade de glucose, foram observados vários inconvenientes. Os dispositivos de teste em que são utilizados esses corantes de acoplamento são concebidos tanto para utilização doméstica como para utilização profissional e como tal são comercializados pelos fabricantes e distribuidores na expectativa de que se mantenham no inventário do utilizador durante um periodo de tempo substancial e têm, é claro, de permanecer eficazes ao longo deste período de tempo. Esta necessidade de um tempo de armazenagem substancial tem provocado dificuldades na formulação de produtos utilizando MBTH como um dos componentes do corante de acoplamento.

Primeiramente, verificou-se que a estabilidade do MBTH decresce com o aumento da temperatura e da alcalinidade. A forma de ácido livre do MBTH é muito lábil e tende a sublimar-se. Numa tentativa para contrariar isto, uma forma preferida é o hidrato ácido de MBTH e.g., cloridrato de hidrazone de 3-metil-2-benzotiazolinona. Infelizmente, este hidrato é ele próprio instável por aumento de temperatura e por aquecimento dissocia-se rapidamente em MBTH ácido livre e HC1. Para além de ter estabilidade baixa a pH elevado, com alcalinidades crescente reduz-se multo a eficácia do MBTH para reagir oxidativamente com o seu parceiro de forma que a pH elevado é produzida essencialmente nenhuma ou pouca cor no corante de acoplamento. 3 Γ·ν I ' /

Devido a estas relações, na prática o MBTH tem de ser utilizado em grandes excessos e a pH baixo para minimizar os efeitos de instabilidade e ineficácia. Idealmente, um pH abaixo de 2,0 seria preferido do ponto de vista de uma sublimação baixa e eficácia elevada do composto. Infelizmente, para os sistemas aqui considerados esse pH baixo ideal não pode ser utilizado. Tal como descrito acima, os sistemas de reagentes utilizados dependem das enzimas que actuam sobre o analito substrato e produzem agentes de oxidação em quantidades indicativas das quantidades do analito presente na amostra a ser testada. O pH baixo, que seria ideal em relação ao reagente MBTH, é totalmente desadequado para enzimas tais como, por exemplo, glucose oxidase e peroxidase de rábano. A esses pHs baicos muitas das enzimas disponíveis comercialmente têm pouca ou nenhuma actividade. Em conformidade, a arte foi forçada a compreender e seleccionar um pH moderado e.g., 4, e um grande excesso de reagentes para assurar eficácia dos seus dispositivos de teste para o tempo de armazenagem requerido.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

De acordo com os ensinamentos desta invenção, é proporcionado um componente altamente estável de um corante de acoplamento num dispositivo de teste contendo enzimas. O componente, em contraste com os utilizados no dispositivos do estado da técnica, é capaz de um acoplamento oxidativo eficaz com uma grande variedade de parceiros de acoplamento nas condições de pH relativamente elevado compatíveis com uma eficácia enzimática elevada. Especificamente, o composto corante de acoplamento desta invenção destina-se a ser utilizado num dispositivo de teste contendo um sistema de reagentes para a detecção da presença ou quantidade de um analito numa amostra em que o sistema de reagentes compreende uma ou mais enzimas que, na presença do analito, produzem um agente oxidante em quantidades indicativas da quantidade do analito na amostra. De acordo com os presentes ensinamentos, o sistema de reagentes 4

compreende adicionalmente um dye couple capaz de formar um cromóforo por oxidação pelo agente oxidante produzido; o corante de acoplamento compreende o composto:

em que Y é seleccionado do grupo que consiste em N02, SC>3“, halogéneo, alquilo ou S1Z3 em que Z é alquilo ou arilo, e R é:

R4 R3 em que quaisquer de Ri, R2, R3, e R4 são independentemente seleccionados do grupo que consiste em H, alquilo, arilo, sililo, halogéneo, hidroxilo, mercapto, alcoxi, tioalcoxi, amino, sulfonato ou carboxilato; e X é seleccionado do grupo que consiste em amino, sulfonato ou carboxilato. Numa forma de realização especifica, é proporcionado um dispositivo de teste para determinar a presença ou a quantidade de analitostais como glucose, colesterol, álcool, ácido úrico, formaldeído ou glicerol-3-fosfato, todos eles analitos correntemente determinados no sangue. Nesses casos, o sistema enzimático compreenderá enzimas seleccionadas do grupo que consiste em glucose oxidase, colesterol oxidase, álcool oxidase, uricase, aldeido oxidase, e glicerofosfato oxidase; conjuntamente com peroxidase de rábano ou um complexo inorgânico que tem actividade semelhante a peroxidase; e.g., hematina, hemina e tetraquis[sulfofenil]porfirino manganês. Ά peroxidase de eleição é peroxidase de rábano. 5

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Fig. 1 é uma vista em perspectiva de uma forma de realização de um dispositivo de teste contendo uma camada reaccional na qual é aplicada a amostra liquida a ser analisada; e a Figura 2 é uma vista em perspectiva de uma segunda forma de realização da utilização do dispositivo de teste da Fig.l.

DISCUSSÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO

Tal como descrito acima, a invenção envolve um composto corante de acoplamento melhorado para utilização num dispositivo de teste para a determinação da presença ou quantidade de um analito numa amostra líquida. Com referência à Fig. 1., numa forma de realização preferida desta invenção, o dispositivo de teste compreende uma matriz porosa 10 que tem incorporado um sistema de reagentes químicos e que é aderente a um suporte 12. É proporcionada uma abertura 16 através di suporte através da qual uma amostra líquida pode ser aplicaca na superfície receptora da amostra da matriz 10. O sistema químico é proporcionado para reagir com qualquer analito presente na amostra líquida e resulta em ter uma superfície de teste da matriz que manifesta propriedades de relectância de radiação indicativas da quantidade de analito presente na amostra líquida. A superfície de teste pode ser lida a olho nú, mas preferencialmente é lida por utilização de um dispositivo espectrofotoanalisador da matriz. Os elementos desse dispositivo estão liustrados esquematicamente na Figura 1 e compreendem uma fonte de radiação 18 tal como um díodo emissor de radiação para dirigir prcfcrcncialmcnte uma radiação de comprimento de onda uniforme para a superfície de teste. É proporcionado adicionalmente um detector de radiação 20 para a detecção da radiação reflectida sa superfície e produção de um sinal 22 indicativo da quantidade de radiação detectada, sinal esse que 6

\e—'

V / pode ser processado por, por exemplo, um microprocessador incorporado no aparelho de leitura para calcular a quantidade de analito na amostra.

Sistemas tais como o descrito acima são conhecidos na arte e estão bem descritos nas Patentes U.S. 4.935.346; 5.049.4S7; 5.059.394; e 5.179.005. Esses sistemas contemplam que estes dispositivos serão inseridos num aparelho de leitura e depois a amostra, e.g., sangue, será aplicada na superfície receptora da amostra. A Figura 2 representa uma alternativa a isto, em que o sangue é primeiramente aplicado na superfície receptora da amostra e só depois é que a superfície de teste é apresentada ao aparelho para leitura. Em todos os outros aspectos, os elementos numerados na Figura 2 são idênticos aos da Figura 1.

As propriedades de reflectância da superfície de teste variam com a quantidade de analito na amostra por operação de uma série de reacções químicas entre o analito na amostra líquida e os reagentes químicos presentes na matriz porosa. Em particular, a matriz inclui uma ou mais enzimas que, conjuntamente com o analito-substituto, resulta na produção de peróxido de hidrogénio ou de outros agentes oxidantes fortes. Na matriz está incluído um corante de acoplamento; i.e., dois compostos que são capazes de ser oxidados para formar um cromóforo que absorve radiação a comprimentos de onda específicos proporcionalmente à quantidade de cromóforo presente. O agente oxidante formado pela reacção catalisada pela enzima reage então com a amostra de corante para produzir o cromóforo. A escolha de enzimas, o agente oxidante resultante e a escolha de corante de acoplamento variam largamente na arte, e são, em grande medida, uma função de qual o analito que está a ser determinado. Por exemplo, no cado da determinação de colesterol numa amostra como o sangue, pode utilizar-se uma enzima oxidase tal como colesterol oxidase. Analogamente, na 7

determinação de metanol ou etanol pode utilizar-se álcool oxidase; nas determinações de formaldeido pode utilizar-se aldeído oxidase; ou nas determinações de glicerol-3-fosfato pode utilizar-se glicerilf os fato oxidase. 0 produto peróxido de hidrogénio destas reacção catalisadas por enzimas pode ser adicional mente modificado por uma reacção subsequente catalisada por enzima para produzir um agente oxidante activo para reacção com o corante de acoplamento para formar cromóforos. Assim, por exemplo, a reacção de peróxido de hidrogénio para formar um regante oxidante activo pode ser catalisada pela enzima peroxidase de rábano.

Em conformidade, embora se entenda que os ensinamentos desta invenção têm aplicação alargada, para efeitos da discussão seguinte, o analito será exemplificado por glucose numa amostra liquida de sangue inteiro. O sistema químico preferido será então exemplificado pela enzima glucose oxidase que actua sobre o substrato glucose para formar peróxido de hidrogénio. 0 peróxido de hidrogénio, por sua vez, é convertido em reagente oxidante activo pela reacção com outra enzima, peroxidase de rábano.

Até agora, o corante de acoplamento largamente utilizado num teste diagnóstico para glucose do tipo descrito acima era a combinação de hidrazona de 3-metil-3-benzotiazolinona, hidrato cloridrato (hidrato de cloridrato de MBTH) (Fórmula I) conjuntamente com dietilamino benzeno (Fórmula II). Estes compostos sofem a seguinte reacção de oxidação para formar um cromóforo de cor azul (Fórmula III): 8 \

/

(III) [Ο] - peróxido de hidrogénio/peroxidase de rábano

Tal como descrito acima, este sistema sofre de graves inconvenientes, o MBTH, mesmo na forma de hidrato do cloridrato é relativamente instável em condições muito ácidas; e.g., pH de 2 ou menos, intelizmente, nestas condições, as enzimas utilizadas nos dispositivos de teste e.g., glucose oxidase e peroxidase de rábano, têm pouca ou nenhuma actividade. Em conformidade, a prática comercial determinou que de forma a obter um sistema relativamente estável, utiliza-se um pH óptimo; e.g.. cerca de 4, e utiliza-se grandes quantidades de ambas as enzimas e do corante de acoplamento para compensar a actividade diminuída das enzimas a eficácia reduzida da oxidação da reacção de acoplamento.

De acordo com esta invenção, verificou-se agora que podem ser proporcionadas formas modificadas de MBTH que ultrapassam o problema de estabilidade encontrado anteriormente e além disso são eficazmente reactivas num ambiente mais favorável à actividades das enzimas utilizadas nos dispositivos de teste aqui contemplados, e.g., a valores de pH na gama desde cerca de 4 até cerca de 7. Além disso, verificou-se que certos derivados preferidos são altamente reactivos com os parceiros de 9 Λ r -λ.· acoplamento desejáveis aminas aromáticas. Os derivados da invenção têm a estrutura geral indicada na Fórmula IV, adiante: CH-

em que Y é seleccionado do grupo que consiste em NO2, SO3", tialogéneo, alquilo ou S1Z3 em que Z é alquilo ou arilo, e R é:

em que quaisquer de Ri, R2, R3, e R4 são independentemente seleccionados do grupo que consiste em H, alquilo, arilo, sililo, halogéneo, hidroxilo, mercapto, alcoxi, tioalcoxi, amino, sulfonato ou carboxilato; e X é seleccionado do grupo que consiste em amino, sulfonato ou carboxilato.

Os derivados de MBTH desta invenção podem sofrer uma reacção oxidativa com uma larga variedade de parceiros de corante de acoplamento tais como aminas aromáticas, fenóis, e fenóis substituídos. Além disso, essas reacções podem decorrer eficientemente à temperatura ambiente e a pHs que podem variar desde 4 até 11. Na forma preferida do derivado desta invenção, a reacção de oxidação é óptima a pH desde cerca de 4 até cerca de 7 e, assim, é particularmente útil em conjunção com os parceiros amina do corante de acoplamento de interesse em química de diagnóstico tais como ácido 3-dimetilaminobenzóico e 8-anilino-1 -naf talenos sul f onato. 10

Ao contrário do MBTH, tanto na forma de ácido livre como de ácido hidratada, estes derivados são notavelmente estáveis mesmo quando aquecidos a 100°C durante tanto tempo como 16 horas. Além disso, nas condições da reacção de oxidação, as enzimas catalisadoras de peróxido, tais como peroxidase de rábano, são especialmente eficazes na realização da reacção de acoplamento por oxidação.

Exemplo 1 - Síntese do Derivado de MBTH

Sintese de meta [3-metil 2-benzotiazolinona hidrazona] N-sulfonil benzenossulfonato monossódico, [2]

Esquema Sintético

11

V

Materiais

Cloridrato de hidrazona de 3-metil 2-benzotiazolinona (MBTH.HC1), Nal, hidróxido de tetrabutilamónio, cloreto de metileno e N-metil-2-pirrolidona foram adquiridos a Aldrich company de Mil.waukee, Wisconsin e utilizados sem purificação adicional. A trietilamina foi obtida de Baker Chemicals e distribuída por Baxter Company de Phillipsburg, New Jersey. 0 cloreto de benzeno-1,3-dissulfonilo foi adquirido a Fluka Chemicals de Ronkonkoma, New York ou Lancaster Chemicals de Windham, New Hampshire. Síntese de [1]

Carregou-se uma amostra de 4 g de MBTH.HC1 num frasco Erlenmeyer de 150 mL equipado com uma barra de agitação magnética, e adicionou-se 50 mL de N-metil-2-pirrolidona e 5 mL de trietilamina. 0 frasco foi tapado com um septo de borracha e colocado numa placa de aquecimento com agitação magnética. A mistura foi aquecida a 60-70eC enquanto se agitava vigorosamente durante 0,5 h, dando uma suspensão amarela. 0 frasco foi colocado num banho de gelo para arrefecer.

Adicionou-se uma amostra de 5 g de cloreto de benzeno-1,3-dissulfonilo a um frasco Erlenmeyer de 250 mL equipado com uma barra de agitação magnética. Desceu-se o frasco para um banho de gelo, e adicionou-se 20 mL de N-metil-2-pirrolidona. A mistura foi agitada até todo o sólido estar dissolvido (ca. 15 min). A suspensão de MBTH base livre, que foi obtida anteriormente, foi decantada para a solução. Deixou-se a mistura amarela clara resultante reagir à temperatura de um banho de gelo durante 1,5 h. Após esse tempo, a reacção foi desactivada com 10 mL de HC1 2 N, e foi agitada durante mais 30 min à temperatura ambiente. Introduziu-se na solução 50 mg de Norti® de 12 mesh (pastilhas de carvão activado), obtendo-se uma solução amarela clara após 10 min de agitação. Filtrou-se então através de uma frita de 12 ο-, \ grau fino com a ajuda de um aspirador. Obteve-se uma solução uniforme amarela a castanha clara. Adicionou-se 300 mL de HCl 2 N à solução amarela com agitação, resultando na precipitação de um pó esbranquiçado. O sólido foi recolhido por filtração sob vácuo e o produto foi lavado 3 vezes com 25 mL de água dceionizada. Por secagem a 110°C sob vácuo durante 2 h obteve-se 5,6 g do produto esbranquiçado. O produto foi analisado por RMN e HPLC e tinha pureza de 97%. O composto [1] não é muito solúvel na maior parte dos solventes orgânicos comuns e em água. É, contudo, solúvel em solução básica e em solventes polares, tais como DMSO, NMP e DMF. Síntese de [2]

Suspendeu-se uma amostra de 2,0 g de [1] em bruto em 50 mL de cloreto de metileno. Adicionou-se lentamente 4 ml de hidróxido de tetrabutilamónio 1 M, ao longo de 2 min, à suspensão com agitação; para dar uma solução amarela clara. A solução foi lavada com 10 mL de água desionizada e seca sobre sulfato de sódio anidro. 0 sulfato foi removido por filtração por gravidade, e a mistura resultante foi evaporada até à secura num evaporador rotativo. Recolheu-se um óleo amarelo espesso. 0 óleo foi retomado em 125 mL de acetona, e adicionou-se 10 mL de Nal a 2 0% em acetona ao longo de 5 min. Observou-se um precipitado branco. Deixou-se a mistura reagir durante mais 20 min, e o precipitado foi recolhido por filtração sob vácuo com uma frita de grau fino. 0 sólido esbranquiçado resultante foi lavado 3 vezes com 20 mL de acetona. Por secagem a 110eC durante 45 min, obteve-se 1,3 g (65%) do produto desejado. 0 composto [2] é muito solúvel em água e numa mistura de água-álcool. 0 sólido é estável ao ar e à luz, mas a sua solução decompõe-se lentamente para dar uma mistura turva amarela clara quando exposta à luz durante um periodo de tempo prolongado. 13 \ \

EXEMPLO 2

Preparação de um Dispositivo de Teste

Submerge-se uma tira de membrana polimérica (matriz de reacção) na solução aquosa da Tabela 1 até ficar saturada. Retira-se da solução e espreme-se o excesso de reagente com uma vareta de vidro. Pendura-se então a tira dentro de uma estufa com circulação de ar forçado a 56°C durante cerca de 5-10 minutos para secar, periodo após o auql a tira é retirada e mergulhada na solução orgânica descrita na Tabela 1 até ficar saturada. Mais uma vez, a tira é então seca como no passo anterior. A tira resultante é então cortada no formato desejado para o ensaio.

Tabela 1 - Formulação de Reagentes

Solução Aquosa (Ajustar o pH para 4,25 com NaOH) Solução Orgânica Áqua 20 mL Áqua 3 mL Ácido cítrico 420 mq Álcool desnaturado 7 mL Ácido etileno diamina tetraacético (EDTA) 16,7 mg Meta[3-metil 2-benzotiazolinona hidrazona] N-sulfonil benzenos sulfonato de sódio 10-60 mg Gantrez" S95 (disponível de GAF, Nova Iorque, Nova Iorque) 90 mg ANS ΙΟΙ 00 mg Crotein™ SPA (disponível de Croda Co., Nova Iorque, Nova Iorque) 250 mg Glucose oxidase 20.500 unidades Peroxidase de rábano 16.200 unidades 14 EXEMPLO 3 - Determinação de Glucose

Aplica-se uma amostra de sangue contendo glucose na superfície da tira impregnada com os reagentes. A amostra é imediatamente absorvida pela matriz e observa-se uma cor azul. A intensidade da cor aumenta com o tempo e é proporcional à concentração do analito. Com base na intensidade da cor, determina-se a concentração de glucose com uma curva de calibração padrão.

Analogamente, uma solução aguosa de peróxido de hidrogénio (peróxidos orgânicos, férrico e quinona) também produz a cor azul desejada na tira impregnada com reagentes. A concentração do analito pode ser determinada pelo mesmo processo que o referido acima.

Lisboa, 25 de Outubro de 2001

E OFICIAL DA PROPRIEDADE iNDUSTRíAL Λ

L 15

Claims

/ REIVINDICAÇÕES Dispositivo de teste contendo um sistema de reagentes para a determinação da presença ou quantidade de um analito numa amostra do tipo em que o referido sistema de reagentes compreende enzimas para produzir um agente oxidante em quantidades indicativas das quantidades do referido analito na referida amostra; e um corante de acoplamento que forma um cromóforo por oxidação pelo referido agente oxidante, caracterizado por o referido corante de acoplamento compreender um composto de fórmula:

em que Y é NO2, SO3”, halogéneo, alquilo ou S1Z3 em que Z é alquilo ou arilo, e R é:

V em que quaisquer de Ri, R2, R3, e R4 são independentemente H, alquilo, arilo, sililo, halogéneo, hidroxilo, mercapto, alcoxi, tioalcoxi, amino, sulfonato ou carboxilato; e X é seleccionado do grupo que consiste em amino, sulfonato ou carboxilato. Dispositivo de teste de acordo com a reivindicação 1 em que as referidas enzimas são glucose oxidase, colesterol 1 * » oxidase, álcool oxidase, uricase, aldeído oxidase, ou glicerofosfato oxidase.
3. Dispositivo de teste de acordo com a reivindicação 2 em que as referidas enzimas compreendem adicionalmente peroxidase ou um complexo inorgânico com propridades semelhantes a peroxidase. 4

5 Dispositivo de teste de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3 em que as referidas enzimas compreendem glucose oxidase e peroxidase de rábano. Dispositivo de teste de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4 em que o referido corante de acoplamento compreende adicionalmente ácido 3-dimetilaminobenzóico.
6. Dispositivo de teste de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4 em que o referido corante de acoplamento compreende adicionalmente 8-anilino-l-naftalenossulfonato. Lisboa, 25 de Outubro de 2001

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