PT625354E

PT625354E - Medicamento contendo a subunidade p40 da interleuquina-12

Info

Publication number: PT625354E
Application number: PT94105595T
Authority: PT
Inventors: Roland Kurrle; Klaus-Dieter Langner; Friedrich Robert Seiler
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1993-05-07
Filing date: 1994-04-12
Publication date: 2001-03-30
Also published as: EP0625354B1; ES2153394T3; CA2123049C; DK0625354T3; CA2123049A1; ATE198048T1; DE4315127A1; EP0625354A1; AU676891B2; AU6190194A; DE59409604D1; US5547852A; KR100345254B1; JP3683291B2; GR3035198T3; JPH06329549A

Description

DESCRIÇÃO "MEDICAMENTO CONTENDO A SUBUNIDADE p40 DA INTERLEUQUINA-12" Δ presente invenção refere-se à utilização da subunidade p40 da interleuquina-12 para a preparação de um medicamento para o tratamento de doenças relacionadas com uma falha de regulação do sistema imunológico, nomeadamente desregulação de actividades mediadas por IL-12.

As reacções imunológicas podem ser mantidas por populações variadas de células T. Conforme o tipo da reacção imunológica prestam-se então preferencialmente células ajudantes T do tipo 1 (TH1) ou células ajudantes T do tipo 2 (TH2) para uma reacção imunológica. As células TH1 distinguem-se das células TH2, pelo menos pelo que é até agora conhecido, pela produção de citoquinas diferentes. Já em 1989 Dunn et al. (J. Immunol. 142:3847 ff, 1989) puderam demonstrar que clonos de TH-1 produzem gama-IFN, desde que fossem cultivados na presença de células acessórias e de IL-2. Além disso, Germann et al. (Eur. J. Immunol., 8:1857-1862, 1991) demonstraram que para a síntese de gama-IFN por células TH1 é necessário um mediador solúvel. A partir de investigações comparativas concluiu-se que o mediador designado por TSF por Germann et al. é idêntico à IL-12 murina. Pouco depois, foi também descrito por Mengel et al. (Eur. J. Immunol. 22:3173-3176, 1992) , no sobrenadante da estirpe de linfoma A-20 de células B murinas activadas, um factor solúvel que estimula a produção de gama-IFN em células T. O mediador solúvel descrito por Mengel no sobrenadante A-20 é funcionalmente comparável com o chamado "Human Natural Killer Cell Stimulatory Faktor (NKSF)" (Wolf S.F. et al., J. Immunol. 156:3074, 1991) e é postulado como o análogo murino da 11-12 humana. Tanto da IL-12 como do 1

NKSF, que são potencialmente idênticos, sabe-se que estimulam a síntese de gama-IFN. É óbvio que a função da 11-12 (correspondente à do NKSF) não se limita à estimulação da produção de gama-IFN. Entre outras, a 11-12 (e o correspondente NKSF) influencia também a função de células Killer naturais (chamadas células Nk ou LGL), a produção de IgE e aumenta a proliferação induzida pela IL-12 de células mononucleares periféricas em repouso.

Sabe-se ainda da IL-12 que é constituída por duas subunidades diferentes, designadas por p35 e p40 (Podlaski, F.J. et al. (1991) Arch. Biochem. Biophys. Vol. 294, N° 1, pag. 230-237) . Descobriu-se também uma estrutura mais ou menos idêntica para a 11-12 murina (Schoenhaut D.S. et al. (1992) J. Immunol. Vol. 148, N° 11, pag. 3433-3440) . Para a subunidade p40 da 11-12 verificou-se que ela isoladamente não possui aliás qualquer bioactividade específica da IL-12, mas que é de grande importância para a bioactividade da molécula de 11-12 completa. Especulou-se que a subunidade p40 interage directamente com o receptor celular de IL-12. A falha de regulação da produção e da acção de citoquinas está, segundo um grande número de publicações, na origem de doenças agudas e crónicas do sistema imunológico e com as suas consequências secundárias. Um sistema terapêutico poderia assim assentar na influência de actividades mediadas por citoquinas. A presente invenção tem por isso como objectivo disponibilizar um medicamento que se possa aplicar com vantagem no tratamento de estados patológicos relacionados com uma desregulação de actividades mediadas pela IL-12.

Verificou-se então surpreendentemente que a subunidade p40 da IL-12 se pode empregar para a inibição de actividades mediadas pela IL-12. É assim possível, por meio de uma intervenção nos chamados mecanismos de regulação, obter um efeito terapêutico.

A presente invenção refere-se assim à utilização de uma subunidade p40 de 11-12 de mamíferos, natural ou recombinante, possivelmente modificada. As subunidades p40 modificadas no sentido da invenção são partes ou variantes efectivas de p40, cuja eficácia se pode comprovar por exemplo em modelos animais (rato) ou in vitro, de acordo com os processos referidos nos exemplos.

Uma forma de execução preferencial da invenção refere-se à utilização de uma subunidade p40 de origem humana.

Um outro aspecto da invenção refere-se à utilização de uma subunidade p40 de IL-12 de mamíferos, natural ou recombinante, de preferência de tecidos ou células de origem humana, para a preparação de um meio de diagnóstico para a identificação da IL-12. A presente invenção refere-se ainda à utilização da subunidade p40 de IL-12 de mamíferos, natural ou recombinante, possivelmente modificada, de preferência de origem humana, para a preparação de um medicamento para o tratamento de estados patológicos relacionados com uma desregulação de actividades mediadas pela IL-12, como por exemplo doenças autoimunes, como Lupus erythematodes sistémico, síndroma de Wagner ou artrite reumática, infecções bacterianas ou virais e determinados tumores sólidos ou leucemias.

Um outro aspecto da invenção refere-se à utilização da subunidade p40 de IL-12 de mamíferos, natural ou recombinante, possivelmente modificada, num processo para a identificação de IL-12 em líquidos corporais, por exemplo de seres humanos. Este processo baseia-se numa inibição específica da actividade da IL-12 pela p40 e pode efectuar-se por exemplo de modo análogo ao dos exemplos | ou 2, nos quais a IL-12 utilizada provém da amostra a an^isar e a p40 é adicionada numa quantidade definida. 3

De entre todos os processos referidos preferem-se aqueles que utilizam p40 natural ou recombinante de origem humana.

Um outro aspecto da invenção refere-se a um meio de diagnóstico contendo IL-12 para a identificação da subunidade p40 da IL-12. 0 emprego deste meio de diagnóstico pode efectuar-se por exemplo de modo análogo ao dos exemplos 1 ou 2, em que a actividade inibitória da p40 utilizada provém da amostra a analisar e a IL-12 se adiciona numa quantidade definida. A invenção é ainda ilustrada pelos exemplos e pelas reivindicações.

Obtenção de IL-12 e p40:

Para a obtenção de IL-12 murina recombinante ou da subunidade p40 de mIL-12 isolou-se mRNA de células de baço murinas, por meio de processos padrão (Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) e transformou-se este em cDNA de cadeia dupla.

Utilizando o "primer" descrito por Schoenhaut et al. (Schoenhaut, D., C-hua, Ά.Ο., Wolitzky, A.G., Quinn, P.M., Dwyer, C.M., McComas, W., Familletti, P.C., Gately, M.K., Gubler, U. (1992) J. Immunol. 148, 3433) e nas condições experimentais referidas, efectuou-se uma PCR através da qual se conseguiu gerar um fragmento de cerca de 800 pares de bases. 0 fragmento obtido por PCR sequenciou-se segundo processos padrão (Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). Como resultado verificou-se que a sequência de cDNA determinada experimentalmente é idêntica à sequência publicada da subunidade p40 murina. De modo análogo se isolou o fragmento de PCR para a subunidade p35 e se 4 ? f-' Li \l sequenciou. Para confirmar que as actividades biológicas a seguir descritas resultavam efectivamente da 11-12 ou da subunidade p40, clonaram-se os fragmentos obtidos por PCR, isoladamente ou combinados, no vector pASstop e exprimiram-se estabilizadamente em células BHK-21 por meio de um processo padrão (Zettlmeifil, G., Wirth, M., Hauser, G., Kiipper, H.A. (1989) Behring Inst. Mitteilungen 82, 26). A partir de sobrenadantes de cultura de células BHK-21 transfectadas puderam isolar-se tanto mIL-12 biologicamente activa como também uma subunidade p40 de mIL-12 biologicamente activa.

Como fonte de uma IL-12 natural utilizaram-se sobrenadantes da estirpe de linfoma A-20 de células B (American Type Culture Collection, ATCC TIB208) que se activou de acordo com o método descrito por Mengel et al. (ver acima). 0 mediador solúvel descrito por Mengel no sobrenadante de A-20 compara-se funcionalmente com NKSF e serve como análogo murino da IL-12 humana. Uma outra fonte de IL-12 natural são as preparações de células de baço, que se prepararam e activaram de acordo com o método descrito por Germann et al. (ver acima). Ensaios comparativos mostraram que o TSF descrito por Germann et al. é idêntico à mIL-12.

Como fonte natural para a subunidade p40 da IL-12 murina conseguiu isolar-se um hibridoma que segrega a subunidade p40 da 11-12 murina. Para a preparação deste hibridoma injectaram-se de modo subcutâneo ratos fêmeas (estirpe Lewis, Zentralinstitut fúr Versuchstierkunde, Hannover) com 1-I0xl06 células T murinas, cultivadas na presença de monócitos sin-genéticos (lxl05/ml) e GM-CSF murino recombinante (50 ng/ml), juntamente com CFA (Complete Freund's adjuvants). Seguiram-se mais duas imunizações com intervalos de duas semanas em que se injectaram iguais quantidades de células por via intraperitoneal. Três dias após a última injecção mataram-se os animais e fundiram-se as células 5 Γ do baço com as células da linha celular de mieloma murino SP2/F0, de acordo com o bem conhecido método padrão de Kõhler e Milstein (Nature 256, pag. 495 ff; 1975). A selecção do hibridoma em crescimento efectuou-se de acordo com métodos padrão. Ensaios efectuados de modo análogo às experiências descritas no exemplo 1 mostraram que o sobrenadante de um dos hibridomas isolados possui uma actividade inibitória sobre a libertação de gama-interferão. A partir do sobrenadante de cultura deste hibridoma purificou-se uma proteína segregada, por analogia com o processo publicado por Kobayashi et al. (Kobayashi, M., Fritz, L., Ryan, M., Hewick, R.M., Ciar, S.C., Chan, S., Loudon, R., Sherman, F., Perussia, B., Trinchieri, G. (1989) J. Exp. med. 170, 827). Após purificação por HPLC de fase reversa separou-se a fracção de proteína isolada por SDS Page, tendo-se descoberto uma banda de proteína dominante na gama de cerca de 40-45 kDa. Comparações de sequências mostraram que a proteína aqui isolada é idêntica à subunidade p40 da IL-12 murina. O medicamento prepara-se finalmente por processos conhecidos do especialista. A subunidade p40 da IL-12 (= ingrediente activo) utiliza-se quer como tal ou em combinação com aditivos ou adjuvantes farmacêuticos adequados, bem como solubilizantes fisiologicamente toleráveis, numa concentração eficaz.

Exemplo 1:

Inibição da libertação de gama-IFN induzida por IL-12 pela p40/IL-12

Para a indução da libertação de gama-IFN cultivaram-se 5xl06 célulao dc baço do ratos BALB/c durante 48 horas na presença ou na ausência de mIL-12 e IL-12 recombinantes ou naturais nas concentrações indicadas em cada caso. Após 48 horas de cultura colheu-se o sobrenadante das células de baço e centrifugou-se este até estar isento de células. Determinou-se o teor em gama- 6 IFN do sobrenadante por meio de sistemas ELISA comercialmente disponíveis (por exemplo Intertest™-gamma, Mouse IFN-gamma ELISA-Kit). A quantificação de gama-IFN a partir do sobrenadante de cultura de células de baço activadas efectuou-se em comparação com o gama-IFN murino recombinante (Genzyme). Na Figura encontra-se representada uma experiência típica. Como mostram os resultados, a cultura de células de baço murinas com IL-12 levou a uma libertação de gama-interferão, de modo dependente da dose, > 5 ng/ml. Contudo, se se pré-incubarem as células de baço no início da cultura com p40/IL-12 murina recombinante, contendo a subunidade p40 da IL-12 natural, e em seguida se estimular com mIL-12, inibe-se a síntese de gama-IFN dependente de IL-12 de pelo menos 50%. Este exemplo mostra que tanto a p40/IL-12 recombinante como também o sobrenadante de hibridoma que contém a subunidade p40 da mIL-12 natural, estão em condições de inibir a síntese de gama-IFN induzida por IL-12.

Exemplo 2:

Inibição da actividade de células NK induzida por IL-12 por p40/IL-12

Cultivaram-se células de baço de ratos C57BL6, com uma densidade celular de 5-10xl06 células/ml, em placas Costar de 24 orifícios, durante 18 horas a 37°C, em meio de Iscove isento de soro. A cultura das células de baço efectuou-se em concentrações variadas de IL-12 murina recombinante ou natural. Após 18 horas colheram-se as células, calculou-se o número de células vivas por meio de coloração com azul de tripano e determinou-se a actividade citolítica por meio de um teste de libertação de 51Cr durante 5 horas. Como células alvo utilizaram-se todas as células YAC-1 (ATCC TIB160) . A marcação com 5lQr das células alvo e a execução do teste efectuou-se de acordo com métodos padrão (por exemplo Schoenhaut D.S. et al. (1992) J. Immunol. Vol. 148, N° 11, pag. 3433-3440) . As razões de células efector para células alvo foram tipicamente de 100:1, 50:1, 25:1, 7 12,5:1. A citólise específica percentual calculou-se como: (% de lise do grupo experimental - % de lise espontânea) : (% de lise máxima - % de lise espontânea) x 100. Através de pré-incubação de células de baço C57BL/6 com IL-12 conseguiu aumentar-se a citólise específica em relação ao controle de partida (rácio 50:1) do pelo menos 5 vezes. Contudo, se se pré-incubarem, nas mesmas condições de cultura, as células de baço adicionalmente com p40/IL-12 murina recombinante ou natural, inibe-se a citólise dependente de IL-12 mais uma vez de pelo menos 50%.

Lisboa, 5 de Janeiro de 2001

0 AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

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Claims

U, ^ REIVINDICAÇÕES 1. Utilização da subunidade p40 da IL-12 natural ou recombinante de mamíferos ou de partes ou variantes da subunidade p40 da IL-12 de mamíferos, que inibem a actividade mediada por IL-12, para a preparação de um medicamento para o tratamento de estados patológicos relacionados com uma desregulação de actividades mediadas por IL-12.
2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a subunidade p40 da IL-12 ser de origem humana.
3. Utilização de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por os estados patológicos se tratarem de doenças autoimunes, como Lupus erythematodes sistémico, síndroma de Wegner ou artrite reumática, infecções bacterianas ou virais ou determinados tumores sólidos ou leucemias.
4. Utilização da subunidade p40 de IL-12 natural ou recombinante de mamíferos ou de partes ou variantes da subunidade p40 de IL-12 de mamíferos, que inibem a actividade mediada por IL-12, para a preparação de um meio de diagnóstico para a identificação da IL-12.
5. Utilização de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por a subunidade p40 da IL-12 ser de origem humana.
6. Processo para a identificação da subunidade p40 de IL-12 de mamíferos, caracterizado por se recolher uma amostra a analisar contendo a subunidade p40 de IL-12 de mamíferos, se adicionar uma quantidade definida de IL-12 e se medir a actividade inibitória da p40 sobre a IL-12. 1
7. Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a amostra a analisar provir de um fluido corporal humano.
8. Meio de diagnóstico, contendo a subunidade p40 da IL-12 natural ou recombinante de mamíferos ou partes ou variantes da subunidade p40 da IL-12 de mamíferos, que inibem a actividade mediada por IL-12.
9. Meio de diagnóstico, de acordo com a reivindicação 8, contendo a subunidade p40 da IL-12 humana. Lisboa, 5 de Janeiro de 2001 o agente oficial da propriedade industriai.

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