PT754754E - Gene das proteinas de ligacao fk506 - Google Patents

Description

Descrição “Gene das proteínas de ligação FK506”

CAMPO TÉCNICO A presente invenção diz respeito a um gene das proteínas de ligação FK506

ANTECEDENTES DA TÉCNICA A proteína FK506 é um poderoso imunossupressor e tal como a ciclosporina A [Borel, J.G. et ai, Agcnts and Actions, 6, 468-471 (1976)] é utilizado frequentemente para evitar a rejeição de aloenxertos [Thomson, A. W., Immunol. Today, 10, 6-9 (1989)]. Considera-se que o mecanismo da sua acção imunossupressora é o centro de interesse na supressão da tradução, durante a activação das células T [Tocci, M. et al., J. Immunol., 143, 718-726 (1989)] de um conjunto de genes de linfoquinas, o qual é crítico para as respostas imunitárias que ocorrem em primeiro lugar (antecipativas). No entanto, ainda não está esclarecido o mecanismo exacto.

Recentemente, descobriu-se uma proteína de ligação à AF506 nas células T humanas. Foi identificada como sendo o receptor citossólico de 15 kDa da FK506 e demonstrou-se que possui actividade de peptidilpropil-cis-trans-isomerase (actividade de PPIase) [Sieker, J. et ai, J. Immunol., 143, 1580-1583 (1989)].

Postenormente, com base na sua sequência de aminoácidos, efectuou-se o isolamento de diversas proteínas de ligação FK506 (PLFK, em inglês FKBP) e dos correspondentes clones de ADNc, tendo sido determinadas as sequências de nucleótidos dos referidos clones [por exemplo, a PLFK humana, tal como a P-12LFK (em inglês FKBP-12) (Standaert, R.F. et al, Nature, 346. 671-674 (1990); Maki, N. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82, 5440-5443 (1990)), a P-13LFK (Jin, Y. et ai, Proc. Naíl. Acad. Sei. USA, 88, 6677-6681 (1991)), a P-25LFK (Wiederrecht, G. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 185, 1298-303 (1992)) e a P-52LFK (Peaítie, D.A. et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89, 10974-10978 (1992)),a PLFK dos murinos (Nelson, P.A. et al., Gene, 109. 255-258 (1991)), a PLFK dos bovinos (Mozier, N.M. et al., Eur. J. Biochem., 194. 19-23 (1990)), a PLFK das leveduras (Heitman, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 87, 1948-1952 (1991)), a PLFK de Neurospora crassa (Tropschug, M. et al., Nature, 346. 674-677 (1990)) e a PLFK de Neisseria meningitis (Sampson, B.A. et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89, 1164-1168 (1992)), etc.]. O documento W095/21861 descreve uma proteína de ligação citossólica FK506, isolada a partir do citossol de tecidos de mamíferos.

Todas as PLFK anteriormente referidas têm actividade de PPIase que é presumivelmente essencial para o dobramento das proteínas durante a síntese de proteínas nas células [Ficher, G. et al, Biomed. Biochim. Acta, 43,1101-1111 (1984)].

Embora não haja provas concludentes que demonstrem que a referida actividade de PPIase é necessária para a activação das células T, presume-se que a ligação de FK506 às PLFK seja a responsável pela inibição da actividade de PPIase e que consequentemente inactive as células T [Tropschug, M. et al., Nature, 346.674-677 (1990)].

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

De forma adequada, constitui um objecto da presente invenção proporcionar um novo gene das proteínas de ligação FK506 (PLFK, em inglês FKBP) e mais particularmente um novo gene de PLFK que seja muitíssimo homólogo com a P-12LFK humana supramencionada e cuja proteína de produto de expressão tenha uma elevada actividade de PPIase.

Como resultado das suas investigações exaustivas, os inventores da presente invenção conseguiram isolar com sucesso, a partir de um banco de ADNc de cérebro de feto humano, um gene novo que codifica uma proteína muitíssimo homóloga com a proteína de 12 kDa humana de ligação de FK506 (a P-12LFK) e conseguiram determinar a sua sequência de ADNc de comprimento completo. Com base nestes resultados, concluíram agora a presente invenção.

Assim, a presente invenção tem por objecto um gene das proteínas de ligação FK506, o qual codifica uma sequência de aminoácidos definida pela sequência identificada por SEQ ID NO:l ou SEQ ID NO:2 na listagem de sequências.

As abreviaturas para os aminoácidos, péptidos, sequências de bases, ácidos nucleicos, etc., tal como utilizadas na presente memória descritiva, são as recomendadas pela União Internacional de Química Pura e Aplicada [’Intemational Union of Pure and Applied Chemistry’ (IUPAC)] e pela União Internacional de Bioquímica (UIB) [’Intemational Union of Biochemistiy (IUB)] e ainda nas “Directrizes para delinear memórias descritivas sobre patentes de invenção relativas a sequências de bases e/ou sequências de aminoácidos” [‘Guidelines for drafting patent specifications relative to base sequences and/or amino acids sequences’], obra editada pelo Instituto Japonês de Patentes de Invenção, ou ainda as que são vulgarmente utilizadas no domínio relevante da especialidade. O gene da presente invenção abrange os genes caracterizados pelo facto de compreenderem um bloco de leitura ininterrupta que é constituído por uma sequência de 324 ácidos nucleicos, que codifica os 108 resíduos aminoácidos que constam da SEQ ED NO:l supramencionada. O gene da presente invenção também abrange os genes caracterizados pelo facto de possuírem um bloco de leitura ininterrupta constituído por uma sequência de 240 ácidos nucleicos, que codifica os 80 resíduos aminoácidos que constam da SEQ ED NO:2 supramencionada.

As novas proteínas de ligação FK506, codificadas pelos genes da presente invenção, caracterizam-se pelo facto de possuírem uma elevada actividade de PPIase.

Embora o gene da presente invenção seja representado por uma sequência de ADN de cadeia singular, conforme ilustrado, por exemplo, na SEQ ID NO:3, a presente invenção também compreende a sequência de ADN complementar de tal sequência de ADN de cadeia singular e também um componente que compreenda as duas. A sequência de ADN que representa o gene da presente invenção, ilustrada na SEQ ID NO:3 supramencionada, é um exemplo da combinação de codões que codificam os respectivos resíduos aminoácidos ilustrada na SEQ ID NO: 1 supramencionada. O gene da presente invenção não se limita àquele que foi mencionado supra, mas pode ter, como é evidente, qualquer outra sequência de bases de ADN, que compreenda uma combinação de codões escolhidos arbitrariamente para os respectivos resíduos aminoácidos sem que seja alterada a sequência de aminoácidos supramencionada. A selecção dos referidos codões pode ser feita pelo método convencional em que se toma em consideração a maneira de usar os codões ou a escolha dos codões no hospedeiro que irá ser utilizado para a recombinação de genes [Nucl. Acids Res., 9, 43-74 (1981)], podendo esses codões ser produzidos, por exemplo, por síntese química, etc.. O gene da presente invenção também compreende sequências de ADN que codificam as equivalentes à sequência de aminoácidos supramencionada e que derivam desta por supressões, adições ou modificações idênticas de um ou vários resíduos aminoácidos ou de uma parte da sequência de aminoácidos e que possuem uma actividade de PPIase semelhante à da proteína de ligação de FK.506. Embora a produção, a alteração (mutação) ou coisa igual possa ocorrer a estes polipeptidos espontaneamente, também podem ser produzidos por modificação pós-traducional. Além disso, é possível produzir qualquer gene desejado por técnicas de manipulação de genes, tais como a técnica de mutagénese específica do local, em que o gene natural (o gene da presente invenção) é alterado por técnicas de síntese química, tais como o método do triéster de fosfito em que são sintetizados os ADN mutantes, ou então combinando as duas técnicas.

Utilizando o gene da presente invenção, designadamente incorporando esse gene num vector utilizável com um microrganismo, por exemplo, e criando em cultura o microrganismo transformante, é possível exprimir facilmente a proteína de ligação de FK506 em grandes quantidades, podendo a referida proteína ser isolada e administrada. Uma vez que tal proteína possui actividade de PPIase, é eficaz para diversos fins farmacológicos, isto sem falar já na activação das células T, e também é útil, entre outras coisas, para esclarecer a patogénese, as patologias ou outras tendências de diversas doenças. Dito de forma mais concreta, uma vez que a proteína de ligação FK506 recombinante, obtida mediante a utilização do gene da presente invenção, é uma proteína de ligação imunossupressora, pode ser utilizada efícientemente, por exemplo, para esclarecer o mecanismo de imunossupressão em organismos vivos, para o desenvolvimento ou para a pesquisa de agentes terapêuticos para as doenças de natureza auto-imunitária (v.g., reumatismo, LES (lúpus eritematoso sistémico), etc.), pesquisa de ligandos endógenos para a nova proteína de ligação e desenvolvimento dos seus agentes terapêuticos.

Seguidamente descrever-se-á a presente invenção mais minuciosamente. O gene da presente invenção pode ser isolado por técnicas gerais da engenharia genética, por exemplo, seleccionando um clone adequado entre um banco de ADNc de cérebro de fetos humanos (ADNc sintetizado de uma forma convencional a partir de ARNm isolado e purificado a partir de ARN total por sua vez obtido a partir de células originais adequadas que contêm um gene que codifica a proteína de ligação FK506), utilizando sondas convenientes, purificando o referido clone e determinando a sua sequência de bases. Desta forma, é possível obter o gene da presente invenção.

Na prática da técnica referida supra, as células originais podem ser células ou tecidos de animais em que seja conhecida a ocorrência de uma proteína de ligação FK506, ou então é possível utilizar fracções solúveis das células daí provenientes e criadas em cultura. Estas podem ser isoladas e purificadas a partir do sobrenadante da cultura, por diversos processos cromatográficos.

As referidas células originas, capazes de exprimirem a proteína de ligação FK506, podem ser criadas em cultura segundo um método de cultura convencional, utilizando um meio adequado de cultura de células. Como exemplos do meio que é possível utilizar neste caso refere-se o meio RPMI 1640, o meio CEM, o meio CMRL-1066, o meio essencial mínimo de Eagle Modificado por Dulbecco (MEM de Eagle), o meio de Fisher, o meio F-10 e outros que tais. Sempre que adequado, é possível acrescentar a esses meios soro, tal como o soro fetal de vitelo (SFV) e /ou os componentes do soro, tais como a albumina. A criação em cultura pode ser feita de uma forma convencional, por exemplo, pelo método de incubação em atmosfera com dióxido de carbono, geralmente a uma temperatura da ordem de 30°C a 40°C, de preferência da ordem de 37°C, durante cerca de 5 a 17 dias, de preferência durante cerca de 8 a 11 dias. A separação do ARN total para fora das células ou tecidos criados em cultura pode ser feita por um método convencional de extracção. Este procedimento de extracção é executado convementeinenle num momento oportuno cm que seja máxima a produção e a acumulação da proteína de ligação FK506 no sobrenadante da cultura que se forma na cultura supramencionada. A extracção do ARN total a partir dos referidos tecidos originais ou das células criadas em cultura pode ser feita conforme a seguir se indica. No caso de se utilizar um tecido original, desmembra-se esse tecido numa solução tampão adequada, tal como uma solução tampão de fosfato de potássio enriquecida com EDTA. DTT (ditiotreitol) ou substâncias idênticas, sob arrefecimento com gelo, e depois a operação de desmembramento parcial ou total prossegue e efectua-se a solubilização utilizando uma solução mista de guanidina-isocianato ou um agente tensioactivo conveniente, por exemplo, seleccionado entre DSS (em inglês SDS), NP-40, ‘Triton X-100’ e ácido desoxicólico, ou então recorrendo a meios físicos, tais como uma homogeneizadora ou ciclos de congelamento e descongelamento e depois corta-se o ADN cromossómico com um certo comprimento utilizando uma misturadora de modelo ‘Polytron’ (Kinematica, Suíça) ou uma misturadora idêntica ou uma seringa, seguindo-se uma operação de separação em uma fracção proteínica e uma fracção de ácido nucleico. Em particular, no caso do procedimento mencionado em último lugar, é possível praticar geralmente o método de extracção em fenol-clorofórmio ou o método do gradiente de densidade em cloreto de césio, com ultracentnfugação sensivelmente a 100 000 x g [Chirgwin, J.M. et al, Biochemistiy, 18, 5294 (1979)], entre outros métodos. Em cada um dos processos referidos antes, é aconselhável evitar a decomposição do ARN que eventualmente possa ser provocada pela RNase, adicionando para isso um inibidor de RNase, por exemplo, seleccionado entre heparina, ácido polivinil-sulfurico, pirocarbonato de dietilo, um complexo de vanádio, bentonite, macalóides enão só. A separação e a purificação do ARNm proveniente do ARN obtido pelo processo de extracção referido supra são operações que podem ser feitas, por exemplo, submetendo o extracto a uma coluna de absorção, tal como uma coluna de oligo(dT)-celulose (Collaborative Research Inc ), uma coluna de poly(U)-‘Sepharose 2B’ (Pharmacia) ou uma coluna de ‘Sepharose’ (Pharmacia), ou por meio de um método descontínuo. O ARNm purificado, obtido conforme se disse antes, é geralmente instável. Por tal motivo, é transcrito rrversamente para dar a forma estável de ADN complementar (ADNc) e junta-se este a um replicão da origem do microrganismo para favorecer a amplificação do gene desejado Λ transcrição supramencionada, efectuada in vitro, de ARNm para ADNc, designadamente a síntese de ADNc, é uma operação que pode ter lugar geralmente conforme a seguir se indica.

Em primeiro lugar, utilizando oligo(dT) (quer oligo(dT) livre quer oligo(dT) unido já a um iniciador vectorial) como iniciador e utilizando o ARNm como matriz, sintetiza-se ADNc de cadeia singular complementar do ARNm com base neste, utilizando transcriptase reversa na presença dos dNTP (dATP, dGTP, dCTP e d lTP). O passo subsequente é diferente consoante se tenha utilizado oligo(ADN) livre ou oligo(ADN) acoplado a um iniciador vectorial, conforme a seguir se descreve.

No primeiro caso, o ARNm utilizado como matriz é removido por decomposição, por exemplo, por meio de um tratamento alcalino e depois é produzido o ADN de cadeia dupla, utilizando como matriz o ADN de cadeia singular, conjuntamente com transcriptase reversa ou polimerase de ADN. As duas extremidades do ADN de cadeia dupla, assim obtido, são tratadas com uma exonuclease e junta-se a cada uma delas um ADN de um ligador adequado ou um conjunto de bases cuja combinação permita a recombinação, seguindo-se a inserção num vector adequado. Isto pode ser feito, consoante o vector utilizado, por meio de um método convencional, por exemplo, pelo método de Gubler-Hoffinan. Para a síntese de ADNc, conforme se disse anteriormente, também é possível utilizar um estojo de síntese de ADNc existente nos circuitos comerciais. A utilização de um estojo deste tipo é vantajosa na medida em que o procedimento é simples e fácil. O vector que se utiliza nesta metodologia não está limitado a nenhuma espécie particular. No entanto, é recomendável seleccioná-lo convenientemente entre os vectores de fagos Xgt, vectores plasmídicos EK e não só, quer por si sós quer em combinação, consoante o hospedeiro que venha a ser utilizado. Como vectores de fagos da família Xgt poder-se-ia mencionar os Xgt 10, Xgtl 1, etc.. O processo em que são utilizados estes vectores de fagos da família Xgt pode ser praticado pelo método de Young et al. [Young, R.A. et al., em ‘DNA Cloning’, l, 49 (1985)].

No último caso, conquanto o ARNm utilizado como matriz seja conservado, o híbrido de ARNm-ADNc, que é um plasmídeo linearizado com um conjunto de bases combinadas de modo a favorecerem a recombinação, conforme se disse antes, e um ADN ligador (utiliza-se frequentemente um fragmento de ADN que contém uma região capaz de replicação autónoma em células de animais e uma região de ARNm promotora da transcrição) são submetidos conjuntamente a uma operação de recombinação para se obter um produto circularizado. Depois substitui-se o ARNm com uma cadeia de ADN na presença dos dNTP, RNase H e ADN-polimerase I para se obter um ADN plasmídico completo. O ADN obtido pelo método descrito siqira pode ser introduzido no hospedeiro adequado do vector, por exemplo, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae e outras espécies, para assim se transformar o hospedeiro. Os métodos praticáveis para esta introdução de ADN no hospedeiro, para efeitos de transformação, são os geralmente utilizados, por exemplo, o método que consiste em colher as células que se encontrem na sua maior parte em fase de crescimento logaiíUnico, tratando-as com CaCf> para que fiquem num estado adequado para uma incorporação espontânea rápida do ADN e permitindo então que o plasmídeo seja incorporado. No processo anterior, é possível fazer com que esteja presente MgC^ ou RbCl para melhorar ainda mais a eficiência da transformação, conforme é genericamente sabido. Também é possível utilizar o método que consiste em converter células microbianas em esferoplastos ou protoplastos, submetendo-os depois a transformação. Os pormenores sobre estes métodos foram descritos por Gubler e Hoffinan [Gubler, U. e Hoffinan, B.J., Gene, 25, 263 (1983)]. Nos casos em que se utiliza um fago λ, que é geral e frequentemente utilizado como fago vectorial, é possível construir um banco de ADNc no fago λ por acondicionamento in vitro. Como banco de ADNc também é possível utilizar os bancos de ADNc existentes nos circuitos comerciais, por exemplo, os diversos bancos de ADNc fornecidos por ‘Clontec’. A pesquisa do banco de ADNc assim obtido, para se procurar o gene da presente invenção, pode ser feita de um modo convencional. Assim, como método de pesquisa é possível referir, por exemplo, o método que consiste em seleccionar o clone de ADNc correspondente pela metodologia das autorradiografias de Western, utilizando um anticorpo específico para a proteína de ligação FK506 contra a proteína produzida pelo ADNc, um método das autorradiografias de Southern, em que é utilizada uma sonda hibridante que se liga de forma selectiva à sequência de ADN desejada, o método das autorradiografias à Northern e uma combinação destes métodos. No que diz respeito à sonda aqui utilizada, recorrer-se-á geralmente, entre outras, a sequências de ADN ou de tipo idêntico que tenham sido sintetizadas quimicamente com base na informação respeitante à desejada sequência de ADN ou de ARN ou à sequência de aminoácidos codificada de modo correspondente. O ADN ou o ARN obtidos a partir de fontes naturais também podem ser utilizados como sondas hibridantes.

Dito de forma mais minuciosa, a sonda hibridante supramencionada é preparada conforme a seguir se descreve. Assim, utilizando uma coluna de oligo(dT)-celulose, selecciona-se ARNpoli(A)+ entre os ARN obtidos a partir de um tecido ou de células criadas em cultura que contenham a proteína de ligação FK506, sintetiza-se o ADNc de cadeia singular pelo método referido antes e depois de a reacção ter terminado amplifica-se o ADNc de cadeia singular pelo método da RCP [Saiki, R.K. et al., Science, 230, 1350-1354 (1985)], utilizando iniciadores admissivelmente correspondentes à informação sobre a sequência dos aminoácidos de partes da proteína de ligação FK506, utilizando para tal um sintetizador automático de oligonucleótidos. A seguir isola-se o fragmento de ADNc amplificado e purifica-se por electroforese em gel derivado agarose a 1,0%. A sequência de bases do fragmento de ADN assim obtido pode ser determinada de uma forma convencional. Por exemplo, depois de se ter feito digerir com uma enzima de restrição adequada o fragmento de ADN obtido, é possível realizar a sequenciação pelo método de didesoxi [Sanger, F., Niclden, D. e Coulson, A.R., “DNA Sequencing with chain-terminating inhibitors” (Sequenciação de ADN com inibidores de terminação da cadeia), Proc. Nad. Acad. Sei. USA, 74, 5463-5467 (1977)] ou pelo método de Maxam-Gilbert [Maxam, A.M. e Gilbert, W., Methods in Enzymology, 65, 499 (1980)], entre outros. Além disso, a determinação da referida sequência de bases também pode ser conseguida utilizando para tal estojos de sequenciação existentes nos circuitos comerciais, ou de tipo idêntico. A sequência de bases de comprimento completo assim determinada, de um ADN que contenha o gene da presente invenção, está ilustrada na listagem de sequências e identificada por SEQ IDNO:3.

Na prática da presente invenção também é possível utilizar como sonda uma parte do fragmento de ADN sequenciado conforme se disse antes, sendo essa sonda marcada com um estojo de marcação de ADN de iniciadores aleatórios (fornecido por Takara Shuzo, Amersham, etc.), em conformidade com o método de marcação de ADN com iniciadores aleatórios [Feinberg, A.P. et al., Anal. Biochem., 137, 266-267 (1984)], por exemplo, e utilizar a sonda marcada assim obtida para a pesquisa do gene desejado da proteína de ligação FK506.

Utilizando a sonda marcada referida supra, por exemplo, é possível pesquisar o ADN desejado por meio da técnica de hibridação de placas desenvolvida por Benton e Davis [Benton, W. e Davis, R., Science, 196. 383-394 (1977)]. O gene da presente invenção, quando obtido pelo processo descrito supra, pode ser clonado em diversos plasmídeos de uma forma convencional. Por exemplo, após a clivagem com uma enzima de restrição adequada e subsequente purificação, o gene da presente invenção pode ser inserido no interior de um vector de clonagem (v.g. um plasmídeo) clivado com a mesma enzima de restrição e purificado, no seu local de clivagem, podendo assim ser obtido um plasmídeo recombinante. Introduzindo o referido plasmídeo recombinante no hospedeiro adequado (v.g. Escherichia coli), para efeitos de transformação, é possível obter com uma enzima de restrição o mapa do clone que contém o referido gene, utilizando o transformante de acordo com uma metodologia conhecida, por exemplo, o método descrito em ‘Molecular Cloning (A Laboratory Manual), T. Maniatis, E.F., Fritsch e J. Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory (1982), páginas 104-106. Após a digestão do clone referido antes com uma enzima de restrição adequada, é possível determinar a sequência de bases do referido clone pelo método de didesoxi já anteriormente referido ou pelo método de Maxam-Gilbert, por exemplo. A determinação da sequência de bases anteriormente referida também pode ser feita facilmente, utilizando um estojo existente nos circuitos comerciais, e não só. A sequência de bases de ADN assim determinada, do gene da proteína de ligação FK506 da presente invenção, e a correspondente sequência de aminoácidos codificada em conformidade constam da listagem de sequências e estão identificadas por SEQ ID NO: 1 e

Utilizando o gene (ADN) referido supra, da presente invenção, é possível obter a proteína de ligação FK506 recombinante por meio de diversas técnicas conhecidas de recombinação de genes [cf., por exemplo, Science, 224, 1431 (1984); Biochem. Biophys. Res. Comm., 130, 692 (1985); Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80, 5990 (1983)]. A referida proteína de ligação FK506 é produzida, dito de forma mois minuciosa, construindo um ADN recombinante que permita a expressão do gene da presente invenção em células hospedeiras, introduzindo esse gene nas células hospedeiras para a sua transformação e criando em cultura a estirpe transformante. As células hospedeiras podem ser procarióticas ou eucarióticas. Como vector de expressão utilizável com células de vertebrados é possível escolher um que contenha um promotor localizado geralmente a montante do gene que se pretende exprimir, o local de junção do ARN, um local de poliadenilação, uma sequência de terminação da transcrição e assim sucessivamente. Tal vector também pode ter, se necessário, uma origem de replicação. As leveduras são utilizadas frequentemente como microrganismos eucarióticos e entre estes utiliza-se, de forma vantajosa, as leveduras pertencentes ao género Saccharomyces. Como vectores de expressão utilizáveis com estas leveduras e com outros microrganismos eucarióticos refere-se os vectores pAM82 [A. Miyanohara et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80, 1-5 (1983)], que contêm um promotor para o gene da fosfatase ácida, e vectores idênticos. Em geral, é muito frequente utilizar os microrganismos Escherichia coli e Baccilus subtilis como fontes de células hospedeiras procarióticas. No caso de serem utilizados estes microrganismos como hospedeiros, na prática da presente invenção, utiliza-se preferencialmente um plasmídeo de expressão que seja obtido, por exemplo, a partir de um vector plasmídico capaz de replicação nos referidos microrganismos hospedeiros e dotado de um promotor, a sequência de bases SD (Shine e Dalgamo) e ainda um codão de iniciação (v.g. ATG) necessário para o início da síntese da proteína, a montante do gene da presente invenção, por forma a que o referido gene possa ser expresso. Entre os microrganismos Escherichia coli hospedeiros referidos supra, utiliza-se frequentemente a estirpe K12 e outras de Escherichia coli e como vector utiliza-se frequentemente o pBR322. No entanto, isto não limita a escolha do microrganismo hospedeiro e do vector, sendo possível utilizar também outras estirpes microbianas e vectores conhecidos. No que diz respeito ao promotor, é possível utilizar, por exemplo, o promotor de triptofano (trp), o promotor lpp, o promotor lac e o promotor PL. O ADN recombinante desejado assim obtido pode ser introduzido nas células hospedeiras para a sua transformação, por meio de diversos métodos convencionais. O transformante obtido pode ser criado em cultura segundo uma metodologia convencional que leva à produção e à acumulação da proteína de ligação FK506 desejada e codificada pelo gene da presente invenção. O meio utilizável para se fazer a referida cultura pode ser escolhido adequadamente, de acordo com as células hospedeiras utilizadas, entre os diversos meios vulgarmente utilizados. No caso de serem utilizadas como células hospedeiras as células de Escherichia coli ou de estirpes semelhantes, por exemplo, a operação de cultura transformante pode ser efectuada utilizando o meio CL (em inglês LB), meio E, meio M9, meio M63 ou semelhantes. A estes meios é possível acrescentar, se necessário, fontes geralmente conhecidas de carbono, azoto, sais inorgânicos, vitaminas, extractos de origem natural, substâncias fisiologicamente activas, etc.. A operação de cultura transformante anteriormente referida pode ter lugar em condições adequadas ao desenvolvimento das células hospedeiras. No caso do microrganismo Escherichia coli, as condições praticadas podem ser, por exemplo, a escolha de um valor de pH apro-ximadamente entre 5 e 8, de preferência 7 ou próximo disso, e um valor de temperatura compreendido sensivelmente entre 20°C e 43°C e de preferência 37°C on próximo disso. Pela maneira agora explicada, as células transformantes produzem e acumulam intracelularmente ou segregam extracelularmente a desejada proteína de ligação FK506 recombinante. A referida proteína desejada pode ser isolada e purificada por meio de diversas técnicas de separação, utilizando as suas propriedades físicas, químicas e outras [cfi, por exemplo, “Seikagaku (Biochemistry) Data Book ΙΓ’, página 1175-1259m Γ edição, Ia impressão, obra publicada a 23 de Junho dc 1980 por Kabushiki Kaisha Tokyo Kagaku Dojin; Biochemistry, vol. 25, n° 25, 8274-8277 (1986); Eur. J. Biochem., 163, 313-321 (1987)]. Como exemplos específicos das referidas técnicas c possível referir o tratamento de reconstituição convencional, o tratamento com um agente que faça precipitar as proteínas (substituição de um sal por outro), centrifugação, tratamento de choque de pressão osmótica, desmembramento ultra-sónico, ultra-filtração, os diversos processos cromatográficos em fase líquida, tais como a cromatografia sobre crivos moleculares (filtração em gel), a cromatografia por adsorção, a cromatografia de permuta tónica, a cromatografia por afinidade e a cromatografia em líquido de elevado rendimento (CLER), diálise e as combinações destas técnicas. Pelo exposto, é possível produzir a desejada proteína recombinante à escala industrial de uma forma fácil e com uma eficiência elevada.

DESCR1CÀO ABREVIADA DOS DESENHOS A figura representa esquematicamente a sequência de bases de OTK4(6-l) (parte de cima) e de OTK4(4-l) (parte de baixo). A figura 2 mostra os resultados da análise da proteína OTK4 por EGPA-DSS: A figura 3 mostra a actividade de PPIase da proteína OTK4. A figura 4 mostra os resultados da análise pelas autorradiografias de Northern, feita a diversos tecidos utilizando o gene de OTK4. 16 A figura 5 mostra os resultados da análise por RCP-TR, feita a diversos tecidos para se investigar a expressão de OTK4(6-l) e OTK4(4-l). MELHORES FORMAS DE EXECUTAR A INVENÇÃO Seguidamente efectua-se a descrição de exemplos para ilustrar a presente invenção mais minuciosamente.

Exemplo 1 (1) Clonagem e sequenciação A partir de um banco de ADNc de cérebro fetal humano (Clontec, CA; vector Uni-ZapII) seleccionou-se um clone de 1,0 kb fortemente homólogo com a proteína de 12 kDa de ligação FK506 humana, por um processo convencional, tendo recebido a designação de OTK4.

Utilizando como sonda o clone OTK4 supramencionado, pesquisou-se o mesmo banco de ADNc (cerca de 1 000 000 de placas), tendo sido obtidos outros dois clones de ADNc que receberam respectivamente as designações de OTK4(6-l) e OTK4(4-l). Determinou-se a sequência de ADN de cada um destes três clones de ADNc pelo método de terniinação didesoxi, utilizando 32S-dTTP.

Em consequência, concluiu-se que o clone OTK4 e o clone OTK4(6-l) têm apenas uma e única sequência de ácidos nucleicos. A sequência completa de ácidos nucleicos do clone OTK4(6-l) está indicada na listagem de sequências e identificada por SEQID NO:3.

Este clone tem um bloco de leitura ininterrupta constituído por uma sequência de 324 resíduos de ácidos nucleicos que codificam os 108 resíduos aminoácidos indicados na SEQ ID NO:l. A sua região não codificadora de 5’ compreende uma sequência de 72 bases que contém uma sequência rica em GC e a sua região não codificadora de 3’ compreende uma sequência de 470 bases que contém um sinal de poliadenilação AATAAA, seguido por um apêndice poli(A).

Por outro lado, o outro clone OTK4(4-l) codifica 80 resíduos aminoácidos representados pela SEQ 1D NO:2 e admite-se que seja derivado do clone OTK4(6-l) por junção. O referido clone OTK4(4-l) tem uma sequência de 45 bases que codifica 14 resíduos aminoácidos e o codão de terminação, tal como inserido na região de codificação do clone OTK4(6-l) num local da 199a base (depois de Ala na posição 66), e em consequência codifica os 80 resíduos aminoácidos supramencionados.

Uma comparação feita com base na análise estrutural do P-12LFK [Van Duyne, G.D. et ai, Science, 252, 839-842 (1991)] revelou que ao clone OTK4(4-l), quando comparado com o clone OTK4(6-l) que possui 5 folhas β, lhe faltam na sua região do terminal C duas folhas β e um elo entre essas folhas.

Os dois clones referidos antes estão representados de fornia esquemática na figura 1. Nesta figura, as se tas indicam os iniciadores FK-1, FK-2 e FK-3 para a RCP, os quais irão ser aqui mencionados mais adiante, e o símbolo “EX” indica a região de inserção da sequência de 45 bases supramencionada.

(2) Homologia com outras PLFK O clone OKT4(6-l) demonstrou a mais elevada homologia com a P-12LFK humana. Assim, concluiu-se que esta homologia com a P-12LFK era de 76% em termos da sequência de ácidos nucleicos e era de 88% em termos da sequência de aminoácidos.

Além disso, revelou 49,5% (97 resíduos aminoácidos) de homologia, 44,6% (92 resíduos aminoácidos) de homologia e 38,0% (108 resíduos aminoácidos) de homologia lespectivamente com a P-52-LFK, a P-52LFK (Peattie, D.A. et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89, 10974--10978 (1992)), a P-13LFK (Jin, Y. et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 88, 6677-6681 (1991)) e a P-25LFK humanas (Wiederrecht, G. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 185. 1298--303 (1992)). (3) Produção da proteína recombinante

Amplificou-se a região completa de codificação do ADNc de OTK4(6-l) pelo método de RCP, utilizando como iniciadores os FK-1 e FK-2 adiante indicados que possuem o local BamHl.

Quadro 1

Iniciador Sequência de bases FK-1 5 ’-GTGGATCCGCTATGGGCGTGGAGAT-3 ’ FK-2 5 -AAGGATCCGTCCCAGTGGCAGACAG-3 ’ FK-3 5’-TGATTCATCCAGAGACAGAA-3’

Fez-se digerir o produto da RCP com BamHl e clonou-se no vector de expressão PGEX2T (Pharmacia) no seu local BamHl. A proteína de ligação FK506 recombinante (proteína OTK4) da presente invenção foi produzida e purificada ao fazer-se com que fosse expressa como uma proteína fundida com GST na estirpe DH5 de Escherichia. coli, de acordo com o método descrito na literatura [Ayer, D.E. et ai, Cell, 72, 211-222 (1993)]

Assim, com uma colónia da estirpe de Escherichia coli transformada com o vector de expressão PGEX2T, obtido conforme se disse antes, inoculou-se 20 mL de um meio constituído por CL/ampicilina e manteve-se a incubar a 37°C durante 12 a 15 horas.

Diluiu-se cultura (1:10) com 200 mL de meio recente constituído por CL/ampicilina. Ao fim de 1 hora de incubação acrescentou-se IPTG (1 mM) e deixou-se a incubação prosseguir durante 3 a 5 horas. Juntou-se as células por centrifugação a 3000 r.p.m., tendo sido depois recolocadas em suspensão em 5 mL de tampão de lise frio, efectuou-se a lise por tratamento com ultra-sons e depois manteve-se a incubar sobre gelo durante 1 hora. Centrifugou-se o lisado celular a 3000 r.p.m., juntou-se o sobrenadante a ‘Glutathion Sepharose 4B’ (Pharmacia) e manteve-se a incubar a 4°C durante 1 hora. Centrifugou-se a mistura a 300 r.p.m. durante 5 minutos e deitou-se fora o sobrenadante. Lavou-se a ‘Glutathion Sepharose 4B’ três vezes com STP e uma vez com STP-T (STP que contém 1% de ‘Triton X’).

Para se obter a proteína OTK4 de comprimento completo sem o marcador GST clivou-se com trombina a proteína fundida com GST. Lavou-se a ‘Glutathion Sepharose 4B’ com tampão de lavagem (Tris 50 mM-HCl (pH 7,5)/NaCl 150 mM), acrescentou-se 900 mL de tampão de clivagem da trombina (tampão de clivagem que contém CaCl2 2,5 mM) e 100 mL de trombina (Sigma) à ‘Glutathion Sepharose 4B’ e manteve-se a mistura a incubar a 25°C durante 1 hora e depois centrifugou-se a 300 r.p.m.. A proteína OTK4 assim obtida (sobrenadante) foi guardada a -80°C. (4) EGPA-DSS, contraste com o corante azul de Coomassie e análise da proteína

Submeteu-se a proteína OTK4 a um procedimento de electroforese sobre um gel de poliacrilamida a 15% e depois analisou-se por contraste com o corante azul brilhante de Coomassie [Wilson, C.M. et al., Methods Enzymol., 91, 236-247 (1983)].

Os resultados obtidos estão ilustrados na figura 2. Na figura 2, a pista 1 diz respeito à proteína celular total obtida sem a indução com IPTG supramencionada, a pista 2 diz respeito à proteína celular total obtida com a referida a indução com IPTG; a pista 3 diz respeito à proteína de fusão GST-OTK4 após o tratamento de purificação; e a pista 4 diz respeito à proteína OTK4 após o tratamento de clivagem. A proteína OTK4 purificada, conforme se disse antes, foi quantificada pelo método de Lowry [Lowry, O.H. et al., Nature, 337, 476-478 (1989)], concluindo-se que havia 500 pg de proteína por cada mL. (5) Demonstração da actividade de PPIase

Determinou-se a actividade enzimática da proteína purificada, recorrendo ao método descrito na literatura [Fisher, G. et ai, Nature, 337, 476-487 (1989)], convenientemente modificado para medir a isomerização (de cis para trans) da ponte peptídica prolina-alanina no péptido (N-succinil-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilida). A forma trans do péptido referido supra é facilmente clivada com quimotripsina, libertando p-nitroarulida que pode ser quantificada medindo a absorvência a 405 nm. A mistura de ligação (1,0 mL) continha o substrato peptídico supramencionado (30 pL retirados de uma solução de reserva 2,1 mM; concentração final igual a 0,1 mM), Tris 100 mM--HC1 (pH 7,8) e proteína OTK4 quer na concentração de 1,0 pg/mL quer na concentração de 10 pg/mL; a reacção decorreu a 25°C.

Depois de passado 1 minuto, acrescentou-se e misturou-se 30 pL de Tris 100 mM-HCl (pH 7,8) contendo quimotripsina na concentração de 2 mg/mL (Sigma). Decorridos 10 segundos após a operação de mistura e depois disso, mediu-se a absorvência a 405 nm com um espectro-fotómetro, a intervalos de 10 segundos.

Os resultados obtidos estão indicados na figura 3 [ordenadas = absorvência (405 nm); abcissas = tempo (x 10 segundos)]. Na figura 3, a curva que contém os círculos em branco indica os resultados obtidos com a proteína 0TK4 na concentração de 1,0 jJg/mL; a curva que contém os círculos preenchidos indica os resultados obtidos com a proteína OTK4 na concentração de 10 pg/mL; e a curva que contém os triângulos preenchidos indica os resultados obtidos com uma contraprova sem proteína OTK4.

Conforme se depreende da referida figura, observou-se um aumento nítido da absorvência nos grupos de proteínas OTK4, comparativamente com a substância de contraprova, e foram observados níveis de actividade dependentes da dose de proteínas OTK4. (6) Análise de diversos órgãos pelas autorradiografias de Northern

Foram examinados os níveis de expressão do gene de OTK4 em diversos tecidos, tendo para tal sido utilizado o ARNm da Clontec (sistema de autorradiografias de Northern de vários tecidos humanos).

Assim, efectuou-se um procedimento de 4 horas de pré-hibridação e 18 horas de hibridação a 50°C numa solução que continha 50% de formamida, solução de Denhardt 10X, SSPE 5X, 2% de DSS e 10 pg de ADN desnaturado do esperma de salmão. A sonda utilizada foi ADNc de OTK4 marcado com 32P. Efectuou-se a lavagem com SSC 2X/0,05% de DSS à temperatura ambiente durante 10 minutos (três vezes) e depois com SSC 0,1X/0,1% de DSS a 50°C durante 15 minutos (duas vezes), seguindo-se um período de 60 horas de exposição a -80°C.

Os resultados obtidos estão ilustrados na figura 4. Nesta figura, a pista 1 e as pistas subsequentes correspondem, pela ordem indicada, a: coração, cérebro, placenta, pulmão, fígado, músculos do esqueleto, rim, pâncreas, baço, timo, próstata, testículos, ovários, intestino delgado, cólon e leucócitos do sangue periférico. Na coluna mais à esquerda estão indicados os marcadores dimensionais de ARNm (em kb). A partir da referida figura é evidente que a expressão do ARNm do gene da OTK4 é observável em diversos tecidos. (7) Análise de diversos órgãos por RCP-TR (transcriptase reversa)

Utilizando o iniciador aleatório p(dN)6 (Boehringer Mannheim GmbH), efectuou-se a transcrição re\ersa de 10 pg de ARN de cada um dos órgãos, seguindo-se a amplificação por RCP utilizando os iniciadores FK-1 e FK-2 (cf. Quadro 1). As condições da RCP foram as seguintes: 40 ciclos com o regime seguinte: 94°C durante 0,5 minutos, 54°C durante 1 minuto e 72°C durante 1 minuto, por ciclo.

Seguindo uma metodologia convencional, submeteu-se então cada produto a uma electro-forese em gel de agarose a 10%, transferiu-se para uma membrana de nylon’ e hibridou-se a 50°C com FK-3 marcado com i2P nos terminais (cf. Quadro 1). Depois de efectuada a lavagem com SSC 6X à temperatura ambiente durante 10 minutos e a seguir a 50°C durante 10 minutos* efectuou-se uma autorradiografia da membrana para efeitos de detecção, utilizando actina como contraprova.

Os resultados assim obtidos estão ilustrados na figura 5. Foram utilizados os órgãos a seguir indicados: cérebro, cerebelo, fígado, timo, músculo do esqueleto, estômago, A partir da referida figura é evidente que qualquer das proteínas OTK4(4-l) e OTK4(6-l) é expressa em todos os órgãos, embora a expressão da OTK4(4-l) seja superior à da OTK4(6-l).

APLICABILIDADE INDUSTRIAL A presente invenção proporciona um gene da proteína de ligação FK506. A utilização do referido gene faz com que seja possível produzir facilmente e em grandes quantidades a proteína de ligação FK506, podendo esta proteína, que possui actividade de PPIase, ser utilizada no desenvolvimento de agentes terapêuticos para diversas doenças. 24

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) ÍNFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 108 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA, proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1:

Ma Gt Vai Glu Be Qu Thr Be Ser Pro Gli Asp Gfi Aig Thr Phe 1 5 10 15 Pro Lis Lis Gfi Gin Thr Cis Vai Vá His Er Thr Gli Met Leu Gbi 20 25 30 Asn α Lb Lis Fte Asp Sσ Ser Aig Αφ Arg Asn Lis Pro Phe Lis 35 40 45 Phe Aig De GH Lis Gin Glu Vá Be T is Gfi Phe Glu Glu Gli Ala 50 55 60 Ala On Met Ser Leu Gli Gin Aig Ala lis Leu Thr α Thr Pro Asp 65 70 75 80 Vá Ala Tr a Ah Thr GS Ffe Pro α Vá Be Pro Pro Asn Ala 85 90 95 Thr Leu Be Phe Asp Vai Gb Leu Leu Asn Leu Glu 100 105 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 80 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido 25 (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:2:

Met GS Vai Ou De Glu Thr De Ser Pro Gfi Asp Gfi Aig Thr Phe 1 5 10 15 Pro Lis Lis cai Gin Thr Cis Vai Vai His Tir Thr ge Met Leu On 20 25 30 Asn α li li Pfe Αφ Ser Ser Aig Asp Aig Asn Lis Pro Phe T is 35 40 45 Phe Aig De ge li On Glu Vai De Lis GE Phe Glu Glu Gfi Ala 50 55 60 Ala Gin Leu GE Pro Leu Ser Pro Leu Pro lie Cfe Ro Hs Pto Gs 65 70 75 80 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUENCIA ID N0.3 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 879 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ANTI-SENTIDO. NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: banco de ADNc de cérebro de fetos humanos (B) CLONE: OTK4 (6-1) (ix) PARTICULARIDADE:

(A) NOME/CÓDIGO. CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 70 .393 26 (a) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO. 3: CGCTGGGCCG GAGCCGAGCC GGGGTCGGGC AGCAGCAGGA CCCCCAGAGG CGGGGCCTGT 60 GGGACCGCT ATG GGC GIG GAG AIC GAG Acr ATT TDC occ GGA GAC GGA 108 Met GB Vai Qu De Ou Thr De Ser Pro a Asp Gfi 1 5 10 AGG ACA TIC OOC AAG AAG GGC CM ACG TGT GIG GIG CAC TAC ACA GGA 156 Alg Thr Phe Pro Lis Lis GE On Thr Cis Vai Vai He Tír Thr Gfi 15 20 25 ΑΙΌ CIC CAA MT GGG AAG AAG ΤΓΓ GAT 1CA ICC AGA GAC AGA AAC AM 204 Met Leu On Asn a lis Lb Phe Asp Ser Ser Alg Asp Aig Asn Lis 30 35 40 45 ocr TIC AAG TIC AGA ATT GGC AM CAG GM GIC AIC AAA GGT TU GM 252 Pro Phe Lis Phe Alg De GE Lis On Ou Vai De Lis Gfi Phe Ou 50 55 60 GAG CGT GCA GGC CAG AID AGC TIG GGG CAG AGG GCG AAG CIO AOC TGC 300 Ou Gfi Ala Ala On Met Ser Leu Gfi Gn Aig Ala Lis Leu Thr Os 65 70 75 A0C ocr GAT GIG GCA. ΤΑΓ GGA GGC ACG GGC CAC GCE GGT GIC AIC ocr 348 Ur Pro Asp Vá Ala Tr Cí Ala Thr α He Pro a Vai De Pro 80 85 90 00c ΑΑΓ G0C AOC CIC ATC ΤΤΓ GAC GIG GAG CIG CIC AAC TTA GAG 393 Pro Asn Ala Thr Leu He Phe Asp Vai Giu Leu Leu Asn Leu Ou 95 100 105 TGAAGGCAGG AAGGAACTCA AGGTGGTGGC TGGAGATGGC TGCTGCTCAC CCTCCTAGCC 453 TGCTCTGCCA CTGGGACGGC TCCTTGCTTT TGGGGCTCTT GATCAGTGTG CTAACCTCAC 513 TGCTCTGCCA CATCATCCAT TCTCTCTGCC CAAGTTGCTC TGTATGTGTT CGTCAGTGTT 573 CATGCGATTC TTGCTTGAGG AAACTTCGTG CAGATTAAGC ATTCAAGGTT GTGCATTTTG 633 TGTGATGCAG TAGTAGCCTT TCCTGATAAC AGAACACAGA TCTCTTGTTC GCACAATCTA 693 CACTAGGCAG TACCTTCACA TTAAACCACA CACAAGGTGC TCAGACATGA AATGTACATG 753 GCGTACCGTA CACAGAGGGA CTTGAGCCAG TTACCTTTGC TGTCACTTTC TCTCTTATAA 813 ATTCTGTTAG CTGCTCACTT AAACAATGTC CTCTTTGAGA AAATGTAAAA TAAAGGCTCT 873 GAGCTT 879

Lisboa, 17 de Outubro de .,2001 1

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/ JOSÉ DE SAjfí^AlC Α.Ο.Ρ.Ϊ.

Viu<· u;. SaiiíiV, 195. r/c -Π -íi(s-062·

Claims (7)

1 e Reivindicações 1. Gene da proteína de ligação FK506 que codifica a sequência de aminoácidos indicada na SEQIDNO:!.

2. Gene da proteína de ligação FK506 de acordo com a reivindicação 1, o qual possui a sequência de bases indicada na SEQ ID NO:3.

3. Proteína FK506 recombinante caracterizada pelo facto de possuir a sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 1.

4. Método para produzir uma proteína FK506 recombinante, o qual consiste em introduzir uma sequência de bases, que contenha o gene da proteína de ligação FK506 da reivindicação 1, no interior de um hospedeiro para assim transformar esse hospedeiro, criar em cultura o transformante assim obtido e recuperar a proteína de ligação FK506 recombinante assim produzida.

5. Gene da proteína de ligação FK506 que codifica a sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO:2.

6. Proteína de ligação FK506 recombinante que possui a sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO:2. 2 I

7. Método para produzir uma proteína FK506 recombinante, o qual consiste em introduzir uma sequência de bases, que contenha o gene da proteína de ligação FK506, da reivindicação 5 no interior de um hospedeiro para assim transformar esse hospedeiro, criar em cultura o transfoimante assim obtido e recuperar a proteína de ligação FK506 recombinante assim produzida. Lisboa, 17 de Outubro de 2001