PT745122E - Receptor de galanina, ácidos nucleicos, células transformadas e utilizações - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

"RECEPTOR DE GALANINA, ÁCIDOS NUCLEICOS, CÉLULAS TRANSFORMADAS E UTILIZAÇÕES" A presente invenção refere-se a novos polipéptidos e o material genético que permite a sua expressão. Mais particularmente, esta refere-se a novos polipéptidos possuindo uma actividade de receptor da galanina. A galanina é um neuropéptido ubíquo de 29 aminoácidos nos mamíferos (30 no homem) que controla as funções biológicas variadas: (i) secreções endócrinas (insulina, somatostatina, glucagão, hormona de crescimento ...), (ii) tonicidade muscular no tracto digestivo, (iii) controlo do comportamento (prisão alimentar, nocicepção, aprendizagem, memória, dor...) por efeito neuro-modulador ao nível do sistema nervoso central. Esta lista não exaustiva dos efeitos da galanina, põe em evidência o mais frequente no animal, explica o interesse crescente dos farmacologistas para este neuropéptido. As moléculas selectivas (agonista ou antagonista da galanina) constituirão os agentes farmacológicos potenciais em endocrinologia, em neurologia e em psiquiatria (Bartfai et al., (1992) TIPS 13, 312-317 O estudo do mecanismo de acção da galanina mostra que actua

por intermédio de receptores membranares específicos. A caracterização bioquímica e molecular do receptor (Chen et al., (1993) PNAS 90, 3845-3849, Fisone et al., (1989) Eur. J.

Biochem. 180, 269-276) indicam que pertencem à família dos receptores acoplados às proteínas G. De acordo com os tecidos 1 alvo, o péptido inibe a adenilato ciclase, diminui o cálcio intracelular, bloqueia os canais cálcicos dependentes da voltagem ou activam os canais potássicos sensíveis a ATP. Os estudos de relações estrutura-actividade, com o auxílio de fragmentos C e N-terminais da galanina e de péptidos quiméricos mostraram que, (1) qualquer que seja o tecido, nenhuma sequência parcial do péptido é suficiente para obter uma actividade total, (2) conforme os tecidos, os 2 primeiros aminoácidos N-terminais e o domínio C-terminal 16-29 da galanina não são sempre essenciais à sua actividade. Estas observações sugerem a existência de sub-tipos de receptores galinérgicos. A presente invenção descreve, pela primeira vez, a clonagem de um gene que codifica para um receptor galinérgico humano. A presente invenção descreve igualmente pela primeira vez, a

sequência de receptores galinérgicos e a sua expressão em células recombinantes. A presente invenção permite assim uma melhor compreensão da estrutura dos receptores galinérgicos e de estudar de maneira mais fina o seu mecanismo de acção. A presente invenção permite igualmente obter receptores galinérgicos de muito grande pureza e em quantidade elevada, que permite a realização de estudos funcionais e farmacológicos da produção de anticorpos, etc. A invenção permite também preparar fragmentos de receptores galinérgicos de tamanho definido, assim como todo o tipo de derivados de receptores galinérgicos. A invenção proporciona igualmente células recombinantes que expressam receptores galinérgicos ou fragmentos de receptores galinérgicos, utilizáveis para a selecção de ligandos destes receptores (agonistas, antagonistas, moduladores, etc). As sequências de ADN da invenção permitem igualmente a realização de sondas, capazes de detectar em amostras biológicas toda a irregularidade na expressão de um receptor galinérgico (não- 2 expressão, mutação, polimorfismo, etc) . Estas sondas são igualmente utilizáveis para a clonagem por hibridação de outros ADNc que codificam para um receptor galinérgico, a partir de tecidos de origens diversas, como indicado mais a seguir.

Um primeiro objectivo da invenção reside assim numa sequência nucleotidica que codifica para um polipéptido possuindo uma actividade de receptor galinérgico. No âmbito da invenção, o receptor galinérgico compreende nomeadamente todos os sub-tipos potenciais. A sequência nucleotidica de acordo com a invenção é seleccionada de: (a) toda ou parte da sequência nucleotidica SEQ ID n° 1, e (b) as sequências derivadas de sequências (a) devido à degenerescência do código genético.

Um modo de realização muito particular da invenção é representado por uma sequência nucleotidica compreendendo toda ou parte da sequência nucleotidica SEQ ID n° 1.

As diferentes sequências nucleotidicas da invenção podem ser de origem artificial ou não. Podem tratar-se de sequências genómicas, de ADNc, de ARN, de sequências híbridas ou de sequências sintéticas ou semi-sintéticas. Estas sequências podem ser obtidas, por exemplo, por pesquisa de bancos de ADN (banco de ADNc, banco de ADN genómico) através de sondas elaboradas com base na sequência SEQ ID n° 1. Destes bancos podem ser preparadas a partir de células de diferentes origens por técnicas clássicas de biologia molecular conhecidas do 3 especialista da técnica. As sequências nucleotídicas da invenção podem igualmente ser preparadas por síntese química, nomeadamente de acordo com o método das fosforamidites ou ainda pelos métodos mistos incluindo a modificação química ou enzimática de sequências obtidas por pesquisa de bancos.

As sequências nucleotídicas da invenção podem ser utilizadas pela produção de polipéptidos galinérgicos. 0 termo polipéptido galinérgico designa todo o polipéptido possuindo uma actividade de receptor galinérgico e todo o fragmento ou derivado de um tal polipéptido. Pela produção de polipéptidos galinérgicos, a parte que codifica para o referido polipéptido é geralmente colocada sob o controlo de sinais que permitem a sua expressão num hospedeiro celular. A escolha desses sinais (promotores, terminadores, etc) pode variar em função do hospedeiro celular utilizado. Com efeito, as sequências nucleotídicas da invenção podem fazer parte de um vector, que pode ser de replicação autónoma ou integrativa. Mais particularmente, podem ser preparados vectores de replicação autónoma utilizando sequências de replicação autónoma no hospedeiro seleccionado. Tratando-se de vectores integrativos, estes podem ser preparados, por exemplo, utilizando sequências homólogas com certas regiões do genoma do hospedeiro, que permitem, por recombinação homóloga, a integração do vector. Os hospedeiros celulares utilizáveis para a produção dos polipéptidos galinérgicos da invenção por via recombinante são tanto hospedeiros eucariotas como procariotas. De entre os hospedeiros eucariotas que convêm, podem citar-se as células animais, as leveduras ou os fungos. Em particular, tratando-se de leveduras, podem citar-se as leveduras do género Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Schwanniomyces, ou Hansenula. Tratando-se de células animais, podem citar-se as células COS, CHO, C127, NIH-3T3, etc. De entre os fungos, podem 4 citar-se, mais particularmente, Aspergillus ssp. ou Trichoderma ssp. Como hospedeiros procariotas, é preferido utilizar as bactérias seguintes E. coli, Bacillus, ou Streptomyces.

As sequências nucleotidicas da presente invenção são igualmente utilizáveis no domínio farmacêutico, seja pela realização de sequências anti-sentido utilizáveis no âmbito de uma terapia génica, seja ainda pela realização de sondas que permitem a detecção, através de experiências de hibridação, de expressão de receptores galinérgicos em amostras biológicas e a de colocar em evidência anomalias genéticas (polimorfismo, mutações) ou de expressões aberrantes. A inibição da expressão de certos genes por sequências anti-sentido foi reconhecida ser uma estratégia promissora no controlo da actividade de um gene. As sequências anti-sentido são sequências em que produto de transcrição é complementar da cadeia que codifica um dado gene e é, deste modo, capaz de hibridar especificamente com o ARNm transcrito ou com o gene,

inibindo a sua transcrição ou a sua tradução em proteína. A invenção tem assim por objectivo as sequências anti-sentido capazes de inibir, pelo menos parcialmente, a produção de polipéptidos galinérgicos tal como definido anteriormente. Estas sequências podem ser constituídas por toda ou parte das sequências nucleotídicas definidas acima. Tratam-se geralmente de sequências ou de fragmentos de sequências complementares de sequências que codificam para péptidos da invenção. Estas sequências podem ser obtidas a partir da sequência SEQ ID n° 1, por fragmentação, etc, ou por síntese química.

Como indicado acima, a invenção permite igualmente a realização de sondas nucleotídicas, sintéticas ou não, capazes 5 de hibridar com as sequências nucleotídicas definidas acima que codificam para os polipéptidos galinérgicos da invenção, ou com os ARNm correspondentes. Estas sondas podem ser utilizadas in vitro como utensílio de diagnóstico, para a detecção da expressão de um receptor galinérgico, ou ainda por colocar em evidência anomalias genéticas (excisão/ligação defeituosa, polimorfismo, mutações pontuais, etc) . Tendo em conta as actividades múltiplas dos ligandos endógenos dos receptores galinérgicos, as sondas da invenção podem assim permitir identificar as afecções neurológicas, cardiovasculares, endocrinológicas ou psiquiátricas. Estas sondas podem igualmente ser utilizadas para colocar em evidência e o isolamento de sequências de ácidos nucleicos homólogas que codificam para os polipéptidos galinérgicos, tal como definido anteriormente, a partir de outras fontes celulares e de modo preferido, de células de origens humanas. Ainda que o presente pedido seja mais particularmente ilustrado por um clone designado GalRl, os estudos bioquímicos e immunológicos descritos na literatura indicam a existência de sub-tipos de receptores galinérgicos. As sondas da invenção permitem isolar por técnicas conhecidas do especialista na matéria (Cf exemplo 4) estes diferentes sub-tipos. As sondas da invenção comportam geralmente pelo menos 10 bases, e estas podem comportar até a integridade da sequência SEQ ID n° 1 ou da sua cadeia complementar. De um modo preferido, estas sondas são marcadas previamente à sua utilização. Para isso, podem ser empregues diferentes técnicas conhecidas do especialista na matéria (marcação radioactiva, enzimática, etc). As condições de hibridação nas quais as sondas podem ser utilizadas são indicadas nas técnicas gerais de clonagem a seguir assim como nos exemplos. 6 A invenção tem igualmente por objectivo um polipéptido compreendendo toda ou parte da sequência peptídica SEQ ID n° 2 ou de um derivado deste modificado por mutação, substituição, deleção e/ou modificação de um ou vários resíduos e possuindo a capacidade de ligar a galanina ou uma variante da galanina, sendo o referido derivado tal que a galanina 2-29 e a galanina 1-16 inibem competitivamente a ligação da (125I) galanina com uma afinidade mais fraca do que a galanina 1-29 e a galanina 2-29 inibe competitivamente a ligação da (125I) galanina com uma afinidade mais fraca do que a galanina 1-16.

Estes derivados podem ser produzidos para fins diferentes, tal como, nomeadamente, o de aumentar a afinidade do péptido para o(s) seus(s) ligando (s), o de melhorar os seus níveis de produção, o de aumentar a sua resistência a proteases, o de aumentar e/ou de modificar a sua actividade, ou o de lhe conferir de novas propriedades farmacocinéticas e/ou biológicas. Dos derivados resultantes de uma adição, podem citar-se, por exemplo, os polipéptidos quimeras que comportam uma parte heteróloga suplementar ligada a uma extremidade. 0 termo derivado compreende igualmente os polipéptidos homólogos ao polipéptido SEQ ID n° 1, proveniente de outras fontes celulares e nomeadamente de células de origem humana, ou de outros organismos e possuem uma actividade do mesmo tipo. Esses polipéptidos homólogos compreendem, nomeadamente, os diferentes sub-tipos de receptores galinérgicos. Estes podem ser obtidos, em particular, por experiências de hibridação como descrito nos exemplos.

De um modo preferido, os polipéptidos da invenção são polipéptidos possuindo a capacidade de ligar a galanina ou uma variante da galanina. Sempre de acordo com um modo preferido, os 7 polipéptidos da invenção são susceptíveis de ser reconhecidos por anticorpos que reconhecem a sequência peptídica SEQ ID n° 1 completa. Esses anticorpos podem ser produzidos por toda a técnica conhecida do especialista na matéria, utilizando como antiqénios os polipéptidos descritos no presente pedido.

Como indicado nos exemplos, estes polipéptidos podem ser expressos nos diferentes tipos celulares para formar os receptores galinérgicos funcionais.

Os polipéptidos da invenção podem ser obtidos por expressão num hospedeiro celular de uma sequência nucleotídica tal como descrito acima por síntese química, na base da sequência SEQ ID n° 1 utilizando as técnicas conhecidas do especialista na matéria, ou por uma combinação destas técnicas.

Um outro objectivo da invenção refere-se às células recombinadas capazes de expressar à sua superfície um polipéptido possuindo uma actividade de receptor galinérgico. Estas células podem ser obtidas por introdução de uma sequência nucleotídica tal como definido acima, depois cultura das referidas células em condições de expressão da referida sequência.

As células recombinadas de acordo com a invenção podem ser células eucariotas e procariotas. Das células eucariotas que convêm, podem citar-se as células animais, as leveduras ou os fungos. Em particular, tratando-se de leveduras, podem citar-se as leveduras do género Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Schwanniomyces ou Hansenula. Tratando-se de células animais, podem citar-se as células COS, CHO, C127, NIH-3T3, etc. Dos fungos, podem citar-se mais particularmente Aspergillus ssp. ou

Trichoderma ssp. Como células procariotas, é preferido utilizar as bactérias seguintes E. coli, Bacillus ou Streptomyces. As células assim obtidas podem ser utilizadas para medir a capacidade de diferentes moléculas se comportarem como ligando ou como modulador da actividade dos receptores galinérgicos.

Mais particularmente, estes podem assim ser utilizados num processo para colocar em evidência e de isolamento de ligandos ou de moduladores da actividade dos receptores galinérgicos e, de um modo mais preferido, de agonistas e de antagonistas.

Um outro objecto da invenção refere-se então a um processo de colocar em evidência e/ou de isolamento de ligandos dos receptores galinérgicos, de acordo com o qual se realizam as seguintes etapas: - colocar em contacto uma molécula ou uma mistura contendo diferentes moléculas, eventualmente não identificadas, com uma célula recombinada, tal como descrito acima, que expressa à sua superfície um polipéptido possuindo uma actividade de receptor galinérgico em condições que permitem a interacção entre o referido polipéptido e referida molécula no caso em que esta possuísse uma afinidade para o referido polipéptido, e, - detectar e/ou isolar as moléculas ligadas ao referido polipéptido.

Num modo particular, este processo da invenção é adaptado para colocar em evidência e/ou isolar agonistas e antagonistas da galanina para os receptores galinérgicos. 9

Um outro objectivo da invenção refere-se a um processo para colocar em evidência e/ou isolar moduladores dos receptores galinérgicos, de acordo com o qual se realizam as seguintes etapas: — colocar em contacto uma molécula ou uma mistura contendo diferentes moléculas, eventualmente não identificadas, com uma célula recombinada, tal como descrito acima, que expressa à sua superfície um polipéptido possuindo uma actividade de receptor galinérgico, em presença do ligando endógeno do referido receptor, em condições que permitem a interacção entre o referido polipéptido e seu ligando e, - detectar e/ou isolar as moléculas capazes de modular a actividade do ligando sobre o referido polipéptido.

Num modo particular, este processo da invenção é adaptado para colocar em evidência e/ou para o isolamento de moduladores da actividade da galanina sobre os receptores galinérgicos.

Um outro objectivo da invenção refere-se à utilização de um ligando ou de um modulador identificado e/ou obtido de acordo com o processo descrito anteriormente como medicamento. Estes ligandos ou moduladores podem, com efeito, permitir tratar certas afecções ligadas aos receptores galinérgicos. Em particular, sendo os receptores galinérgicos os mediadores de um efeito analgésico, os agonistas destes receptores podem ser utilizados para diminuir as sensações de dor. Foram mencionadas outras actividades dos receptores galinérgicos na introdução. 10 A invenção refere-se igualmente a todo o medicamento compreendendo como principio activo pelo menos uma molécula que actua sobre um receptor da invenção. De um modo preferido, a molécula é um ligando ou um modulador identificado e/ou isolado de acordo com o processo descrito anteriormente.

Outras vantagens da presente invenção aparecerão com a leitura dos exemplos que se seguem, que devem ser consideradas como ilustrativos e não limitativos

Legenda das figuras

Figura 1: Saturação dos receptores da galanina pela galanina de porco, sobre as membranas de células Cosi transfectadas pelo clone GalRl. 0 mapa representa a transformação de Scatchard dos dados da curva de ligação (Os valores apresentados correspondem a uma experiência representativa em que cada ponto foi determinado em triplicado).

Figura 2: Deslocamentos pelos péptidos da ligação especifica da (125I)-galanina em membranas de células Cosi transfectadas pelo clone GalRl (Os valores apresentados correspondem a uma experiência representativa em que cada ponto foi determinado em triplicado).

Figura 3: Inibição pela galanina da estimulação da produção de AMPc em células Cosi transfectadas pelo clone GALR1 (Os valores apresentados correspondem a uma experiência representativa em que cada ponto foi determinado em duplicado). 11 Técnicas gerais de clonagem

Os métodos classicamente utilizados em biologia molecular, tais como as extracções preparativas de ADN plasmidico, a centrifugação de ADN plasmidico em gradiente de cloreto de césio, a electroforese em géis de agarose ou de acrilamida, a purificação de fragmentos de ADN por electroeluição, as extracções de proteínas com fenol ou com fenol-clorofórmio, a precipitação de ADN em meio salino por etanol ou isopropanol, a transformação em Escherichia coli, etc, são bem conhecidas do especialista da técnica e são vastamente descritos na literatura [Maniatis T. et ai., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982;

Ausubel F.M. et al. (eds), "Current Protocols in Molecular

Biology", John Wiley & Sons, Nova Iorque, 1987] .

Para as ligações, os fragmentos de ADN são separados de acordo com a sua dimensão por electrof orese em géis de agarose ou de acrilamida, extraídos com fenol ou com uma mistura de fenol/clorofórmio, precipitados com etanol, depois incubados na presença de ADN ligase do fago T4 de acordo com as recomendações do fornecedor. 0 preenchimento das extremidades 5' proeminentes é efectuado pelo fragmento Klenow de ADN Polimerase I de E. coli de acordo com as especificações do fornecedor. A destruição das extremidades 3' proeminentes é efectuada na presença de ADN Polimerase do fago T4 utilizada de acordo com as recomendações do fabricante. A destruição das extremidades 5' proeminentes é efectuada por um tratamento efectuado pela nuclease Sl. 12 A mutagénese dirigida in vitro por oligodesoxinucleótidos sintéticos é efectuada de acordo com o método desenvolvido por Taylor et ai. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764]. A amplificação enzimática de fragmentos de ADN pela técnica referida de PCR [Polymerase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R.K. et ai., Science 230 (1985) 1350-1354; Mullis K.B. e Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350]. A verificação das seguências nucleotidicas é efectuada pelo método desenvolvido por Sanger et ai. [Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74 (1977) 5463-5467].

Para as experiências de hibridação, as condições de restringência são baseadas em Maniatis T. et ai., pré-citado. 1. Isolamento do receptor humano da galanina

Este exemplo descreve o isolamento do clone GalRI gue codifica para o receptor da galanina humano por pesguisa por expressão de um banco de ADNc. la. Construção do banco

Um banco de ADNc foi construído a partir da linha melanocitária humana Bowes (ATCC CRL 9607), utilizando o vector de expressão transitória de mamífero pcDNAl. Após extraeção dos ARN totais, os ARN poliA+ são purificados em coluna de oligodT celulose. A síntese de ADNc é efectuada na presença de uma mistura de iniciadores (oligodT e oligonucleótidos hibridam ao acaso). Após um fraccionamento pela dimensão (>1100 pares de 13 bases), o banco foi construído por ligação dos ADNc no vector pcDNAl (sítios de clonagem Bstx1) e transformação em E. coli (MC 1061/P3). Foram obtidos e amplificados 106 clones independentes. Cerca de 720000 clones bacterianos foram então cultivados em meio sólido selectivo com uma densidade de 8000 colónias por caixa. Foram preparados por lise alcalina 90 lotes de ADN plasmídico, correspondente cada um a 8000 colónias. lb. Transfecção O ADN plasmídico de cada lote foi transfectado independentemente nas células Cosi (ATCC CRL 1650) por electroporação de acordo com o protocolo seguinte: 32 mg de ADN, 8 106 células em 500 mL de meio DMEM (Meio Eagle Modificado de Dulbecco) suplementado com 10% de soro de vitela fetal, 6 mM de glutamina, 100 UI/mL de penicilina e 100 mg/mL de estreptomicina sob 5% de C02, 960 mFarad, 250 Volts, electroporador Biorad.

Após electroporação, as células foram cultivadas em monocamada em caixas de cultura (Nunc) de 16 cm de diâmetro durante 72 horas. Nestas condições, uma média de 30% de células são transfectadas. lc. Selecçao por expressão

As células transfectadas foram testadas quanto à sua capacidade de ligarem a (125I)-galanina. As células foram mudadas 48 horas após a transfecção. No dia da ligação, estas são colocadas na presença de DMEM durante 1 hora, depois lavadas com 10 mL de tampão 1 (Tris HC1 a 25 mM pH: 7,5, MgC12 a 10 mM, BSA

a 2%) . As células foram então incubadas durante 5 horas a 20 °C 14 na presença de tampão 2 (tampão 1 contendo um cocktail de inibidores de proteases: 10 mg/mL de aprotinina, 1 mg/ mL de bacitracina, 10 mg/mL de pepstatina A e 10~5 M de fenilmetilsulfonilf luoreto) contendo 10~10 M de (125I)-galanina (NEN, galanina 1-29 de porco, AS: 2200 curie/mmole). Após lavagem (5 x 15 mL de tampão 1), as caixas foram secas e expostas a autorradiografia (película Amersham hyperscreen MP) durante 15 dias a -80 °C. ld. Isolamento do clone GalRl que codifica para o receptor da galanina

Nos 720000 clones bacterianos testados, foi identificado um lote de 8000 colónias, que dão um sinal específico em autorradiografia (i. e., (i) que ultrapassa o ruído de fundo, (ii) que desaparece na presença de 10~6 M de galanina arrefecida) . Este lote foi de seguida dividido em 48 lotes de 700 clones cada um. Após transfecção, as células foram testadas quanto à sua capacidade de ligarem a (125I)-galanina. Três lotes produziram um sinal específico em autorradiografia. Um deles foi subdividido 2 vezes (25 lotes de 30 clones depois 60 clones individuais), conduziram a 2 clones que conferiam às células Cosi uma forte capacidade de ligarem a (125I)-galanina. 2. Estudo estrutural do receptor da galanina

Os 2 clones isolados no exemplo 1 contêm uma inserção idêntica de 3,1 kb. A sequência de um dos 2 clones foi determinada nas 2 cadeias, pela técnica fluorescente (Applied 15

Biosystems) derivada do método de Sanger, utilizando a Taq Polimerase e didesoxinucleótidos fluorescentes. A sequência obtida corresponde à sequência SEQ ID n° 1. Esta comporta uma grelha de leitura aberta de 1053 pares de bases: o sítio de iniciação da tradução é atribuído ao codão ATG na posição 787 da sequência SEQ ID n° 1. A grelha de leitura aberta assim definida codifica para uma proteína de 349 aminoácidos (SEQ ID n° 1) de pesos molecular calculado de 38897 Daltons. A análise do perfil de hidrofaticidade da sequência em aminoácidos sugere que o receptor possui 7 segmentos constituídos por aminoácidos maioritariamente hidrófobos, formando globalmente segmentos transmembranares (STM), ponto comum aos membros da família dos receptores acoplados às proteínas G. O receptor é organizado como se segue: MET1-ASN33, segmento N-terminal; PHE34-LEU58, STM I; ALA59-ASN71, ansa intracelular I; LEU72-LEU9 8, STM II; PRO99-LYS109, ansa extracelular I; PHE110-ASP13 2, STM III; ARG133-ASN151, ansa intracelular II; ALAI5 2-VAL17 0, STM IV; ALAI 71-ALA199, ansa extracelular II; TYR2 0 0-VAL2 23, STMV; LEU224-LYS244, ansa intracelular III; THR2 45-LEU2 6 8, STM VI; TRP269-PR0279, ansa extracelular III; ALA280-SER307, STMVII; GLU308-VAL349, segmento C-terminal.

Além disso, certos aminoácidos conservados no seio dos membros da família dos receptores acoplados às proteínas G estão presentes na sequência proteica do receptor GALR1. Em particular, nota-se (1) 2 sítios de N-glicosilação (ASN7 e ASN12), (2) 1 sítio de fosforilação para a proteína cinase dependente de cAMP ou cGMP (SER143), (3) 1 sítio de famesilação (CYS340), (4) 2 cisteínas (CYS187 e 308), (5) 4 prolinas (PR0169,212,262 et300), (6) o motivo GLY.ASN.X.X.VAL (50-54), (7) o motivo ASP.ARG.TYR (132-134), (8) o motivo 16 ASN.PRO.ILE.X.TYR (299-303). A sequência da proteína da presente invenção foi finalmente comparada com as sequências das proteínas da família dos receptores acoplados às proteínas G (banco de dados Swissprot). A homologia mais importante (33,8%, incluindo 3 intervalos) é observada com o receptor da somatostatina de tipo 4. 3. Estudos bioquímicos do receptor GalRl expressos transitoriamente nas células Cosi 3a. Esteguiometria e farmacologia do receptor GalRl O ADN plasmídico do clone GalRl foi preparado pelas técnicas de biologia molecular clássicas para transfectar células Cosi. As membranas das células transfectadas foram em seguida utilizadas para estimar os parâmetros de ligação ao equilíbrio da galanina 1-29 e de fragmentos de galanina. O ADN plasmídico (90 mg/8 106 células Cosi) foi transfectada por electroporação como descrito anteriormente (lb). 72 horas depois da transfecção, as células recombinantes foram recolhidas e sedimentadas. As membranas foram então preparadas como se segue: a 4 °C, o resíduo celular é colocado na presença de 10 mL de tampão 3 (Hepes 5 mM, pH 7,5) durante 20 minutos; após centrifugação a 13000 g durante 15 minutos, o resíduo é ressuspenso no tampão 3 e conservado a -80 °C até utilização.

Foram realizadas experiências de ligação ao equilíbrio (saturação e competição) em membranas na presença de (125I)-galanina e de diferentes péptidos nas seguintes condições experimentais: as membranas (10 mg de proteína) foram incubadas 17 durante 30 minutos a 20 °C com 5 10'11 M de (125I)-galanina na ausência ou na presença de concentrações crescentes de galanina 1-29, galanina 2-29, galanina 3-29 ou galanina 1-16 (10~n M-10-6 M) num volume final de 0,25 mL de tampão 2 (lc) . A reacção foi de seguida interrompida por adição de 0,25 mL de tampão 1 (lc) e centrifugação durante 15 minutos a 13000 g. O resíduo obtido foi lavado três vezes com 0,2 mL de tampão Tris 25 mM (pH: 7,5) arrefecido em gelo contendo 10% de sacarose, depois a radioactividade foi medida com um contador de cintilações gama. A ligação não específica é medida na presença de 10-7 M de galanina 1-29 de porco. Os valores das constantes de afinidade (Ki) foram obtidas de acordo com a equação de Cheng e Prussof: Ki = IC50/ (1 + L/Kd) .

Nas condições experimentais acima descritas, são observados os resultados seguintes: contrariamente às células Cosi não transfectadas, ou transfectadas por um plasmídeo controlo, as células Cosi transfectadas pelo clone GalRl apresentam uma ligação específica da galanina iodada. A análise dos resultados pelo método de Scatchard mostra a existência de uma única classe de sítios de elevada afinidade, com uma constante de dissociação aparente (Kd) = 0,8 nM e de elevada capacidade, com um número máximo de sítios de fixação (Bmax) = 2,8 pmoles/mg proteínas.

Tendo em conta a eficácia de transfecção (cerca de 30%, lb) , o nível de expressão de receptores galinérgicos da invenção nas células Cosi é estimada em 5 105 sítios/célula.

As galaninas de rato, de porco e humana inibem de forma competitiva a ligação da (125I)-Galanina às membranas das células transf ectadas com um Ki = 0,3, 0,2 e 0,8 nM respect ivamente. A galanina 2-29 (Ki= 115 nM) e a galanina 1-16 (Ki= 5 nM) inibem competitivamente a ligação da ( I)-galanina com uma afinidade 18 mais fraca do que a galanina 1-29. Este clone nao possui afinidade pela galanina 3-29. A ordem de eficácia destas diferentes moléculas confirma a especificidade do receptor GalRl como receptor galinérgico. Estes resultados mostram, por exemplo, que as células Cosi da presente invenção são capazes de expressar o receptor da galanina possuindo caracteristicas de ligação comparáveis às do receptor nativo. 3b. Estudo funcional do receptor GalRl 0 acoplamento do receptor Galanina à adenilato ciclase foi estimado pela capacidade da galanina inibir a produção de AMPc nas células Cosi transfectadas pelo clone GalRl. Para este estudo, 105 células transfectadas nas condições descritas acima foram semeadas em placas de cultura multipoço (1,5 cm de diâmetro) e as experiências de AMPc foram realizadas 72 horas após a transfecção (o meio de cultura é renovado na véspera da experiência) . Após uma pré-incubação de 1 hora a 37 °C em meio DMEM, as células foram lavadas por DMEM contendo 2% de BSA.

Estas foram então incubadas 30 minutos a 37 °C no mesmo meio contendo 2 10-4 M de isobut ilmet ilxant ina, na ausência e na presença de forscolina (10-4 M) e/ou de galanina humana (10~41 M-10~6 M) . Após três lavagens das células em meio DMEM, o AMPc intracelular é extraído por adição de etanol a 70%. Após liofilização, o AMPc é medido por radioimunologia (Kit AMPc, Amersham).

Os resultados mostram que nas células Cosi transfectadas pelo clone GalRl, a galanina inibe fortemente a produção de AMPc 19 intracelular induzida pela forscolina (a produção induzida é da ordem das 2 pmoles/105 células, ou seja 10 vezes o basal). Este efeito não é observado em condições basais. A semi-inibição e a inibição máxima da produção de AMPc são induzida por 10“9 M e 10~6 M de galanina humana, respectivamente. Na presença de 10“6 M de galanina, a produção de AMPc intracelular induzida pela forscolina é diminuída em 50%. A inibição pela galanina da produção de AMPc intracelular induzida pela forscolina confirma a especificidade do receptor GalRl como receptor galinérgico. Estes resultados mostram, por exemplo, que as células Cosi da presente invenção são capazes de expressar o receptor da galanina possuindo características funcionais comparáveis às do receptor nativo. 4. Pesquisas de sequências homólogas, nomeadamente de sub-tipos em outros tecidos

Este exemplo mostra que a sequência nucleotídica de SEQ ID n° 1 ou de fragmentos desta pode ser utilizada para colocar em evidência sequências homólogas, nomeadamente sub-tipos, a partir de outros tecidos. Para isso, são utilizáveis diferentes técnicas, tais como a PCR, a hibridação in situ, a transferência de Northern, etc...

Mais particularmente, pela pesquisa por PCR, os ARN totais dos diferentes tecidos estudados são preparados, depois submetidos a transcrição reversa e a uma amplificação, na presença de transcriptase reversa , de Taq polimerase e de iniciadores derivados da sequência SEQ ID n° 1 apropriados. Os produtos assim obtidos são a seguir transferidos sobre filtros 20 de nitrocelulose e hibridados em condições de restringência variáveis.

As sequências homólogas colocadas em evidência e durante estas experiências podem ser a seguir isoladas e/ou amplificadas por técnicas clássicas de biologia molecular. LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Aventis Pharma S.A. <120> Receptor de galanina, ácidos nucleicos, células transformadas e utilizações. <130> ST94008 <160> 2 <170> Patentln versão 3.3

<210> 1 <211> 3083 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0>

<221> CDS <222> (787)..(1836) <223> /produto= "receptor de galanina humano" <40 0> 1 21 attcggcggc gacccatccc gctagaatcc gtccagtctc tgctcgcgca ccgtgacttc 60 taaggggcgc ggatttcagc cgagctgttt tcgcctctca gttgcagcag agaagcccct 120 ggcacccgac tctatccacc accaggaagc ctcccaaaag agctctcgcc ctgtggacga 180 ctcggaatcc ctggaaaagc cgggagggag tcggaggcgc cagcccactg gggaggtggc 240 gctgggcgcg cgggatgcgc ggggagcctt ctctgcagga gccgcacagt gcactgctgc 300 gcgctgggca gtgcggggaa gcgccgcggg aaggagcggc tccgagcaac aggtgcagca 360 cgcagccgct ccgggagcca gggaaaaccg ccggcgaaga tctggagcgg taaggcggag 420 agaagggtct ttccacctgc geggetgcag ccggcggatc cctcttccca ggctcegtgg 480 tcgcgcagcg ggcggaggcg cccgggcagg ggaccccagt gctctcgaga tcaccgtccc 540 ttcccgagaa ggtccagctc cgggctcccg aacccaccct ctctcagaag gtcgcggcgc 600 aaagacggtg ccaccaggca cggccaccgg atccccgctc ccgctggctc gcgcctcggg 660 ggaagctcag actcctaaac tcgcactctc cgtgctttgc gccgggaccc ctggccaccc 720 ccggcgcctg ctatcccgcc ctccctcccg cgcgctccgc cgctcgccgg gacagccccg 780 cgggcc atg gag ctg gcg gtc ggg aac ctc age gag ggc aac gcg age 828 Met Glu Leu Ala val Gly Asn Leu Ser i Glu i GTy . Asn , Ala : ser 1 5 10 tgt ccg gag ccc ccc gçc ccg gag ccc ggg ccg ctg ttc ggc ate ggc 876 Cys Pro Glu Pro Pro Ala pro Glu pro GTy pro Leu Phe Gly Ile GTy 15 20 25 30 gtg gag aac ttc flte acg ctg gtg gtg ttc ggc ctg ate ttc gcg ctg 924 vaT GlU Asn phe val Thr Leu val Val Phe Gly Leu ile Phe Ala Leu 35 40 45 ggc gtg ctg ggc aac age cta gtg ate acc gtg ctg gcg ege age aag 972 Gly vai Leu Giy A$n Ser Leu Val Ile Thr val Leu Ala Arq Ser Lys 50 55 60 ccg ggc aag ccg cgg age acc acc aac ctg ttc ate ctc aac ctg age 1020 ΡΓΟ Gly Lys Pro Arg Ser Thr Thr Asn Leu Phe Ile Leu Asn Leu Ser 65 70 75 ate 9CC gac ctg gee tac ctg ctc ttc tgc ate ccc ttc eag gee acc 1068 ile Ala ASp Leu Ala Tyr Leu Leu phe cys Ile Pro Phe Gin Ala Thr 80 85 90 gtg vai tac Tyr gçg Ala ctg Leu ccc Pro acc Thr tgg Trp gtg VaT ctg Leu ggc GTy 9« Ala ttc phe ate Ile tgc Cys aag Lys ttc phe 1116 95 100 105 110 ate cac tac ttc ttc acc gtg tcc atg ctg gtg age ate ttc acc cta 1164 fie His Tvr Phe Dha Thr W-»l v u > jci Met mu val Ser ne Phe Thr Leu 115 120 125 22 gcc gcg Ala Ala atg tcc Met ser 130 gtg vai gac ege tac Asp Arg Tyr gtg vai 135 gcc Ala ate ile gtg vai cac His teg cgg Ser Arg 140 ege Arg 1212 tcc tcc ser ser tcc Ser 145 ctc agg Leu Arg SI? tcc ege Ser Arg 150 aac Asn gcg Ala ctg ctg Leu Leu ggc Gly 155 SI? ggc tgc Gly cys 1260 ate tgg ile Trp 160 gcg Ala ctg Leu tcc ser att gcc atg gcc ile Ala Met Ala 165 teg Ser ccc Pro gtg vai 170 gcc tac Ala Tyr cac His cag Gin 1308 ggc ctc Gly Lêu 175 ttc Phe cac His ccg ΡΓΟ ege gcc Arg Ala 180 age Ser aac Asn cag Gin acc Thr 185 ttc Phe tgc cys tgg gag Trp Glu cag Gin 190 1356 tgg ccc gac Trp Pro Asp cct pro ege Arg 195 cac His aag Lys aag Lys gcc tac Ala Tyr 200 gtg gtg Vai Vai tgc Cys acc Thr ttc Phe 205 gtc Vai 1404 ttc ggc tac phe Giy Tyr ctg Leu 210 ctg Leu ccg pro ctc Leu ctg Leu ctc Leu 215 ate tgc ttc tgc tat ile cys Phe cys T^r gcc Ala aag Lys 1452 gtc ctt vai Leu aat Asn 225 cac HIS ttg Leu cat HÍS aaa Lys aag 2¾ ttg Leu aag Lys aac Asn atg Met tea Ser 235 aag Lys aag Lys tet Ser 1500 gaa gea Glu Ala 240 tcc Ser aag Lys aaa Lys aag Lys act Thr 24S gea Ala cag Gl n aca gtt Thr vai ctg Leu 250 89 gtg vai gtt vai SI? 1548 gtg ttt vai Phe 255 gga Gly ate Ile tcc tgg ctg Ser Trp Leu 260 ccg Pro cac His cac His ate Ile 265 ate Ile cat His ctc tgg gct Leu Trp Ala 270 1596 gag ttt gga gtt Glu Phe Gly vai ttc Phe 275 ccg pro ctg Leu acg Thr ccg gct tcc pro Ala ser 280 ttc Phe ctc Leu ttc Phe aga Arg 285 ate lie 1644 acc gcc Thr Ala cac His tgc ctg gcg tac age aat Cys Leu Ala Tyr ser Asn 290 295 tcc ser tcc ser 89 aat A$n cct pro 300 ate ile att ile 1692 tat gea Tyr Ala ttt Phe 305 ctc Leu tet Ser gaa Glu aat Asn ttc agg aag gcc tat Phe Arg Lys Ala Tyr 310 aaa Lys 315 caa Gin SI? ttc phe 1740 aag tgt -y5 ÍFo cac His att ege Ile Arg aaa Lys gat tea Asp Ser 325 cac His ctg Leu agt Ser gat Asp 330 act aaa Thr Lys gaa Glu aat Asn 1788 aaa agt cga ata gac acc cca cca tea acc aat tgt act cat gtg tga 1836

Lys ser Arg Ile Asp Thr ppo ργο Ser Thr Asn Cys Thr His vai 335 340 345 taaaagatag agtatcctta tggttgagtt tccatataag tggaccagac acagaaacaa acagaatgag ctagtaagcg atgctgcaac ttgttatctt aacaagaatt caagtcgttt taattaaatc ccacgtgtgt taaaaagtac tttgatccat ttaggaaatt cctaggtcta gtgagaatta tttttcaatt ttattttagt tctaaattat gtttcagaaa caaaagacaa 1896 1956 2016 2076 23 tgctgtacag ttttattcct cttcagacat gaaagggaac atatatattc catatatatg 2136 ΐLCàãWtCtt catagattgt gagctggccc atcaatatgg tcaggaatat ttgcagtcta 2196 cattttaaag ccaatttatt tagaaaaaaa atttgagctt taattcttta attttaagag 2256 aagtaatatt gtgagctatg tattttaaaa tatgatcatg gacacacaat gatgaàtttt 2316 ttggccattt acatagacat atctattaag tggaaagaag gctttctgaa gtctgtttgc 2376 acaggtggca tttgcttcca attgtagcta gcgcacagag Ctttggaagc ctgrcattat 2436 gagatacagt cggtttacct caggagtcaa ttcagtgttg tactggtgac ctgggatgca 2496 gtagtaggca ctgttgattc aaatttatcc tgtgaaactg gctttataga gttaacaaaa 2556 cagagtcaga gaccactgtc ttaacagtgg aagatgcaaa taagtttttg agaataaaac 2616 tggattttga aattttacat tagtacttga caaaagtttt cattttgcct tgaatggaae 2676 ctactaaaaa gagagatgaa aaaaaatcag cgaggttgat gtagataata atttctatgg 2736 gaccaaagac tagacagaat tcagtaagtc acatgaagta atggtcatgc ctgtacataa 2796 agcatatttc atgtttgatt tagatgacat tcaaaaaaaa tcatgggact gaatatacct 2856 ggggtatcct atcttgtaca aatgcatgct ttttcattaa atttgtaatg atgtttaatg 2916 aacatttcca ccaaacatta tttcctctaa aaatgttaat ttggggttaa aaccatcacc 2976 atttgaattt caaatgtagt tttcatgaca attttatatt ggatgtgtgt ttacaatgag 3036 aaaatggcat gaaaatatta aattgtcttg tatcggaaaa ggaattc 3083

<210> 2 <211> 349 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Met Glu Leu Ala vai Gly Asn Leu ser Glu Gly Asn Ala Ser Cys pro 15 10 15

Glu pro Pro Ala Pro Glu Pro Gly Pro Leu Phe Gly lie Gly vai Glu 20 25 30

Asn Phe vai Thr Leu vai vai Phe Gly Leu lie Phe Ala Leu Gly Vai 35 40 45

Leu Gly Asn ser Leu vai lie Thr vai Leu Ala Arg Ser Lys Pro Gly 50 55 60 24

Lys Pro Arg ser Thr Thr Asn Leu Phe Ile Leu Asn Leu Ser lie Ala 65 S 70 75 80

Asp Leu Ala Tyr Leu Leu Phe Cys He Pro Phe Gin Ala Thr vai Tyr 85 90 95

Ala Leu pro Thr Trp vai Leu Gly Ala Phe Ile Cys Lys Phe ile His 100 105 110

Tyr Phe Phe Thr Vai ser Met Leu Vai ser Ile Phe Thr Leu Ala Ala 115 120 125

Met ser vai Asp Arg Tyr Vai Ala Ile Vai His Ser Arg Arg ser ser 130 135 140 ser Leu Arg Vai Ser Arg Asn Ala Leu Leu Gly vai Gly Cys ile Trp 145 150 155 160

Ala Leu ser ile Ala Met Ala Ser Pro Vai Ala Tyr His Gin Gly Leu 165 170 175

Phe His Pro Arg Ala ser Asn Gin Thr Phe cys Trp Glu Gin Trp Pro 180 185 190

Asp Pro Arg His Lys Lys Ala Tyr vai Vai Cys Thr Phe vai phe Gly 195 200 205

Tyr Leu Leu pro Leu Leu Leu ile Cys Phe cys Tyr Ala Lys vai Leu 210 215 220

Asn His Leu His Lys Lys Leu Lys Asn Met Ser Lys Lys Ser Glu Ala 225 230 235 240

Ser Lys Lys Lys Thr Ala Gin Thr vai Leu vai vai vai vai vai Phe 245 250 255

Gly xle ser Trp Leu Pro His His ile ile His Leu Trp Ala Glu Phe 260 265 270

Gly Vai Phe Pro Leu Thr Pro Ala Ser Phe Leu Phe Arg ile Thr Ala 275 280 285

His Cys Leu Ala Tyr ser Asn ser ser vai Asn Pro lie lie Tyr Ala 290 295 300

Phe Leu ser Glu Asn Phe Arg Lys Ala Tyr Lys Gin Vai Phe Lys Cys 305 310 315 320

His Ile Arg Lys Asp Ser His Leu Ser Asp Thr Lys Glu Asn Lys ser 325 330 335 25

Arg Ile Asp Thr Pro Pro Ser Thr Asn cys Thr His Vai 340 345

Lisboa, 28 de Janeiro de 2009 26

Claims (15)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Sequência nucleotídica que codifica para um polipéptido possuindo uma actividade de receptor galinérgico, caracterizada por ser seleccionada de: (a) toda ou parte da sequência nucleotídica SEQ ID n° 1, e (b) as sequências derivadas das sequências (a) devido à degenerescência do código genético.
2. 2. Sequência nucleotídica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por codificar para um receptor galinérgico humano.
3. 3. Sequência nucleotídica caracterizada por compreender uma sequência nucleotídica SEQ ID n° 1 ou a sua cadeia complementar.
4. 4. Sequência nucleotídica de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizada por ser seleccionada das sequências de ADN genómico, de ADNc, de ARN, as sequências híbridas ou as sequências sintéticas ou semi-sintéticas.
5. 5. Sequência de acordo com uma das reivindicações 1 a 4, caracterizadas por a parte que codifica para o referido polipéptido ser colocada sob o controlo de sinais que permitem a sua expressão num hospedeiro celular. 1
6. 6. Polipéptido possuindo uma actividade de receptor galinérgico resultante da expressão de uma sequência nucleotidica, sendo a referida sequência seleccionada de: a) toda ou parte da sequência nucleotidica SEQ ID n° 1, e b) as sequências derivadas das sequências (a) devido a degenerescência do código genético.
7. 7. Polipéptido compreendendo toda ou parte da sequência peptídica SEQ ID n° 2 ou de um seu derivado, modificada por mutação, substituição, deleção e/ou modificação de um ou vários resíduos e possuindo a capacidade de ligar a galanina ou uma variante da galanina, sendo o referido derivado de modo que a galanina 2-29 e a galanina 1-16 inibem competitivamente a ligação da (125I) galanina com uma afinidade mais fraca do que a galanina 1-29 e que a galanina 2-29 inibe competitivamente a ligação da (125I) galanina com uma afinidade mais fraca do que a galanina 1-16.
8. 8. Sequência anti-sentido capaz de inibir, pelo menos parcialmente, a produção de um polipéptido de acordo com uma das reivindicações 6 ou 7.
9. 9. Célula recombinada que expressa à sua superfície um polipéptido de acordo com uma das reivindicações 6 ou 7, obtida por introdução de uma sequência de acordo com a reivindicação 5. 2
10. 10. Célula de acordo com a reivindicação 9, caracterizada por ser seleccionada das células eucariotas ou procariotas.
11. 11. Processo para colocar em evidência e/ou de isolamento de ligandos de receptores galinérgicos, caracterizada por realizar as etapas seguintes: colocar em contacto uma molécula ou uma mistura contendo diferentes moléculas, eventualmente não identificadas, com uma célula recombinada de acordo com a reivindicação 9 que expressa à sua superfície um polipéptido de acordo com uma das reivindicações 6 e 7, em condições que permitem a interacção entre o referido polipéptido e referida molécula no caso em que possuam uma afinidade para o referido polipéptido e, - detectar e/ou isolar as moléculas ligadas ao referido polipéptido.
12. 12. Processo de acordo com a reivindicação 11 para colocar em evidência e/ou para o isolamento de agonistas e/ou de antagonistas dos receptores galinérgicos.
13. 13. Processo para colocar em evidência e/ou de isolamento de moduladores dos receptores galinérgicos, caracterizada por realizar as etapas seguintes: - colocar em contacto uma molécula ou uma mistura contendo diferentes moléculas, eventualmente não identificadas, com uma célula recombinada de acordo com a reivindicação 9 que expressa à sua superfície um polipéptido, de acordo com uma das reivindicações 6 e 7, 3 possuindo uma actividade de receptor galinérgico, na presença de um ligando do referido receptor, em condições que permitem a interacção entre o referido polipéptido e o ligando e, - detectar e/ou isolar as moléculas capazes de modular a actividade do ligando sobre o referido polipéptido.
14. 14. Anticorpos que reconhecem um polipéptido de acordo com a reivindicação 6 .
15. 15. Processo de obtenção de um polipéptido de acordo com uma das reivindicações 6 e 7 compreendendo a expressão de uma sequência nucleotidica de acordo com uma das reivindicações 1 a 5 numa célula. Lisboa, 28 de Janeiro de 2009 4