PT700253E

PT700253E - Fabrico de queijo com protease aspartica recombinante

Info

Publication number: PT700253E
Application number: PT94913508T
Authority: PT
Inventors: Hans Peter Heldt-Hansen; Peter Budtz
Original assignee: Dsm Nv
Priority date: 1993-04-27
Filing date: 1994-04-22
Publication date: 2000-04-28
Also published as: DE69422514T3; CN1056036C; GR3032856T3; ES2143545T3; EP0700253B1; CN1121686A; ES2143545T5; DK47493D0; EP0700253A1; DE69422514D1; DK700253T4; DK0700253T3; ATE188347T1; DE69422514T2; AU6563994A; WO1994024880A1; US5800849A; AU677652B2; EP0700253B2

Description

DESCRIÇÃO "FABRICO DE QUEIJO COM PROTEASE ASPÁRTICA RECOMBINANTE" A presente invenção refere-se a um processo para produzir queijo com rendimentos melhorados.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Na produção de queijo é necessário coagular o leite de modo a ser capaz de separar a caseina do soro do leite coalhado. Produtos contendo renina, que é a enzima coagulante do leite isolada de estômagos de vitelas, tem sido utilizada desde há muitos anos para este efeito. A diminuição de estômagos de vitela disponíveis tem resultado, nas últimas décadas, em pesquisas intensas para outras enzimas coagulantes do leite. Hoje, estão a ser utilizadas comercialmente pepsina bovina e pepsina suína bem como enzimas microbianas. Os mais úteis de entre os coalhos microbianos são o coalho de Rhizomucor mieheí e o coalho de Rhizomucor pusillus.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Nesta invenção descobriu-se surpreendentemente que a glicosilação da protease aspártica pode provocar um aumento no rendimento do queijo de 0,2% em comparação com a enzima nativa. Um aumento no rendimento do queijo de 0,2% significaria mais 2 Kg de queijo por uma tonelada de queijo, um valor de cerca de 8-10 US$ (preços da fábrica de lacticínios).

De acordo com isto, a presente invenção refere-se a um processo para produzir queijo com rendimentos melhorados, em que uma protease aspártica recombinante é adicionada ao leite em quantidades suficientes para efectuar a coagulação do leite, 1 r u

t após a qual a coalhada é processada de um modo conhecido per se para produzir queijo. 0 termo "protease aspártica recombinante" é aplicado a (pro)quimosina ou protease aspártica microbiana produzida num organismo hospedeiro transformado com ADN que codifica para a protease. 0 organismo hospedeiro pode convenientemente ser um fungo, p. ex. uma levedura ou um fungo filamentoso. 0 termo ''fungo filamentoso" pretende incluir fungos pertencentes aos grupos Phycomycetes, Zygomycetes, Ascomycetes, Basidiomycetes ou fungos imperfeitos, incluindo Hyphomycetes tais como os géneros Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Fusarium ou Humicola.

REVELAÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Protease

De acordo com a presente invenção é preferível utilizar protease aspártica recombinante de Mucorales (p. ex. Rhizomucor, em particular Rhizomucor miehei ou Rhizomucor pusillus) expressa em Aspergillus ou Trichoderma num processo de produção de queijo com rendimentos melhorados.

Uma sequência de ADN codificando proquimosina bovina ou pré-proquimosina, pode ser obtida por exemplo como descrito em EP 215 594. Uma sequência de ADN que codifica para protease aspártica de Rhizomucor miehei pode ser isolada como descrito em EP 238 023.

Sequências de ADN que codificam funções que facilitam a expressão de genes compreendem tipicamente um promotor, sítios de iniciação de transcrição e funções de terminação de transcrição e poli-adenilação. O promotor, que pode ser precedido por sequências activadoras a montante e sequências amplificadoras como é conhecido no meio, pode ser qualquer sequência de ADN que exiba 2 uma forte actividade de transcrição em fungos filamentosos e possa ser derivada de um gene que codifique para uma proteína extracelular ou intracelular tal como uma amilase, uma glucoamilase, uma protease, uma lipase ou uma celulase.

Exemplos de promotores adequados são aqueles derivados do gene que codifica amilase TAKA de A. oryzae, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, α-amilase neutra de A. niger, a-amilase estável em ácido de A. niger, glucoamilase de A. niger, lipase de Rhizomucor miehei, protease alcalina de A. oryzae ou isomerase de triose fosfato de A. oryzae. 0 organismo fungo filamentoso hospedeiro pode ser convenientemente um que tenha sido previamente utilizado como um hospedeiro para produzir proteínas recombinantes, p. ex. uma estirpe de Aspergillus sp., tal como A. niger, A. nidulans ou A. oryzae. A utilização de A. oryzae na produção de proteínas recombinantes está descrita exaustivamente em, p. ex., EP 238 023.

As sequências de terminação e poliadenilação podem ser adequadamente derivadas das mesmas fontes do promotor.

As técnicas utilizadas para transformar um célula hospedeira de fungo pode adequadamente ser adaptada dos métodos para transformação de A. nidulans descritos em, por exemplo, Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 8_1, 1984, pp. 1470-1474, ou EP 215 594, ou dos métodos utilizados para transformar A. niger descritos em, por exemplo, Buxton et al., Gene 37, 1985, pp. 207-215 ou US 4,885,249, ou dos métodos para transformar A. oryzae descritos em EP 238 023. No processo da presente invenção, a célula hospedeira é transformada com um sistema de vector compreendendo uma sequência de ADN que codifica para um marcador de selecção que é capaz de ser incorporado no genoma do organismo hospedeiro na transformação, mas que ou não é expresso pelo hospedeiro antes da transformação ou é expresso em quantidades que não são suficientes para permitir o crescimento em condições selectivas. Os 3 V Γ~ u K- transformantes podem então ser seleccionados e isolados de não-transformantes com base no marcador de selecção incorporado.

Marcadores de selecção adequados são derivados do gene argB de A.nidulans ou de A. niger, do gene trpC de A. nidulans, do gene amdS de A. nidulans, do gene pyr4 ou genes DHFR de Neurospora crassa, ou do gene niaD de A. niger ou A. oryzae.

As sequências de ADN que codificam para a protease aspártica, promotor e terminador podem ser inseridas num vector contendo o marcador de selecção, ou podem ser inseridas num vector separado para introdução na célula hospedeira. No presente contexto, o termo "sistema de vector" pretende incluir um único vector ou dois ou mais vectores que conjuntamente contêm a informação total de ADN a ser introduzida na célula hospedeira. 0 vector ou vectores podem ser moléculas lineares ou circular fechadas. Numa realização preferida do processo da invenção o sistema de vector compreende dois vectores, um transportando a sequência de ADN que codifica para o marcador de selecção e o outro transportando as sequências de ADN que codificam a proteína hemo, a pré-região e as funções que facilitam a expressão do gene.

Verificou-se surpreendentemente que a extensão da glicosilação da protease aspártica recombinante era superior à glicosilação das proteases aspárticas obtidas a partir de estirpes de Rhizomucor que ocorrem naturalmente. Mais especificamente, a nova protease aspártica recombinante é caracterizada por o conteúdo em carbohidratos ser de pelo menos 50% mais do que o da protease aspártica nativa, preferencialmente o conteúdo em carbohidratos é de um nível de 100% mais do que a protease aspártica nativa. O termo "protease aspártica nativa" pretende indicar a protease produzida por um organismo na natureza (p. ex. em estômago de vitela ou por um microrganismo tal como Rhizomucor). 4 I L· ^ A diferenciação e identificação da protease aspártica nativa e da protease aspártica recombinante são possíveis através de medição das suas glicosilações.

Foi anteriormente descrito que Aspergillus glicolisa lipase de Humicola de um modo diferente do de lipase em Humicola (ver EP 305 216), mas é novidade que Aspergillus também glicolise protease aspártica de Rhizomucor diferentemente da protease aspártica nativa de Rhizomucor, e especificamente que por este processo o conteúdo em carbohidratos da protease aspártica aumente em 50-100%.

Aumento da Quantidade de Glicosilação ligada a N A quantidade de glicosilação ligada a N é determinada como a diferença em pesos moleculares entre a protease aspártica e uma protease aspártica desglicosilada. A desglicolisação é realizada por Endoglicosedase H (de Genzyme) (remove glicolisação ligada a N) , utilizando protease a 1 mg/ml e um tempo de reacção de 18 horas a 37°C, a Endo H é doseada de modo a que não seja obtida desglicosilação adicional a dosagens de Endo H superiores. O peso molecular PM é medido por SDS-PAGE. A quantidade de glicosilação ligada a N é expressa em kD de glicosilação por mole de proteína.

Fabrico de Queijo

Qualquer tipo de leite, em particular leite de ruminantes tais como vacas, ovelhas, cabras ou camelos, pode ser. utilizado como material de partida no processo da invenção, p. ex. como leite reconstituído, leite total, leite total concentrado ou leite desnatado. O leite pode ser concentrado de várias maneiras tais como por evaporação ou secagem por aspersão, mas é preferencialmente concentrado por filtração em membrana, p. ex. ultrafiltração na 5

V

u qual as moléculas com um peso molecular até 20 000 são permitidas passar através da membrana, opcionalmente com diafiltração antes ou após ultrafiltração, ou possivelmente hiperfiltração na qual moléculas de um peso molecular até 500 são permitidas passar através da membrana. Para uma descrição mais detalhada do processo de ultrafiltração ver, por exemplo, Quist et al., Beretning fra Statens Mejerifors0g, 1986.

Uma cultura inicidora pode ser adicionada ao leite antes ou simultaneamente à adição da ácido aspártico recombinante na presente invenção. A cultura iniciadora é uma cultura de bactérias ácido lácticas utilizadas no fabrico de queijo convencional, para fermentar a lactose presente no leite e para provocar mais decomposição da caseína coagulada em péptidos mais pequenos e aminoácidos livres como resultado da sua produção de proteases e peptidases. A cultura iniciadora pode ser adicionada em quantidades que são convencionais para o presente objectivo, i.e. tipicamente quantidades de cerca de 1 x 104 - 1 x 105 bactérias/g de leite de queijo, e pode ser adicionada na forma de culturas liofilizadas, congeladas ou líquidas. Quando o leite empregue no processo da invenção é leite concentrado, é preferível adicionar a cultura iniciadora após a concentração do leite, embora isto não seja um requisito absoluto, uma vez que as bactérias iniciadoras serão retidas durante a filtração.

Após adicionar a enzima coagulante do leite, os passos subsequentes no processo de fabrico de queijo, i.e., posterior adição de sal, pressão, maturação da coalhada, podem ser realizadas do modo tradicional de produção de queijo, p. ex. como descrito por R. Scott, Cheesemaking in Practise, 2a Ed., Elsevier, London, 1986.

Presentemente considera-se que a maior parte dos tipos de queijo podem ser preparados vantajosamente pelo processo da invenção. A presente invenção refere-se a uma preparação de protease aspártica numa forma líquida, estabilizada, seca por aspersão, 6

t seca sob vácuo, liofilizada ou granulada, ou imobilizada num transportador adequado.

As várias maneiras pelas quais a preparação da enzima pode ser formulada são bem conhecidas na arte das enzimas, conforme por exemplo K. Aunstrup et al., "Production of Microbial

Enzymes", em Microbial Technology (H.J. Peppler e D. Perlman, Eds.), 2a Ed., Vol I, Academic Press 1979, pp. 295-297.

No processo da presente invenção a quantidade de protease aspártica recombinante variará de acordo com o grau de concentração do leite, mas a enzima será usualmente adicionada numa quantidade de 1 - 10 KRU por 1 1 de leite total.

Força do Coalho 1 RU é a unidade da Novo para a força do coalho. 1 KRU = 1000 RU. A força do coalho é determinada utilizando um método de Berridge modificado (N.J. Berridge, Analyst, 77, 1952, p. 57) no qual a força do coalho é determinada utilizando uma Rennilase® em pó (protease aspártica de Rhizomucor miehei disponível da Novo Nordisk A/S) padrão como uma referência. 0 princípio do método é que a enzima actua numa solução de leite desnatado em pó contendo cloreto de cálcio em condições padrão. É medido o tempo necessário desde a adição da enzima até que a mistura de reacção comece a apresentar floculação. Este tempo é aproximadamente inversamente proporcional à concentração de enzima e é comparado com o tempo de floculação de uma amostra com força enzimática conhecida. Estes tempos não devem diferir substancialmente um do outro e devem ser de 5,0 min ±0,5 min. A determinação da força é feita visualmente e é realizada a 30°C. É utilizado "Substrato de Berridge" consistindo em 12 g de leite em pó desnatado seco por aspersão dissolvido em 100 ml de solução de cloreto de cálcio a 0,01 Μ. O substrato deve repousar durante pelo menos 1 hora até poder ser utilizado. 7

A análise é realizada num banho de água de vidro no qual os tubos de ensaio são feitos rodar lentamente ao longo dos seus eixos longitudinais por meio de um motor, com inclinação de cerca de 30° em relação à superfície da água. Formar-se-á assim um filme de leite continuamente no tubo, acima da superfície do leite e é fácil de observar a floculação neste filme assim que se inicia.

Por vezes podem ocorrer coagulações locais no leite. Estas coagulações não devem ser confundidas com a verdadeira floculação que é caracterizada pela adesão de pequenos flocos de caseína ao tubo de ensaio perto da superfície do leite.

Cerca de meia hora antes da análise ser realizada coloque tubos de ensaio rolhados contendo 10 ml de substrato de leite no banho de água a temperatura constante de 30°C ± 0,1°C. O tempo de floculação varia ligeiramente com o tempo durante o qual o substrato é mantido quente. Agora adicione com uma seringa um ml da solução de enzima diluída a cada um dos três tubos de ensaio e simultaneamente active um cronómetro para cada tubo. O cronómetro é iniciado imediatamente após a solução de enzima ter sido injectada para dentro do tubo de ensaio. A solução de enzima é injectada contra a parede do tubo para evitar a formação de espuma no leite. Imediatamente após a adição da enzima o tubo de ensaio é tapado com um rolha limpa e seca e invertido 3 vezes de modo a remover toda a enzima da parede do tubo para dentro do leite. De seguida o primeiro tubo de ensaio pode ser colocado imediatamente no dispositivo de rotação. Neste momento, quando se começam a depositar pequenos flocos de coágulo no tubo, o cronómetro para o primeiro tubo é parado, o tubo é substituído pelo tubo N° 2, etc. Tente alcançar um tempo de floculação entre 4,5 e 5,5 min. O tempo de floculação para os 3 tubos de ensaio não devem variar mais do que 0,1 min (6 seg.), e a média é utilizada para calcular a força do coalho. 8 Cálculo da Força do Coalho

Força da amostra =

Força do padrão x Tempo de floculaçâo da diluição do padrão

Tempo de floculaçâo da amostra X Diluição da amostra Diluição do padrão 0 método modificado de Berridge é apenas adequado para a determinação das forças de coalhos em coalhos sem sais de cálcio adicionados. A invenção é ainda ilustrada nos exemplos seguintes que não pretendem de qualquer forma limitar o âmbito da invenção como reivindicado.

Exemplo 1

Produção de Queijo Utilizando Protease Aspártica Produzida por Aspergillus oryzae e Rennilase® XL

Enzimas

Protease produzida por Aspergillus oryzae: 0 transformante p777 (descrito na EP 489 718) foi fermentado durante aprox. 5 dias num fermentador de 2,5 m3 convencional agitado e arejado, num meio contendo grãos de soja suplementados com maltodextrina durante o crescimento, o pH foi mantido abaixo de 6,0 por adição de ácido fosfórico. A protease aspártica foi recolhida do caldo de fermentação através de técnicas convencionais de filtração, ultrafiltração e evaporação. A protease aspártica foi desestabilizada como descrito em US Patent 4,357,357. O concentrado de protease aspártica foi diluído para 56,63 KRU/g. 9

Γ

Lr

Protease aspártica produzida por Rhizomucor miehei: foi utilizada Rennilase® XL a 51,42 KRU/g (disponível em Novo Nordisk A/S).

Ambas as enzimas foram utilizadas de modo a que o primeiro sinal de floculação aparecesse após cerca de 15 min. As dosagens foram mantidas a um nível constante ao longo da experiência. As variações na coagulabilidade do leite foram compensadas fazendo variar os tempos de corte.

Produção de Queijo em Provetas

Foi adicionado a uma proveta de 5 1 4000 g de leite total pasteurizado (disponível de MD Foods, Karolinevej 1, DK-4200

Slagelse, Dinamarca).

Uma cultura inicial de CHL 113 lote 010691 (disponível em Chr. Hansen, Boge Alie 10, DK-2970 Horsholm, Dinamarca) foi incubada durante 16 horas numa quantidade de leite suficiente à temperatura ambiente e congelada em porções de 40 g, porções suficientes para toda a experiência.

Foram adicionados 0,8 g de CaCl2 por porção e uma porção descongelada da cultura iniciadora. Após 30 minutos de tempo de maturação foi introduzida a enzima de coagulação do leite numa quantidade de 10,9 KRU por 4000 g de leite. Ambas as enzimas foram utilizadas em cada ensaio e a sua ordem não foi aleatória. 0 tempo de floculação foi de cerca de 15 min e o tempo de reacção de corte foi aproximadamente 2 vezes o tempo de floculação mais 1 min. Após um período de cura de 4 min e um tempo de agitação de 15 min a coalhada e o soro de leite coalhado foram transferidos para um molde com pano de peneira e deixado a escoar durante a noite.

Análise 10

0 soro de leite coalhado total bem misturado foi filtrado através de uma camada de gaze para remover partículas da coalhada. 0 N total foi determinado utilizando um método de Kjeldal modificado num Digestor Tecator e Sistema de Destilação Kjeltec 1003. A proteína foi expressa como N x 6,38. Todas as análises foram realizadas em triplicado.

Um teste de t emparelhado foi utilizado com n = 61 diferenças no conteúdo de proteína total de soro de leite coalhado, utilizando t = Xmédia/ (Sz/n)h como uma estimativa, em que X é a diferença em proteína de soro de leite coalhado total entre as experiências correspondentes com as duas enzimas, e S2 é a variação estimada de X, t0,95(60%) = 1,67, t0,995(60%) = 3,23.

Resultados

Na Tabela 1 podem ser encontrados alguns parâmetros de fabrico de Queijo Feta. Os tempos de coagulação variaram entre 15,41 min para a protease aspártica e 15,35 min para Rennilase XL. Aproteína foi calculada como a diferença entre a quantidade de soro de leite coalhado por Rennilase XL vezes a % de proteína deduzindo a quantidade de soro de coalhado por Protease Aspártica vezes a % de proteína. Verificou-se que a perda média de proteína era de 30,30 g com soro de leite coalhado por protease aspártica e 30,50 g com soro de leite coalhado por Rennilase XL. Estes valores podem significar um aumento da produção de queijo de 0,2%, quando se muda de Rennilase XL para protease aspártica.

Verificou-se que Xmédia em Aproteína era de -0, 1953 e s era de 0,4642 e n= 61, e assim uma estimativa para t pode ser calculada como to = -0,1953/(0,46422/61)H = -3,2860, o que significa que a hipótese de que não existe diferença entre rendimentos pode ser rejeitada com uma probabilidade muito alta {p< 0,001). 11 f- U. ^

Tabela 1 Alguns parâmetros do fabrico de Queijo Feta Parâmetro média n s Quantidade de leite 4000 g constante Iniciador 1% constante Enzima de coagulação do leite KRU/4000 g Protease aspártica 10, 9 61 constante Rennilase®XL 10, 9 61 constante CaCl2 0, 02% constante tempo min Maturação 30 122 constante Floculação Protease aspártica 15,41 61 ±0, 63 Rennilase XL 15,35 60 ±0, 64 tempo de corte Protease aspártica 31,79 61 ±1,25 Rennilase XL 31,82 60 ±1,21 Tempo de cura 4 constante Agitação 15 constante Vazamento 10 constante Vazamento para prensar 120 constante PH leite 6, 69 122 - depósito 6,57 122 ±0, 05 soro protease aspártica 6, 53 56 ±0,14 Rennilase XL 6, 53 51 ±0,14 Temperaturas °C depósito 33 Pesos g Leite 4000 122 constante Soro 3299,3 122 ±27,5 Coalho 685, 7 117 ±20, 6 12 Γ

% de Recuperação produtos/ingredientes soro de leite coalhado/produtos coalhada/produtos 99, 9 82,8 17,2 EXEMPLO 2

Desglicosilação por EndoH de Protease Aspártica Expressa a partir de Rhizomucor miehei e Aspergillus oryzae

A protease aspártica é uma proteína glicosilada tanto quando expressa em R. miehei como em A. oryzae. A endoglicosidase H pode libertar o grupo glico de proteínas N- glicosiladas por hidrólise específica entre duas moléculas de N-acetilglucosamina que estão ligadas a Asn em proteínas N- glicosiladas.

Amostras A protease aspártica produzida por Aspergillus oryzae (produzida como descrito no Exemplo 1) foi purificada do meio de cultura pelo método descrito em Journal of Cromatography 47 6 (1989) 227-233. A protease aspártica produzida por Rhizomucor miehei foi purificada de Rennilase 150® L (disponível de Novo Nordisk A/S) pelo método descrito em Journal of Cromatography 476 (1989) 227-233.

Experiência: A protease aspártica produzida por Aspergillus oryzae e a protease aspártica produzida por Rhizomucor miehei foram incubadas a uma concentração de 1 mg/ml com EndoH (genzyme), 13

L· t durante 18 horas a 37°C em tampão fosfato a 100 mM a pH 6,0. 0 grau- de hidrólise foi determinado a partir da alteração do PM por SDS-PAGE em géis de gradiente 5 - 20%.

Resultados: A experiência demonstrou que EndoH a 0,02 U/ml foi suficiente para desglicosilação quase total e que o PM da molécula de protease aspártica não alterou quando incubada sem EndoH. O PM da protease aspártica desglicosilada foi de 38,3 kD, tanto a de R. miehei como a de A. oryzae, enquanto que a enzima glicosilada de R. miehei apresentou um PM de 41,5 kD e a enzima glicosilada de A. oryzae apresentou um PM de 44,7 kD. O conteúdo de glicosilação ligada a N de protease aspártica expressa por A. oryzae é então 6,4 kD (44,7 kD menos 38,3 kD) por mole de proteína, sendo 100% mais do que os 3,2 kD (41,5 kD - 38,3 kD) de glicosilação ligada a N por mole de Rennilase (protease aspártica expressa por R. miehei). EXEMPLO 3

Glicosilação de Protease Aspártica

Amostras A protease aspártica produzida por A. oryzae (produzida como descrito no Exemplo 1) foi purificada a partir do meio de cultura pelo método descrito em Journal of Chromatography 476 (1989) 227-233. A protease aspártica produzida por Rhizomucor miehei foi purificada a partir de Rennilase 150® L (disponível em Novo Nordisk A/S) pelo método descrito em Journal of Chromatography 476.: (1989) 227-233. 14 V ^^

Ambas as enzimas purificadas foram liofilizadas.

Determinação da Glicosilação

Amostras de 25 μς foram hidrolisadas em TFA (ácido trifluoroacético) a 2 M num forno de micro-ondas.

Os monossacáridos foram separados e detectados por uma cromatografia de troca aniónica de elevado desempenho, Dionex (HPAEC), as separações foram realizadas por uma eluição isocrática em NaOH a 16 mM. Os monossacáridos foram detectados por detecção amperométrica pulsada (ref: Rocklin e Pohl; J. Liq. Chromatography 6: 1577-1590).

As amostras analisadas são equivalentes a 20 μg de matéria seca (amostra).

As amostras foram analisadas em triplicado.

Resultados

Protease aspártica Protease aspártica produzida por produzida por

Rhizomucor miehei Aspergillus oryzae

Galactosamina 0 0 Glucoseamina 265 630 Galactose 170 500 Glucose 200 100 Manose 1300 2860

Os resultados são apresentados em quantidades relativas. Observa-se que existem diferenças significativas no conteúdo em açúcar entre a protease aspártica expressa por A. oryzae e a protease aspártica expressa por R. miehei, e que a 15 protease aspártica recombinante possui um conteúdo em glucoseamina ligada a N, galactose e manose de 100% mais do que a protease nativa.

Lisboa 21 de Janeiro de 2000 AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL f— Lc, ^ \l 16

Claims

Γ REIVINDICAÇÕES 1. Processo de produção de queijo em que uma protease aspártica recombinante é adicionada ao leite em quantidades suficientes para efectuar a coagulação do leite, após a qual a coalhada resultante é processada de um modo conhecido per se para fazer queijo, de modo a obter rendimentos melhorados comparados com a enzima nativa.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o gene que codifica para a protease aspártica é derivado de um fungo filamentoso.
3. Processo de acordo com a reivindicação 2, em que o fungo filamentoso é da ordem Mucorales.
4. Processo de acordo com a reivindicação 2, em que o fungo filamentoso é do género Rhizomucor.
5. Processo de acordo com a reivindicação 2, em que o fungo filamentoso é Rhizomucor miehei ou Rhizomucor pusillus.
6. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1-5, em que a protease aspártica é produzida por técnicas de ADN recombinante num fungo filamentoso.
7. Processo de acordo com a reivindicação 6, em que o fungo filamentoso pertence ao género Aspergillus ou Trichoderma.
8. Processo de acordo com a reivindicação 7, em que o fungo filamentoso é uma estirpe de A. oryzae, A. niger, A. nidulans, ou A. awamori, ou em que o fungo filamentoso é uma estirpe de Trichoderma reesei. 1
9. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 6 - 8, em que a protease aspártica recombinante possui uma glicosilação diferente daquela da protease nativa.
10. Processo de acordo com a reivindicação 9, em que a protease recombinante possui um conteúdo em carbohidratos ligados a N de pelo menos 50% mais do que a protease nativa, preferencialmente um conteúdo em carbohidratos ligados a N de 100% mais do que a protease nativa.
11. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 - 10, em que a referida protease aspártica é adicionada numa quantidade de 1 - 10 KRU por 1 1 de leite.
12. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 - 11, em que o leite é leite total ou leite concentrado.
13. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 - 12, em que a cultura iniciadora é adicionada ao leite antes ou em simultâneo com a adição da protease aspártica recombinante. Lisboa, 21 de Janeiro de 2000 AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

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