PT752869E

PT752869E - Celulas com multiplos epitopos alterados sobre um antigenio de superficie para utilizacao em transplantes

Info

Publication number: PT752869E
Application number: PT95914995T
Authority: PT
Inventors: Scott C Chappel
Original assignee: Diacrin Inc
Priority date: 1994-03-31
Filing date: 1995-03-30
Publication date: 2002-01-30
Also published as: CA2186529A1; DK0752869T3; EP0752869B1; US6096537A; ES2161875T3; DE69521794D1; EP0752869A1; US5679340A; GR3036951T3; DE69521794T2; ATE203163T1; AU684932B2; WO1995026741A1; AU2203995A

Description

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DESCRICAO

"Células com múltiplos epítopos alterados eobrc um antigénio de euperfície para utilização em transplantes"

Antecedentes da invenção Várias doenças são tratadas por transplante de tecido doado por outros humanos (aloenxertos) ou obtidos de animais (xenoenxertos). Por exemplo, a diabetes dependente de insulina é frequentemente tratada por transplante de células de ilhéus pancreáticos que segregam insulina. Embora as células transplantadas possam ter a capacidade de realizar a função desejada (e.g., secreção de insulina em resposta a níveis crescentes de glucose), o enxerto falha tipicamente em resultado de rejeição imunológica. Pouco após o transplante, as células do sistema imunitário do receptor reconhecem as células alogénicas ou xenogénicas como estranhas e prosseguem com o ataque do enxerto através de ambas as vias, humoral e celular. As células alogénicas ou xenogénicas são inicialmente reconhecidas pelo sistema imunitário do receptor através de determinantes antigénicos expressos na superfície das células. Os antigénios predominantes reconhecidos como "não próprios" são antigénios do complexo principal de histocompatibilidade de classe I e classe II (MHC de classe I e classe II). As antigénios do MHC de classe I são expressos em virtualmente todas as células parenquimatosas (e.g., células de ilhéus pancreáticos). Em contraste, os antigénios do MHC de classe II são expressos num número limitado de tipos de células, principalmente células B, macrófagos, células dendríticas, células de Langerhans e epitélio tímico. A interacção de antigénios do MHC estranhos com o receptor de células T em células T do hospedeiro faz com que estas células fiquem activadas. Após a activação, as células T proliferam e induzem funções efectoras que resultam na lise das células e na destruição das células transplantadas.

Para que o transplante seja uma opção terapêutica viável, são necessária*; abordagens para inibir a rejeição de células transplantadas pelo sistema imunitário do receptor. Um método para inibir este processo de rejeição consiste na administração de drogas que suprimem a função do sistema imunitário. Embora drogas como a ciclofosfamida e a ciclosporina inibam eficazmente as acções do sistema imunitário e permitam portanto a aceitação do enxerto, a sua utilização pode causar imunossupressáo generalizada, não

87 244 ΕΡ Ο 752 869 /ΡΤ 2 específica, no receptor do enxerto, ο que deixa o receptor susceptívei a outras desordens tais como infecção e crescimento de tumores. Adicionalmente, a administração de drogas imunossupressoras é frequentemente acompanhada por outros efeitos secundários graves tais como falha renal e hipertensão.

Mostrou-se que é possível alterar um antigénio na superfície de uma célula antes do transplante para "mascarar" o antigénio do reconhecimento normal por células do sistema imunitário do receptor (veja-se Faustman e Coe (1991) Science 252:1700-1702 e WO 92/04033). Por exemplo, antigénios do MHC de classe I em células transplantadas podem ser alterados através de contacto das células com uma molécula que se liga ao antigénio, tal como um anticorpo ou um seu fragmento (e.g., um fragmento F(ab')2) antes do transplante. Esta alteração de antigénios do MHC de classe I modifica a interaeção entre os antigénios nas células e linfócitos T no receptor após transplante para assim inibir a rejeição das células transplantadas. São necessários métodos adicionais para reduzir a imunogenicidade de um aloenxerto ou xenoenxerto para inibir a rejeição do enxerto após o transplante num hospedeiro.

Sumário da invenção A presente invenção refere-se a células adequadas para transplante que foram tratadas antes do transplante para reduzir a imunogenicidade das células e assim inibir a rejeição das células após o transplante para um receptor alogénico ou xenogénico. As células para utilização no transplante têm pelo menos um antigénio na superfície celular que estimula .uma respostaJmunitária contra a célula num receptor alogénico ou xenogénico. De acordo com a invenção, as células são tratadas antes do transplante para alterar pelo menos dois epítopos diferentes no antigénio da superfície celular. A alteração dos epítopos no antigénio resulta numa modificação de uma interaeção entre o antigénio e a célula hematopoiética (e.g., um linfócito T) no receptor, inibindo desse modo a rejeição das células transplantadas. A presente invenção baseia-se, pelo menos em parte, na verificação de que a alteração de dois epítopos diferentes no mesmo antigénio da superfície celular numa célula adequada para transplante é mais eficaz para inibir a rejeição da célula após o transplante do que a alteração de um único epítopo no antigénio. Este resultado é inesperado uma vez que se demonstrou anteriormente que a alteração de um

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único epítopo num antigénio de superfície celular era suficiente para inibir a rejeição da célula por um receptor.

Numa concretização preferida, o antigénio na superfície celular que é alterado é um antigénio do MHC de classe I. Assim, dois ou mais epítopos diferentes no mesmo antigénio do MHC de classe I numa célula são alterados antes do transplante da célula num receptor alogénico ou xenogénico. A alteração de dois ou mais epítopos no antigénio do MHC de classe I ocorre por contacto da célula in vitro com duas ou mais moléculas que se ligam aos epítopos. Preferivelmente, a molécula que se liga a um epítopo é um anticorpo, ou um seu fragmento ou derivado, que se liga ao epítopo mas não activa o complemento nem induz a lise da célula. Um fragmento de anticorpo preferido é um fragmento F(ab')2.

Os epítopos em antigénios do MHC de classe I humanos a alterar de acordo com a invenção incluem epítopos que são reconhecidos por um anticorpo monoclonal, W6/32, e um anticorpo monoclonal, PT85. Assim, uma combinação de moléculas preferida que pode ser utilizada para alterar dois epítopos diferentes no mesmo antigénio do MHC de classe I humano são fragmentos dos anticorpos monoclonais W6/32 e PT85, tais como fragmentos F(ab')2-

Em acordo, a presente invenção proporciona meios para reduzir a imunogenicidade de uma célula adequada para transplante num receptor alogénico ou xenogénico em que são alterados dois ou mais epítopos de um antigénio na superfície celular que estimula uma resposta imunitária contra a célula no receptor. As células da invenção podem melhorar grandemente a eficácia do transplante de enxertos alogénicos ou xenogénicos, com menos efeitos secundários do que drogas imunossupressoras como a ciclosporina.

Breve descricão dos desenhos

As Figuras 1A-1D são perfis de citometria de fluxo que representam a ligação de fragmentos F(ab')2 de PT85 marcados com FITC a células HeLa na presença de quantidades crescentes de fragmentos F(ab')2 de W6/32 ou fragmentos F(ab')2 de PT85, não marcados. 8/ 244 ΕΡ Ο 752 869 /ΡΤ

4 A Figura 2 é um perfil de citometria de fluxo que representa a ligação de concentrações crescentes de fragmentos F(ab')2 de PT85 marcados com FITC a células HeLa.

Descrição detalhada da invenção A presente invenção refere-se a células melhoradas para transplante em receptores alogénicos e xenogénicos. Os melhoramentos proporcionados pela invenção envolvem a alteração de pelo menos dois epítopos diferentes num antigénio na superfície da célula antes do transplante para inibir a rejeição da célula após o transplante num indivíduo receptor alogénico ou xenogénico. Em acordo, a invenção proporciona uma célula adequada para transplante que tem alterados pelo menos dois epítopos diferentes num antigénio antes do transplante para inibir a rejeição da célula após o transplante. Os epítopos num antigénio na superfície de uma célula do dador são alterados para modificar uma interacção entre o antigénio e uma célula hematopoiética num receptor. Num estado inalterado, o antigénio estimula uma resposta imunitária contra a célula (também referida aqui como célula do dador) quando a célula é administrada a um indivíduo heterólogo (também referido aqui como o receptor ou hospedeiro). Alterando epítopos no antigénio, o reconhecimento imunológico normal da célula do dador pelas células do sistema imunitário do receptor é modificado. O reconhecimento imunológico da forma alterada dos epítopos no antigénio resulta numa incapacidade de resposta de longo prazo específica para a célula do dador, no receptor. A alteração de dois ou mais epítopos num antigénio numa -célula do dador______ . antes de administrar a célula a um receptor interfere com a fase inicial de reconhecimento da célula do dador por células do sistema imunitário do hospedeiro subsequente à administração da célula. A interferência nesta fase inicial de reconhecimento da célula do dador pode induzir incapacidade de resposta imunológica ou tolerância no hospedeiro, evitando desse modo a indução de fases efectoras de uma resposta imunitária (e.g., produção de células T citotóxicas, produção rie anticorpos, etc.) que são por último responsáveis pela rejeição de células estranhas numa resposta imunitária normal. Tal como aqui se utiliza, o termo "alterado" abrange alterações que são feitas a dois ou mais epítopos no antigénio da célula do dador que reduzem a imunogenicidade do antigénio para desse modo interferir no reconhecimento imunológico do antigénio pelo sistema imunitário do receptor. Preferivelmente, a

8/ 244 EP 0 752 869 /PT incapacidade de resposta imunológica às células do dador no indivíduo receptor é gerada como um resultado da alteração do antigénio. Não de pretende incluir no termo alterado a eliminação completo do antigénio na célula do dador uma vez que a entrega de um sinal inadequado ou insuficiente às células imunitárias do hospedeiro (e.g., linfócitos T) pode ser necessária para conseguir a incapacidade de resposta imunológica.

Pelo menos dois epítopos diferentes num antigénio numa célula do dador são alterados de acordo com a invenção para modificar uma interaeção entre o antigénio e uma célula hematopoiética num receptor alogénico ou xenogénico, inibindo desse modo uma resposta imunitária específica contra a célula do dador no receptor. A interaeção entre o antigénio e a célula hematopoiética pode ser uma interaeção indirecta (e.g., mediada por factores solúveis que induzem uma resposta na célula hematopoiética) ou, mais preferivelmente, é uma interaeção directa (e.g., interaeção de ligação) entre o antigénio e a molécula presente na superfície da célula hematopoiética. Tal como aqui se utiliza, na expressão "célula hematopoiética" pretendem-se incluir linfócitos T, linfócitos B, monócitos e outras células que apresentam antigénios. Preferivelmente, os dois epítopos a alterar estão presentes num antigénio que interactua com um linfócito T no receptor (e.g., o antigénio normalmente liga-se a um receptor na superfície de um linfócito T).

Tal como aqui se utiliza, o termo "epítopo" refere-se a um determinante conformacional ou linear na estrutura de uma superfície celular, tal como uma proteína da superfície celular. Um epítopo numa proteína é uma porção da proteína que é especificamente reconhecida por uma molécula, e.g., um anticorpo ou um receptor de células T. Os epítopos conformacionais são formados em resultado de uma dobragem tridimensional de uma proteína enquanto os epítopos lineares dependem apenas da sequência de aminoácidos primária no epítopo. Tipicamente, os anticorpos ligam-se a epítopos conformacionais numa proteína imunogénica e uma única proteína pode ter muitos epítopos diferentes que podem ser ligados por diferentes anticorpos.

Numa concretização preferida, o antigénio na célula do dador a alterar é um antigénio do MHC de classe I. Assim, pelo menos dois epítopos diferentes no mesmo antigénio do MHC de classe I na célula do dador são alterados antes do transplante. Os antigénios do MHC de classe I estão presentes em quase

todos os tipos de células. Numa resposta imunitária normal, moléculas do MHC próprias funcionam para apresentar péptidos antigénicos ao receptor de células T (TCR) na superfície dos linfócitos T próprios. No reconhecimento imunitário de células alogénicas ou xenogénicas, os antigénios do MHC estranhos (mais provavelmente em conjunto com um péptido a si ligado) em células do dador são reconhecidos pelo receptor de células T em células T do hospedeiro para eliciar uma resposta imunitária. Os epítopos num antigénio do MHC de classe I numa célula do dador são alterados para interferir no reconhecimento do antigénio do MHC de classe I por células T num hospedeiro alogénico ou xenogénico (e.g., as porções do antigénio do MHC de classe I que são normalmente reconhecidas pelo receptor de células T são bloqueadas ou "mascaradas" de modo que o reconhecimento normal do antigénio do MHC de classe I deixa de poder ocorrer). Adicionalmente, uma forma alterada de um antigénio do MHC de classe I que é exposto a células T do hospedeiro (i.e., disponível para apresentação ao receptor de células T do hospedeiro) pode entregar um sinal inadequado ou insuficiente à célula T do hospedeiro de modo que, em vez de estimular uma resposta imunitária contra a célula alogénica ou xenogénica, é induzida incapacidade de resposta de células T específica para a célula do dador. Por exemplo, sabe-se que as células T que recebem um sinal inadequado ou insuficiente através do seu receptor de células T (e.g., por ligação a um antigénio do MHC na ausência de um sinal co-estimulante, tal como o proporcionado por B7) tornam-se anérgicas e não activadas e podem permanecer refractárias a nova estimulação durante longos períodos de tempo (veja-se por exemplo Damle et aí. (1981) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78:5096-5100; Lesslauer et ai (1986) Eur. J. Immunol. 16:1289-1295;. Gimmi, et...a/.. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 6575-6579; Linsley et ai. (1991) J. Exp. Med. 173:721-730; Koulova et ai (1991) J. Exp. Med. 173:759-762; Razi-Wolf, et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:4210-4214).

Em alternativa a antigénios do MHC de classe l, podem ser alterados dois ou mais epítopos em outros antigénios de superfície em células do dador. Por exemplo, podem ser alterados epítopos em antigénios do MHC de classe II. De modo semelhante aos antigénios do MHC de classe I, os antigénios do MHC de classe II funcionam para apresentar péptidos antigénicos ao receptor de células T em linfócitos T. Contudo, os antigénios do MHC de classe II estão presentes num número limitado de tipos de células (principalmente células B, macrófagos, células dendríticas, células de Langerhans e células epiteliais tímicas). Em

87 244 ΕΡ Ο 752 869 /ΡΤ 7 adição ou em alternativa aos antigénios do MHC, podem ser alterados epítopos em outros antigénios numa célula do dador que interactuam com moléculas nas células T do hospedeiro e que se sabe estarem envolvidas na rejeição imunológica de células alogénicas ou xenogénicas. Outros antigénios de células do dador que se sabe interactuarem com as células T do hospedeiro e contribuir para a rejeição de uma célula do dador incluem moléculas que funcionam para aumentar a avidez da interaeção entre a célula do dador e a célula T do hospedeiro. Devido a esta propriedade, estas moléculas são tipicamente referidas como moléculas de adesão (embora possam servir outras funções em adição ao aumento da adesão entre a célula do dador e a célula T do hospedeiro). Exemplos de moléculas de adesão preferidas que podem ser alteradas de acordo com a invenção incluem LFA-3, ICAM-1 e ICAM-2. Estas moléculas são ligandos para os receptores CD2 e LFA-1, respectivamente, em células T. Alterando uma molécula de adesão na célula do dador, (tal como LFA-3, ICAM-1 ou uma molécula com funcionamento semelhante), a capacidade das células T do hospedeiro para se ligarem e interactuarem com a célula do dador é reduzida. Tanto LFA-3 como ICAM-1 encontram-se em células endoteliais no interior de vasos sanguíneos em órgãos transplantados tais como rim e coração. Alterando estes antigénios pode-se facilitar o transplante de qualquer implante vascularizado, evitando o reconhecimento destes antigénios por linfócitos T do hospedeiro CD2+ e LFA-1 +. A presença de moléculas do MHC ou moléculas de adesão tais como LFA-3, ICAM-1, etc. numa célula do dador particular, pode ser determinada por procedimentos Standard conhecidos na arte. Por exemplo, a célula do dador pode reagir com um anticorpo marcado dirigido contra a molécula a detectar (e.g., molécula do MHC, ICAM-1, LFA-1 etc.) e a associação do anticorpo marcado com a célula pode ser medida através de uma técnica adequada (e.g., imuno-histoquímica, citometria de fluxo, etc.).

Um método preferido para alterar pelo menos dois epítopos diferentes num antigenio numa célula do dador para inibir uma resposta imunitária contra a célula consiste em colocar a célula em contacto com pelo menos duas moléculas diferentes que se ligam aos epítopos. Prefere-se que a célula a colocar em contacto com pelo menos duas moléculas diferentes que se ligam aos epítopos diferentes antes da administração da célula ao receptor (i.e., a célula é colocada em contacto com a molécula in vitro). Por exemplo, a célula 87 244 ΕΡ Ο 752 869 /ΡΤ 8

pode ser incubada com as moléculas que se ligam aos epítopos sob condições que permitem a ligação das moléculas aos epítopos e depois quaisquer moléculas não ligadas pudem ser removidas (tal como descrito na Exemplificação que se segue). Após a administração da célula do dador a um receptor, as moléculas permanecem ligadas aos epítopos no antigénio de superfície durante um tempo suficiente para interferir no reconhecimento imunológico pelas células do hospedeiro e induzir incapacidade de resposta no receptor.

Preferivelmente, a molécula para alterar um epítopo numa célula do dador é um anticorpo, ou um seu fragmento ou derivado, que retém a capacidade de se ligar ao epítopo. Para utilização em aplicações terapêuticas, é necessário que um anticorpo que se liga aos epítopos a alterar seja incapaz de fixar o complemento, evitando assim a lise da célula do dador. A fixação do complemento pelo anticorpo pode ser evitada por deleção de uma porção Fc de um anticorpo, utilizando um isotipo de anticorpo que não seja capaz de fixar o complemento, ou, menos preferivelmente, utilizando um anticorpo que fixa o complemento em conjunto com uma droga que inibe a fixação do complemento. Alternativamente, os resíduos de aminoácido dentro da região Fc de um anticorpo que são importantes para a activação do complemento (veja-se e.g., Tan et at. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:162-166; Duncan e Winter (1988) Nature 332: 738-740) podem ser mutados para reduzir ou eliminar a capacidade de activação do complemento de um anticorpo intacto. Do mesmo modo, os resíduos de aminoácido dentro da região Fc de um anticorpo que são necessários para a ligação da região Fc aos receptores de Fc (veja-se e.g. Canfield, S.M. e S.L. Morrison (1991) J. Exp. Med. 173:1483-1491; e Lund, J. et at. (1991) J. Immunol. 147:2657-2662) podem também ser mutados para reduzir ou eliminar a ligação ao receptor de Fc se for utilizado um anticorpo intacto.

Um fragmento de anticorpo preferido para alterar um epítopo é um fragmento F(ab')2. Os anticorpos podem ser fragmentados utilizando técnicas convencionais. Por exemplo, a porção Fc de um anticorpo pode ser removida através do tratamento de um anticorpo intacto com pepsina, gerando desse modo um fragmento F(ab')2. Num procedimento Standard para gerar fragmentos F(ab')2, incubam-se anticorpos intactos com pepsina imobilizada e a mistura de anticorpo digerida é aplicada a uma coluna de proteína A imobilizada. A porção

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Fc livre liga-se à coluna enquanto os fragmentos F(ab')2 passam através da coluna. Os fragmentos F(ab')2 podem ser adicionalmente purificados por HPLC ou FPLC. Os fragmentos F(ab')2 podem ser tratados para reduzir pontes de dissulfureto para produzir fragmentos Fab'.

Um anticorpo, ou seu fragmento ou derivado, a utilizar para alterar múltiplos epítopos num antigénio pode ser derivado de anti-soros policlonais contendo anticorpos reactivos com vários epítopos no antigénio. Mais preferivelmente, contudo, são alterados dois epítopos diferentes no mesmo antigénio utilizando dois anticorpos monoclonais diferentes que se ligam a dois epítopos diferentes no mesmo antigénio (e.g., um antigénio do MHC de classe I). Os anticorpos policlonais e monoclonais que se ligam a epítopos diferentes num ou mais antigénios podem ser preparados por técnicas Standard conhecidas na arte. Por exemplo, um mamífero (e.g., um ratinho, hamster ou coelho) pode ser imunizado com um antigénio (e.g., um antigénio do MHC de classe I) ou com uma célula que expresse o antigénio (e.g., na superfície celular) para eliciar uma resposta de anticorpos contra o antigénio no mamífero. Alternativamente, pode-se utilizar, para eliciar anticorpos, tecido ou um órgão completo que expresse o antigénio. O progresso da imunização pode ser monitorizado por detecção dos títulos de anticorpo no plasma ou no soro. Pode-se utilizar ELISA Standard ou outro imunoensaio com o antigénio para determinar os níveis de anticorpos. Após a imunização, podem ser obtidos anti-soros e, se desejado, anticorpos policlonais isolados dos soros. Para produzir anticorpos monoclonais, as células que produzem os anticorpos (linfócitos) podem ser recolhidas de um animal imunizado e fundidas com células de mieloma por procedimentos Standard de fusão de células somáticas imortalizando assim estas células e produzindo células de hibridoma. Estas técnicas são bem conhecidas na arte. Por exemplo, pode-se utilizar a técnica do hibridoma originalmente desenvolvida por Kohler e Milstein ((1975) Nature 256:495-497) bem como outras técnicas tais como a técnica de hibridoma de células B humanas (Kozbar et at., (1983) Immunol. Today 4:72), e a técnica do hibridoma com EBV, para produzir anticorpos monoclonais humanos (Cole et at. (1985) Monoclonal Antibodies in Câncer Therapy, Allen R. Bliss, Inc., páginas 77-96). As células de hibridoma podem ser pesquisadas imunoquimicamente quanto à produção de anticorpos especificamente reactivos com o antigénio, e os anticorpos monoclonais isolados.

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Outro método de produção de anticorpos específicos, ou fragmentos de anticorpos, reactivos contra epítopos num antigénio consiste em pesquisar bibliotecas de expressão dc genes que codificam imunoglobulinas, ou suas porções, expressas em bactérias com o antigénio (ou uma sua porção). Por exemplo, fragmentos Fab completos, regiões VH, regiões Fv e anticorpos de cadeia simples podem ser expressos em bactérias utilizando bibliotecas de expressão de fagos. Veja-se por exemplo Ward et al., (1989) Nature 341:544-546; Huse et at., (1989) Science 246:1275-1281; e McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-554. Alternativamente, pode-se utilizar o ratinho SCID-hu para produzir anticorpos, ou seus fragmentos (disponível de Genpharm). Os anticorpos com a especificidade de ligação apropriada que são produzidos por estas técnicas podem ser utilizados para alterar um antigénio numa célula do dador.

Um anticorpo, ou seu fragmento, produzidos num indivíduo não humano podem ser reconhecidos em vários graus como estranhos quando o anticorpo é administrado a um indivíduo humano (e.g., quando uma célula do dador com um anticorpo a si ligado é administrada a um indivíduo humano) e pode ser gerada no indivíduo uma resposta imunitária contra o anticorpo. Uma abordagem para minimizar ou eliminar este problema consiste em produzir derivados de anticorpos quiméricos ou humanizados, i.e., moléculas de anticorpo compreendendo porções que são derivadas de anticorpos não humanos e porções que são derivadas de anticorpos humanos. As moléculas de anticorpos quiméricos podem incluir, por exemplo, o domínio de ligação ao antigénio de um anticorpo de ratinho, rato ou outra espécie, com regiões constantes humanas. Foram descritas várias abordagens para a preparação de anticorpos quiméricos. Veja-se, por exemplo, Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 81, 6851 (1985); Takeda et at., Nature 314, 452 (1985), Cabilly et at., Pat. U.S. No. 4 816 567; Boss et al., Pat. U.S. No. 4 816 397; Tanaguchi et al., Publicação de Patente Europeia EP 171 496; Publicação de Patente Europeia 0 173 494, Patente do Reino Unido GB 2177096B. Para utilização em aplicações terapêuticas, prefere-se que um anticorpo utilizado para alterar epítopos diferentes num antigénio não contenha uma porção Fc. Assim, um fragmento F(ab')2 humanizado em que partes da região variável do anticorpo, especialmente as regiões de estrutura conservada do domínio de ligação ao antigénio, são de origem humana, e apenas as regiões hipervariáveis são de origem não humana é um derivado de anticorpo preterido, tstas moléculas de

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EP 0 752 869 /PT 11 imunoglobulina alteradas podem ser produzidas por qualquer uma de várias técnicas conhecidas na arte, (e.g., Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 80, 7308-7312 (1983); Kozbor et al., Immuno/ogy Today, 4, 7279 (1983); Olsson et a!., Meth. EnzymoL, 92, 3-16 (1982)), e são preferivelmente produzidos de acordo com os ensinamentos da Publicação do PCT W092/06193 ou EP 0 239 400. Os anticorpos humanizados podem ser produzidos comercialmente, por exemplo, por Scotgen Limited, 2 Holly Road, Twickenham, Middlesex, Grã Bretanha. A capacidade de dois diferentes anticorpos monoclonais que se ligam ao mesmo antigénio, para se ligarem a epítopos diferentes no antigénio, pode ser determinada utilizando um ensaio de ligação de competição como descrito na Exemplificação. Em resumo, um anticorpo monoclonal é marcado e utilizado para corar células que expressam o antigénio. É então avaliada a capacidade do segundo anticorpo monoclonal não marcado para inibir a ligação do primeiro anticorpo monoclonal marcado ao antigénio nas células. Se o segundo anticorpo monoclonal se liga a um epítopo diferente, no antigénio, daquele a que se liga o primeiro anticorpo, o segundo anticorpo será incapaz de inibir competitivamente a ligação do primeiro anticorpo ao antigénio.

Cada um dos antigénios da superfície celular possuindo dois ou mais epítopos a alterar, e.g., os antigénios do MHC de classe I, os antigénios do MHC de classe II, LFA-3 e ICAM-1, é bem caracterizado, e os anticorpos reactivos com estes antigénios estão comercialmente disponíveis. Por exemplo, está disponível um anticorpo reactivo com antigénios do MHC de classe I humanos (i.e., um anticorpo anti-HLA de classe I), W6/32, de American Tissue Culture Society (ATCC HB 95). Este anticorpo foi criado contra membranas de linfócitos de amígdala humana e liga-se a HLA-A, HLA-B e HLA-C (Barnstable, C.J. et al. (1978) Cell 14:9-20). Outro anticorpo anti-MHC de classe I que pode ser utilizado é ο PT85 (veja-se Davis, W.C. et al. (1984) Hybridoma Technology in Agricultural and Vetrinary Research. N.J. Stern e H.R. Gamble, eds., Rownman and Allenheld Publishers, Totowa, NJ, p. 121; comercialmente disponível de Veterinary Medicine Research Development, Pullman WA). Este anticorpo foi criado contra antigénios de leucócitos de suíno (SLA) e liga-se a antigénios de classe I de várias espécies diferentes (e.g., de porco, humana, de ratinho, de cabra). Um anticorpo anti-ICAM-1 pode ser obtido de AMAC, Inc., 87 244 ΕΡ Ο 752 869 /ΡΤ 12

Maine. As células de hibridoma que produzem anti-LFA-3 podem ser obtidas de American Type Culture Collection, Rockville, Maryland.

Tal como demonstrado na Exemplificação, a utilização combinada de fragmentos F(ab')2 dos anticorpos monoclonais W6/32 e PT85 para alterar dois epítopos diferentes em antigénios do MHC de classe I em células humanas de ilhéus pancreáticos é mais eficaz na inibição da rejeição das células de ilhéus quando transplantadas do que a utilização de W6/32 ou PT85 sozinhos. Pode-se demonstrar que o W6/32 e ο PT85 reconhecem epítopos diferentes em antigénios do MHC de classe I humanos através de um ensaio de ligação competitiva, em que quantidades crescentes de W6/32 não marcado são incapazes de inibir a ligação de PT85 marcado a células humanas (veja-se a Exemplificação e as Figuras 1A-1D). Em acordo, os epítopos preferidos a alterar em antigénios do MHC de classe I humanos são os epítopos que são reconhecidos pelos anticorpos monoclonais W6/32 e PT85. Estes epítopos podem ser alterados utilizando W6/32 e PT85 em combinação (e.gfragmentos F(ab')2 de W6/32 e de PT85, como descrito na Exemplificação) ou utilizando outros anticorpos monoclonais que reconhecem os mesmos epítopos que W6/32 e PT85. Um anticorpo monoclonal que reconhece o mesmo epítopo que W6/32 ou PT85 pode ser preparado por técnicas Standard para a produção de anticorpos monoclonais (aqui descritos) e depois ser identificado com base na capacidade do anticorpo monoclonal para inibir competitivamente a ligação quer de W6/32 quer de PT85 a células humanas (e.g., um anticorpo monoclonal que reconhece o mesmo epítopo que PT85 inibirá competitivamente a ligação de PT85 a células humanas).

Dois ou mais anticorpos adequados, ou seus fragmentos ou derivados, para utilização na invenção, podem ser identificados com base na sua capacidade para inibir uma rejeição imunológica de células alogénicas ou xenogénicas utilizando um protocolo tal como o descrito na Exemplificação. Em resumo, os anticorpos (ou fragmentos de anticorpo) são incubados durante um curto período de tempo (e.g., 30 minutos à temperatura ambiente) com células ou tecido a transplantar, e qualquer anticorpo não ligado é removido por lavagem. As células ou tecido são então transplantados num animal receptor. A capacidade do pré-tratamento com múltiplos anticorpos para inibir ou evitar a rejeição das células ou tecido transplantados é então determinada por

87 244 ΕΡ Ο 752 869 /ΡΤ 13 monitorização da função do enxerto e/ou por monitorização de sinais de rejeição das células ou tecido em comparação com controlos não tratados.

Podem ser utilizadas outras moléculas que se ligam a um epítopo num antigénio numa célula do dador e produzem um resultado funcionalmente semelhante ao de anticorpos, ou seus fragmentos ou derivados, (e.g., outras moléculas que interferem na interacção do antigénio com uma célula hematopoiética e induzem incapacidade de resposta imunológica), para alterar o epítopo na célula do dador. Uma destas moléculas é uma forma solúvel de um ligando para um antigénio (e.g., um receptor) na célula do dador que possa ser utilizado para alterar um epítopo no antigénio na célula do dador. Por exemplo, uma forma solúvel de CD2 (i.e., compreendendo o domínio extracelular de CD2 sem o domínio transmembranar ou citoplasmático) pode ser utilizada para alterar um epítopo em LFA-3 na célula do dador por ligação a LFA-3 em células do dador de uma maneira análoga a um anticorpo. Alternativamente, pode ser utilizada uma forma solúvel de LFA-1 para alterar um epítopo em ICAM-1 na célula do dador. Uma forma solúvel de um ligando pode ser preparada por procedimentos Standard de ADN recombinante, utilizando um vector de expressão recombinante contendo ADN que codifica o ligando abrangendo apenas o domínio extracelular (i.e., sem ADN que codifica os domínios transmembranar e citoplasmático). 0 vector de expressão recombinante que codifica o domínio extracelular do ligando pode ser introduzido nas células do hospedeiro para produzir um ligando solúvel, que pode então ser isolado. Os ligandos solúveis úteis têm uma afinidade de ligação para o receptor na célula do dador suficiente para permanecerem ligados ao receptor para interferir no reconhecimento imunológico e induzir incapacidade de resposta quando a célula é administrada a um receptor (e.g., preferivelmente, a afinidade para ligação do ligando solúvel ao receptor é de pelo menos cerca de 10'7 M). Adicionalmente, o ligando solúvel pode estar na forma de uma proteína de fusão compreendendo a porção de ligação ao receptor do ligando fundida com outra proteína ou porção de uma proteína. Por exemplo, podem-se utilizar uma proteína de fusão de imunoglobulina que inclui um domínio extracelular, ou uma porção funcional de CD2 ou LFA-1 ligada a uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina (e.g., a charneira, regiões CH2 e CH3 de uma imunoglobulina humana tal como IgG 1). Proteínas de fusão de imunoglobulinas podem ser preparadas, por exemplo, de acordo com os ensinamentos de Capon, D.J. et ai. (1989) Nature 337:525-531 e Pat. U.S. No. 5 116 964 de Capon e Lasky. 87 244 ΕΡ Ο 752 869 /ΡΤ 14

Outro tipo de molécula que pode ser utilizada para alterar um antigénio do MHC {e.g., anliyénio do MHC de classe I) é um pcptido que se liga ao antigénio do MHC e interfere na interacção do antigénio do MHC com um linfócito T. Numa concretização, o péptido solúvel imita uma região do receptor de células T em contacto com o antigénio do MHC. Este péptido pode ser utilizado para interferir na interacção do receptor de células T intacto (num linfócito T) com o antigénio do MHC. Este péptido liga-se a uma região da molécula do MHC que é especificamente reconhecida por uma porção do receptor de células T (e.g., a volta alfa-1 ou alfa2 de um antigénio do MHC de classe I), alterando desse modo o antigénio do MHC de classe I e inibindo o reconhecimento do antigénio pelo receptor de células T. Noutra concretização, o péptido solúvel imita uma região de uma molécula de superfície de células T em contacto com o antigénio do MHC, tal como uma região da molécula CD8 em contacto com um antigénio do MHC de classe I ou uma região de uma molécula CD4 em contacto com um antigénio do MHC de classe II. Por exemplo, um péptido que se liga a uma região da volta alfa-3 de um antigénio do MHC de classe I pode ser utilizado para inibir a ligação de CD8 ao antigénio, inibindo desse modo o reconhecimento do antigénio pelas células T. Os péptidos derivados do receptor de células T foram utilizados para inibir respostas imunitárias restritas do MHC de classe I (veja-se e.g., Clayberger, C. et al. (1993) Transplant Proc. 25:477-478) e prolongar a sobrevivência de enxertos de pele alogénico in vivo quando injectados subcutaneamente no receptor (veja-se e.g., Goss, J.A. et aí. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:9872-9876). ___________

Prefere-se que um anticorpo, ou seu fragmento ou derivado, que é utilizado para alterar um epítopo, tenha uma afinidade para a ligação ao seu epítopo alvo de pelo menos 10'7M. A afinidade de um anticorpo, ou outra molécula, para ligação a um epítopo num antigénio pode ser determinada por técnicas convencionais (veja-se Masan, D.W. e Williams, A.F. (1980) Biochem. J. 187:1-10). Em resumo, o. anticorpo a testar é marcado com I125 e incubado com células que expressam o antigénio em concentrações crescentes até se atingir o equilíbrio. Os dados estão representados graficamente como [anticorpo ligado]/[anticorpo livre] versus [anticorpo ligado] e o declive da linha é igual ao kD (análise Scatchard). 87 244 ΕΡ Ο 752 869 /ΡΤ 15

Podem-se utilizar ο mesmo ou diferentes tipos de moléculas para alterar dois ou mais epítopos diferentes numa célula do dador. Numa concretização preferida, dois anticorpos diferentes (ou seus fragmentos) são utilizados para alterar dois epítopos diferentes. Alternativamente, um epítopo pode ser alterado com um tipo de molécula e um segundo epítopo pode ser alterado com outro tipo de molécula. Por exemplo, dois epítopos diferentes no mesmo antigénio do MHC de classe I podem ser alterados utilizando um anticorpo anti-MHC de classe I e um péptido de ligação ao MHC.

Em alternativa à ligação de uma ou mais moléculas (e.g., anticorpos) a epítopos num antigénio numa célula do dador para inibir a rejeição imunológica da célula, os epítopos podem ser alterados por outros meios. Por exemplo, os epítopos podem ser alterados directamente (e.g., mutados) de modo a que deixem de interactuar normalmente com a célula hematopoiética (e.g., um linfócito T) num receptor alogénico ou xenogénico e induzir incapacidade de resposta imunológica à célula do dador, no receptor. Por exemplo, uma forma alterada de um antigénio do MHC de classe I ou molécula de adesão (e.g., LFA-3 ou ICAM-1), em que dois ou mais epítopos estão mutados, pode ser criada por mutagénese e seleccionada em cultura in vitro com base na incapacidade da molécula para contribuir para a activação de células T. Uma forma alterada de um antigénio do MHC de classe I ou molécula de adesão entrega um sinal inadequado ou insuficiente a uma célula T após ligação a um receptor na célula T. Um ácido nucleico que codifica a forma mutada do antigénio (i.e., o antigénio com epítopos mutados) pode então ser inserido no genoma de um animal não humano, quer na forma de um_transgene quer_por_ recombinação homóloga (para substituir o gene endógeno que codifica o antigénio do tipo selvagem). As células do animal não humano que expressam a forma mutada do antigénio podem então ser utilizadas como célula do dador para transplante num receptor alogénico ou xenogénico.

Em acordo, a presente invenção proporciona um método melhorado para reduzir a imunogenicidade de uma célula para transplante num indivíduo receptor de células alogénicas ou xenogénicas. Antes do transplante as células são colocadas em contacto com pelo menos duas moléculas diferentes que se ligam a pelo menos dois epítopos diferentes num antigénio na superfície celular para alterar o antigénio para inibir a rejeição da célula quando transplantada no indivíduo receptor. Estas células podem então ser administradas a um indivíduo.

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Preferivelmente, ο antigénio que é alterado é um antigénio do MHC de classe I e as moléculas com que a célula é colocada em contacto são anticorpos ou seus fragmentos ou derivados, tais como fragmentos F(ab')2. Para células humanas, preferem-se os anticorpos que se ligam a epítopos reconhecidos pelos anticorpos monoclonais W6/32 e PT85. Este método é mais eficaz para reduzir a imunogenicidade de uma célula para transplante do que o contacto da célula com uma única molécula que se liga a um único epítopo num antigénio na célula.

No método da invenção para transplante, a célula é administrada a um indivíduo (i.e., transplantada num indivíduo) após alteração de pelo menos dois epítopos diferentes num antigénio na superfície da célula do dador. No termo "indivíduo" pretendem-se incluir mamíferos, preferivelmente humanos, em que uma resposta imunitária é eliciada contra células alogénicas ou xenogénicas. A célula pode ser administrada a um indivíduo por qualquer via apropriada que resulte na entrega da célula numa localização desejada no indivíduo. Por exemplo, as células podem ser administradas por via intravenosa, subcutânea, intramuscular, intracerebral, subcapsular (e.g., sob a cápsula renal) ou intraperitoneal. As células podem ser administradas num transportador fisiologicamente compatível, tal como uma solução salina tamponada. Quando as células estão no interior de um tecido ou órgão, o tecido ou órgão a transplantar numa localização adequada no indivíduo por técnicas convencionais para administrar as células ao indivíduo.

Os métodos da invenção podem ser aplicados a qualquer tipo de célula que seja adequada para transplante (i.e, qualquer tipo de célula que possa ser isolada ou obtida numa forma que possa ser transplantada para outro indivíduo). A célula pode ser uma célula humana ou pode ser uma célula não humana. Uma célula não humana preferida é uma célula porcina. Os tipos de célula preferidos para utilização no método da invenção são células que podem proporcionar uma função terapêutica numa doença ou desordem. Os exemplos destas células incluem células musculares (e.g., mioblastos, miócitos, miotubos), células hepáticas, células de ilhéus pancreáticos, células neuronais e células hematopoiéticas. Por exemplo, as células musculares podem ser transplantadas em indivíduos que sofrem de distrofia muscular (e.g., distrofia muscular de Duchenne), as células de ilhéus pancreáticos podem ser transplantadas num indivíduo que sofre de diabetes, as células neurais podem ser transplantadas

87 244 ΕΡ Ο 752 869 /ΡΤ 17 num indivíduo que sofre de doença de Parkinson ou doença de Huntington, as células hepáticas podem ser transplantadas num indivíduo com disfunção de células hepáticas (e.g. em hipercolesterolemia, hemofilia ou cnfisema hereditário), e as célula hematopoiéticas podem ser transplantadas em pacientes com disfunção hematopoiética ou imunológica.

Em adição a permitir o transplante de células, a invenção pode facilitar o transplante de tecidos ou órgãos, e.g., rim, coração, fígado, pulmão, cérebro e tecido muscular. Em acordo, as células da invenção podem estar no interior de um tecido ou órgão. Quando a célula está no interior de um tecido, podem ser alterados epítopos diferentes num antigénio de superfície nas células (e.g., um antigénio do MHC de classe I) por contacto de todo o tecido com pelo menos duas moléculas diferentes (e.g., anticorpos) que se ligam a epítopos diferentes no antigénio de superfície (e.g., incubando o tecido numa solução contendo as moléculas que se ligam aos epítopos). Alternativamente, quando a célula está no interior de um órgão, os epítopos em antigénios na superfície das células (e.g., antigénios do MHC de classe I) podem ser alterados por perfusão do órgão com uma solução contendo pelo menos duas moléculas diferentes (e.g. anticorpos) que se ligam a pelo menos dois epítopos diferentes nas células do órgão. Os órgãos são perfundidos com uma solução contendo as moléculas utilizando técnicas convencionais de perfusão de órgãos.

Embora a invenção tenha sido descrita em particular em relação à alteração de dois epítopos diferentes na célula do dador, notar-se-á que poderá haver ainda um benefício adicional na modificação de epítopos adicionais na célula do dador. Em acordo, as células que têm mais de dois epítopos alterados (e.g., três, quatro, cinco, etc. epítopos alterados), e métodos que utilizam estas células, estão dentro do âmbito da presente invenção. A presente invenção é adicionalmente ilustrada pela Exemplificação que se segue que não deve ser entendida como limitante. O conteúdo de todas as referências c patentes publicadas e pedidos de patente citados neste pedido são aqui incorporados por referência.

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ΕΡ Ο 752 869 /ΡΤ EXEMPLIFICAÇÃO

Este exemplo envolve o transplante xenogénico de células de ilhéus humanas positivas para MHC I em receptores ratinhos Balb/c não imunossuprimidos.

Ilhéus humanos recentemente isolados foram pré-tratados, antes do transplante, com o seguinte:

Grupo A: sem tratamento

Grupo B: máscara de MHC I com F(ab')2 de W6/32

Grupo C: máscara de MHC I com F(ab')2 de PT85

Grupo D: máscara de MHC I com W6/32 e PT85

Isolaram-se as células de ilhéus e purificaram-se de acordo com métodos Standard, obtendo-se preparações de ilhéus humanos limpos, isentas de contaminação endotelial e excrescências de fibroblastos.

Preparação de fragmentos FtabMo

Fragmentos F(ab')2 de anticorpos W6/32 e PT85 foram gerados utilizando pepsina imobilizada, como se segue. Adicionou-se o anticorpo purificado, a 20 mg/ml em tampão de digestão a pH 4,7 e digerido durante 4,0 horas. O digerido bruto foi removido da pepsina e imediatamente neutralizado com tampão de ligação a pH 7,0. A mistura de anticorpos foi aplicada numa coluna de Proteína A imobilizada e o eluado foi recolhido para os fragmentos F(ab')2. Realizou-se então a diálise contra solução salina tamponada com fosfato durante 24 h utilizando uma tubagem com limite de exclusão de pesos moleculares de 50 000 para livrar o digerido de fragmentos Fc contaminantes. Adicionou-se tampão CHAPS ao saco de diálise numa concentração de 10 mM. A conclusão do digerido e a purificação do F(ab*)2 foram monitorizadas por coloração com prata de géis de poliacrilamida SDS a 15%. A purificação final dos fragmentos foi conseguida utilizando uma coluna de HPLC de Superose 12. A conclusão da remoção de Fc foi demonstrada num ensaio in vitro em que a ligação do material a uma célula alvo foi seguida pela adição de complemento, e a citólise das células alvo pré-carregadas foi medida por libertação de crómio. A ligação de W6/32 e PT85 a epítopos diferentes em antigénios do MHC de classe I foi demonstrada num ensaio de ligação de competição. Como

87 244 ΕΡ Ο 752 869 /ΡΤ 19 controlo, utilizaram-se fragmentos F(ab')2 de PT85 marcados com FITC para colorir células HeLa, que foram analisadas por citometria de fluxo. Tal como mostrado na Figura 2, quantidades crescentes de fragmentos F(ab')2 de PT85 marcados com FITC resultaram em quantidades crescentes de coloração de superfície de células HeLa. Em seguida, os fragmentos F(ab')2 de PT85 marcados com FITC (quer 3 μg quer 1 μg) foram utilizados para corar células HeLa na presença de quantidades crescentes de fragmentos F(ab')2 não marcados, quer de W6/32 não marcado quer de PT85 não marcado. A Figura 1A, representa a ligação de 3 μg de PT85 marcado com FITC na presença de quantidades crescentes de W6/32 não marcado. De modo semelhante, A Figura 1B representa a ligação de 1 pg de PT85 marcado com FITC na presença de quantidades crescentes de W6/32 não marcado, enquanto a Figura 1C representa a ligação de 3 pg de PT85 marcado com FITC na presença de quantidades crescentes de PT85 não marcado. A Figura 1D representa a ligação de 1 pg de PT85 marcado com FITC na presença de quantidades crescentes de PT85 não marcado. Tal como mostrado nos perfis de citometria de fluxo nas Figuras 1A-1D, quantidades crescentes de PT85 não marcado inibem a ligação de fragmentos F(ab')2 de PT85 marcados com FITC a células HeLa, enquanto quantidades crescentes de W6/32 não marcado não inibem a ligação de fragmentos F(ab')2 de PT85 marcados com FITC a células HeLa. Isto demonstra que o W6/32 não inibe competitivamente a ligação de PT85 e portanto liga-se a um epítopo diferente em antigénios do MHC de classe I do que ο PT85. Máscara de células de ilhéus pancreáticos

Incubaram-se fragmentos F(ab')2 preparados como descrito atrás, com células de ilhéus humanos numa concentração de 1 μg de anticorpo por aproximadamente 1 milhão de células durante 30 min. à temperatura ambiente. Após a incubação, os ilhéus tratados ou não tratados foram lavados uma vez com tampão de Hanks contendo soro fetal de vitelo a 2% inactivado pelo calor e depois foram imedialarnente transplantados sob a cápsula renal dc um ratinho por injecção com seringa. Os ilhéus humanos foram transplantados nos quatro dias que se seguiram ao isolamento. Foram transplantados dezasseis animais (quatro por grupo) com ilhéus tratados ou não tratados. Catorze dias após a injecção, desafiou-se cada animal com uma injecção de glucose (30% p/v) após um jejum de uma noite. Obteve-se uma amostra de sangue de cada animal a 0 /'-CesSS&Z <J» tf 87 244 ΕΡ Ο 752 869 /ΡΤ 20 45-60 min. após a injecção e analisou-se quanto a insulina humana num radioimunoensaio empregando um anticorpo que não reage de modo cruzado com insulina de ratinho. Os resultados destas determinações estão apresentados abaixo (Tabela 1):

Tabela 1

Concentrações no plasma de insulina humana em ratinhos catorze dias após a injecção de ilhéus humanos sob a cápsula renal. Tratamento dos ilhéus Cone. de insulina no plasma aos 14 dias Nenhum 1,6 uU/ml (Grupo A) 2,2 2,3 * F(ab')2 de W6/32 1.7 (Grupo B) 1,6 1.7 1.7 F(ab')2 de PT85 3.8 (Grupo C) 1.1 1.1 * Combinação de W6/32 e PT85 3.5 (Grupo D) 3.8 3.8 3.8 *o animal morreu antes da colheita c e sangue

Os dados da Tabela 1 demonstram que o tratamento de ilhéus humanos com uma preparação de F(ab')2 sozinho foi bem sucedido em permitir a aceitação do enxerto em apenas um de sete casos. A combinação de ambos os anticorpos permitiu a aceitação do enxerto em quatro de quatro animais.

Outras concretizações

Outras concretizações estão dentro do âmbito da invenção. Por exemplo, os procedimentos descritos atrás para o tratamento de células de ilhéus podem ser utilizados para tratar outras células parenquimatosas transplantadas tais 87 244 ΕΡ Ο 752 869 /ΡΤ 21

«sitV* & como células hepáticas. Tal como as células de ilhéus, as células hepáticas expressam antigénios estimulantes de rejeição, incluindo antigénios do MHC I. O tecido do fígado pode ser obtido de dadores em morte cerebral ou de animais não humanos tais como porcos. As células podem ser dissociadas por digestão com colagenase. As células viáveis podem ser obtidas e lavadas por centrifugação (a 700xg), eluição e ressuspensão. Os epítopos num antigénio de superfície (e.g., antigénio do MHC de classe I) nas células hepáticas foram alterados por tratamento com dois ou mais fragmentos F(ab')2 de diferentes especificidades como descrito atrás. Após a alteração dos epítopos, as células foram administradas através da veia umbilical ao fígado do paciente receptor.

Noutra concretização, células nervosas obtidas de uma fonte (tal como um aborto) são tratadas com uma combinação de fragmentos (Fab')2 de diferentes especificidades e estereotaxicamente localizados no interior da área desejada do cérebro, tal como o corpo estriado. Utilizaram-se neurónios dopaminérgicos ou GABA-érgicos para o tratamento da doença de Parkinson ou de Huntington, respectivamente.

Noutra concretização, células musculares podem ser obtidas de um dador (e.g., por biopsia de um dador vivo relacionado ou de um dador em morte cerebral) utilizando uma alicate de corte de calibre 14-16 numa incisão na pele de 1-2 polegadas. O tampão de músculo fresco pode ser ligeiramente digerido numa suspensão de células individuais utilizando colagenase, tipsina e dispase a 37°C. Removeram-se os detritos flutuantes com uma pipeta e lavagens com meios e contou-se a pelete de células viáveis após centrifugação a 1000 rpm durante 10 minutos. A contagem de células é então utilizada para calcular a quantidade de fragmentos de anticorpo a utilizar para alterar epítopos no antigénio de superfície nas células musculares. As células musculares são tratadas com uma combinação de fragmentos (Fab')2 de diferentes especificidades, como descrito atrás, e injectadas intramuscularmente num paciente receptor com necessidade de um aumento de reserva muscular, e.g., um paciente idoso com enfraquecimento muscular grave, ou injectadas num grupo de músculos de um paciente afectado com distrofia muscular de Becker ou de Duchenne.

Em ainda outra concretização, a células que são alteradas de acordo com a invenção são geneticamente modificadas para expressar um produto génico. 22 87 244 ΕΡ Ο 752 869 /ΡΤ

As células geneticamente modificadas podem ser transplantadas num indivíduo receptor para entregar o produto génico ao indivíduo. As células podem ser geneticamente modificadas para expressar um produto génico por introdução de ácido nucleico que codifica o produto génico na célula. Por exemplo, uma célula pode ser infectada com um vírus recombinante (e.g., retrovírus, adenovírus) que contém o ácido nucleico de interesse. Uma célula não humana que é geneticamente modificada para expressar um produto génico humano pode ser ulili^add para entregar o produto génico humano a um indivíduo humano através da alteração de dois ou mais epítopos na superfície da célula não humana e transplante da célula no indivíduo receptor.

Em ainda outra concretização, um indivíduo receptor em que células alteradas da invenção foram transplantadas é também tratado com um agente inibidor de células T para inibir adicionalmente a rejeição das células transplantadas. 0 agente inibidor de células T inibe a actividade das células T. Por exemplo, o agente inibidor de células T pode ser uma droga imunossupressora. Uma droga imunossupressora preferida é a ciclosporina A. Outras drogas imunossupressoras que podem ser utilizadas incluem FK506 e RS-61443. Estas drogas imunossupressoras podem ser utilizadas em conjunto com um esteróide (e.g., glucocorticóides tais como prednisona, metilprednisolona e dexametasona) ou agentes quimioterapêuticos (e.g., azatioprina e ciclofosfamida), ou ambos. Alternativamente, o agente inibidor de células T pode ser um ou mais anticorpos que esgotam a actividade das células T, tais como anticorpos dirigidos contra moléculas de superfície de células T (e.g., anticorpos anti-CD2, anti-CD3, anti-CD4 e/ou anti-CD8). EQUIVALENTES ---------- --------------

Os peritos na arte reconhecerão, ou poderão determinar, utilizando não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes das concretizações específicas da invenção aqui descritas. Estes equivalentes pretendem-se abrangidos pelas reivindicações que se seguem.

Lisboa,

Por DIACRIN, INC. - O AGENTE OFICIAL -

Eng.” ANTÓNIO JOÃO DA CUNHA FERREIRA Ag. Of. Pr. Ind. Rua das Flores, 74-4.° 1200-195 LISBOA

Claims

87 244 ΕΡ Ο 752 869 /ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Célula (e.g., uma cclula humana ou não humana) adequada para transplante possuindo um antigénio na sua superfície (e.g., um antigénio do MHC de classe I) que é capaz de estimular uma resposta imunitária contra a célula num indivíduo receptor alogénico ou xenogénico, em que pelo menos dois epítopos diferentes no antigénio são alterados para inibir a rejeição da célula quando transplantada num indivíduo receptor e/ou para modificar uma interacção entre o antigénio e um linfócito T num indivíduo receptor alogénico ou xenogénico.
2. Célula de acordo com a reivindicação 1, em que os epítopos são alterados por contacto da célula antes do transplante com pelo menos duas moléculas diferentes que se ligam aos epítopos.
3. Célula de acordo com a reivindicação 2, em que pelo menos uma molécula que se liga a um epítopo é: (a) um anticorpo, ou seu fragmento ou derivado, que se liga ao epítopo mas não activa o complemento nem provoca a lise da célula, sendo o anticorpo ou seu fragmento ou derivado, opcionalmente, um fragmento F{ab')2, ou; (b) um péptido que se liga a um antigénio do MHC de classe I.
4. Célula de acordo com a reivindicação 3, em que os fragmentos F(ab')2 se ligam a epítopos do MHC de classe I reconhecidos por anticorpos monoclonais W6/32 e PT85, sendo os fragmentos F(ab')2 opcionalmente fragmentos F(ab')2 de anticorpos monoclonais W6/32 e PT85.
5. Célula de acordo com a reivindicação 2, em que as moléculas que se ligam aos epítopos são péptidos que se ligam a um antigénio do MHC de classe I.
6. Célula de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores que é uma célula de ilhéu pancreático, uma célula do fígado, uma célula neural, uma célula muscular ou uma célula hematopoiética.
7. Método para reduzir a imunogenicidade de uma célula para transplante possuindo um antigénio (e.g., um antigénio do MHC de classe I) na sua 87 244 ΕΡ Ο 752 869 /ΡΤ 2/2 superfície que estimula uma resposta imunitária contra a célula num indivíduo receptor alogénico ou xenogénico, compreendendo colocar em contacto a cclula, antes do transplante, com pelo menos duas moléculas diferentes que se ligam a pelo menos dois epítopos diferentes no antigénio na superfície da célula para alterar o antigénio para inibir a rejeição da célula quando transplantada num indivíduo receptor, sendo as moléculas que se ligam aos diferentes epítopos no antigénio do MHC de classe I, opcionalmente, anticorpos, ou seus fragmentos ou derivados, que se ligam ao antigénio mas não activam o complemento nem provocam a lise da célula.
8. Método de acordo com a reivindicação 7 em que os anticorpos, ou seus fragmentos ou derivados, são fragmentos F(ab')2, em que os fragmentos F(ab')2 se ligam opcionalmente a epítopos reconhecidos por anticorpos monoclonais W6/32 e PT85, sendo os fragmentos F(ab')2 por exemplo fragmentos F(ab')2 de anticorpos monoclonais W6/32 e PT85.
9. Célula de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, para utilização em medicina.
10. Utilização de uma célula de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 na preparação de um transplante para utilização em alotransplante ou xenotransplante.
11. Utilização de acordo com a reivindicação 10 em que a célula tem um antigénio do MHC de classe I na sua superfície e em que pelo menos-dois epítopos diferentes no referido antigénio estão alterados como descrito na reivindicação 1. Lisboa, Por DIACRIN, INC. - 0 AGENTE OFICIAL -