PT701607E - Preparacao e utilizacao de ratinhos transgenicos com falta de expressao de cd28 - Google Patents

Description

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DESCRICÂO "Preparação e utilização de ratinhos transgénicos com falta de expressão de CD28"

Campo da invenção A presente invenção refere-se a mamíferos em que a expressão de um ou mais genes foi suprimida. Mais especificamente, a invenção refere-se à inserção de uma construção de ADN exógeno no ADN genómico dos mamíferos produzindo desse modo animais tr,apsgénicos com expressão diminuída ou completamente suprimida de um gene ou genes endógenos.

Descricão da arte relacionada O sistema imunitário dos mamíferos é constituído por muitas células especializadas que actuam em conjunto, de uma maneira altamente complexa e orquestrada para proteger o mamífero de patogénios, toxinas e outras substancias estranhas invasoras.

As células responsáveis pela especificidade do sistema imunitário são referidas como linfócitos. Os linfócitos são uma classe de glóbulos brancos. Duas classes importantes de linfócitos são as células T e as células B. As células T desenvolvem-se no timo e são responsáveis pela imunidade mediada por células. Existem muitos tipos de células T especializadas, tais como, por exemplo, células T auxiliares (que potenciam a actividade de outros tipos de glóbulos brancos), células T supressoras (que suprimem a actividade de outros glóbulos brancos), e células T citotóxicas (que matam células). As células B desenvolvem-se na medula óssea e exercem o seu efeito produzindo e segregando anticorpos.

Existem muitas desordens do sistema imunitário e são continuamente identificadas novas desordens. Um tipo desordem imunitária que ocorre com frequência é o sistema imunitário hiper-activo. Aqui, certos factores induzem a activação de tipos de células particulares no sistema imunitário quando o não deviam fazer. I 1 2 86 165 ΕΡ Ο 701 607/ΡΤ

Outro tipo de desordem imunitária é a auto-imunidade. Esta desordem é caracterizada por o sistema imunitário montar uma resposta imunitária contra os tecidos do próprio mamífero.

Foram identificadas várias proteínas e outras moléculas como possuindo funções chave na regulação da resposta do sistema imunitário de mamíferos. Duas dessas proteínas são CD28 e CD45. O receptor CD28, também conhecido por CD28, é um homodímero de peso molecular de:'cerca de 44 quilodalton (kD). O CD28 é expresaq^ern diferentes níveis na superfície celular de várias células T, e tem uma estrutura molecular semelhante a receptores da família supergénica de imunoglobulinas. O CD28 parece estar envolvido na regulação da activação de células T, e ultimamente parece exercer o seu efeito regulando a expressão de genes de citóquinas de células T através da fosforilação de tirosina de certos substratos intracelulares tais como certas fosfolipases. (Veja-se Linsley et a/., Ann. fíev. Immunof., 11:191-212(1993]).

Outra proteína que é importante na regulação do sistema imunitário é a molécula do receptor da superfície celular conhecido como receptor CD45 ou CD45. Esta molécula é expressa na superfície de muitos tipos de células hematopoiéticas, incluindo por exemplo células B e certas células T. O gene que codifica CD45 sofre uma união alternativa. O CD45 tem 34 exões (Johnson et a/., J. Biol. Chem., 264:6220-6229 [1989]). Como resultado, existem múltiplas isoformas de CD45. As diferentes isoformas são expressas em diferentes células, mas um tipo de células pode expressar mais do que uma isoforma (Thomas, Ann. Rev. Immunol., 7:339-369 [1989]). O CD45 tem um peso molecular entre cerca de 180 kD e 235 kD, dependendo da isoforma. O CD45 é uma proteína-tirosina-fosfatase e está envolvido na sinalização das células (Charbonneau et a!., Proc. Nati. Acad. Sei. USA 85:7182-7186 [1988]; Tonks et aí., Biochem., 27:8695-8701 [1988]).

Produziram-se clones de células T de murídeo com falta de expressão de CD45, através de mutagénese química (Pingel et a/., Cell, 58:1055-1065 [1989]); Weaver et al., Moí. Cell. Biol., 11:4415-4422 [1991]). Estas células foram incapazes de ser activadas (i.e., não proliferaram) em resposta a certos compostos que normalmente serviriam como sinais de activação. As células 3 86 165 ΕΡ Ο 701 607/ΡΤ tinham também outras funções danificadas tais como uma produção de citóquinas diminuída.

Produziu-se uma linha de células de leucemia de células T humanas mutantes com expressão de CD45 suprimida, utilizando irradiação gama (Koretzky et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 88:2037-2041 [1991]). Entre outras funções danificadas, mostrou-se que a esta linha de células faltava a capacidade de activar uma tirosina-quinase associada a um receptor de células T.

Apesar da utilização de linhas de células isoladas ser útil para compreender o papel de várias proteínas na regulação do sistema imunitário, consegue-se obter uma informação mais completa estudando os efeitos dessas proteínas directamente num mamífero (i.e., um sistema in vivo). Com este fim, foram produzidos vários mamíferos com níveis alterados de expressão de certos genes. Uma classe destes mamíferos consiste nos chamados mamíferos transgónicos. Estes mamíferos têm um novo gene, ou genes, introduzidos no seu genoma. Outra classe destes mamíferos consiste nos chamados mamíferos com uma mutação inactivadora ("mamíferos knockout"), em que a expressão de um gene endógeno foi suprimida através de manipulação genética.

Foram desenvolvidos vários mamíferos transgénicos. Por exemplo a Patente dos E.U.A. No. 4 736 866, concedida em 12 de Abril de 1988, descreve um ratinho contendo um transgene que codifica um oncogene. A Patente dos E.U.A. No. 5 175 384, concedida em 29 de Dezembro de 1992, descreve um ratinho transgénico deficiente em células T maduras. A Patente dos E.U.A. No. 5 175 383, concedida em 29 de Dezembro de 1992, descreve um ratinho com um transgene que codifica um gene na família int-2/FGF. Este gene promove a hiperplasia prostática benigna. A Patente dos E.U.A. No. 5 175 385, concedida em 29 de Dezembro de 1992, descreve um ratinho transgénico com resistência aumentada a certos vírus. 4 ΕΡ Ο 701 607/ΡΤ Ο pedido de patente PCT n°. WO 92/22645, publicado em 23 de Dezembro de 1992, descreve um ratinho transgénico deficiente em certos tipos de células linfóides. A preparação de um mamífero knockout requer, primeiro, a introdução de uma construção de ácido nucleico que será utilizada para suprimir a expressão de um gene particular num tipo de células não diferenciadas denominado hemocitoblasto embrionário. Esta célula é depois injectada num embrião de mamífero, onde se espera que se integre no embrião em desenvolvimento. O embrião é então implantado numa mãe hospedeira durante o período de gestação.

Pfeffer et al. (Ce//, 73:457-467 [1993]) descrevem ratinhos em que o gene que codifica o receptor do factor de necrose tumoral p55 foi suprimido. Os ratinhos apresentaram uma resposta diminuída à sinalização do factor de necrose tumoral.

Fung-Leung et al. (Cell, 65:443-449 [1991]); J. Exp. Med., 174:1425-1429 [1991]) descrevem ratinhos knockout a que falta a expressão do gene que codifica CD8. Verificou-se que estes ratinhos tinham um nível diminuído de resposta de-células T citotóxicas a vários antigénios e a certos patogénios virais tais como o vírus de coriomeningite linfocitária.

Tendo em conta os efeitos devastadores que podem resultar de desordens imunitárias, existe uma necessidade na arte de proporcionar sistemas in vivo para a pesquisa e avaliação de drogas úteis no tratamento destas desordens.

Assim, é um objectivo da presente invenção proporcionar mamíferos em que um gene envolvido na regulação do sistema imunitário tenha sido suprimido, através da utilização da tecnologia da mutação inactivadora ("tecnologia knockout"). É um objectivo adicional da presente invenção proporcionar métodos para a preparação, e preparar estes mamíferos knockout. 5 86 165 ΕΡ Ο 701 607/ΡΤ

Estes e outros objectivos serão prontamente aparentes aos normais peritos na arte.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Num aspecto, a invenção proporciona um método para a preparação de um ratinho e sua progénie, possuindo um nível suprimido de expressão do gene que codifica CD28 em células T. O gene é suprimido através da inserção no genoma do ratinho de uma sequência de ácido nucleico compreendendo pelo menos uma porção de um exão da sequência de codificação de CD28 ligado a urria séqiíência marcadora; a sequência marcadora pode ser o.· gene de resistência a neomicina.

Em outros aspectos, a invenção proporciona linhas de hemocitoblastos embrionários contendo uma construção knockout (inactivadora) de uma isoforma de CD28.

Em ainda um outro aspecto, a invenção proporciona um método de pesquisa de uma droga quanto a efeitos imunoestimulantes, compreendendo a administração da droga a um ratinho com um nível suprimido de expressão de CD28, e o ensaio do ratinho quanto a imunoestimulação.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 representa a construção knockout utilizada para suprimir a expressão de CD28. 1A representa a estrutura de uma porção do gene de CD28 nativo. 1B representa a construção knockout de CD28 gerada, e 1C representa esta construção knockout inserida no gene de CD28 nativo após recombinação homóloga. As enzimas de restrição utilizadas são indicadas por abreviaturas de uma só letra. S= SalI; X= Xba\\ E= £coRI; e B= BamH\. A Figura 2 representa os efeitos da construção knockout de CD28 na proliferação de esplenócitos de 1) ionóforo de cálcio em combinação com PMA, e 2) Concanavalina A (na presença ou ausência de IL-2). As barras a preto representam esplenócitos de ratinhos do tipo selvagem, as barras traçadas na horizontal representam esplenócitos de ratinhos knockout heterozigóticos, e as barras traçadas em oblíquo representam esplenócitos de ratinhos knockout homozigóticos. Estes resultados foram obtidos após dois dias de cultura das células. 6 86 165 ΕΡ Ο 701 607/ΡΤ A Figura 3 representa ο nível de anticorpos neutralizantes IgM e IgG em ratinhos do tipo selvagem (barras a cheio) e knockout de CD28 homozigóticos (barras traçadas ) imunizados com vírus de estomatite vesicular. Os dados foram recolhidos em vários tempos (como indicado) após a imunização, "n.d." indica sem nível detectável. A Figura 4 representa a construção knockout de ADN utilizada para suprimir a expressão da isoforma do exão 6 de CD45. 4A representa uma porção do gene de CD45 nativo. 4B representa a construção knockout onde os exões 6-8 foram substituídos pela sequência’- neo. 4C mostra os locais de restrição da construção knockout. A Figura 5 representa a proliferação de esplenócitos de ratinhos do tipo selvagem (barras a cheio), knockout de CD45 heterozigóticos (barras com traçado simples) ou knockout de CD45 homozigóticos (barras com traçado duplo) em resposta a 1) lipopolissacárido (LPS) ou 2) anticorpos anti-μ purificados (B-7-6). Estes dados foram obtidos 3, 4 ou 5 dias após os estimulantes terem sido adicionados aos meios de cultura. "S.E." indica sem estimulante adicionado. A Figura 6 representa a resposta de células T citotóxicas de ratinhos do tipo selvagem e knockout homozigóticos de isoforma do exão 6 de CD45, quando expostos a LCMV (vírus de coriomeningite linfocitária da estirpe Armstrong). 6A representa a reacção de inchaço da almofada da pata, e 6B representa a lise específica de células infectadas com LCMV. Os triângulos a branco representam os ratinhos knockout da isoforma do exão 6 de CD45 homozigóticos, e os triângulos a cheio representam os ratinhos do tipo selvagem.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção baseia-se em parte na verificação de que o nível de expressão de um determinado gene num mamífero pode ser diminuído ou mesmo completamente suprimido através da introdução, no ADN genómico do mamífero, de uma nova sequência de ADN que serve para interromper alguma porção da sequência de ADN do gene a suprimir. 7 86 165 ΕΡ Ο 701 607/ΡΤ Ο termo "knockout" refere-se à supressão parcial ou completa da expressão de pelo menos uma porção de uma proteína codificada por uma sequência de ADN endógena numa célula. O termo "construção knockout" refere-se a uma sequência de ácido nucleico que é desenhada para diminuir ou suprimir a expressão de uma proteína codificada por sequências de ADN endógenas numa célula. A sequência de ácido nucleico utilizada como construção knockout é tipicamente constituída por (1) ADN de uma porção do gene (sequência de exão, sequência de intrão-e/òu1 sequência de promotor) a suprimir e (2) uma sequência, marcadora utilizada para detectar a presença da construção knockout na célula. A construção knockout é inserida numa célula, e integra-se no ADN genómico da célula numa posição tal que evita ou interrompe a transcrição da sequência de ADN nativa. Uma tal inserção ocorre normalmente por recombinação homóloga [i.e., regiões da construção knockout que são homólogas a sequências de ADN endógenas hibridam umas com as outras quando a construção knockout é inserida na célula e recombinam-se de modo a que a construção knockout seja incorporada na posição correspondente do ADN endógeno). A sequência de ácido nucleico da construção knockout pode compreender 1) uma sequência completa ou parcial de um ou mais exões e/ou ihtrões do gene a suprimir, 2) uma sequência completa ou..parcial de um promotor do gene a suprimir, ou 3) suas combinações.

Tipicamente, a construção knockout é inserida num hemocitoblasto embrionário (célula ES) e é integrada no ADN genómico da célula ES, usualmente através do processo de recombinação homóloga. Esta célula ES é então injectada, e integra-se, no embrião em desenvolvimento. A frase "ruptura do gene" refere-se à inserção de uma sequência de ácido nucleico numa região da sequência de ADN nativa (usualmente um ou mais exões) e/ou na região do promotor de um gene de modo a diminuir ou evitar a expressão desse gene na célula em comparação com a sequência do tipo selvagem ou de ocorrência natural do gene. Como exemplo, pode-se preparar uma construção de ácido nucleico contendo uma sequência de ADN que codifica um gene de resistência a um antibiótico que é inserida na sequência de ADN que é complementar à sequência de ADN (região do promotor e/ou de codificação) que se pretende que sofra a ruptura. Quando esta construção de 8 86 165 ΕΡ Ο 701 607/ΡΤ ácido nucleico é então tránsfectada para uma célula, a construção irá integrar-se no ADN genómico. Assim, muita da progénie da célula já não expressará o gene em pelo menos algumas células, ou expressá-lo-á num nível diminuído, uma vez que o ADN sofreu ruptura através do gene de resistência ao antibiótico.

Os termos "CD28" e "receptor CD28" referem-se a uma proteína receptora de superfície celular que é expressa em certas células do sistema imunitário, especialmente em células T. Crê-se que a engrenagem de CD28 com os seus ligandos B7/BB1, é um sinal de co-estjmulação essencial, necessário para a activação de células T.

Os termos "CD45", "receptor CD45" e "L-CA" referem-se a uma glicoproteína receptora de superfície celular expressa na superfície de muitos tipos de células hematopoiéticas. O CD45 tem múltiplas ísoformas variando em peso molecular de cerca de 180 kD a cerca de 235 kD. As diferentes linhas de células hematopoiéticas expressam diferentes isoformas de CD45, e algumas células podem expressar mais do que uma isoforma. Tal como aqui se utiliza, CD45 refere-se a qualquer uma e a todas estas isoformas. O termo "isoforma do exão 6 de ,CD45" refere-se à isoforma de CD45 que expressa o exão 6 (bem como outros exões) do gene de CD45. "Construção knockout da isoforma do exão 6 de CD45" refere-se a uma construção knockout desenhada para suprimir a expressão da isoforma de CD45 que expressa o exão 6 (bem como outros exões). A expressão "sequência marcadora" refere-se a uma sequência de ácido nucleico que é (1) utilizada como parte de uma construção de ácido nucleico (/.e., a "construção knockout") para provocar a ruptura da expressão do(s) gene(s) de interesse (tais como, por exemplo, CD28 ou CD45), e (2) utilizada como um meio para identificar as células que têm incorporada a construção knockout no seu genoma. A sequência marcadora pode ser qualquer sequência que sirva estes propósitos, apesar de tipicamente ser uma sequência que codifica uma proteína que confere um traço detectável à célula, tal como um gene de resistência a um antibiótico ou de uma enzima ensaiável que não se encontra tipicamente na célula. Quando a sequência marcadora codifica uma

86 165 ΕΡ Ο 701 607/ΡΤ proteína, a sequência marcadora conterá também tipicamente um promotor que regula a sua expressão.

Os termos "roedor" ou "roedores" referem-se a todos os membros da ordem filogenética Rodentia incluindo qualquer e toda a progénie de todas as gerações futuras dela derivadas. O termo "murídeo" refere-se a qualquer e todos os membros da família Murídae, incluindo ratos e ratinhos. O termo "progénie" refere-se a qualquer e todas as futuras gerações derivadas e descendentes de um determinado mamífero, i.e., um mamífero contendo uma construção knockout inserida no seu ADN genómico. Assim, incluem-se aqui a progénie de qualquer geração sucessiva de modo que estão incluídas nesta definição a progénie, as gerações F1, F2, F3 e assim por diante indefinidamente.

Os termos "imunomodular" e "imunomodulação" referem-se a alterações no nível de actividade de quaisquer componentes do sistema imunitário em comparação com a actividade média desse componente para uma espécie em particular. Assim, 'tal como aqui se utiliza, imunomodulação refere-se a, qm aumento ou uma diminuição de actividade. A imunomodulação pode ser detectada por ensaio do nível de células B, qualquer um ou todos os tipos de células T, células que apresentam antigénios, e quaisquer outras células que se acredite estarem envolvidas na função imunitária. Adicionalmente, ou alternativamente, a imunomodulação pode ser detectada por avaliação 1) do nível de expressão de genes particulares que se crêem ter um papel no sistema imunitário, 2) do nível de compostos particulares tais como citóquinas (interleucinas e semelhantes) ou outras moléculas que têm um papel no sistema imunitário, e/ou 3) do nível de enzimas e proteínas particulares, e semelhantes, que estão envolvidas no funcionamento do sistema imunitário. Métodos de concretização da invenção 1, Seleccão de qene(s) knockout 0 gene a inactivar (a sofrer knockout) pode ser qualquer gene desde que esteja disponível pelo menos alguma informação sobre a sequência do ADN no qual se pretende inferir a ruptura, para se utilizar na preparação tanto da 10 86 165 ΕΡ Ο 701 607/ΡΤ construção knockout como das sondas para pesquisa. Usualmente, o ADN a utilizar na construção knockout será uma ou mais regiões de exões e/ou intrões, e/ou uma região de promotor, mas também pode ser uma sequência de ADNc desde que o ADNc seja suficientemente grande. Geralmente, o ADN terá pelo menos cerca de 1 quilobase (kb) de comprimento e preferivelmente 3-4 kb de comprimento, proporcionando assim suficiente sequência complementar para hibridação quando a construção knockout é introduzida no ADN genómico da célula ES (adiante discutido). Tipicamente, o gene a inactivar (sofrer knockout) será um gene que 1) é expresso em células T e/ou células B maduras e/ou imaturas, 2) èstá envolvido, quer directa quer indirectamen^e,.^na .via · de activação durante respostas de inflamação ou imunossupressão pelo sistema imunitário, e 3) não resulta em letalidade quando é inactivado (sofre knockout). Os genes preferidos para inactivar (sofrerem knockout) são os genes de CD28 e CD45.

Está incluído no âmbito da presente invenção um mamífero em que dois ou mais genes tenham sido inactivados (sofrido knockout). Estes mamíferos podem ser gerados repetindo os procedimentos aqui apresentados para a produção de cada construção knockout, ou fazendo a criação de mamíferos, cada um com um único gene inactivado (que sofreu knockout), cruzando-os uns com os outros, e pesquisando aqueles que têm o genótipo do duplo knockout. A sequência de ADN a utilizar para o knockout de um gene seleccionado pode ser obtida utilizando métodos bem conhecidos na arte tais como os descritos por Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY [1989]). Estes métodos ^incluem, por exemplo, a pesquisa de uma biblioteca genómica com uma sonda de ADNc que codifica pelo menos uma porção do mesmo gene de modo a obter pelo menos uma porção da sequência genómica. Alternativamente, quando se pretende utilizar uma sequência de ADNc numa construção knockout, o ADNc pode ser obtido por pesquisa de uma biblioteca de ADNc com sondas oligonucleotídicas ou antibióticos (quando a biblioteca é clonada num vector de expressão). Quando se pretende utilizar uma sequência de um promotor na construção knockout, podem ser desenhadas sondas de ADN sintéticas para a pesquisa de uma biblioteca genómica contendo a sequência do promotor. 11 86 165 ΕΡ Ο 701 607/ΡΤ

Outro método para a obtenção do ADN a utilizar na construção knockout consiste no fabrico da sequência de ADN, sinteticamente, utilizando um sintetizador de ADN. A sequência de ADN que codifica a construção knockout tem que ser gerada em quantidade suficiente para manipulação genética e inserção em células ES. A amplificação podo sor conduzida 1) colocando a sequência num vector adequado e transformando células bacterianas ou outras células que possam amplificar rapidamente o vector, 2) através de amplificação por PCR, ou 3) através de síntese com um sintetizador de. ADN. '· 2. Preparação de construções knockout A sequência de ADN a utilizar na produção da construção knockout é digerida com uma determinada enzima de restrição seleccionada para cortar numa localização ou localizações tais que uma nova sequência de ADN codificando um gene marcador possa ser inserida na posição correcta dentro desta sequência de ADN. A posição correcta para a inserção do gene marcador é a que servirá para evitar a expressão do gene nativo; esta posição dependerá de vários factores tais como dos locais de restrição na sequência a cortar, e se se pretende interromper uma sequência de exão ou uma sequência de promotor, ou ambas {/.e., a localização precisa de inserção necessária para inibir a função do promotor ou para inibir a síntese do exão nativo). Preferivelmente, a enzima seleccionada para cortar o ADN gerará um braço mais longo e um braço mais curto, em que o braço mais curto tenha pelo menos cerca de 300 pares de bases (pb). Em alguns casos, será desejável remover realmente uma porção ou mesmo todo de um ou mais exões do gene a suprimir de modo a manter o comprimento da construção knockout comparável com a sequência genómica original quando o gene marcador é inserido na construção knockout. Nestes casos, o ADN genómico é cortado com endonucleases de restrição apropriadas de modo a que possa ser removido um fragmento com tamanho correcto. 0 gene marcador pode ser qualquer sequência de ácido nucleico que seja detectável e/ou ensaiável, contudo, tipicamente, é um gene de resistência a um antibiótico ou outro gene cuja expressão ou presença no genoma possa ser facilmente detectada. O gene marcador está usualmente operativamente ligado ao seu próprio promotor ou a outro promotor forte de qualquer fonte que ficará activo ou será facilmente activado na célula na qual é inserido; contudo, o gene 12 86 165 ΕΡ Ο 701 607/ΡΤ marcador não necessita de ter o seu próprio promotor ligado uma vez que pode ser transcrito utilizando o promotor do gene a suprimir. Em adição, o gene marcador terá normalmente uma sequência poliA ligada na extremidade 3' do gene; esta sequência serve para terminar a transcrição do gene. Os genes marcadores preferidos são quaisquer genes de resistência a antibióticos tais como neo (o gene de resistência a neomicina) e beta-gal (beta galactosidase).

Após a sequência de ADN genómico ter sido digerida com as enzimas de restrição apropriadas, a sequência do gene marcador é ligada à sequência de ADN genómico utilizando métodos bem conhecidos dos peritos na arte e descritos em Sambrook et al., supra. As extremidades dos fragmentos de ADN a ligar têm que ser compatíveis; isto é conseguido cortando todos os fragmentos com enzimas que geram extremidades compatíveis ou tornando as extremidades lisas antes da ligação. Tornam-se as extremidades lisas utilizando métodos bem conhecidos na arte, tais como, por exemplo, utilizando o fragmento de Klenow (ADN-polimerase I) para preencher extremidades coesivas. A construção knockout ligada pode ser inserida directamente em hemocitoblastos embrionários (adiante discutido) ou pode ser primeiro colocada num vector adequado para amplificação antes da inserção. Os, vectores preferidos são aqueles que são rapidamente amplificados em células bacterianas tais como o vector pBluescript II SK (Stratagene, San Diego, CA) ou pGEM7 (Promega Corp., Madison, Wl). 3. Transfeccão de hemocitoblastos embrionários A presente invenção contempla a produção de mamíferos knockout a partir de qualquer espécie de roedor, incluindo, sem limitação, coelhos, ratos, hamsters, e ratinhos. Os roedores preferidos incluem membros da família Murídae, incluindo ratos e ratinhos. Geralmente, os hemocitoblastos embrionários (células ES) utilizados para produzir o mamífero knockout serão da mesma espécie que o mamífero knockout a gerar. Assim, por exemplo, utilizar-se-ão usualmente hemocitoblastos embrionários de ratinho para criar um ratinho knockout.

Os hemocitoblastos embrionários são tipicamente seleccionados quanto à sua capacidade para se integrarem, e se tornarem parte da linha germinativa de

86 165 ΕΡ Ο 701 607/ΡΤ um embrião em desenvolvimento de modo a criar a transmissão da construção knockout na linha germinativa. Assim, qualquer linha de células ES que se creia ter esta capacidade é adequada para utilização na presente invenção. Uma estirpe de ratinhos que é tipicamente utilizada para a produção de células ES, é a estirpe 129J. Uma linha de células ES preferida é a linha celular de murídeo D3 (n°. CRL 1934 no catálogo da American Type Culture Collection). As células são cultivadas e preparadas para inserção de ADN utilizando métodos bem conhecidos dos peritos na arte tais como os que são apresentados por Robertson {in: Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical .. '-Apptoach, E.J. Robertson, ed. IRL Press, Washington, . D.,GV [19.87]) e por Bradley et ai (Current Topics in Devei Bioi, 20:357-371 [1986]) e por Hogan et ai {Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY [1986]). A inserção da construção knockout nas células ES pode ser conseguida utilizando vários métodos bem conhecidos na arte incluindo, por exemplo, electroporação, micro-injecção e tratamento com fosfato de cálcio (veja-se Lovell-Badge, em Robertson, ed., supra). Um método preferido de inserção é a electroporação.

Cada construção knockout de ADN a inserir na célula tem primeiro que ser linearizada se a construção knockout tiver sido inserida num vector. A linearização é conseguida digerindo o ADN com uma endonuclease de restrição adequada seleccionada para cortar apenas dentro da sequência do vector e não dentro da sequência da construção knockout.

Para inserção da sequência de ADN, a construção knockout de ADN é adicionada às células ES sob condições apropriadas para o método de inserção escolhido. Quando se pretende introduzir mais do que uma construção na célula ES, os ADN que codificam cada construção podem ser introduzidos simultaneamente ou um de cada vez.

Quando se pretende eletroporar as células, as células ES e a construção knockout de ADN são expostas a um pulso eléctrico utilizando uma máquina de electroporação e seguindo as orientações para utilização do fabricante. Após a electroporação, deixam-se as células recuperar sob condições de incubação 14 86 165 ΕΡ Ο 701 607/ΡΤ adequadas. As células são então pesquisadas quanto à presença da construção knockout. A pesquisa pode ser realizada utilizando vários métodos. Quando o gene marcador é um gene de resistência a um antibiótico, as células são cultivadas na presença de uma concentração, de outro modo letal, do antibiótico. As células qua sobrevivem integraram presumivelmente a construção knockout. Se o gene marcador for outro que não um gene de resistência a um antibiótico, realiza-se uma transferência de Southern do ADN genómico das células ES que pode ser sondado com uma.sequência dé^ÁDN desenhada para hibridar apenas com a sequência marcadora. Finalmente, se o gene marcador for um gene que codifica uma enzima cuja actividade pode ser detectada (e.g., beta-galactosidase), o substrato da enzima pode ser adicionado às células sob condições adequadas, e a actividade enzimática pode ser analisada. A construção knockout pode ser integrada em várias localizações no genoma da célula ES, e pode integrar-se numa localização diferente no genoma de cada célula, devido à ocorrência de eventos de inserção aleatória; a localização desejada da inserção é numa posição complementar à sequência de ADN que se pretende inactivar (que sofra knockout). Tipicamente, menos de cerca de 1-5 porcento das células ES que captam a construção knockout. integrarão realmente a construção knockout na localização desejada. Para identificar as células com integração correcta da construção knockout, o ADN pode ser extraído das células utilizando métodos Standard tais como os descritos por Sambrook et al., supra. O ADN pode então ser sondado numa transferência de Southern com uma sonda ou sondas desenhadas para hibridar num padrão específico com o ADN genómico digerido com (a) uma enzima ou enzimas de restrição particulares. Altemativamente, ou adicionalmente, o ADN genómico pode ser amplificado por PCR com sondas especificamente desenhadas para ampliar fragmentos de ADN de tamanho e sequência particulares (/.e., apenas as células contendo a construção knockout na posição correcta gerarão fragmentos de ADN com o tamanho correcto). 4. Inieccão/lmplantacão de embriões

Após as células ES adequadas, contendo a construção knockout na localização correcta, terem sido identificadas, as células são inseridas num embrião. A inserção pode ser realizada de várias maneiras, contudo, a 15 86 165 ΕΡ Ο 701 607/ΡΤ micro-injecção é um método preferido. Para micro-injecção, recolhem-se cerca de 10-30 células para uma micropipeta e injectam-se em embriões que estão no estádio de desenvolvimento correcto para integrar a célula ES no embrião em desenvolvimento. 0 estádio adequado de desenvolvimento para o embrião é muito dependente das espécies, contudo, para ratinhos, é de cerca de 3,5 dias. Os embriões são obtidos por perfusão do útero de fêmeas grávidas. Os métodos adequados para realizar isto são conhecidos dos peritos na arte e são apresentados por Bradíey (em Robertson, ed., supra). t

Embora qualquer embrião na idade/estádio de desenvolvimento correctos seja adequado para utilização, os embriões preferidos são machos e têm genes que codificam para uma cor de pelagem diferente da cor de pelagem codificada pelos genes da célula ES. Deste modo, as crias podem ser pesquisadas facilmente quanto à presença da construção knockout procurando a cor de pelagem mosaico (indicando que a célula ES foi incorporada no embrião em desenvolvimento). Assim, por exemplo, se a linha de células ES for portadora de genes para pelo branco, o embrião seleccionado será portador de genes para pelo preto ou castanho.

Depois das células ES terem sido introduzidas no embrião, o embrião é implantado no útero de uma mãe hospedeira pseudográvida. Embora qualquer mãe hospedeira possa ser utilizada, estas são tipicamente seleccionadas quanto à sua capacidade para procriar e reproduzir bem, e quanto à sua capacidade para cuidar das suas crias. Estas mães hospedeiras são tipicamente preparadas fazendo-as acasalar com machos vasectomizados da mesma espécie. O estádio da pseudogravidez da mãe hospedeira pseudográvida é importante para o sucesso da implantação, e depende das espécies. Para ratinhos, este estádio é de cerca de 2-3 dias de pseudogravidez. 5. Pesquisa da presença do gene knockout

As crias que nascem da mãe hospedeira podem ser pesquisadas inicialmente quanto a cor de pelagem mosaico onde se emprega a estratégia de selecção da cor da pelagem (como descrito acima). Em adição, ou em alternativa, o ADN de tecido da cauda das crias pode ser pesquisado quanto à presença da construção knockout utilizando transferência de Southern e/ou PCR 16 86 16b EP 0 701 607/PT como descrito acima. As crias que parecem ser mosaico são então cruzadas umas com as outras quando se crê que são portadoras da construção knockout na sua linha germinativa para gerar animais knockout homozigóticos. Se não for claro se as crias terão transmissão na linha germinativa, podem ser cruzadas com uma estirpe progenitora ou outra estirpe e as crias podem ser pesquisadas quanto a heterozigocidade. Os heterozigotos são identificados por transferência de Southern e/ou amplificação por PCR do ADN, como acima descrito.

Os heterozigotos podem então ser cruzados uns com os outros para gerar crias knockout homozigóticas. Os homozigotps·-podem ser identificados por transferência de Southern de quantidades equivalentes de ADN genómico de ratinhos que são o produto deste cruzamento, bem como ratinhos que são heterozigotos conhecidos e ratinhos do tipo selvagem. As sondas para pesquisar as transferências de Southern podem ser desenhadas como acima descrito.

Estão disponíveis outros meios de identificação e caracterização de crias knockout. Por exemplo, pode-se utilizar transferência de Northern para sondar o ARNm quanto à presença ou ausência de transcritos que codificam o gene inactivado (que sofreu knockout), o gene marcador, ou ambos. Em adição, pode-se utilizar transferência de Western para determinar o nível de expressão do gene inactivado (que sofreu knockout) em vários tecidos destas crias sondando a transferência de Western com um anticorpo contra a proteína codificada pelo gene inactivado (que sofreu knockout), ou um anticorpo contra o produto do gene marcador, quando este gene é expresso. Finalmente, pode ser conduzida a análise in situ (tal como a fixação das células e a marcação com anticorpo) e/ou a análise FACS (ordenação de células activadas por fluorescência) das várias células das crias utilizando anticorpos adequados para procurar a presença ou ausência do produto génico da construção knockout.

Utilizações de mamíferos knockout O mamífero da presente invenção terá uma variedade de utilizações dependendo do gene ou dos genes que foram suprimidos. Quando o gene ou os genes suprimidos codificam proteínas que se crêem estar envolvidas na imunossupressão ou na inflamação, o mamífero pode ser utilizado para pesquisar drogas úteis para imunomodulação, i.e., drogas que potenciam ou inibem estas actividades. A pesquisa de drogas úteis envolveria a administração

86 165 ΕΡ Ο 701 607/ΡΤ ao ratinho da droga candidata numa gama de doses, e o ensaio em vários pontos temporais quanto ao(s) efeito(s) imunomodulador(es) da droga sobre a desordem imunitária que se está a avaliar. Um tal ensaio incluiria, por exemplo, a procura de níveis aumentados ou diminuídos de células T e B, produção aumentada ou diminuída de imunoglobulina, de níveis aumentados ou diminuídos de mensageiros químicos tais como citóquinas {e.g., interleucinas e semelhantes), e/ou de níveis aumentados ou diminuídos de expressão de genes particulares envolvidos na resposta imunitária.

Por exemplo, pacientessubmetidos a quimioterapia sofrem frequentemente imunossupressão. Seria desejável activar o sistema imunitário destes indivíduos através da administração ao paciente de um agente terapêutico capaz de produzir um tal efeito. Um mamífero da presente invenção poderá ser utilizado para pesquisar uma variedade de compostos, sozinhos ou em combinação, para determinar se resulta o restabelecimento ou a activação parciais ou totais da resposta imunitária. A mesma estratégia pode ser aplicada para encontrar compostos que seriam úteis para suprimir a resposta inflamatória observada em muitos pacientes com artrite, ou úteis para suprimir o fenómeno auto-imune observado em pacientès com artrite reumatóide e lúpus. >

Em adição, os mamíferos da presente invenção podem ser úteis para avaliar o desenvolvimento do sistema imunitário e para estudar os efeitos de mutações de determinados genes.

Outras utilizações serão rapidamente aparentes aos peritos na arte. A invenção será mais completamente entendida por referência aos exemplos seguintes. Estes exemplos não deverão ser entendidos como de modo algum limitantes do âmbito da presente invenção. EXEMPLO I: PREPARAÇÃO DE UM RATINHO KNOCKOUT DE CD28

1. Preparação da construção knockout de ADN

Isolou-se um clone genómico do gene de CD28 de murídeo (descrito por Lee et al., J. Immunol.. 145:344 [1999]) a partir de uma biblioteca genómica de murídeo BALB/c utilizando a sequência de ADNc do exão 2 de CD28 de 18 86 165 ΕΡ Ο 701 607/ΡΤ murídeo como sonda. Substituíram-se a extremidade 3' do intrão 1 e a região a 5' do exão 2, por inserção de uma construção de ADN que codifica o gene de resistência a neomicina (neo) ligado ao promotor de timidina-quinase do vírus do herpes simples. A construção de ADN do neo foi obtida a partir do plasmídeo pMCIneoPolA (Thomas et al., Cell, 51:503 [1987]) por digestão deste plasmídeo com as endonucleases de restrição Xba\ e fcoRI. Ligou-se a sequência do neo à sequência genómica de CD28 através de corte da sequência genómica com £coRI e Xba\, e ligou-se então esta construção knockout neo/CD28 ao vector pGEM7 (Promega Corp. Madison, Wl). Transfórmou-se este vector na bactérias E. co/i da estirpe -0.^5, alfa para amplificação. Após a amplificação, purificou-se o plasmídeo utilizando a lise alcalina e o gradiente de CsCI Standard para purificação. 2. Electroporação e injecção de hemocitoblastos

Linearizou-se a construção knockout de plasmídeo purificado por digestão com a endonuclease de restrição AatW, gerando assim um braço mais curto e um braço mais longo da sequência de CD28 de cada lado do gene neo. A construção knockout linearizada foi então transfectada na linha de hemocitoblastos embrionários D3 como se segue: Adicionaram-se cerca de 5 nmol de ADN linearizado a cerca de 5 x 106 células ES num volume de cerca de 800 μΙ de meio de cultura. Submeteram-se as células a um pulso de 0,34 quilovolt e 250 pF, e plaqueou-se cada frasco de células em duas placas de cultura de células de 10 cm contendo células alimentadoras de fibroblastos embrionários e pré-revestidas com gelatina a 1 porcento, e contendo 10 ml de meio DMEM (gibco/BRL, Grand Island, NY), 15 porcento de soro de vitelo fetal (Gibco/BRL, Grand Island, NY ou equivalente de Hyclone Labs, Logan, UT), e factor inibidor de leucemia (Fung-Leung et a/., Cell, 65:443-449 [1991]). Após dois dias, iniciou-se a selecção de neo por adição do antibiótico G418 a 250 pg/ml às culturas. As células que sobreviveram na presença de G418 muito provavelmente continham a construção knockout. Estas células foram então pesquisadas para verificar que as células tinham incorporado a construção knockout no ADN genómico. A pesquisa foi realizada utilizando o método da reacção em cadeia com polimerase (PCR) para amplificação de ADN. Utilizaram-se dois iniciadores em PCR. O primeiro iniciador era dirigido a uma sequência específica para o promotor da timidina-quinase e está estabelecido adiante; o segundo iniciador, também estabelecido adiante, era específico para o intrão 2 de CD28. 19 19

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Iniciador 1 (SEQ ID ΝΟ:1): 5'-CCTGAGTCCTGATCTGTCAGACT-3'

Iniciador 2 (SEQ ID NO:2): 5'-ATTCGGCAATGACAAGACGCTGG-3' A linha de células D3 contendo a construção knockout de CD28 foi depositada na ATCC (American Type Culture Collection) com o número de acesso CRL 11382.

Analisaram-se transferências de Southern de ADN genómico de células de controlo e de células transfectadas, para determinar células transfectadas que continham a construção knockout na localização e orientação correctas no ADN genómico {i.e., para identificar as células que tinham sofrido recombinação homóloga). Sondaram-se as transferências de Southern com duas sondas. A primeira sonda era um fragmento EcoR\/Xba\ de 200 pares de bases (pb) do intrão 2 de CD28. A segunda sonda era um fragmento do gene de neo e foi gerada por digestão do plasmídeo pMCINeoPolA (acima descrito) com Hind\\\ e Xho\, e isolamento do fragmento de 1,2 kb utilizando procedimentos Standard de electroforese em gel de agarose.

Prepararam-se as linhas de células contendo a inserção CD28-neo que tinha sido inserida no ADN genómico correctamente, para injecção em embriões de murídeo por tratamento com tripsina seguindo métodos descritos por Robertson (Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C., [1987], Robertson, E.J., ed.). Os embriões injectados eram embriões de 3,5 dias de idade obtidos por perfusão do útero de ratinhos fêmea que tinham acasalado com ratinhos macho. Após injecção dos hemocitoblastos embrionários nos embriões, os embriões foram implantados em ratinhos fêmea pseudo-grávidas para gestação. As crias foram acasaladas umas com as outras ou com um ratinho com uma cor de pelagem adequada de modo a se poder detectar os ratinhos portadores da construção knockout. 3. Pesquisa de ratinhos quanto à construção knockout

As crias destes acasalamentos foram avaliadas quanto à presença da construção knockout sondando uma transferência de Southern de ADN obtido 20 86 165 ΕΡ Ο 701 607/ΡΤ de tecido da cauda com a sonda do gene de neo (acima descrita). A sonda não hibridou com ADN obtido dos ratinhos do tipo selvagem.

Para avaliar o nível de expressão de CD28 em ratinhos knockout e do tipo selvagem, obtiveram-se linfócitos de sangue periférico (PBL) desses ratinhos colhendo cerca de 25 μΙ de sangue de sangrias da cauda para um tubo contendo 100μΙ de EDTA 20 mM em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Isolaram-se os PBL por adição de 2 ml de tampão de lise de Gey (para lisar os glóbulos vermelhos) à solução de sangue e lavagem, duas vezes, com PBS suplementada'corri BSA (albumina sérica bovina) a 1 porcento e azida de., sódio a 0,1 porcento. Incubaram-se as células com anticorpo monoclonal anti-CD28 de murídeo de hamster conjugado com ficoeritrina (PE) (5 μΙ de uma solução de 0,2 mg/ml) obtido de Pharmigen (San Diego, CA). Fixaram-se então os PBL com paraformaldeído a 1 porcento. Analisaram-se cerca de 5 000 células para cada ratinho. Estas células foram então ordenadas com base na intensidade de PE utilizando FACS (ordenação de células activadas por fluorescência; utilizou-se uma máquina de FACS de Becton-Dickinson [Mountain View, CA]). 4. Análise dos efeitos do gene knockout h 1 As populações de timócitos de ratinhos knockout homozigóticos e de ratinhos do tipo selvagem foram avaliadas quanto à expressão de CD4 e CD8 na superfície celular. Coraram-se os timócitos com anticorpo monoclonal acoplado a FITC dirigido para CD8, ou com anticorpo monoclonal acoplado a ficoeritrina dirigido para CD4 (os anticorpos foram obtidos de Beckton-Dickinson, Mountain View, CA). Avaliaram-se esplenócitos quanto a expressão do marcador de superfície celular B7 e a quantidade de células B por coloração com anticorpo anti-B220 marcado com FITC e anti-B7 marcado com biotina que foi detectado com estreptavidina marcada com PE. Analisaram-se as células por FACS, e foram analisadas cerca de 10 000 células por cada amostra. Todos os ratinhos apresentaram subtipos CD4/CD8 normais no timo, sugerindo que o desenvolvimento de células T não foi afectado de forma detectável nos ratinhos knockout. Em adição, todos os ratinhos apresentaram perfis de células B e B7 semelhantes, sugerindo que os ratinhos knockout não compensaram a mutação alterando o nível de expressão de B7.

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As respostas imunitárias de ratinhos do tipo selvagem e ratinhos knockout homozigóticos e heterozigóticos, foram avaliadas através do ensaio de esplenócitos de cada tipo de ratinho quanto à proliferação quando expostos a vários mitogénios. Os esplenócitos foram obtidos sacrificando um ratinho e extraindo o seu baço. O baço foi esmagado em meios contendo soro de vitelo fetal a 2 porcento, e lisaram-se os glóbulos vermelhos como descrito anteriormente. Estas células foram então plaqueadas em placas de fundo raso de 96 poços a uma densidade de cerca de 2 x 105 células/poço, e adicionaram-se vários mitogénios como se segue: 1) A concanavalina A (ConA) foi avaliada a concentrações entre 5,0 pg/ml e 1,25 pg/ml, e-a 2,5 pg/ml quer na presença quer na ausência de IL-2; e 2) o ionóforo de cálcio A23167 a 250 ng/ml foi avaliado na presença do éster de forbol PMA a 50 ng/ml. Determinou-se a proliferação celular medindo a captação de 3H-timidina após dois dias de cultura. Os resultados são apresentados na Figura 2. Em relação a ConA, as células do ratinho do tipo selvagem apresentaram uma grande resposta proliferativa, as células dos ratinhos knockout de CD28 heterozigóticos apresentaram menos de uma resposta e as células de ratinhos knockout de CD28 homozigóticos tinham a menor quantidade de captação de 3H-timidina. Contudo, a resposta ao ionóforo de cálcio/PMA foi mais comparável entre os três tipos de células.

Avaliou-se presença de anticorpos neutralizantes nos soros em resposta a infecção com vírus de estomatite vesicular (VSV, estirpe Indiana). Injectaram-se ratinhos com 2x10® ufc do vírus. Após 4, 10 ou 20 dias, analisaram-se os soros dos ratinhos quanto a anticorpos IgG e IgM neutralizantes utilizando métodos descritos por Leist et al., (J. Immunol., 138:2278 [1987]). Os resultados, expressos como títulos de actividade neutralizante, estão apresentados na Figura 3. Cada barra representa o valor médio de um grupo de 5 ratinhos; n.d. significa "não detectável". Embora os títulos de ratinhos knockout homozigóticos e do tipo selvagem fossem comparáveis no dia 4, os ratinhos knockout homozigóticos tinham níveis muito mais baixos de IgG do que os ratinhos do tipo selvagem nos dias 10 e 20. EXEMPLO 2: PREPARAÇÃO DE UM RATINHO KNOCKOUT DE CD45

1. Preparação da construção knockout de ADN

Isolou-se um fragmento de ADN genómico de murídeo de 4,0 kb do gene de CD45, como descrito por Johnson et al. (J. Biol. Chem., 264:6220-6229 22 86 165 ΕΡ Ο 701 607/ΡΤ ι [1989]). Este fragmento estende-se dos exões 2-8 do gene. O fragmento foi inserido no vector pGEM-9Zf(-) (Promega Corp., Madison, Wl) previamente digerido com as endonucleases de restrição Saci e BamH\. Após a inserção, digeriu-se a construção com as endonucleases de restrição Kpn\ e Nsi1; estes locais estão localizados entre os intrões 5 e 6, e entre os intrões 6 e 7, respectivamente, do fragmento do gene de CD45. A construção do gene de resistência à neomicina contendo um sinal de terminação poliA foi obtida a partir do plasmídeo pMCIneoPolA (Thomas et al., Cell, 51:503 [1987]) e foi digerida com Kpn\ e Nsi\ e foi então ligada à construção na orientação anti-sentido relativamente.à orientação da transcrição de CD45. A construção knockout resultante está representada na Figura 4. 2. Electroporação e injecção de hemocitoblastos Linearizou-se a construção knockout por digestão com a endonuclease de restrição Saci, e electroporaram-se cerca de 25 pg deste ADN em hemocitoblastos embrionários D3. As células electroporadas contendo a construção foram depositadas na ATCC com o número de acesso XXX. A electroporação foi realizada utilizando o procedimento descrito no Exemplo I. Utilizaram-se cerca de 50 pg de ADN por 107 células. Após a electroporação, plaquearam-se as células e pesquisaram-se como descrito no Exemplo I.

As células que eram resistentes a G418 foram pesquisadas quanto a recombinação homóloga por PCR utilizando iniciadores específicos para o gene de resistência à neomicina e quanto a um local específico para o gene de CD45. Os iniciadores utilizados são a seguir estabelecidos:

Iniciador 1 (SEQ ID NO:3): 5 '-CTT ACTACACATCCCAACCT-3'

Iniciador 2 (SEQ ID NO:4): CTT G ACG AGTT CTT CT G AGG-3'

As condições da reacção PCR foram: desnaturação a 91°C, hibridação a 60°C e prolongamento a 72°C. Realizaram-se cerca de 35-40 ciclos. Em adição, confirmou-se a recombinação homóloga nestas células foi confirmada por análise de transferência de Southern utilizando uma sonda de ADN de 1,4 kb marcada com 32P que se estende numa região entre os intrões 4 e 5 do gene de 23 23

86 165 ΕΡ Ο 701 607/ΡΤ CD45. A transferência de Southern foi conduzida por isolamento do ADN genómico de células resistentes a G418 utilizando métodos Standard tal como descritos por Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY [1989]). O ADN genómico foi digerido com BamVW, separado utilizando electroforese em agarose Standard, e transferido para papel de membrana Immobilon-N. A transferência para a membrana foi realizada a 20°C durante 12 horas em SSC a 10 porcento (Sambrook et al., supra). A membrana foi sondada durante 12 horas a 67°C e depois lavada três vezes. A primeira lavagem foi com SSC a 5 porcento, SDS a 0,01 porcento;· a segunda lavagem foi com SSC a 3 porcento, SDS,. a>0,01 porcento; a terceira lavagem foi com SSC a 1 porcento, SDS a 0,01 porcento. A preparação de células ES, a injecção em embriões e a implantação em mães hospedeiras foram como descrito no Exemplo I. 3. Pesquisa de ratinhos quanto à construção knockout As crias (os ratinhos criadores) foram pesquisadas quanto a mosaicismo por avaliação da pigmentação do pelo (o embrião era de um ratinho de pelo preto e o hemocitoblasto embrionário era de um ratinho aguti; a maioria dos ratinhos mosaico tinham portanto uma pelagem que era parcialmente aguti e parcialmente preta). Os ratinhos criadores foram de novo cruzados para gerar ratinhos knockout de CD45 heterozigóticos. As crias provenientes deste cruzamento foram pesquisadas para determinar se eram homozigóticas ou heterozigóticas quanto à construção knockout de CD45. A pesquisa foi realizada por transferência de Southern de ADN obtido de tecido da cauda. O tecido da cauda foi obtido por corte de uma porção da cauda de ratinhos de 3 semanas de idade. O tecido da cauda foi incubado com 500 μΙ de uma solução de TNE (Sambrook et al., supra), 150pg/ml de Proteinase K, 1 porcento de SDS e 1 mg/ml de Pronase E. Após esta incubação, adicionaram-se 750 μΙ desta solução a 750 μΙ de fenol:clorofórmio (1:1 v/v) para isolar o ADN. Centrifugou-se a mistura 5 minutos para formar uma pelete com os resíduos celulares. Adicionou-se o sobrenadante a 450 μΙ de álcool isopropílico e incubou-se esta mistura sobre gelo seco para precipitar o ADN. Após incubação, formou-se uma pelete com o ADN precipitado por centrifugação, secou-se ao ar e ressuspendeu-se em 100 μΙ de água destilada, e manteve-se a 86 165 ΕΡ Ο 701 607/ΡΤ 24

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4°C. Realizaram-se transferências de Southern deste ADN como descrito acima para os hemocitoblastos embrionários.

Para testar as células B e as células T dos ratinhos quanto à expressão de CD45 e para determinar a zigocidade dos ratinhos, pesquisaram-se células de vários ratinhos quanto à presença de marcadores imunológicos utilizando anticorpos e métodos como se descreve adiante.

Prepararam-se suspensões de células únicas de timócitos, esplenócitos, células de nódulos linfáticos mesentériçqs.,e .células da medula óssea, de ratinhos de 6-12 semanas de idade, como se segue: sacrificaram-se ratinhos utilizando dióxido de carbono seguindo protocolos Standard do Canadian Research Council, e recolheram-se os órgãos de cada ratinho e mantiveram-se em solução salina tamponada com fosfato (PBS) a 4°C. Preparam-se suspensões de células únicas esmagando os órgãos contra um peneiro de malha de aço com um êmbolo de seringa. Lavaram-se as células duas vezes com PBS. Cada suspensão foi ressuspensa em PBS e incubada com os anticorpos apropriados como se segue: 1) Detectou-se o antigénio Pan-CD45 com 1) anticorpo monoclonal Ly-5 marcado com FITC (isotiocianato de fluoresceína) ou PE (ficoeritrina) (Pharmingen, San Diego, CA) ou 2) com anticorpo monoclonal IgG de rato, 13/2.3, derivado de sobrenadante (Trowbridge et a/., J. Exp. Med., 148:313 [1978]). 2) Detectou-se o epítopo codificado pelo exão 4 de CD45 com anticorpo monoclonal de rato, 14.8, derivado de sobrenadante; obtido de Kincade et al., J. Immunol., 127:2262-2268 [1981]). 3) Detectou-se o epítopo codificado pelo exão 5 de CD45 com anticorpo monoclonal IgG de rato, MB23G2, obtido de sobrenadante (Birkeland et a/., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 86:6734-6738 [1989]). 4) Detectou-se um epítopo de glicosilação de CD45 de células B com anticorpo monoclonal B220 (marcado com FITC ou PE; Pharmigen, San Diego, CA). 25 86 165 ΕΡ Ο 701 607/ΡΤ 5) Detectou-se CD4 com anticorpo monoclonal anti-CD4 (marcado com FITC ou PE) obtido de Becton-Dickinson (Mountain View, CA). 6) Detectou-se CD8 com anticorpo monoclonal anti-CD8 (marcado com FITC, PE ou biotina) obtido de Becton-Dickinson (Mountain View, CA). 7) Detectou-se TCRVbeta8.1 +8.2 com anticorpo monoclonal IgG de rato, KJ16 (Hoskins et ai, J. Exp. Med., 160:452-471 [1984]). 8) Detectou-se.· TGRVbeta8.2 com anticorpo monoclonal IgG de ratinho, F23.2 (Staerz et ai, J. Immunoi, 134:3994-4000 [1985]). 9) Detectou-se H-2b com anticorpo monoclonal B8-24 marcado com FITC (Pharmigen, San Diego, CA). 10) Detectou-se H-2d com anticorpo monoclonal 34-2-12 marcado com FITC (Pharmigen, San Diego, CA). 11) Detectou-se CD3 com anticorpo monoclonal anti-CD3 (Pharmigen, San Diego, CA). 12) Detectou-se Thy1.2 com anticorpo monoclonal anti-Thy1.2 marcado com FITC ou PE (Pharmigen, San Diego, CA). 13) Detectou-se antigénio slgM com anticorpo monoclonal marcado com FITC (Pharmigen, San Diego, CA). A marcação das células com os anticorpos foi realizada como se segue: Para coloração simples ou dupla utilizando anticorpo marcado com PE ou FITC, incubaram-se cerca de 1 x 10® células com 4 μΙ de anticorpo marcado a 4°C durante 30 minutos em 100 μΙ de uma solução de Tampão de Coloração que consistia em PBS com 10 porcento de soro de vitelo fetal (FCS) e 0,1 porcento de azida de sódio. Lavaram-se então as células, uma vez, com 5 ml de PBS e fixaram-se em paraformaldeído a 1 porcento (em PBS) e mantiveram-se a 4°C até estarem prontas para a análise FACS. 26 86 165 ΕΡ Ο 701 607/ΡΤ

Para a marcação das células utilizando os sobrenadantes, incubaram-se 1 x 10® células com cerca de 50 μΙ do sobrenadante apropriado durante 30 minutos a 4°C em 100μΙ de Tampão de Coloração. Após esta incubação, a ligação do anticorpo foi visualizada por incubação com 3 μΙ de IgG de cabra anti-ratinho ou IgG de cabra anti-coelho, marcados com PE ou FITC (ambos obtidos de Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL) durante 30 minutos a 4°C. As células foram então lavadas uma vaz com PBS e depois foram fixadas em paraformaldeído como descrito acima. ’Á visualização de anticorpos de rato ou ratinho foi conduzida utilizando IgG de cabra anti-rato marcado com PE ou FITC e anti-soros de cabra anti-ratinho marcados com FITC (ambos obtidos de Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL), e a visualização de anticorpos marcados com bíotina foi com estreptavidina-RED613 (Gibco/BRL, Grand Island, NY). Quando se utilizaram protocolos de coloração dupla com anticorpos de rato, bloqueou-se primeiro a coloração não específica devida a locais de IgG anti-rato remanescentes, utilizando 2 pg/100 μ| de IgG de rato (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) e incubaram-se as células a 4°C durante 10 minutos antes da lavagem com PBS. Todas as amostras foram analisadas com uma máquina FCScan utilizando um programa Lysis II (Becton-Dickinson, Mountain View, CA).

Os resultados demonstraram que a isoforma do exão 6 de CD45 não era detectada na superfície celular de linfócitos B de medula óssea e baço de ratinhos knockout da isoforma do exão 6 de CD45 homozigóticos. Em adição, o número de células T periféricas que expressaram a isoforma do exão 6 de CD45 na superfície celular foi significativamente reduzido em comparação com os ratinhos do tipo selvagem. Os ratinhos knockout heterozigóticos tinham um nível diminuído de expressão da isoforma do exão 6 de CD45 nestas células em comparação com os ratinhos do tipo selvagem. O número total de células slgM + no baço e na medula óssea era comparável entre ratinhos knockout homozigóticos e ratinhos do tipo selvagem. Contudo, o número total de células T em órgãos linfóides periféricos foi consideravelmente reduzido nos ratinhos knockout homozigóticos em comparação com os ratinhos do tipo selvagem. Não se detectaram diferenças 86 165 ΕΡ Ο 701 607/ΡΤ significativas em compartimentos de células B e T periféricas e células de medula óssea, entre os ratinhos knockout heterozigóticos e os ratinhos do tipo selvagem, mesmo sendo o CD45 expresso a um nível reduzido em ratinhos knockout heterozigóticos em comparação com ratinhos do tipo selvagem.

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Apesar de a expressão da isoforma do exão 6 de CD45 em timócitos ter sido significativamente suprimida em ratinhos knockout homozigóticos em comparação com ratinhos do tipo selvagem, o número total de timócitos em ratinhos knockout homozigóticos era apenas ligeiramente reduzido em comparação com os ratinhos do ..tipo selvagem. Em adição, os ratinhos knockout homozigóticos tinham números normais de timócitos duplamente positivos CD4+ CD8+ imaturos, contudo, o número total de células precursoras CD4- CD8- era diminuído, e o tamanho das linhagens de células T maduras, tanto CD4+ como CD8 + , era significativamente reduzido nestes ratinhos. 4. Análise dos efeitos do gene knockout

Para examinar os efeitos da supressão do gene da isoforma do exão 6 de CD45 sobre o desenvolvimento de células B, clonaram-se suspensões de células únicas de medula óssea, baço ou células peritoneais em ágar semi-sólido sob várias condições que permitem a proliferação selectiva quer de pré-células B, (IL-7 ou IL-7 mais a linha de células estromais S17), células B (LPS ou LPS + S17) ou células mielóides (IL-3 ou meio condicionado por L929 como fonte de factor estimulante de colónias de macrófagos, M-CSF-1). Para avaliar a proliferação, estabeleceram-se culturas em dupla camada em ágar como se segue: primeiro, preparou-se uma subcamada de 1 ml consistindo em meio OPTI-MEM (Gibco/BRL, Grand Island, New York) suplementado com NaHC03 2,4 g/l, estreptomicina 5 mg/l, 5x103 U/l de penicilina, beta-mercaptoetanol 5 x 10‘5 M, soro de vitelo fetal a 10% (Gibco/BRL, Grand Island, New York) e ágar Bacto fundido a 0,3% (Difco Labs). Depois, deixaram-se as células estromais S17 (Collins et al., J. Immunol. 138:1082-1097 [1987]) aderir à placa de plástico durante 5 horas (2 x 10“ S17 irradiadas [2000Gy]/placa). Removeram-se então as células não aderentes por sucção com vácuo e verteu-se a camada de ágar do fundo contendo os suplementos apropriados.

Suplementaram-se os meios com LPS a 25 pg/ml (lipopolissacárido de Sa/monella typhosa estirpe WO901; Difco Labs); IL-7 e IL-3 de murídeo 28 86 16b

EP 0 701 607/PT (adicionados aos meios na forma de sobrenadantes de culturas de linhas de células contendo os vectores apropriados; descritos em detalhe por Cumano et al., Eur. J. Immunol., 20:2183-2189 [1990]); Cumano etal., EMBO J., 11:593-601 [1992]; Karasuyama et al., Eur. J. Immunol. 18:97-104 [1988]); ou factor estimulante de colónias de macrófagos (M-CSF-1; obtido de meio condicionado por L929). Determinaram-se quantidades opcionais de IL-3, IL-7 e M-CSF em experiências de titulação como descrito por Cumano et al.. supra.

Os resultados são apresentados na Tabela I na forma de números absolutos de^célplas formadoras de colónias encontradas em diferentes teçidos-testados. Não houve diferença detectável na quantidade de formação de colónias de células mielóides derivadas de medula óssea ou células B progenitoras entre ratinhos knockout homozigóticos, knockout heterozigóticos e do tipo selvagem.

Numero total de células linfóides (x 108) Órgão linfático_ Timo Timo + DXT Baço Nódulos linfáticos Medula óssea Leucócitos sanguíneos (x 106)/ml

Tipo selvagem Heterozigotos 1,20 (0,27) 0,15 (0,05) 0,78 (0,11) 0,31 (0,03) 0,46 (0,06) 7,7 (0,3) 0,10 (0,15) 0,16 (0,05) 0,93 (0,29) 0,33 (0,09) 0,38 (0,09) 8,1 (1,2)

Homozigotos 0,76 (0,14) 0,03 (0,01) 1,96 (0,38) ,0,41 (0,07) 0,35 (0,09) 7,4 (1,8) (Os números entre parêntesis referem-se ao desvio padrão)

Para determinar a importância da expressão da isoforma do exão 6 de CD45 nos efeitos de sinalização de células mediados por imunoglobulina (Ig), adicionou-se o anticorpo monoclonal específico anti-lgp, B-76, (obtido do Dr. Michael Julius, McGill University, Montreal, Canadá) a células B esplénicas obtidas de ratinhos knockout homozigóticos e heterozigóticos, bem como de ratinhos do tipo selvagem. Colocaram-se as células B esplénicas em placas de microtítulo a uma densidade de cerca de 105 células/poço e incubaram-se durante 3, 4 ou 5 dias numa atmosfera de 5 porcento de C02 a 37°C quer sem estimulante exógeno adicionado quer com adição de lipopolissacárido ou de anticorpo B-76. A estimulação foi medida por adição de 3H-timidina às células

86 165 ΕΡ Ο 701 607/ΡΤ 29 durante 10 horas utilizando 1 pCi de 3H-timidina por poço. Transferiu-se então o conteúdo de cada poço para papel de filtro e contou-se a radioactividade.

Os resultados, mostrados na Figura 5, indicaram que a estimulação por anti-lgp requer a expressão da isoforma do exão 6 de CD45 nas células B enquanto que a estimulação por LPS não.

Para avaliar as funções efectoras das células T in vivo, testaram-se ratinhos knockout homozigóticos e heterozigóticos quanto à sua capacidade para gerar uma resposta antiviral de células T citotóxicas: Injectaram-se cerca de 30 μΙ de vírus da coriomeningite linfocitária Armstrong (LCMV) equivalentes a cerca de 400 ufp, por via subcutânea, nas almofadas das patas traseiras dos ratinhos. Mediu-se o inchaço das almofadas das patas diariamente com um calibrador de carregador de mola. Os resultados são apresentados na Figura 6A. A fase precoce da reacção de inchaço (dias 7-9 após a infecção) foi completamente abolida nos ratinhos knockout homozigóticos (triângulos a branco) mas não nos ratinhos do tipo selvagem (triângulos a cheio).

Para confirmar adicionalmente a incapacidade de ratinhos knockout homozigóticos para gerar uma resposta citotóxica a certos patogénios, obtiveram-se linfócitos citotóxicos de baços de ratinhos após os ratinhos terem sido infectados com LCMV. Estes linfócitos citotóxicos foram então novamente estimulados in vitro 5 ou 30 dias após a infecção inicial. A nova estimulação foi realizada por exposição a macrófagos peritoneais infectados com LCMV (Lehmann-Grube, Viroi. Monogr., 10 [1971]) preparados como se segue: obtiveram-se os macrófagos por lavagem do peritoneu de ratinhos C57BL/6 que tinham sido injectados seis dias antes com 2 ml de ácido tioglicólico (3 porcento peso/volume) e foram infectados intraperitonealmente quatro dias antes com 1000 ufp de LCMV Armstrong.

Estabeleceram-se culturas com 4 x 106 células de baço responsivas e 2x 105 macrófagos peritoneais irradiados (1200 rad) infectados. Incubaram-se as culturas durante 5 dias em meio IMDM com 10 porcento de soro de vitelo fetal e beta-mercaptoetanol 10'5 M. Ensaiaram-se diluições em duplicado das culturas quanto a citotoxicidade de células T específicas de LCMV em células alvo de fibrossarr.oma MC57(H-2b) marcadas com 51 Cr e infectadas com LCMV, de acordo com protocolos Standard descritos por Cerrottini et ai. (Adv. 30 86 165 ΕΡ Ο 701 607/ΡΤ

Immunol., 18:67-132 [1974]). A lise específica após quatro horas foi então calculada como descrito por Cerrottini et ai, supra.

Os resultados, apresentados na Figura 6B, indicam que os ratinhos knockout homozigóticos (triângulos a branco) eram incapazes de montar uma resposta citotóxica, enquanto os ratinhos do tipo selvagem (triângulos a cheio) eram capazes de montar essa resposta.

Toda a literatura citada é aqui especificamente incorporada por referência.

Lisboa, 22. FEV. 2001

Por ONTARIO CÂNCER INSTITUTE e THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF MICHIGAN - O AGENTE OFICIAL -

DA CUNHA FERREIRA Ag. Of. Pr. Ind. Km· des Flores, 74 - 4.* 1βθΟ LISBOA

Claims (6)

1. 86 165 ΕΡ Ο 701 607/ΡΤ 1/1 REIVINDICAÇÕES 1. Método de preparação de um ratinho que exibe um nível muito mais baixo de IgG do que o ratinho do tipo selvagem, que compreende substituir uma porção do gene de CD28 num hemocitoblasto embrionário, por recombinação homóloga, por uma sequência de ADN compreendendo pelo menos uma porção de um exão da sequência de codificação de CD28 ligada a uma sequência marcadora.
2. 2. Linha de células D3 contendo uma construção knockout de CD28 que'contem uma sequência de ADN que compreende pelo menos,uma porção de um exão da sequência de codificação de CD28 ligada a uma sequência marcadora e depositada na ATCC com o número de acesso CRL11382.
3. 3. Sequência de ácido nucleico compreendendo a construção knockout de CD28 contida dentro da linha de células de acordo com a reivindicação 2.
4. 4. Método de pesquisa de uma droga quanto a efeitos imunomoduladores, compreendendo (a) a administração da droga a um ratinho como definido na reivindicação 1, e (b) o ensaio do ratinho quanto a imunomodulação.
5. 5. Ratinho e sua progénie, preparados de acordo com o método da reivindicação 1, em que o ratinho e a sua progénie exibem um nível muito mais baixo de IgG do que o ratinho do tipo selvagem, em que uma porção do gene de CD28 do referido ratinho e sua progénie foi substituída por um sequência de ADN compreendendo pelo menos uma porção de um exão da sequência de codificação de CD28 ligada a uma sequência marcadora.
6. 6. Ratinho e sua progénie, de acordo com a reivindicação 5, em que a sequência marcadora é o gene de resistência a neomicina.

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