PT2984163T

PT2984163T - Célula progenitora imunomoduladora (imp)

Info

Publication number: PT2984163T
Application number: PT157298860T
Authority: PT
Inventors: Reginald Ajan; John Evans Martin; Sultan Sabena
Original assignee: Cell Therapy Ltd
Priority date: 2014-06-12
Filing date: 2015-06-09
Publication date: 2017-05-09
Also published as: CN105473711A; SG11201610355PA; ZA201608402B; IL249298B; LT2984163T; EA034083B1; CA2951492C; ES2622397T3; JP2017200474A; AU2015273271B2; IL249298A0; WO2015189587A1; MA38860B1; HRP20170657T1; EP2984163A1; KR20160029092A; EA201692254A1; IL262827A; PL2984163T3; CY1119093T1

Description

DESCRIÇÃO "Célula progenitora imunomoduladora (IMP)"

Campo da invenção A invenção refere-se a células progenitoras imunomoduladoras (IMP) e ao seu uso em terapia.

Antecedentes da invenção

As células mesodérmicas são derivadas de vários tecidos e atuam como uma estrutura de suporte para outros tipos de células. Por exemplo, a medula óssea é feita de células hematopoiéticas e mesenquimais. Descreveram-se e caracterizaram-se anteriormente dois tipos principais de células mesenquimais, nomeadamente (i) células estaminais mesenquimais (MSC) e seus precursores e (ii) células precursoras mesenquimais (MPC) que se encontram na medula óssea. As células estaminais mesenquimais (MSC) são células estaminais multipotentes, adultas. As MSC diferenciam-se para formar diferentes células especializadas que se encontram nos tecidos esqueléticos. Por exemplo, podem diferenciar-se em células de cartilagem (condrócitos) , células de osso (osteoblastos) e células de gordura (adipócitos).

As MSC usam-se em várias terapias, tal como o tratamento da degeneração da mácula associada ao envelhecimento (AMD) e do enfarte do miocárdio. Uma vez administradas ao doente, as MSC migram tipicamente (ou mobilizam-se para) o tecido danificado e exercem os seus efeitos terapêuticos através de sinalização parácrina e pela promoção da sobrevivência, reparação e regeneração das células vizinhas no tecido danificado.

As terapias atuais envolvem tipicamente a infusão de uma mistura de subtipos de MSC, alguns dos quais não migram eficazmente para o tecido de interesse. Tal necessita do uso de uma dose elevada de células que pode levar a efeitos secundários fora do alvo e a efeitos secundários relacionados com o volume. As MSC obtêm-se tipicamente a partir de medula óssea e por isso é difícil obter grandes quantidades.

Sumário da invenção

Esta invenção refere-se a um novo tipo de células que não foi anteriormente identificado ou isolado, a célula progenitora imunomoduladoras. Esta célula IMP é bastante distinta e diferente tanto das MSC como das MPC na sua composição, função e características que conferem uma capacidade imunomoduladora aumentada.

Os inventores identificaram surpreendentemente uma nova célula progenitora imunomoduladora (IMP) com um padrão específico de expressão de marcador. Nomeadamente, a célula IMP expressa à sua superfície MIC A/B, CD304 (neuropilina 1), CD178 (ligando de FAS), CD289 (recetor do tipo Toll 9), CD363 (recetor de esfingosina-l-fosfato 1), CD99, CD181 (recetor de quimiocina C-X-C de tipo 1; CXCR1), recetor do fator de crescimento epidérmico (EGF-R), CXCR2 e CD126. A célula IMP expressa quantidades significativamente superiores desses marcadores à sua superfície do que uma célula estaminal mesenquimal (MSC). As células IMP da invenção podem ser isoladas de células mononucleares (MC), tais como MC de sangue periférico. As células IMP são capazes de migrar eficazmente e reparar tecidos danificados. Nomeadamente, são capazes de mobilização, aderência, transmigração, proliferação, efeitos angiogénicos e sinalização parácrina. Assim, a invenção proporciona uma célula progenitora imunomoduladora (IMP), em que a célula expressa à sua superfície níveis detetáveis de MIC A/B, CD304 (neuropilina 1), CD178 (ligando de FAS), CD289 (recetor do tipo Toll 9) , CD363 (recetor de esfingosina-1- fosfato 1), CD99, CD181 (recetor de quimiocina C-X-C de tipo 1; CXCR1) , recetor do fator de crescimento epidérmico (EGF-R), CXCR2 e CD126. A invenção também proporciona: - uma população de duas ou mais células IMP da invenção; — uma população de células progenitoras imunomoduladoras (IMP), em que (i) pelo menos 90% das células na populaçao expressam à sua superfície níveis detetáveis de MIC A/B, (ii) pelo menos 60% das células na população expressam à sua superfície níveis detetáveis de CD304 (neuropilina D , (iii) pelo menos 45% das células na população expressam à sua superfície níveis detetáveis de CD178 (ligando de FAS) , (iv) pelo menos 10% das células na população expressam à sua superfície níveis detetáveis de CD289 (recetor do tipo Toll 9), (v) pelo menos 15% da população expressa à sua superfície níveis detetáveis de CD363 (recetor de esfingosina-1-fosfato 1), (vi) pelo menos 20% das células na população expressam à sua superfície níveis detetáveis de CD99, (vii) pelo menos 80% das células na população expressam à sua superfície níveis detetáveis de CD181 (recetor de quimiocina C-X-C de tipo 1; CXCR1), (viii) pelo menos 30% das células na população expressam à sua superfície níveis detetáveis de recetor do fator de crescimento epidérmico (EGF-R), (xi) pelo menos 60% das células na população expressam à sua superfície níveis detetáveis de CXCR2 e (x) pelo menos 5% das células na população expressam à sua superfície níveis detetáveis de CD126; — uma composição farmacêutica compreendendo (a) uma célula IMP da invenção ou uma população da invenção e (b) um transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável, um ou mais lipossomas e/ou uma ou mais microbolhas; - um método de produzir uma população de células IMP da invenção, compreendendo (a) cultivar células mononucleares (MC) durante 15 a 25 dias num meio compreendendo lisado plaquetário, com oxigénio (O2) a pelo menos 20% e sob condições que permitam que as células IMP adiram às MC e as induzam a diferenciarem para células IMP e (b) recolher e cultivar as células IMP que têm um padrão de expressão tal como definido anteriormente e assim produzam uma população da invenção; - uma população da invenção ou uma composição farmacêutica da invenção para uso num método de reparar um tecido danificado num doente; e - uma população da invenção ou uma composição farmacêutica da invenção para uso num método para tratar uma lesão ou doença cardíaca, dos ossos, da cartilagem, dos tendões, dos ligamentos, do fígado, dos rins ou dos pulmões, num doente.

Descrição detalhada da invenção

Considera-se que se podem adaptar aplicações diferentes dos produtos e métodos divulgados a necessidades específicas na especialidade. Considera-se também que a terminologia aqui usada tem como objetivo apenas descrever concretizações específicas da invenção e não se pretende que seja limitativa.

Além disso, tal como usado neste fascículo e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma", "o" e "a" incluem os respetivos plurais exceto se o contexto indicar claramente o contrário. Assim, por exemplo, a referência a "uma célula" inclui "células", a referência a "um tecido" inclui dois ou mais de tais tecidos, a referência a "um doente" inclui dois ou mais de tais doentes e semelhantes. Célula IMP da invenção A presente invenção proporciona uma célula progenitora imunomoduladora (IMP). A célula IMP expressa à sua superfície níveis detetáveis de MIC A/B, CD304 (neuropilina 1), CD178 (ligando de FAS) , CD289 (recetor do tipo Toll 9) , CD363 (recetor de esfingosina-l-fosfato 1), CD99, CD181 (recetor de quimiocina C-X-C de tipo 1; CXCR1), recetor do fator de crescimento epidérmico (EGF-R), CXCR2 e CD126. A MIC permite a adaptação de células e o seu comportamento imunitário num contexto inflamatório pela diminuição da sua suscetibilidade à morte por NK. 0 CD304 (nome alternativo, neuropilina 1) é um coreceptor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e desempenha papéis em angiogénese, sobrevivência celular, migração e invasão. 0 CD178 (nome alternativo, ligando de FAS) mantém o fenótipo celular e controla a diferenciação. É também capaz de induzir proliferação de células. Apesar do ligando de FAS ser conhecido principalmente em sinalização apoptótica, demonstrou-se que as células que expressam FAS e ligando de FAS são resistentes a apoptose induzida por FAS. 0 CD289 (nome alternativo, recetor do tipo Toll 9) está envolvido na modulação de respostas imunitárias e pode facilitar a migração celular em direção a um tecido alvo. A ativação prolongada de CD363 (o nome alternativo é recetor de esfingosina-l-fosfato 1) resultou no aumento da inserção de células in-vivo. 0 CD363 também promove angiogénese, modula a mobilização celular, modula o tráfego e migração de células e regula a quimiotaxia. 0 CD99 está envolvido em adesão e transmigração celular.

Existem duas classes de recetores de interleucina-8 (IL-8), CXCR1 (ou CD181) e CXCR2. Ambos os recetores ligam IL-8 com elevada afinidade, contrariamente às outras quimiocinas de CXC. Funcionalmente, demonstrou-se que CXCR1 e CXCR2 desempenham papéis significativos em proliferação, migração, invasão e angiogénese. Os tecidos danificados libertam vários fatores inflamatórios solúveis, tais como fator inibidor da migração de macrófagos (MIF) e interleucina-8 e estes fatores podem atrair as células IMP da invenção (e outras células inflamatórias) para o tecido danificado através da ligação a CXCR1 e/ou CXCR2 de ligação. 0 EGF-R está envolvido em migração, adesão e proliferação celular. 0 CD126 (o nome alternativo é IL-6R1) aumenta o imunoprivilégio.

As células IMP da invenção têm várias vantagens. As vantagens principais serão aqui resumidas. Contudo, da discussão seguinte tornar-se-ão evidentes vantagens adicionais.

As células IMP da invenção podem ser usadas vantajosamente para reparar tecidos danificados em doentes. As células IMP são capazes de migrar eficazmente (ou de se mobilizarem) para um tecido danificado e exercer efeitos anti-inflamatórios no tecido. Tal é discutido mais detalhadamente seguidamente. Uma das capacidades mais importantes das células IMP é a de migrarem (ou de se mobilizarem) para os locais lesionados, o que envolve quimiotaxia. Tal baseia-se na sinalização com quimiocinas e utiliza mecanismos tais como rolar, adesão e transmigração. Os efeitos anti-inflamatórios das células IMP promovem sobrevivência, reparação e regeneração das células vizinhas no tecido danificado. As células são também capazes de exercer efeitos parácrinos tais como excreção de fatores angiogénicos, quimiotáticos e anti-apoptóticos. Tal discute-se também mais detalhadamente seguidamente.

Tal como discutido mais detalhadamente seguidamente, as células IMP produzem-se a partir de células mononucleares (MC), tal como as MC periféricas, retiradas de um indivíduo, tal como um indivíduo humano. Dado que as células IMP são produzidas a partir das MC, podem ser produzidas facilmente (tal como a partir de sangue periférico) e podem ser autólogas para o doente a ser tratado evitando assim o risco de rejeição imunológica pelo doente.

Em princípio é possível produzir um número ilimitado de células IMP a partir de um único indivíduo, dado que se podem obter várias amostras de MC (i.e. várias amostras de sangue). É seguramente possível produzir números muito elevados de células IMP a partir de um único indivíduo. As células IMP da invenção podem, portanto, ser produzidas em números elevados.

As células IMP da invenção são produzidas em condições clinicamente relevantes, por exemplo na ausência de quantidades vestigiais de endotoxinas e outros contaminantes ambientais, assim como produtos animais tal como soro fetal de vitelo. Tal torna as células IMP da invenção especialmente adequadas para administração a doentes.

Dado que as células IMP da invenção são produzidas a partir de MC, são substancialmente homólogas e podem ser autólogas. Elas também evitam variações entre dadores, que ocorrem frequentemente com MSC. Podem produzir-se várias populações de células IMP da invenção a partir de uma única amostra retirada do doente antes do início de qualquer outra terapia, tal como quimioterapia ou radioterapia. Assim, as células IMP da invenção podem escapar a qualquer dos efeitos prejudiciais desses tratamentos.

As células IMP da invenção podem ser produzidas rapidamente. Podem produzir-se células IMP a partir de MC em menos de 30 dias, tal como em cerca de 22 dias. A produção de células IMP a partir de MC evita as implicações morais e éticas envolvidas com o uso de células estaminais mesenquimais MSC, derivadas de células estaminais embrionárias humanas (hESC).

As células IMP da invenção são tipicamente produzidas a partir de MC humanas. As células IMP da invenção são, portanto, tipicamente humanas. Alternativamente, as células IMP podem ser produzidas a partir de MC de outros animais ou mamíferos, por exemplo de animais criados para fins comerciais tais como cavalos, gado bovino, ovelhas ou porcos, de animais de laboratório, tais como ratinhos ou ratos ou de animais de estimação, tais como gatos, cães, coelhos ou porquinhos-da-índia .

As células IMP da invenção podem ser identificadas como células progenitoras imunomoduladoras usando métodos padrão conhecidos na especialidade, incluindo expressão de marcadores restritos a uma linhagem e caracteristicas estruturais e funcionais. As células IMP expressarão à sua superfície níveis detetáveis de marcadores de superfície celular que se sabe serem característicos de IMP. Estes discutem-se seguidamente.

As células IMP da invenção são capazes de completar com sucesso ensaios de diferenciação in vitro para confirmar que elas são da linhagem mesodérmica. Tais ensaios incluem ensaios de diferenciação adipogénica, ensaios de diferenciação osteogénica e ensaios de diferenciação neurogénica (Zaim M et al Ann Hematol. agosto de 2012; 91 (8) :11175-86), não se lhes limitando.

As células IMP da invenção não são células estaminais. Nomeadamente, não são MSC, sendo diferenciadas terminalmente. Apesar de poderem ser forçadas, nas condições apropriadas, a se diferenciar in vitro, por exemplo para cartilagem ou células ósseas, não se diferenciam tipicamente in vivo. As células IMP da invenção manifestam os seus efeitos por migração para o tecido danificado e exercendo sinalização parácrina no tecido danificado. Nomeadamente, as células IMP são preferentemente capazes de induzir efeitos anti-inflamatórios no tecido danificado. Tal discute-se mais detalhadamente seguidamente.

As células IMP da invenção caracterizam-se tipicamente por uma morfologia fusiforme. As células IMP são tipicamente do tipo fibroblasto, i.e., apresentam um corpo celular pequeno com alguns processos celulares longos e finos. As células têm um diâmetro tipicamente entre cerca de 10 a cerca de 20 pm.

As células IMP da invenção distinguem-se de células conhecidas incluindo MSC, através do padrão de expressão de marcadores. As IMP expressam à sua superfície níveis detetáveis de MIC A/B, CD304 (neuropilina 1), CD178 (ligando de FAS) , CD289 (recetor do tipo Toll 9), CD363 (recetor de esfingosina-1-fosfato 1), CD99, CD181 (recetor de quimiocina C-X-C de tipo 1; CXCR1), recetor do fator de crescimento epidérmico (EGF-R), CXCR2 e CD126. As IMP expressam preferentemente à sua superfície uma quantidade aumentada destes marcadores comparativamente com MSC. Tal pode determinar-se por comparação do nível/quantidade de expressão de marcadores numa IMP da invenção com o nível/quantidade de expressão de uma MSC usando a mesma técnica e nas mesmas condições. Estão disponíveis comercialmente MSC adequadas. As MSC usadas para comparação são preferentemente MSC humanas. As MSC humanas estão disponíveis comercialmente de Mesoblast® Ltd, Osiris Therapeutics® Inc. ou Lonza®. A MSC humana obtém-se preferentemente de Lonza®. Tais células usaram-se para a comparação no exemplo. As MSC podem ser derivadas de qualquer dos animais ou mamíferos discutidos anteriormente.

As células IMP expressam preferentemente à sua superfície uma quantidade aumentada de um ou mais de MIC A/B, CD304 (neuropilina 1) , CD178 (ligando de FAS), CD289 (recetor do tipo Toll 9) , CD363 (recetor de esfingosina-l-fosfato 1) , CD99, CD181 (recetor de quimiocina C-X-C de tipo 1; CXCR1), recetor do fator de crescimento epidérmico (EGF-R), CXCR2 e CD126 comparativamente com uma MSC. As células IMP expressam preferentemente à sua superfície uma quantidade aumentada de todos os dez marcadores comparativamente com uma MSC.

Podem usar-se métodos padrão conhecidos na especialidade para determinar a expressão detetável ou a expressão aumentada dos vários marcadores discutidos anteriormente (e seguidamente). Os métodos adequados incluem imunocitoquímica, imunoensaios, citometria de fluxo, tal como separação celular ativada por fluorescência (FACS) e reação de polimerização em cadeia (PCR), tal como PCR com transcrição reversa (RT-PCR), não se lhes limitando. Os imunoensaios adequados incluem transferência "Western", ensaio de imunoadsorção enzimática (ELISA), ensaios de imunoadsorção enzimática de mancha (ensaios de ELISPOT), técnicas de imunoensaio multiplicadas por enzima, ensaios de radioalergoabsorvente (RAST), radioimunoensaios, ensaios de radioligação e imunofluorescência, não se lhes limitando. As transferências "Western", as ELISA e as RT-PCR são todos quantitativos e como tal podem ser usados para medir o nível de expressão de vários marcadores, caso estejam presentes. 0 uso de FACS de alto rendimento (ΗΤ-FACS) é divulgado no exemplo. A expressão ou expressão aumentada de qualquer dos marcadores aqui divulgados é efetuada preferentemente usando HT-FACS. Estão disponíveis comercialmente anticorpos e anticorpos com marcação fluorescente para todos os vários marcadores aqui discutidos.

As células IMP da invenção demonstram preferentemente uma intensidade de fluorescência média (MFI) por anticorpo de pelo menos 330, tal como pelo menos 350 ou pelo menos 400, para MIC A/B, uma MFI de pelo menos 210, tal como pelo menos 250 ou pelo menos 300, para CD304 (neuropilina 1), uma MFI de pelo menos 221, tal como pelo menos 250 ou pelo menos 300, para CD178 (ligando de FAS) , uma MFI de pelo menos 186, tal como pelo menos 200 ou pelo menos 250, para CD289 (recetor do tipo Toll 9), uma MFI de pelo menos 181, tal como pelo menos 200 ou pelo menos 250, para CD363 (recetor de esfingosina-l-fosfato 1), uma MFI de pelo menos 184, tal como pelo menos 200 ou pelo menos 250, para CD99, uma MFI de pelo menos 300, tal como pelo menos 350 ou pelo menos 400, para CD181 (recetor de quimiocina C-X-C de tipo 1; CXCRl) , uma MFI de pelo menos 173, tal como pelo menos 200 ou pelo menos 250, para recetor do fator de crescimento epidérmico (EGF-R), uma MFI de pelo menos 236, tal como pelo menos 250 ou pelo menos 300, para CXCR2 e uma MFI de pelo menos 160, tal como pelo menos 200 ou pelo menos 250, para CD126. A intensidade de fluorescência média (MFI) é uma medida da intensidade, do fluxo de energia por tempo médio medida em watts por metro quadrado. É uma unidade do SI. A MFI para cada marcador mede-se tipicamente usando HT-FACS. A MFI para cada marcador mede-se preferentemente usando HT-FACS tal como descrito no exemplo. Além dos dez marcadores especificados anteriormente, as células IMP da invenção expressam tipicamente à sua superfície níveis detetáveis de um ou mais dos outros marcadores apresentados na tabela 1 no exemplo. As células IMP podem expressar à sua superfície níveis detetáveis de quaisquer números ou combinações daqueles marcadores.

As células IMP da invenção são preferentemente capazes de migrar para um tecido danificado específico num doente. Por outras palavras, quando as células são administradas a um doente com um tecido danificado, as células são capazes de migrar (ou de se mobilizar) para o tecido danificado. Tal é vantajoso porque significa que as células podem ser infundidas através de vias padrão, por exemplo intravenosamente e terão então como alvo o local da lesão. As células não têm que ser entregues ao tecido danificado. O dano pode ser devido a lesão ou doença tal como discutido mais detalhadamente seguidamente. 0 tecido específico é preferentemente tecido cardíaco, do osso, cartilagem, tendões, ligamentos, fígado, rim ou pulmão. Tal aplica-se não apenas à migração mas também à aderência, transmigração, proliferação, efeitos anti-inflamatórios e angiogénese, tal como discutido mais detalhadamente seguidamente.

Pode medir-se a capacidade das células IMP da invenção migrarem para tecido danificado usando ensaios padrão conhecidos na especialidade. Os métodos adequados incluem reação de polimerização em cadeia com transcrição reversa genómica (RT-PCR com ou sem genes de repórter) e técnicas de marcação, não se lhes limitando. A RT-PCR é o meio mais simples e direto de monitorizar num doente as células IMP da invenção. Pode usar-se um transgene transduzido ou marcadores do dador individual para este objetivo e obtiveram-se sinais específicos das células transplantadas em vários estudos com doentes. Os resultados são geralmente semi-quantitativos.

Alternativamente, as células IMP da invenção podem ser coradas com um corante de interesse, tal como um corante fluorescente e podem ser monitorizadas no doente através do sinal do corante. Tais métodos são rotineiros na especialidade. A migração (ou mobilização) é tipicamente determinada pela medição do número de células que chegam ao tecido danificado. Pode também medir-se indiretamente pela observação dos números de células que se acumularam nos pulmões (e não no tecido danificado). 0 tecido danificado do coração liberta quimiocinas e citocinas inflamatórias, tal como fator derivado de células do estroma 1 (SDF-1), interleucina-8 (IL-8), fator de necrose tumoral alfa (TNF-alfa), fator de estimulação das colónias de granulócitos (G-CSF), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e fator de crescimento de hepatócitos (HGF). Além disso, o enfarte de miocárdio aumenta os níveis de VEGF e eritropoietina (EPO). 0 CXCR4 liga-se ao seu ligando SDF-1 e assim as células IMP da invenção que expressam CXCR4 migrarão através do gradiente de SDF-1 gerado pelo tecido danificado do coração. Outros tecidos danificados tal como o osso, também libertam SDF-1. Se o tecido danificado especifico for tecido cardíaco, as células IMP da invenção expressam preferentemente níveis detetáveis de CXCR4 ou expressam uma quantidade aumentada de CXCR4 comparativamente com MSC.

Se o tecido danificado específico for tecido ósseo, as células IMP da invenção expressam preferentemente níveis detetáveis de TGF-beta 3, proteína morfogenética óssea 6 (BMP-6), SOX-9, colagénio 2, CD117 (c-kit), ligando 12 de quimiocina (motivo de C-C) (CCL12), CCL7, interleucina-8 (IL-8), fator de crescimento derivado de plaquetas A (PDGF-A), PDGF-B, PDGF-C, PDGF-D, fator inibidor da migração de macrófagos (MIF), IGF-1, fator de crescimento de hepatócitos (HGF), PDGF-Ra, PDGF-Rp, CXCR4, recetor de quimiocina C-C de tipo 1 (CCR1), recetor de IGF-1 (IGF-1R), recetor do fator de crescimento de hepatócitos (HGFR), CXCL12 e NFkapaB. As células IMP de mobilização para o osso da invenção expressam preferentemente uma quantidade aumentada de um ou mais ou mesmo de todos estes fatores, comparativamente com células estaminais mesenquimais (MSC). A expressão detetável destes marcadores pode ser medida tal como discutido anteriormente.

As células IMP da invenção são preferentemente capazes de aderir ao tecido danificado específico num doente. Os ensaios de aderência e adesão são conhecidos na especialidade (Humphries, Methods Mol Biol. 2009;522:203-10).

As células IMP da invenção são preferentemente capazes de transmigrar através do endotélio vascular para um tecido danificado específico num doente. Os ensaios de transmigração são conhecidos na especialidade (Muller e Luscinskas, Methods Enzymol. 2008; 443: 155-176).

As células IMP da invenção são preferentemente capazes de proliferar num tecido danificado específico num doente. Os ensaios de proliferação de células são bem conhecidos na especialidade. Tais ensaios estão disponíveis comercialmente, por exemplo a partir de Life Technologies®.

As células IMP da invenção são preferentemente capazes de promover angiogénese num tecido danificado específico num doente. Os ensaios de angiogénese são conhecidos na especialidade (Auerback et al., Clin Chem., janeiro de 2003; 49 (1) :32-40) .

As células IMP da invenção são preferentemente capazes de apresentar efeitos anti-inflamatórios num tecido danificado de um doente. Pode também medir-se a capacidade das células IMP da invenção apresentarem efeitos anti-inflamatórios usando ensaios padrão conhecidos na especialidade. Os métodos adequados incluem ensaios de imunoadsorção enzimática (ELISA) para a excreção de citocinas, reações de leucócitos mistas aumentadas e regulação positiva de moléculas de co-estimulação e marcadores de maturação, medidos por citometria de fluxo, não se lhes limitando. Os métodos específicos que podem ser usados são divulgados no exemplo. As citocinas medidas são tipicamente interleucinas, tal como interleucina-8 (IL-8), selectinas, moléculas de adesão, tal como molécula de adesão intercelular (ICAM-1) e proteínas quimioatratoras, tais como proteína quimiotática de monócitos-1 (MCP-1) e fator de necrose tumoral alfa (TNF-alfa). Os ensaios para estas citocinas estão disponíveis comercialmente. Os fatores anti-inflamatórios são preferentemente detetados e medidos usando o ensaio de Luminex® descrito nos exemplos. Tais ensaios estão disponíveis comercialmente de Life Technologies®.

As células IMP excretam preferentemente níveis detetáveis de uma ou mais de interleucina-6 (IL-6), IL-8, quimiocina 10 com motivo de C-X-C (CXCL10; proteína 10 induzida por interferão gama; IP-10), ligando 2 de quimiocina (motivo de C-C) (CCL2; proteína quimiotática de monócitos-1; MCP-1) e ligando 2 de quimiocina (motivo de C-C) (CCL5; regulada por ativação, expressa e excretada por células T normais; RANTES). As células IMP podem excretar quaisquer destes fatores assim como suas combinações. As células IMP excretam preferentemente todos estes marcadores.

As células IMP excretam preferentemente uma quantidade aumentada de um ou mais de IL-6, IL-8, IP-10, MCP-1 e RANTES comparativamente com uma MSC. As células IMP podem excretar uma quantidade aumentada de quaisquer destes fatores assim como de suas combinações. As células IMP excretam preferentemente uma quantidade aumentada de todos estes marcadores .

As células IMP excretam preferentemente uma quantidade diminuída de interleucina-10 (IL-10) e/ou IL-12 comparativamente com uma célula estaminal mesenquimal, MSC. IL-10 e IL-12 são citocinas pró-inflamatórias.

As células IMP da invenção são mais preferentemente capazes de migrar para um tecido danificado num doente e apresentar efeitos anti-inflamatórios no tecido danificado. Tal permite que a lesão seja eficazmente reparada e reduz o número de células que necessita ser administrado.

As células IMP da invenção expressarão uma variedade de outros marcadores diferentes para além dos discutidos anteriormente. Alguns destes assistirão as células IMP na sua capacidade de migrar para um tecido danificado e uma vez aí chegadas, apresentarem efeitos anti-inflamatórios. Qualquer das células IMP da invenção pode expressar adicionalmente níveis detetáveis de um ou mais de (i) fator de crescimento semelhante à insulina 1 (IGF-1), (ii) recetor de IGF-1; (iii) recetor de C-C de quimiocina tipo 1 (CCR1), (iv) fator derivado de células do estroma 1 (SDF-1), (v) fator indutível por hipoxia 1 alfa (HIF-1 alfa) , (vi) Aktl e (vii) fator de crescimento de hepatócitos (HGF) e/ou fator de estimulação das colónias de granulócitos (G-CSF).

Os recetores de IGF-1 promovem a capacidade de migração ao longo de um gradiente de IGF-1. Um dos mecanismos pelos quais o IGF-1 aumenta a migração é pela regulação positiva de CXCR4 à superfície das células, o que as torna mais sensíveis à sinalização por SDF-1. Isto discute-se anteriormente. 0 CCR1 é o recetor para CCL7 (anteriormente denominado MCP3) que aumenta a mobilização e a capacidade de integração das MSC (e assim esperar-se-ia que apresentasse o mesmo efeito para as células IMP da invenção) e pode aumentar a densidade capilar em miocárdio lesionado através de sinalização parácrina. 0 HIF-1 alfa ativa vias que aumentam a entrega de oxigénio e promovem respostas pró-sobrevivência adaptativas. De entre os muitos genes alvo de HIF-1 alfa contam-se a eritropoietina (EPO), a endotelina e o VEGF (com o seu recetor

Flk-1). As células IMP que expressam quantidades normais ou aumentadas de HIF-1 alfa apresentarão expressão aumentada de estímulos parácrinos de, por exemplo, vários fatores de crescimento vasculogénico que podem promover um subtipo mais terapêutico. Tal como descrito mais detalhadamente seguidamente, as células IMP da invenção podem ser precondicionadas para um subtipo mais terapêutico pelo seu crescimento em condições de hipoxia (oxigénio a menos de 20%) , tal como por exemplo oxigénio a cerca de 2% ou a cerca de 0%. A AKtl é uma proteína cinase de serina/treonina intracelular que desempenha um papel chave em múltiplos processos celulares tais como o metabolismo da glucose, a proliferação celular, apoptose, transcrição e migração celular. Provou-se que a sobrexpressão de Aktl faz com que MSC de rato não sofram apoptose e terá o mesmo efeito nas células IMP da invenção. A proteção contra apoptose aumentará o efeito terapêutico das células IMP.

Demonstrou-se que a sobrexpressão de HGF pelas MSC previne insuficiência cardíaca pós-isquémica pela inibição de apoptose através da via mediada pela calcineurina e angiogénese. HGF e G-CSF apresentam neste aspeto efeitos sinérgicos. As MSC que apresentam uma expressão elevada de HGF e do seu recetor c-met, também apresentam uma capacidade migratória aumentada para o tecido danificado, obtida através de sinalização hormonal, parácrina e autócrina. O mesmo acontecerá para as células IMP da invenção que expressam HGF e/ou G-CSF.

As células IMP podem expressar níveis detetáveis de um ou mais de (i) a (vii) definidos anteriormente. As células IMP da invenção expressam preferentemente uma quantidade aumentada de um ou mais de (i) a (vii) comparativamente com MSC. Descrevem-se anteriormente ensaios quantitativos para marcadores celulares. Pode medir-se a expressão detetável desses marcadores e do seu nível de expressão tal como discutido anteriormente.

Qualquer das células IMP da invenção pode expressar níveis detetáveis de um ou mais de (i) fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), (ii) fator de crescimento de transformação beta (TGF-beta), (iii) fator de crescimento semelhante à insulina 1 (IGF-1), (iv) fator de crescimento de fibroblastos (FGF), (v) fator de necrose tumoral alfa (TNF-alfa), (vi) interferão gama (IFN-gama) e (vii) interleucina-1 alfa (IL-1 alfa) . Demonstrou-se que o meio condicionado de células que sobrexpressam VEGF mitiga a insuficiência cardíaca num modelo de hamster. Assim, as células IMP da invenção que expressam quantidades normais ou aumentadas de VEGF terão o mesmo efeito de tecido cardíaco lesionado. As células IMP podem expressar níveis detetáveis de um ou mais de (i) a (vii). As células IMP da invenção podem expressar uma quantidade aumentada de um ou mais de (i) a (vii) comparativamente com MSC. Descrevem-se anteriormente ensaios quantitativos para marcadores celulares. Pode medir-se a expressão detetável desses marcadores e do seu nível de expressão tal como discutido anteriormente.

Em ambos os conjuntos de definições de (i) a (vii) apresentados anteriormente, qualquer combinação de um ou mais de (i) a (vii) pode ser expressa ou expressa numa quantidade aumentada. Por exemplo, para cada definição de (i) a (vii), as células IMP podem expressar níveis detetáveis ou expressar uma quantidade aumentada de (i) ; (ii); (iii) ; (iv); (v) ; (vi); (vii); (i) e (ii) ; (i) e (iii); (i) e (iv) ; (i) e (v) ; (i) e (vi); (i) e (vii); (ii) e (iii); (ii) e (iv); (ii) e (v); (ii) e (vi); (ii) e (vii); (iii) e (iv); (iii) e (v); (iii) e (vi); (iii) e (vii); (iv) e (v) ; (iv) e (vi); (iv) e (vii); (v) e (vi) ; (v) e (vii); (vi) e (vii); (i) , (ii) e (iii); (i) , (ii) e (iv) ; (i), (ii) e (v) ; (i) , (ii) e (vi); (i) , (ii) e (vii); (i, ) , (iii) e (iv) ; (i), (iii) e (v) ; (i) , (iii) e (vi); (i) , (iii) e (vii); (i), (iv) e (v) ; (i) , (iv) e (vi); (i) , (iv) e (vii) ; (i), (v) e (vi); (i) , (v) e (vii); (i) , (vi) e (vii); (ii), (iii) e (iv) ; (ii) , (iii) e (v) ; (ii) , (iii) e (vi); (ii), (iii) e (vii); (ii), (iv) e (v); (ii), (iv) e (vi); (ii), (iv) e (vii); (ii), (v) e (vi); (ii) , (v) e (vii); (ii), (vi) e (vii) ; (iii) , (iv) e (v) ; (iii) , (iv) e (vi) ; (iii) , (iv) e (vii) ; (iii) , (v) e (vi) ; (iii) , (v) e (vii) ; (iii) , (vi) e (vii); (iv), (v) e (vi); (iv), (v) e (vii); (iv), (vi) e (vii); (v) , (vi) e (vii); (i) , (ii) , (iii) e (iv) ; (i) , (ii) , (iii) e (v); (i), (ii), (iii) e (vi); (i), (ii) , (iii) e (vii); (i), (ii) , (iv) e (v) ; (i), (ii) , (iv) e (vi); (i) , (ii) , (iv) e (vii); (i), (ii), (v) e (vi); (i) , (ii) , (v) e (vii); (i) , (ii), (vi) e (vii); (i) , (iii), (iv) e (v) ; (i) , (iii), (iv) e (vi); (i), (iii), (iv) e (vii); (i), (iii), (v) e (vi); (i), (iii) , (v) e (vii) ; (i) , (iii) , (vi) e (vii) ; (i), (iv) , (v) e (vi) ; (i) , (iv) , (v) e (vii) ; (i) , (iv) , (vi) e (vii) ; (i) , (v) , (vi) e (vii); (ii) , (iii), (iv) e (v) ; (ii) , (iii), (iv) e (vi) ; (ii) , (iii), (iv) e (vii); (ii) , (iii), (v) e (vi) ; (ii) , (iii) , (v) e (vii) ; (ii) , (iii) , (vi) e (vii) ; (ii), (iv) , (v) e (vi) ; (ii) , (iv) , (v) e (vii); (ii) , (iv) , (vi) e (vii); (ii), (v), (vi) e (vii); (iii), (iv), (v) e (vi); (iii), (iv) , (v) e (vii); (iii), (iv), (vi) e (vii); (iii) , (v) , (vi) e (vii) ; (iv) , (v) , (vi) e (vii) ; (i) , (ii) , (iii) , (iv) e (v) ; (i), (ii) , (iii), (iv) e (vi) ; (i) , (ii) , (iii), (iv) e (vii); (i), (ii), (iii), (v) e (vi) ; (i) , (ii) , (iii), (v) e (vii); (i) , (ii), (iii), (vi) e (vii); (i) , (ii) , (iv) , (v) e (vi) ; (i) , (ii) , (iv), (v) e (vii); (i) , (ii) , (iv) , (vi) e (vii) ; (i) , (ii) , (v) , (vi) e (vii); (i) , (iii), (iv) , (v) e (vi) ; (i) , (iii), (iv) , (v) e (vii); (i) , (iii), (iv) , (vi) e vii); (i) , (iii), (v) , (vi) e (vii); (i) , (iv) , (v) , (vi) e (vii) ; (ii) , (iii), (iv), (v) e (vi); (ii), iii) , (iv), (v) e (vii) ; (ii) , (iii), (iv), (vi) e (vii) ; (ii) , (iii) , (v) , (vi) e (vii); (ii), (iv), (v), (vi) e (vii); (iii), (iv), (v), (vi) e vii); (i) , (ii), (iii), (iv), (v) e (vi); (i) , (ii), (iii), (iv) , (v) e (vii); (i) , (ii) , (iii), (iv) , (vi) e (vii); (i) , (ii) , (iii), (v) , (vi) e (vii); (i) , (ii) , (iv) , (v) , (vi) e (vii); (i), (iii), (iv), (v), (vi) e (vii); (ii), (iii), (iv) , (v) , (vi) e (vii); ou (i) , (ii) , (iii), (iv) , (v) , (vi) e (vii). As combinações para cada definição de (i) a (vii) são selecionadas independentemente desta lista.

Além de qualquer dos marcadores discutidos anteriormente, as células IMP da invenção expressam preferentemente também níveis detetáveis de LIF e/ou recetores de fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF). As células IMP da invenção expressam preferentemente uma quantidade aumentada de LIF e/ou recetores de fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) comparativamente com células estaminais mesenquimais. Os recetores de PDGF são preferentemente recetores de PDGF-A e/ou recetores de PSDGF-B. As MSC que podem apresentar expressão elevada destes recetores podem migrar eficazmente para áreas nas quais as plaquetas foram ativadas, tais como feridas e vasos trombóticos. 0 mesmo se aplicará a células IMP que expressam quantidades normais ou aumentadas dos recetores.

As células IMP da invenção são preferentemente autólogas.

Por outras palavras, as células são preferentemente derivadas do doente ao qual se administrarão as células. Alternativamente, as células IMP são preferentemente alogénicas. Por outras palavras, as células são preferentemente derivadas de um doente que é compatível imunologicamente com o doente ao qual se administrarão as células. Uma célula IMP da invenção pode ser isolada, substancialmente isolada, purificada ou substancialmente purificada. A célula IMP é isolada ou purificada caso se encontre complemente isenta de quaisquer outros componentes, tais como meio de cultura, outras células da invenção ou outros tipos de células. A célula IMP é substancialmente isolada caso esteja misturada com transportadores ou diluentes, tal como meio de cultura, o qual não interferirá com o uso pretendido. Alternativamente, a célula IMP da invenção pode estar presente numa matriz de crescimento ou imobilizada numa superfície tal como discutido seguidamente.

As células IMP da invenção podem ser isoladas usando uma variedade de técnicas incluindo técnicas baseadas em anticorpos. As células podem ser isoladas usando técnicas de seleção negativas e positivas baseadas na ligação de anticorpos monoclonais aos marcadores de superfície que se encontram presentes na célula IMP (consultar anteriormente). Assim, as células IMP podem ser separadas usando qualquer técnica baseada em anticorpos, incluindo separação celular ativada por fluorescência (FACS) e separação com pérolas magnéticas.

Tal como discutido mais detalhadamente seguidamente, as células IMP podem ser tratadas ex vivo. Para tal, as células podem ser carregadas ou transfetadas com um agente terapêutico ou de diagnóstico e seguidamente usadas terapeuticamente nos métodos da invenção.

População da invenção A invenção também proporciona uma população de duas ou mais células IMP da invenção. A população pode apresentar qualquer número de células. A população da invenção compreende preferentemente pelo menos cerca de 5 x 105 células IMP da invenção. Com maior preferência a população compreende pelo menos cerca de 1 x 106, pelo menos cerca de 2 x 106, pelo menos cerca de 2,52 x 106, pelo menos cerca de 5 x 106, pelo menos cerca de 1 x 107, pelo menos cerca de 2 x 107, pelo menos cerca de 5 x 107, pelo menos cerca de 1 x 108 ou pelo menos cerca de 2 x 108 células IMP da invenção. Em alguns casos, a população pode compreender pelo menos cerca de 1,0 x 107, pelo menos cerca de 1,0 x 108, pelo menos cerca de 1,0 x 109, pelo menos cerca de 1,0 x 1010, pelo menos cerca de 1,0 x 1011 ou pelo menos cerca de 1,0 x 1012 células IMP da invenção ou mesmo mais. A população compreendendo duas ou mais células IMP da invenção pode compreender outras células além das células IMP da invenção. Contudo, pelo menos 70% das células na população são preferentemente células IMP da invenção. Mais preferentemente, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% das células na população são células IMP da invenção. A invenção também proporciona populações especificas de células IMP. A invenção proporciona uma população de células progenitoras imunomoduladoras (IMP), em que (i) pelo menos 90%, preferentemente pelo menos 97% e mais preferentemente pelo menos 97,1% das células na população expressam à sua superfície níveis detetáveis de MIC A/B, (ii) pelo menos 60%, preferentemente pelo menos 65% e mais preferentemente pelo menos 65,2% das células na população expressam à sua superfície níveis detetáveis de CD304 (neuropilina 1), (iii) pelo menos 45%, preferentemente pelo menos 51% e mais preferentemente pelo menos 51,6% das células na população expressam à sua superfície níveis detetáveis de CD 178 (ligando de FAS) , (iv) pelo menos 10%, preferentemente pelo menos 11% e mais preferentemente pelo menos 11,3% das células na população expressam à sua superfície níveis detetáveis de CD289 (recetor do tipo Toll 9), (v) pelo menos 15%, preferentemente pelo menos 18% e mais preferentemente pelo menos 18,7% da população expressa à sua superfície níveis detetáveis de CD363 (recetor de esfingosina-l-fosfato 1) , (vi) pelo menos 20%, preferentemente pelo menos 24% e mais preferentemente pelo menos 24,8% das células na população expressam à sua superfície níveis detetáveis de CD99, (vii) pelo menos 80%, preferentemente pelo menos 85% das células na população expressam à sua superfície níveis detetáveis de CD181 (recetor de quimiocina C-X-C de tipo 1; CXCRl), (viii) pelo menos 30%, preferentemente pelo menos 33% e mais preferentemente pelo menos 33,3% das células na população expressam à sua superfície níveis detetáveis de recetor do fator de crescimento epidérmico (EGF-R), (ix) pelo menos 60%, preferentemente pelo menos 68% e mais preferentemente pelo menos 68,8% das células na população expressam à sua superfície níveis detetáveis de CXCR2 e (x) pelo menos 5%, preferentemente pelo menos 7% e mais preferentemente pelo menos 7,05% das células na população expressam à sua superfície níveis detetáveis de CD126.

As células nestas populações preferidas podem expressar adicionalmente à sua superfície níveis detetáveis de qualquer dos marcadores discutidos anteriormente em referência às IMP da invenção. As células nestas populações preferidas podem apresentar qualquer das propriedades vantajosas das células IMP discutidas anteriormente.

Pelo menos 90%, tal como pelo menos 95% das células na população preferentemente expressam à sua superfície níveis detetáveis de um ou mais de CD10, CD111, CD267, CD47, CD273, CD51/CD61, CD4 9f, CD49d, CD146, CD55, CD340, CD91, Notch2, CD175s, CD82, CD49b, CD95, CD63, CD245, CD58, CD108, B2-microglobulin, CD155, CD298, CD44, CD49c, CD105, CD166, CD230, HLA-ABC, CD13, CD29, CD49e, CD59, CD73, CD81, CD90, CD98, CD147, CD151 e CD276. Pelo menos 90%, tal como pelo menos 95% das células na população podem expressar à sua superfície níveis detetáveis de um qualquer número e combinações destes marcadores. Pelo menos 90%, tal como pelo menos 95% das células na população preferentemente expressam à sua superfície níveis detetáveis de todos estes marcadores.

Pelo menos 80%, tal como pelo menos 85% das células na população preferentemente expressam à sua superfície níveis detetáveis de um ou mais de CD156b, CD61, CD202b, CD130, CD148, CD288, CD337, SSEA-4, CD349 e CD140b. Pelo menos 80%, tal como pelo menos 85% das células na população podem expressar à sua superfície níveis detetáveis de um qualquer número e combinações destes marcadores. Pelo menos 80%, tal como pelo menos 85% das células na população preferentemente expressam à sua superfície níveis detetáveis de todos estes marcadores.

Pelo menos 70%, tal como pelo menos 75% das células na população preferentemente expressam à sua superfície níveis detetáveis de um ou mais de CD318, CD351, CD286, CD46, CD119 e CD132. Pelo menos 70%, tal como pelo menos 75% das células na população podem expressar à sua superfície níveis detetáveis de um qualquer número e combinações destes marcadores. Pelo menos 70%, tal como pelo menos 75% das células na população preferentemente expressam à sua superfície níveis detetáveis de todos estes marcadores. 1% ou menos, tal como 0,5% ou menos das células na população preferentemente expressam à sua superfície níveis detetáveis de um ou mais de CD72, CD133, CD192, CD207, CD144, CD41b, FMC7, CD75, CD3e, CD37, CD158a, CD172b, CD282, CD100, CD94, CD39, CD66b, CD158b, CD40, CD35, CD15, PAC-1, CLIP, CD48, CD278, CD5, CD103, CD209, CD3, CD197, HLA-DM, CD20, CD74, CD87, CD129, CDw329, CD57, CD163, TPBG, CD206, CD243 (BD), CD19, CD8, CD52, CD184, CD107b, CD138, CD7, CD50, HLA-DR, CD158e2, CD64, DCIR, CD4 5, CLA, CD38, CD45RB, CD34, CD101, CD2, CD41a, CD69, CD136, CD62P, TCR alfa beta, CD16b, CDla, ITGB7, CD154, CD7 0, CDw218a, CD137, CD43, CD27, CD62L, CD30, CD36, CD150, CD66, CD212, CD177, CD142, CD167, CD352, CD42a, CD336, CD244, CD23, CD45RO, CD229, CD200, CD22, CDH6, CD28, CD18, CD21, CD335, CD131, CD32, CD157, CD165, CDl07a, CDlb, CD332, CD180, CD65 e CD24. 1% ou menos, tal como 0,5% ou menos das células na população podem expressar à sua superfície níveis detetáveis de um qualquer número e combinações destes marcadores. 1% ou menos, tal como 0,5% ou menos das células na população preferentemente expressam à sua superfície níveis detetáveis de todos estes marcadores.

Em qualquer das concretizações anteriores nas quais as populações se definem por referência à % de células que expressam determinados marcadores à sua superfície, as populações compreendem preferentemente pelo menos 5 000 células, tal como pelo menos 6 000, pelo menos 7 000, pelo menos 8 000, pelo menos 9 000, pelo menos 10 000, pelo menos 20 000, pelo menos 30 000 ou pelo menos 40 000 células. Estas populações podem compreender quaisquer dos números de células discutidas anteriormente.

Qualquer das populações de células aqui divulgadas pode ser diluída com outras células antes da utilização. Por exemplo, pode combinar-se a população com sangue do doente, células mononucleares (MC), MSC, células progenitoras da linhagem mesodérmica (PML) ou uma sua combinação. As PML são divulgadas em PCT/GB2012/051600 (publicado como WO 2013/005053).

As populações da invenção são vantajosas para terapia tal como discutido seguidamente. Esta capacidade de produzir populações compreendendo números elevados de células IMP da invenção é uma das principais vantagens da invenção. A invenção permite o tratamento de doentes com uma população de células das quais a maioria, se não todas, migram eficazmente para o tecido de interesse e uma vez aí chegadas têm efeitos anti-inflamatórios. Tal permite a utilização de uma dosagem reduzida de células e evita efeitos secundários fora do alvo e efeitos secundários relacionados com volume.

A população da invenção é preferentemente homóloga. Por outras palavras, todas as células IMP na população são preferentemente genotípica e fenotipicamente idênticas. A população é preferentemente autóloga ou alogénica tal como definido anteriormente.

Contudo, a população pode também ser semi-alogénica. As populações semi-alogénicas são tipicamente produzidas a partir de células mononucleares de dois ou mais doentes que são compativeis imunologicamente com o doente ao qual se administrará a população. Por outras palavras, todas as células na população são preferentemente idênticas geneticamente ou suficientemente idênticas geneticamente de modo a que população seja compatível imunologicamente com o doente ao qual se administrará a população. Dado que as células IMP da invenção podem ser derivadas de um doente, estas podem ser autólogas para o doente a ser tratado (i.e., idênticas geneticamente ao doente ou suficientemente idênticas geneticamente de modo a serem compatíveis para administração ao doente). A população da invenção pode ser isolada, substancialmente isolada, purificada ou substancialmente purificada. Uma população é isolada ou purificada se estiver completamente isenta de quaisquer outros componentes, tais como meio de cultura e outras células. Uma população é substancialmente isolada caso esteja misturada com transportadores ou diluentes, tal como meio de cultura, o qual não interferirá com o uso pretendido. Discutem-se outros transportadores e diluentes mais detalhadamente seguidamente. Uma população substancialmente isolada ou substancialmente purificada não compreende células diferentes das células IMP da invenção. Em algumas concretizações, a população da invenção pode estar presente numa matriz de crescimento ou imobilizada numa superfície tal como discutido seguidamente. A população é tipicamente cultivada in vitro. As técnicas para cultivar células são bem conhecidas do perito na especialidade. As células podem ser cultivadas em condições padrão a 37 °C, CO2 a 5% em meio sem soro. As células são preferentemente cultivadas em condições de baixa concentração de oxigénio tal como discutido mais detalhadamente seguidamente. As células podem ser cultivadas em qualquer frasco ou vaso adequados, incluindo os poços de uma placa rasa tal como uma placa de 6 poços padrão. Tais placas estão disponíveis comercialmente de Fisher scientific, dos fornecedores VWR, Nunc, Starstedt ou Falcon. Os poços têm tipicamente uma capacidade de cerca de 1 ml a cerca de 4 ml. 0 frasco, vaso ou poços no interior dos quais se obtém ou se cultiva a população pode ser modificado para facilitar o manuseamento das células IMP. Por exemplo, podem modificar-se o frasco, vaso ou poços para facilitar a cultura das células, por exemplo, incluindo uma matriz de crescimento. 0 frasco, vaso ou poços podem ser modificados para permitir ligação das células IMP ou para permitir imobilização das células IMP numa superfície. Podem revestir-se uma ou mais superfícies com proteínas da matriz extracelular tais como laminina ou colagénio ou com quaisquer outras moléculas de captura que se ligam às células e as imobilizam ou capturam na (s) superfície(s).

Pode modificar-se a população ex vivo usando qualquer das técnicas aqui descritas. Por exemplo, a população pode ser transfetada ou carregada com agentes terapêuticos ou de diagnóstico. A população pode então ser usada nos métodos de tratamento discutidos mais detalhadamente seguidamente. Método para produzir uma célula IMP da invenção A invenção também proporciona um método para produzir uma população da invenção. 0 método envolve cultivar células mononucleares (MC) durante entre 15 e 25 dias num meio compreendendo lisado plaquetário com oxigénio (O2) a pelo menos 20% e sob condições que permitem que as IMP adiram para induzir a diferenciação das MC para células IMP. O método envolve então recolher e cultivar as células IMP que expressam à sua superfície níveis detetáveis de MIC A/B, CD304 (neuropilina 1), CD178 (ligando de FAS), CD289 (recetor do tipo Toll 9), CD363 (recetor de esfingosina-l-fosfato 1), CD99, CD181 (recetor de quimiocina C-X-C de tipo 1; CXCR1), recetor do fator de crescimento epidérmico (EGF-R), CXCR2 e CD126. As células recolhidas podem expressar à sua superfície níveis detetáveis ou quantidades aumentadas de qualquer dos marcadores e fatores descritos anteriormente em referência às células da invenção. São conhecidas na especialidade células mononucleares (MC) e métodos de as isolar. As MC podem ser MC primárias isoladas de medula óssea. As MC são preferentemente MC de sangue periférico (PBMC), tais como linfócitos, monócitos e/ou macrófagos. As PBMC podem ser isoladas a partir de sangue usando um polissacárido hidrofílico, tal como Ficoll®. Por exemplo, podem isolar-se PBMC a partir de sangue usando Ficoll-Paque® (um meio de densidade disponível comercialmente) tal como divulgado no exemplo.

Antes da cultura, podem expor-se as MC a uma mistura de enriquecimento de células estaminais mesenquimais. A mistura compreende preferentemente anticorpos que reconhecem CD3, CD14, CD19, CD38, CD66b (que estão presentes em células não pretendidas) e um componente dos eritrócitos. Tal mistura reticula células não pretendidas com eritrócitos formando rosetas imunitárias que podem ser removidas das MC pretendidas. Uma mistura preferida é RosetteSep®. São conhecidas na especialidade condições adequadas para induzir diferenciação das MC para células mesenquimais (tecido principalmente derivado da mesoderme). Por exemplo, são discutidas condições adequadas em Capelli, C., et al. (Human platelet lysate allows expansion and clinical grade production of mesenchymal stromal cells from small samples of bone marrow aspirates or marrow filter washouts, Bone Marrow Transplantation, 2007. 40: p. 785-791). Podem usar-se também estas condições para induzir diferenciação de MC para células IMP de acordo com a invenção. O método compreende cultivar MC com lisado de plasma para induzir diferenciação de MC para células IMP. O lisado plaquetário refere-se à combinação dos fatores de crescimento naturais contidos nas plaquetas que foram libertados através da lise dessas plaquetas. Pode conseguir-se lise por meios químicos (i.e. CaCl2) , meios osmóticos (uso de H2O destilada) ou através de procedimentos de congelamento e descongelamento. O lisado plaquetário pode ser derivado de sangue completo tal como descrito em patente U.S. ne 5 198 357. O lisado plaquetário é preferentemente preparado tal como descrito em PCT/GB12/052911 (publicado como WO 2013/076507). O lisado de plasma é preferentemente lisado de plasma humano. A etapa (a) do método da invenção compreende cultivar MC num meio compreendendo lisado plaquetário durante um intervalo de tempo suficiente para induzir diferenciação de MC para células IMP. 0 intervalo de tempo suficiente é desde cerca de 15 a cerca de 25 dias, preferentemente cerca de 22 dias. 0 meio compreende preferentemente cerca de 20% ou menos de lisado plaquetário por volume, tal como cerca de 15% ou menos por volume ou cerca de 10% ou menos por volume. O meio compreende preferentemente desde cerca de 5% a cerca de 20% de lisado plaquetário por volume, tal como desde cerca de 10% a cerca de 15% por volume. O meio compreende preferentemente cerca de 10% de lisado plaquetário por volume.

Noutra concretização preferida, a etapa (a) do método da invenção compreende expor MC a uma mistura de enriquecimento mesenquimal e seguidamente cultivar as MC num meio compreendendo lisado plaquetário durante um intervalo de tempo suficiente para induzir diferenciação das MC para células IMP. O intervalo de tempo suficiente é desde cerca de 15 a cerca de 25 dias, preferentemente cerca de 22 dias.

Na etapa (a) o meio é preferentemente meio mínimo essencial (MEM). O MEM está disponível comercialmente de várias origens incluindo Sigma-Aldrich. O meio compreende adicionalmente preferentemente um ou mais de heparina, L-glutamina e penicilina/estreptavidina (P/S). A L-glutamina pode ser substituída por GlutaMAX® (que está disponível comercialmente de Life Technologies).

Tal como discutido anteriormente, algumas das células IMP da invenção expressam níveis detetáveis de CXCR4. A expressão de CXCR4 é dependente de citocinas e aumenta quando as células são expostas aos fatores de células estaminais (SCF), interleucina-6 (IL-6), ligando de Flt-3, fator de crescimento de hepatócitos (HGF) e IL-3. O meio pode compreender um ou mais de (i) SCF, (ii) IL-6, (iii) ligando de Flt-3, (iv) fator de crescimento de hepatócitos e (v) IL-3, tais como (i); (ii); (iii); (iv) ; (v) ; (i) e (ii) ; (i) e (iii); (i) e (iv) ; (i) e (v); (ii) e (iii); (ii) e (iv); (ii) e (v); (iii) e (iv); (iii) e (v) ; (iv) e (v) ; (i) , (ii) e (iii); (i) , (ii) e (iv) ; (i) , (ii) e (v) ; (i) , (iii) e (iv) ; (i), (iii) e (v) ; (i) , (iv) e (v) ; (ii) , (iii) e (iv) ; (ii) , (iii) e (v) ; (ii) , (iv) e (v) ; (iii) , (iv) e (v) ; ou (i) , (ii) , (iii), (iv) e (v) . Qualquer de (i) a (v) podem estar presentes a desde cerca de 10 a cerca de 150 ng/ml. A etapa (a) compreende cultivar as MC em condições que permitem que as células IMP adiram. As condições adequadas são discutidas mais detalhadamente anteriormente.

Na etapa (a) , cultivam-se as MC a menos de cerca de 20% de oxigénio (O2) , tal como menos de cerca de 19%, menos de cerca de 18%, menos de cerca de 17%, menos de cerca de 16%, menos de cerca de 15%, menos de cerca de 14%, menos de cerca de 13%, menos de cerca de 12%, menos de cerca de 11%, menos de cerca de 10%, menos de cerca de 9%, menos de cerca de 8%, menos de cerca de 7%, menos de cerca de 6%, menos de cerca de 5%, menos de cerca de 4%, menos de cerca de 3%, menos de cerca de 2% ou menos de cerca de 1% de oxigénio (O2) . As MC são preferentemente cultivadas a desde cerca de 0% a cerca de 19% de O2, tal como desde cerca de 1% a cerca de 15% de O2, desde cerca de 2% a cerca de 10% de O2 ou desde cerca de 5% a cerca de 8% de O2. As MC são com a maior preferência cultivadas a cerca de 0% de O2. Os valores para a % de oxigénio (ou % de O2) mencionadas anteriormente referem-se a % por volume de oxigénio no gás fornecido às células durante a cultura, por exemplo pela incubadora de células. É possível que possa haver fuga de algum oxigénio para dentro da incubadora ou que entre quando se abre a porta.

As MC são cultivadas com a maior preferência na presença de lisado plaquetário e menos de cerca de 20% de oxigénio (O2) · Esta combinação mimetiza as condições naturais no tecido danificado e portanto, resulta em células mais saudáveis e com maior potência terapêutica. Efetua-se cultura celular convencional com oxigénio a 20% ou 21% (aproximadamente o conteúdo atmosférico) mas este nível de oxigénio não ocorre em qualquer lugar do corpo humano. As células epiteliais nos pulmões "veriam" este nível de oxigénio mas após este oxigénio se dissolver e deixar os pulmões, diminui para cerca de 17%. A partir daí, diminui ainda mais para cerca de 1-2% na maioria dos tecidos, apresentando valores tão baixos como 0,1% em tecidos avasculares tal como cartilagem nas articulações.

Na etapa (b), o método compreende adicionalmente recolher e cultivar células IMP que têm o padrão de expressão de marcadores necessário tal como discutido anteriormente. As células IMP com o padrão de expressão de marcadores necessário podem ser recolhidas usando qualquer técnica baseada em anticorpos, incluindo separação celular ativada por fluorescência (FACS) e separação com pérolas magnéticas. Prefere-se FACS. ΗΤ-FACS é mais preferido.

Qualquer dos métodos para cultivar células IMP divulgado em relação à etapa (a) aplica-se igualmente à etapa (b) . Nomeadamente, cultivam-se células na etapa (b) na presença de lisado plaquetário e menos de cerca de 20% de oxigénio (O2) tal como discutido anteriormente em relação à etapa (a).

Tal como se tornou evidente da discussão anterior, efetua-se o método da invenção em condições clinicamente relevantes, i.e. na ausência de quantidades vestigiais de endotoxinas e outros contaminantes ambientais, tais como lipopolissacáridos, lipopéptidos e peptidoglicanos, etc. Tal torna as células IMP da invenção particularmente adequadas para administração a doentes.

As MC são preferentemente obtidas a partir de um doente ou de um dador alogénico. A invenção também proporciona um método para produzir uma população da invenção que é adequada para administração a um doente, em que o método compreende cultivar MC obtidas a partir do doente durante entre 15 e 25 dias num meio compreendendo lisado plaquetário, com oxigénio (O2) a menos de 20% e sob condições que permitem que as IMP adiram e induzam diferenciação das MC para células IMP e (b) recolher e cultivar as células progenitoras que apresentem um padrão de expressão tal como definido anteriormente e produzir assim uma população da invenção que é adequada para administração ao doente. A população será autóloga para o doente e consequentemente não será rejeitada após implante. A invenção também proporciona uma população da invenção que é adequada para administração a um doente e é produzida desta forma.

Alternativamente, a invenção proporciona um método para produzir uma população da invenção que é adequada para administração a um doente, em que o método compreende cultivar MC obtidas a partir de um doente diferente que é compatível imunologicamente com o doente ao qual se administrarão as células durante entre 15 a 25 dias num meio compreendendo lisado plaquetário com oxigénio (O2) a menos de 20% e sob condições que permitem que as IMP adiram e induzam diferenciação das MC para células IMP e (b) recolher e cultivar as células IMP que apresentem um padrão de expressão tal como definido anteriormente e produzir assim uma população da invenção que é adequada para administração ao doente. A população será alogénica para o doente e consequentemente reduzirá a probabilidade de rejeição após implante. A invenção também proporciona uma população da invenção que é adequada para administração a um doente e é produzida desta forma.

Medicamentos, métodos e uso terapêutico

As células IMP da invenção podem ser usadas num método de terapia de um corpo humano ou animal. Assim, a invenção proporciona uma célula IMP da invenção ou uma população da invenção para uso num método de tratamento do corpo humano ou animal por terapia. Nomeadamente, a invenção refere-se ao uso das células IMP da invenção ou de uma população da invenção para reparar um tecido danificado num doente. A invenção também se refere à utilização das células IMP da invenção ou de uma população da invenção para tratar uma lesão ou doença cardíaca, dos ossos, da cartilagem, dos tendões, dos ligamentos, do fígado, rim ou pulmão, num doente. A invenção também proporciona uma população da invenção para uso na reparação de um tecido danificado no doente. A invenção também proporciona o uso de uma população da invenção no fabrico de um medicamento para reparar um tecido danificado num doente. O tecido é preferentemente derivado da mesoderme. O tecido é mais preferentemente tecido cardíaco, dos ossos, da cartilagem, dos tendões, dos ligamentos, do fígado, rim ou pulmão.

Os danos ao tecido podem ser provocados por lesão ou doença. A lesão ou doença é preferentemente uma doença cardíaca, dos ossos, da cartilagem, dos tendões, dos ligamentos, do fígado, rim ou pulmão, num doente. A invenção proporciona, portanto, um método para tratar uma lesão ou doença cardíaca, dos ossos, da cartilagem, dos tendões, dos ligamentos, do figado, rim ou pulmão, num doente, compreendendo administrar ao doente uma população da invenção, em gue a população compreende um número terapeuticamente eficaz de células e assim tratar a lesão ou doença no doente. A invenção também proporciona uma população da invenção para uso no tratamento de uma doença cardíaca, dos ossos, da cartilagem, dos tendões, dos ligamentos, do fígado, rim ou pulmão, num doente. A invenção também proporciona o uso de uma população da invenção no fabrico de um medicamento para tratar uma doença ou lesão cardíaca, dos ossos, da cartilagem, dos tendões, dos ligamentos, do fígado, rim ou pulmão, num doente. A lesão ou doença cardíaca é preferentemente selecionada de enfarte do miocárdio (MI), hipertrofia ventricular esquerda, hipertrofia ventricular direita, êmbolos, insuficiência cardíaca, cardiopatia congénita, doença das válvulas cardíacas, arritmia e miocardite. 0 MI aumenta os níveis de VEGF e EPO libertados pelo miocárdio. Além disso, o MI está associado a uma reação inflamatória e o tecido de enfarte também liberta fator de inibição da migração de macrófagos (MIF), interleucina (IL-6) e KC/Gro-alfa. CCL7 (anteriormente denominada MCP3), CXCL1, CXCL2 são reguladas positivamente de forma significativa no coração após enfarte de miocárdio (MI) e podem estar implicadas na regulação de enxerto e mobilização de MSC para miocárdio em enfarte.

No modelo de ratinho de enfarte de miocárdio, provou-se que IL-8 regulava positivamente fortemente a expressão génica, principalmente nos primeiros 2 dias pós-MI. Notavelmente, a expressão aumentada de IL-8 foi predominantemente localizada na área de enfarte e na zona de fronteira e apenas num grau nitidamente inferior no miocárdio não afetado. Através da ativação de CXCR2, o MIF apresenta funções do tipo de quimiocina e atua como um regulador principal do recrutamento de células inflamatórias e aterogénese. A doença ou lesão dos ossos é preferentemente selecionada de fratura, fratura de Salter-Harris, fratura em "galho verde", obstrução óssea, craniossinostose, sindrome de Coffin-Lowry, fibrodisplasia ossificante progressiva, displasia fibrosa, doença de Fong (ou sindrome de unha-patela), hipofosfatasia, sindrome de Klippel-Feil, doença óssea metabólica, sindrome de unha-patela, osteoartrite, osteite deformante (ou doença óssea de Paget), osteite fibrosa cística (ou osteite fibrosa ou doença óssea de Von Recklinghausen), osteite púbica, osteite condensante, osteite condensante do ilíaco, osteocondrite dissecante, osteogénese imperfeita, osteomalácia, osteomielite, osteopenia, osteopetrose, osteoporose, osteonecrose, hiperostose porótica, hiperparatiroidismo primário, osteodistrofia renal, cancro ósseo, uma lesão óssea associada a cancro metastático, doença de Gorham Stout, hiperparatiroidismo primário, doença periodontal e descolamento assético das substituições de articulações. 0 cancro ósseo pode ser sarcoma de Ewing, mieloma múltiplo, osteossarcoma (tumor gigante ósseo), osteocondroma ou osteoclastoma. 0 cancro metastático que resulta numa lesão óssea pode ser cancro da mama, cancro da próstata, cancro dos rins, cancro dos pulmões e/ou leucemia de células T no adulto.

Se o tecido danificado for tecido cardíaco ou tecido ósseo, as células IMP na população preferentemente expressam à sua superfície níveis detetáveis de CD29, CD44, CD73, CD90, CD105, CD271, CXCR1, CXCR2 e CXCR4 e não expressam à sua superfície níveis detetáveis de CD14, CD34 e CD45. Se o tecido danificado for tecido ósseo, as células IMP na população expressam, à sua superfície, mais preferentemente níveis detetáveis de CD29, CD44, CD73, CD90, CD105, CD271, TGF-beta 3, proteína morfogenética óssea 6 (BMP-6), SOX-9, colagénio 2, CD117 (c-kit), ligando 12 de quimiocina (motivo de C-C) (CCL12), CCL7, interleucina-8 (IL-8), fator de crescimento derivado de plaquetas A (PDGF-A), PDGF-B, PDGF-C, PDGF-D, fator de inibição da migração de macrófagos (MIF), IGF-1, fator de crescimento de hepatócitos (HGF), PDGF-Ra, PDGF-R3, CXCR4, recetor de quimiocina tipo 1 C-C (CCR1), recetor de IGF-1 (IGF-1R) , recetor de fator de crescimento de hepatócitos (HGFR), CXCL12 e NFkapaB e não expressam à sua superfície níveis detetáveis de CD14, CD34 e CD45. A doença ou distúrbio pode ser doença periodontal, endometriose ou fendas meniscais.

Em todos os casos, as células IMP da invenção são preferentemente derivadas do doente ou de um dador alogénico. 0 facto de derivar as células IMP da invenção do doente deve permitir assegurar que as células IMP não são elas próprias rejeitadas pelo sistema imunitário do doente. Qualquer diferença entre dador e recebedor causará em última análise depuração das células IMP, não sem antes estas terem reparado pelo menos uma parte do tecido danificado. A invenção refere-se à administração ao doente de um número terapeuticamente eficaz de células IMP da invenção ao doente. Um número terapeuticamente eficaz é um número que melhore um ou mais sintomas do dano, doença ou lesão. Um número terapeuticamente eficaz é preferentemente um número que repare o tecido danificado ou trate a doença ou lesão. Discutem-se mais detalhadamente seguidamente números adequados.

As células IMP da invenção podem ser administradas a qualquer doente adequado. 0 doente é geralmente um doente humano. 0 doente pode ser qualquer dos animais ou mamíferos anteriormente mencionados com referência à fonte das células IMP . 0 doente pode ser um bebé, um jovem ou um adulto. Pode saber-se que o doente tem um tecido danificado ou suspeitar-se que tem um tecido danificado. 0 doente pode ser suscetível ou pode estar em risco de contrair uma doença ou lesão relevantes. Por exemplo, o doente pode ter predisposição genética para insuficiência cardíaca.

Pode usar-se a invenção em combinação com outros meios e substâncias para reparar tecido danificado ou proporcionar alívio da dor. Em alguns casos, as células IMP da invenção podem ser administradas simultânea, sequencial ou separadamente com outras substâncias que se pretendem que reparem o tecido danificado ou que proporcionem alívio da dor. Podem usar-se as células IMP em combinação com tratamentos existentes para tecido danificado e podem, por exemplo, ser simplesmente misturadas com tais tratamentos. Assim, a invenção pode ser usada para aumentar a eficácia de tratamentos existentes de tecido danificado. A invenção refere-se preferentemente ao uso de células IMP carregadas ou transfetadas com um agente terapêutico e/ou de diagnóstico. Um agente terapêutico pode ajudar a reparar o tecido danificado. Um agente de diagnóstico, tal como uma molécula fluorescente, pode ajudar a identificar a localização das células IMP no doente. As células IMP podem ser carregadas ou tranfetadas usando qualquer método conhecido na especialidade. A carga de células IMP pode efetuar-se in vitro ou ex vivo. Em cada caso, as células IMP podem ser simplesmente postas em contacto com o agente na cultura. Alternativamente, as células IMP podem ser carregadas com um agente usando veiculo de entrega, tal como lipossomas. Tais veículos são conhecidos na especialidade.

Pode efetuar-se a transfeção de células IMP in vitro ou ex vivo. Alternativamente, pode efetuar-se transfeção estável na fase de MC permitindo que as células IMP que expressam o transgene sejam diferenciadas dessas. Transfetam-se as células IMP com um ácido nucleico que codifica para o agente. Por exemplo, podem utilizar-se partículas víricas ou outros vetores que codificam para o agente. Os métodos para tal são conhecidos na especialidade. 0 ácido nucleico dá origem à expressão do agente nas células IMP. A molécula de ácido nucleico compreenderá preferentemente um promotor que está ligado operacionalmente às sequências que codificam para o agente e que é ativo nas células IMP ou que pode ser induzido nas células IMP.

Numa concretização particularmente preferida, o ácido nucleico que codifica para o agente pode ser entregue através de uma partícula vírica. A partícula vírica pode compreender uma molécula de direção ao alvo para assegurar transfeção eficaz. A molécula de direção ao alvo será tipicamente proporcionada completa ou parcialmente à superfície do vírus de modo a que a molécula seja capaz de dirigir o vírus ao alvo de células IMP.

Em tais concretizações pode usar-se qualquer virus adequado. 0 virus pode, por exemplo, ser um retrovirus, um lentivirus, um adenovirus, um virus adenoassociado, um vírus de vaccinia ou um vírus de herpes simplex. Numa concretização particularmente preferida, o vírus pode ser um lentivirus. 0 lentivirus pode ser um vírus de VIH modificado adequado para uso na entrega de genes. 0 lentivirus pode ser um vetor baseado em SIV, FIV ou no vírus da anemia infeciosa equina (EQIA). 0 vírus pode ser um vírus de leucemia murina de Moloney (MMLV). Os vírus usados na invenção apresentam preferentemente replicação deficiente. Não têm que se usar partículas víricas. Pode usar-se qualquer vetor capaz de transfetar as células IMP da invenção, tal como na transfeção convencional com ADN plasmídico ou ARN. A absorção de construções de ácido nucleico pode ser melhorada através de várias técnicas de transfeção conhecidas, por exemplo as que incluem o uso de agentes de transfeção. Os exemplos destes agentes incluem agentes catiónicos, por exemplo, fosfato de cálcio e DEAE-Dextrano e lipofetantes, por exemplo, liptofectamina, Fugene e Transfectam. A célula pode ser carregada ou transfetada sob condições adequadas. A célula e agente ou vetor podem, por exemplo, ser postos em contacto durante entre cinco minutos e dez dias, preferentemente durante entre uma hora e cinco dias, mais preferentemente desde cinco horas a dois dias e ainda com maior preferência entre doze horas e um dia. A invenção também proporciona células IMP que foram carregadas ou transfetadas com um agente tal como discutido anteriormente. Tais células IMP podem usar-se nas concretizações terapêuticas da invenção.

Em algumas concretizações, podem recuperar-se MC a partir de um doente, convertendo-as em células IMP usando a invenção, carregadas ou transfetadas in vitro e seguidamente devolvidas ao mesmo doente. Em tais situações, as células IMP utilizadas na invenção serão células autólogas e completamente compatíveis com o doente. Num caso preferido, as células usadas na invenção sao recuperadas a partir de um doente e utilizadas ex vivo e subsequentemente devolvidas ao mesmo doente.

Composições farmacêuticas e administração A invenção proporciona adicionalmente uma composição farmacêutica compreendendo uma célula IMP da invenção ou uma população da invenção em combinação com um transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável, (ii) um ou mais lipossomas e/ou (iii) uma ou mais microbolhas. A composição pode compreender (i) ; (ii) ; (iii) ; (i) e (ii) ; (i) e (iii) ; (ii) e (iii); ou (i), (ii) e (iii). A célula IMP ou população estão preferentemente contidas no um ou mais lipossomas e/ou na uma ou mais microbolhas. Pode encontrar-se presente qualquer número de lipossomas e/ou microbolhas. Qualquer dos números discutidos anteriormente com referência à população da invenção são iqualmente aplicáveis aos lipossomas e/ou microbolhas. Um lipossoma ou microbolha pode conter uma célula IMP ou mais de uma célula IMP. A composição pode compreender qualquer das células IMP ou populações aqui mencionadas e, em algumas concretizações, as moléculas de ácido nucleico, vetores ou vírus aqui descritos. A invenção proporciona um método para reparar um tecido danificado num doente compreendendo administrar ao doente uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica da invenção. Qualquer das concretizações terapêuticas discutidas anteriormente se aplica igualmente a esta concretização.

As várias composições da invenção podem ser formuladas usando qualquer método adequado. A formulação de células com transportadores e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis padrão pode ser efetuada usando métodos de rotina da especialidade farmacêutica. A natureza precisa de uma formulação dependerá de vários fatores incluindo das células a serem administradas e da via de administração pretendida. Descrevem-se exaustivamente tipos de formulações adequados em Remington's Pharmaceutical Sciences, 19a edição, Mack Publishing Company, Eastern Pennsylvania, EUA.

As células podem ser administradas por qualquer via. As vias adequadas incluem as vias intravenosa, intramuscular, intraperitoneal ou outras vias de administração adequadas, não se lhes limitando. Caso o tecido danificado seja tecido cardíaco, as células podem ser administradas pela via endomiocárdica, epimiocárdica, intraventicular, intracoronária, retrógrada no seio coronário, intra-arterial, intrapericárdica ou intravenosa. Caso o tecido danificado seja o osso, as células podem ser administradas pela via intraóssea ou no local de lesão, tal como uma fratura ou doença. Caso o tecido danificado seja cartilagem, tendão, ligamento, tecido de fígado, rim ou pulmão, as células podem ser administradas diretamente no tecido. Caso o tecido danificado seja tecido pulmonar, as células podem ser introduzidas pela via intrapulmonar. Caso o tecido danificado seja do fígado ou do pulmão, as células podem ser introduzidas através de uma via intraperitoneal. De preferência, as células são administradas intravenosamente.

As composições podem ser preparadas conjuntamente com um transportador ou diluente fisiologicamente aceitável. Tipicamente, tais composições são preparadas como suspensões líquidas de células. As células podem ser misturadas com um excipiente que é farmaceuticamente aceitável e compatível com o ingrediente ativo. Os excipientes adequados são, por exemplo, água, soro fisiológico, dextrose, glicerol, semelhantes e suas combinações.

Adicionalmente, caso pretendido, as composições farmacêuticas da invenção podem conter pequenas quantidades de substâncias auxiliares, tais como agentes de molhagem ou emulsionantes, agentes de tamponação de pH e/ou adjuvantes que melhorem a eficácia. Preferentemente, a composição compreende albumina sérica humana.

Um transportador ou diluente adequado é Plasma-Lyte A®. Este é uma solução estéril, não pirogénica e isotónica para administração intravenosa. Cada 100 mL contêm 526 mg de cloreto de sódio, USP (NaCl); 502 mg de gluconato de sódio (C6HllNa07); 368 mg de acetato de sódio tri-hidratado, USP (C2H3Na02·3H20); 37 mg de cloreto de potássio, USP (KC1); e 30 mg de cloreto de magnésio, USP (MgC12*6H20). Não contém quaisquer agentes antimicrobianos. O pH é ajustado com hidróxido de sódio. O pH é de 7,4 (6,5 a 8,0).

As células IMP podem estar contidas no um ou mais lipossomas e/ou na uma ou mais microbolhas. São conhecidos na especialidade lipossomas adequados. Os lipossomas adequados são divulgados, por exemplo, em Akbarzadeh et al. Nanoscale Research Letters 2013, 8:102 e Meghana et al. International Journal Of Pharmaceutical And Chemical Sciences, 2012, 1(1): 1-10. Discutem-se seguidamente lípidos adequados para uso na formação de lipossomas relativamente a microbolhas.

As microbolhas, a sua formação e usos biomédicos são conhecidos na especialidade (e.g. Sirsi e Borden, Bubble Sci Eng Technol. novembro de 2009; 1(1-2): 3-17). As microbolhas são bolhas com diâmetros inferiores a um milímetro e diâmetros superiores a um micrómetro. A microbolha usada na presente invenção tem um diâmetro, de preferência, igual ou inferior a 8 pm, tal como um diâmetro igual ou inferior a 7 pm, diâmetro igual ou inferior a 6 pm, diâmetro igual ou inferior a 4 pm, diâmetro igual ou inferior a 3 pm ou diâmetro igual ou inferior a 2 pm.

As microbolhas podem ser formadas a partir de qualquer substância. A composição geral de uma microbolha é um núcleo de gás estabilizado por um invólucro. O núcleo de gás pode compreender ar ou um gás pesado, tal como perfluorocarbono, azoto ou perfluoropropano. Os gases pesados são menos solúveis em água e, portanto, é menos provável que vazem da microbolha, levando a dissolução da microbolha. As microbolhas com núcleos de gases pesados duram tipicamente mais tempo em circulação. A invólucro pode ser formado a partir de qualquer material. 0 material de invólucro compreende preferentemente uma proteína, um tensioativo, um lípido, um polímero ou uma sua mistura.

As proteínas adequadas incluem albumina, lisozima e avidina, não se lhes limitando. As proteínas integrantes do invólucro podem ser reticuladas quimicamente, por exemplo por ligação cisteína-cisteína. São conhecidas outras reticulações na especialidade.

Os tensioativos adequados incluem monopalmitato de sorbitano (tal como SPAN-40), detergentes de polissorbato (tal como TWEEN-40), misturas de SPAN-4 0 e TWEEN-4 0 e estearato de sacarose (monoéster e diéster), não se lhes limitando.

Os polímeros adequados incluem polímeros de alginato, polímeros de duplo éster de etilideno, o copolímero poli(D,L-lactídeo-co-glicolídeo) (PLGA), poli(vinilálcool) (PVA), o copolímero poliperfluoro-octiloxicaronil-poli(ácido láctico) (PLA-PFO) e outros copolímeros em bloco, não se lhes limitando. Os copolímeros em bloco são materiais poliméricos nos quais duas ou mais subunidades de monómeros são polimerizadas conjuntamente para criar uma única cadeia polimérica. Os copolímeros em bloco tipicamente têm propriedades que são contribuições de cada subunidade de monómero. No entanto um copolímero em bloco pode apresentar propriedades únicas que os polímeros formados pelas subunidades individuais não apresentam. Os copolímeros em bloco podem ser concebidos de modo que uma das subunidades de monómero é hidrofóbica (i.e., lipofílica), enquanto a(s) outra(s) subunidade(s) é(são) hidrofílicas em meio aquosos. Neste caso, o copolímero em bloco pode apresentar propriedades anfifílicas e pode formar uma estrutura que mimetiza uma membrana biológica. 0 copolímero em bloco pode ser um dibloco (consistindo de duas subunidades de monómero), mas também pode ser construído a partir de mais do que duas subunidades de monómero para formar arranjos mais complexos que se comportam como anfifílicos. 0 copolímero pode ser um copolímero em tribloco, tetrabloco ou pentabloco. Os copolímeros em bloco também podem ser construídos a partir de subunidades que não estão classificadas como submateriais lipídicos; por exemplo um polímero hidrofóbico pode ser preparado a partir de siloxano ou de outros monómeros não baseados em hidrocarbonetos. A subsecção hidrofílica do copolímero em bloco também pode possuir propriedades de baixa ligação de proteínas, o que permite a criação de uma membrana que é altamente resistente quando exposta a amostras biológicas em bruto. Esta unidade do grupo de cabeça também pode ser derivada de grupos de cabeça lipídicos não clássicos.

Pode usar-se qualquer material lipídico que forma uma microbolha. A composição lipídica é selecionada de modo a que a microbolha tenha as propriedades necessárias, tais como carga superficial, densidade de empacotamento ou propriedades mecânicas. A composição lipídica pode compreender um ou mais lipidos diferentes. Por exemplo, a composição lipídica pode conter até 100 lipidos. A composição lipídica contém preferentemente 1 a 10 lipidos. A composição lipídica pode compreender lipidos de ocorrência natural e/ou lipidos artificiais. O lipido tipicamente compreende um grupo de cabeça, uma parte interfacial e dois grupos de cauda hidrofóbica que podem ser iguais ou diferentes. Os grupos de cabeça adequados incluem grupos de cabeça neutros, tais como diacilglicerídeos (DG) e ceramidas (CM); grupos de cabeça iões zwitter, tais como fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE) e esfingomielina (SM); grupos de cabeça carregados negativamente, tais como fosfatidilglicerol (PG); fosfatidilserina (PS), fosfatidilinositol (PI), ácido fosfático (PA) e cardiolipina (CA); e grupos de cabeça carregados positivamente, tais como trimetilamónio-Propano (TAP), não se lhes limitando. As partes interfaciais adequadas incluem partes interfaciais de ocorrência natural, tais como partes baseadas em glicerol ou baseadas em ceramida, não se lhes limitando. Os grupos de cauda hidrofóbica adequados incluem cadeias de hidrocarbonetos saturados, tais como ácido láurico (ácido n-dodecanólico), ácido mirístico (ácido n-tetradeconónico), ácido palmítico (ácido n-hexadecanóico), ácido esteárico (ácido n-octadecanóico) e araquídico (n-eicosanóico); cadeias de hidrocarbonetos insaturados, tais como ácido oleico (cis-9-octadecanóico); e cadeias de hidrocarbonetos ramificados, tais como fitanoilo, não se lhes limitando. O comprimento das cadeias e a posição e número de ligações duplas nas cadeias de hidrocarbonetos insaturados pode variar. O comprimento das cadeias e a posição e número de ramificações, tais como grupos metilo, nas cadeias de hidrocarbonetos ramificados pode variar. Os grupos de cauda hidrofóbica podem estar ligados à parte interfacial como um éter ou um éster.

Os lipidos também podem ser modificados quimicamente. O grupo de cabeça ou o grupo de cauda dos lipidos podem ser modificados quimicamente. Os lipidos adequados cujos grupos de cabeça foram modificados quimicamente incluem lipidos modificados com PEG, tais como 1,2-diacil-sn-Glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenoglicol)-2000] ; lípidos com PEG funcionalizados, tais como 1,2-diestearoil-sn-glicero- 3-fosfoetanolamina-N-[biotinil(polietilenoglicol)2000]; e lipidos modificados para conjugação, tais como 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(succinilo) e 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(biotinilo), não se lhes limitando. Os lipidos adequados cujos grupos de cauda foram modificados quimicamente incluem lipidos polimerizáveis, tal como 1,2-bis(10,12-tricosadi-inoil)-sn-glicero-3-fosfocolina; lipidos fluorinados, tal como l-palmitoil-2-(16— fluoropalmitoil)-sn-glicero-3-fosfocolina; lipidos deuterados, tal como 1,2-dipalmitoil-D62-sn-glicero-3-fosfocolina; e lipidos ligados com éter, tal como 1,2-di-O-fitanil-sn-glicero-3-fosfocolina, não se lhes limitando. Os lipidos podem ser modificados quimicamente ou funcionalizados para facilitar o acoplamento dos ligandos, recetores para anticorpos, tal como discutido anteriormente. A composição lipidica pode compreender um ou mais aditivos que afetarão as propriedades da microbolha. Os aditivos adequados incluem ácidos gordos, tais como ácido palmitico, ácido miristico e ácido oleico; álcoois gordos, tais como álcool palmitico, álcool miristico e álcool oleico; esteróis, tais como colesterol, ergosterol, lanosterol, sitosterol e estigmasterol; lisofosfolipidos, tais como l-acil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfocolina; e ceramidas, não se lhes limitando. O invólucro da microbolha é preferentemente formado a partir de um fosfolipido. Os fosfolipidos adequados são conhecidos na especialidade.

Existem várias formulações comercialmente disponíveis de microbolhas de invólucro de lípido, tais como Definity (Lantheus Medical Imaging) e Sonovue® (Bracco Diagnostics). A microbolha também pode ser formada a partir de um híbrido de polímero-tensioativo que envolve a formação de invólucros em multicamada de polieletrólito (PEM) numa microbolha preformada. A microbolha preformada é revestida com uma camada de tensioativo carregado ou proteína, que serve como um substrato para a deposição de PEM. A técnica de montagem camada-a-camada é usada para adsorver sequencialmente poli-iões de cargas opostas no invólucro da microbolha. Por exemplo, podem depositar-se PEM em microbolhas usando poli (cloridrato de alilamina) (PAH) e poli(sulfonato de estireno) (PSS) como par de poli-ião. Também se desenvolveram microbolhas com PEM com o fosfolípido contendo o grupo de cabeça catiónico trimetilamónio propano (TAP) como camada subjacente e ADN e poli (L-lisina) (PLL) como o par de poli-ião . A microbolha é tipicamente formada proporcionando uma interface entre um gás e um material de invólucro da microbolha. Pode usar-se qualquer dos materiais discutidos anteriormente. Alguns dos materiais, tais como os fosfolipidos, formam microbolhas espontaneamente. Os fosfolipidos sofrem automontagem formando uma microbolha. Outros materiais necessitam de sonicação da interface, i.e. da aplicação de energia sonora ou de ondas sonoras à interface. Usam-se tipicamente ondas ultrassónicas. São conhecidos métodos adequados na especialidade para sonicação. A microbolha pode ser carregada com as células IMP após formação da microbolha ou durante a formação da microbolha.

As células IMP são administradas de uma forma compatível com a formulação de dosagem e numa quantidade que será eficaz terapeuticamente. A quantidade a ser administrada depende do indivíduo a ser tratado, da capacidade do sistema imunitário do indivíduo e do grau de reparação pretendido. As quantidades exatas das células IMP necessárias para administração podem depender da opinião do médico assistente e podem ser específicas para cada indivíduo.

Pode administrar-se qualquer número adequado de células a um indivíduo. Por exemplo, podem administrar-se pelo menos, ou cerca de 0,2 x 106, 0,25 x 106, 0,5 x 106, 1,5 x 106, 4,0 x 106 ou 5,0 x 106 células por kg de doente. Por exemplo, podem administrar-se pelo menos, ou cerca de 105, ΙΟ6, ΙΟ7, ΙΟ8, 109 células. Como um guia, o número de células da invenção a ser administrado podem ser de 105 a 109, preferentemente de 106 a 108. Tipicamente, podem administrar-se a cada doente até 2 x 108 células IMP. Podem administrar-se qualquer dos números específicos discutidos anteriormente relativamente às populações da invenção. Nos casos em que as células são administradas ou se encontram presentes, o meio de cultura pode estar presente para facilitar a sobrevivência das células. Em alguns casos, podem proporcionar-se as células da invenção em alíquotas congeladas e podem estar presentes substâncias, tais como DMSO, para facilitar a sobrevivência durante o congelamento. Tais células congeladas serão tipicamente descongeladas e seguidamente colocadas num tampão ou meio quer para manutenção, quer para administração.

Composição híbrida

Uma ou mais células IMP da invenção podem fazer parte de uma composição híbrida, tal como divulgada no pedido de patente internacional N2 PCT/GB2015/051672 (WO 2015/189586) e são preferentemente administradas a um doente como parte de tal composição. Em particular, a invenção proporciona uma composição híbrida, que compreende: (a) uma ou mais fibras biocompatíveis; (b) uma ou mais células IMP da invenção; e (c) um ou mais componentes biocompatíveis que (i) se ligam a uma ou mais células terapêuticas, à uma ou mais fibras e/ou que incorporam a uma ou mais células terapêuticas com a uma ou mais fibras e/ou (ii) são capazes de ligar a composição a um tecido. A composição híbrida da invenção compreende uma ou mais fibras biocompatíveis. Uma fibra é biocompatível caso não cause quaisquer reações adversas ou efeitos secundários quando em contacto com um tecido danificado.

Pode estar presente na composição qualquer número de fibras biocompatíveis. A composição pode compreender apenas uma fibra. A composição tipicamente compreende mais do que uma fibra, tal como pelo menos 2, pelo menos 5, pelo menos 10, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 100, pelo menos 200, pelo menos 500 fibras, pelo menos 1000 fibras ou ainda mais fibras. São conhecidas na especialidade fibras biocompatíveis adequadas. A uma ou mais fibras biocompatíveis podem ser naturais ou sintéticas. As fibras biocompatíveis preferidas incluem fibras de celulose, fibras de colagénio, fibras de colagénio-glicosaminoglicano, fibras de gelatina, fibras de fibroína de seda, uma ou mais fibras de fibrina, fibras de quitosano, fibras de amido, fibras de alginato, fibras de hialuronano, fibras de poloxâmero ou uma sua combinação, não se lhes limitando. 0 glicosaminoglicano é preferentemente condroitina. A celulose é preferentemente carboximetilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose ou metilcelulose. 0 poloxâmero é preferentemente ácido plurónico, opcionalmente Pluronic F-127.

Caso esteja presente mais do que uma fibra na composição, a população das fibras pode ser homogénea. Por outras palavras, todas as fibras na população podem ser o mesmo tipo de fibra, e.g. fibras de celulose. Alternativamente, a população de fibras pode ser heterogénea. Por outras palavras, a população de fibras pode conter diferentes tipos de fibras, tais como fibras de celulose e fibras de colagénio. A uma ou mais fibras podem ter qualquer comprimento. A uma ou mais fibras têm preferentemente aproximadamente o comprimento igual à profundidade do dano no tecido a ser tratado usando a composição. 0 comprimento de uma ou mais fibras é preferentemente concebido de modo que a composição possa penetrar num tecido danificado a uma profundidade indicada. A uma ou mais fibras podem ter qualquer comprimento. 0 limite inferior do comprimento da uma ou mais fibras é tipicamente determinado pelo diâmetro da uma ou mais células terapêuticas. Os comprimentos adequados incluem pelo menos 1 pm de comprimento, pelo menos 10 pm de comprimento, pelo menos 100 pm de comprimento, pelo menos 500 pm de comprimento, pelo menos 1 mm de comprimento, pelo menos 10 mm (1 cm) de comprimento, pelo menos 100 mm (10 cm) de comprimento, pelo menos 500 mm (50 cm) de comprimento ou pelo menos 1000 mm (100 cm ou 1 m) de comprimento, não se lhes limitando. A uma ou mais fibras podem ser ainda mais compridas. Por exemplo, a uma ou mais fibras podem ter até 5 m ou 10 m de comprimento, por exemplo caso sejam usadas para reparar danos ao longo do trato intestinal humano ou mesmo mais compridas caso sejam usadas em animais maiores, tais como cavalos. 0 comprimento da uma ou mais fibras é tipicamente determinado pelo seu uso pretendido e/ou pela sua capacidade de serem manipuladas, por exemplo por um cirurgião, por um robô ou através de outros meios, tal como magneticamente. A uma ou mais fibras podem ser carregadas. A uma ou mais fibras são preferentemente carregadas positivamente. A uma ou mais fibras são preferentemente carregadas negativamente. A uma ou mais fibras podem ser magnéticas. A uma ou mais fibras podem ser modificadas para incluir um ou mais átomos ou grupos magnéticos. Tal permite dirigir a composição ao alvo magneticamente. Os átomos ou grupos magnéticos podem ser paramagnéticos ou superparamagnéticos. Os átomos ou grupos adequados incluem átomos de ouro, átomos de ferro, átomos de cobalto, átomos de níquel e grupos de quelatação de metal, tais como ácido nitrilotriacético, contendo qualquer destes átomos, não se lhes limitando. 0 grupo de quelatação de metal pode conter, por exemplo, um grupo selecionado de -C(=0)0-, -c-o-c-, -C(=0), -NH-, -C(=0)-NH, -C (=0)-CH2-I, -S(=0)2- e -S-. A composição também compreende um ou mais componentes biocompativeis. 0 um ou mais componentes biocompatíveis (i) ligam a uma ou mais células terapêuticas à uma ou mais fibras e/ou incorporam a uma ou mais células terapêuticas com a uma ou mais fibras e/ou (ii) são capazes de ligar a composição a um tecido. 0 um ou mais componentes biocompativeis podem (a) ligar a uma ou mais células terapêuticas à uma ou mais fibras, (b) incorporar a uma ou mais células terapêuticas com a uma ou mais fibras, (c) são capazes de ligar a composição a um tecido, (d) ligar a uma ou mais células terapêuticas à uma ou mais fibras e incorporar a uma ou mais células terapêuticas com a uma ou mais fibras, (e) ligar a uma ou mais células terapêuticas à uma ou mais fibras e são capazes de ligar a composição a um tecido, (f) incorporar a uma ou mais células terapêuticas com a uma ou mais fibras e são capazes de ligar a composição a um tecido ou (g) ligar a uma ou mais células terapêuticas à uma ou mais fibras, incorporar a uma ou mais células terapêuticas com a uma ou mais fibras e são capazes de ligar a composição a um tecido.

Um componente é biocompatível caso não cause quaisquer reações adversas ou efeitos secundários quando em contacto com um tecido danificado.

Pode estar presente qualquer número de componentes biocompativeis na composição. A composição tipicamente compreende apenas um componente ou dois componentes. A composição pode compreender mais do que dois componentes, tais como pelo menos 3, pelo menos 5, pelo menos 10, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50 componentes ou ainda mais componentes. O um ou mais componentes biocompativeis preferentemente compreendem um adesivo biocompatível que liga a uma ou mais células terapêuticas à uma ou mais fibras. O adesivo biocompatível pode ligar a uma ou mais células terapêuticas (a) à superfície da uma ou mais fibras, (b) ao interior da uma ou mais fibras ou (c) tanto à superfície como ao interior da uma ou mais fibras. O adesivo biocompatível pode ser natural ou sintético. São conhecidos na especialidade adesivos biocompatíveis adequados. Os adesivos adequados incluem fibrina, gel de fibrina, integrina, gel de integrina, caderina e gel de caderina, não se lhes limitando. O um ou mais componentes biocompatíveis preferentemente compreendem um gel biocompatível que incorpora a uma ou mais células terapêuticas com a uma ou mais fibras. São conhecidos na especialidade géis biocompatíveis adequados. O gel biocompatível pode ser natural ou sintético. Os géis biocompatíveis preferidos incluem um gel de celulose, um gel de colagénio, um gel de gelatina, um gel de fibrina, um gel de quitosano, um gel de amido, um gel de alginato, um gel de hialuronano, um gel de agarose, um gel de poloxâmero ou uma sua combinação, não se lhes limitando. O gel de celulose pode ser formado a partir de qualquer das celuloses discutidas anteriormente. A concentração de polímero de celulose é preferentemente desde cerca de 1,5% (p/p) a cerca de 4,0% (p/p), tal como desde cerca de 2,0% (p/p) a cerca de 3,0% (p/p). O polímero de celulose preferentemente tem um peso molecular desde cerca de 450 000 a cerca de 4 000 000, tal como desde cerca de 500 000 a cerca de 3 500 000, desde cerca de 500 000 a cerca de 3 000 000 ou desde cerca de 750 000 a cerca de 2 500 000 ou desde cerca de 1 000 000 a cerca de 2 000 000. O gel de poloxâmero é preferentemente um gel de ácido plurónico, opcionalmente um gel de Pluronic F-127. O adesivo e/ou gel preferentemente tem uma viscosidade na gama de 1 000 a 500 000 mPa*s (cps) à temperatura ambiente, tal como desde cerca de 1 500 a cerca de 450 000 mPa«s à temperatura ambiente, desde cerca de 2 000 a cerca de 400 000 mPa*s à temperatura ambiente, desde cerca de 2 500 a cerca de 350 000 mPa*s à temperatura ambiente, desde cerca de 5 000 a cerca de 300 000 mPa*s à temperatura ambiente, desde cerca de 10 000 a cerca de 250 000 mPa*s à temperatura ambiente, desde cerca de 50 000 a cerca de 200 000 mPa*s à temperatura ambiente ou desde cerca de 50 000 a cerca de 150 000 mPa*s à temperatura ambiente. A viscosidade é uma medida da resistência do adesivo e/ou gel a serem deformados por tensão de cisalhamento ou tensão de tração. A viscosidade pode ser medida usando qualquer método conhecido na especialidade. Os métodos adequados incluem o uso de um viscosímetro ou de um reómetro, não se lhes limitando. A temperatura ambiente é tipicamente desde cerca de 18 °C a cerca de 25 °C, tal como desde cerca de 19 °C a cerca de 24 °C ou desde cerca de 20 °C a cerca de 23 °C ou desde cerca de 21 °C a cerca de 22 °C. A temperatura ambiente é preferentemente qualquer de 18 °C, 19 °C, 20 °C, 21 °C, 22 °C, 23 °C, 24 °C e 25 °C. A viscosidade é com a maior preferência medida a 25 °C. O um ou mais componentes biocompatíveis preferentemente compreende um adesivo biocompatível que liga a uma ou mais células terapêuticas à uma ou mais fibras e um gel biocompatível que incorpora a uma ou mais células terapêuticas com a uma ou mais fibras. Por exemplo, a composição pode compreender um gel de fibrina que liga a uma ou mais células terapêuticas à uma ou mais fibras e um gel de celulose que incorpora a uma ou mais células terapêuticas com a uma ou mais fibras.

Em qualquer das concretizações discutidas anteriormente, o adesivo biocompatível e/ou o gel biocompatível preferentemente compreende lisado plaquetário. Por exemplo, o adesivo e/ou o gel pode ser um gel de lisado plaquetário. 0 lisado plaquetário refere-se à combinação de fatores de crescimento naturais contidos em plaquetas que foram libertados através da lise dessas plaquetas. A lise pode ser efetuada através de meios químicos (i.e. CaCl2) , meios osmóticos (uso de H20 destilada) ou através de procedimentos de congelamento/descongelamento. 0 lisado plaquetário pode ser derivado de sangue completo, tal como descrito em patente U.S. N2 5 198 357. 0 lisado plaquetário é preferentemente preparado tal como descrito em PCT/GB12/052911 (publicado como WO 2013/076507) . Por exemplo, pode ser preparado sujeitando uma população de plaquetas a pelo menos um ciclo de congelamento-descongelamento, em que a parte de congelamento de cada ciclo é efetuada a uma temperatura inferior ou igual a -78 °C. O adesivo e/ou gel preferentemente compreende (a) lisado plaquetário, (b) pelo menos um polímero farmaceuticamente aceitável e (c) pelo menos uma espécie química carregada positivamente farmaceuticamente aceitável selecionada do grupo que consiste de lisina, arginina, histidina, ácido aspártico, ácido glutâmico, alanina, metionina, prolina, serina, asparagina, cisteína, poliaminoácidos, protamina, aminoguanidina, iões zinco e iões magnésio, em que a composição é um gel aquoso com uma viscosidade na gama de 1 000 a 500 000 mPa*s (cps) à temperatura ambiente. O polímero farmaceuticamente aceitável é preferentemente celulose ou um poloxâmero. Pode ser qualquer das celuloses e poloxâmeros discutidos anteriormente. O lisado plaquetário é preferentemente lisado plaquetário humano. O lisado plaquetário é discutido mais detalhadamente anteriormente. A composição híbrida pode estar contida no um ou mais lipossomas ou na uma ou mais microbolhas. Tais estruturas são conhecidas na especialidade.

Os seguintes exemplos ilustram a invenção.

Exemplos

Exemplo 1 - Isolamento de medula óssea e sangue periférico e expansão de células IMP

Diluiu-se uma amostra de medula óssea com solução salina tamponada de Hank e colocou-se uma camada em cima de Ficoll-Paque para isolar células mononucleares (MC) por centrifugação. As MC foram então ressuspensas em solução salina tamponada de Hank e contadas usando um ensaio de exclusão com azul de tripano a 0,4% para avaliar a viabilidade celular. As células foram inoculadas em frascos T25 (em 5 ml de meio de cultura, aMEM, GlutaMAX, penicilina-estreptomicina, lisado plaquetário, heparina) e incubadas a 37 °C, C02 a 5%. No dia 8 mudou-se o meio. As células foram monitorizadas diariamente para observação de células do tipo IMP e, caso presentes, recolhidas usando solução de dissociação celular, de acordo com as instruções do fabricante, e subcultivadas no mesmo meio anterior. As células foram crioconservadas na passagem 2 em meio de cultura suplementado com dimetilsulfóxido a 10%, a -80 °C e armazenadas em azoto líquido para utilização posterior.

Exemplo 2 - Análise por HT-FACS A análise por separação celular ativada por fluorescência de alto rendimento (HT-FACS) é uma plataforma de rastreio de alto rendimento que pode caracterizar rapidamente o fenótipo de superfície celular de células em suspensão, com mais de 370 marcadores de superfície celular atualmente no painel. Esta plataforma teve uma validação extensa e foi efetuada em muitos tipos de tecidos e células humanos. O painel consiste de 375 anticorpos específicos de superfície celular humana dispostos em placas de 96 poços.

O objetivo foi determinar o perfil de expressão de antigénio de superfície de IMP humanas da invenção e MSC humanas obtidas de Lonza®. A plataforma de FACS de elevado rendimento (HT-FACS) permite o rastreio de 375 antigénios de superfície.

Inoculou-se um frasquinho de PB-MSC (lxlO6 células/ml) crioconservadas, num frasco T75 cm2, contendo 15 mL de meio CTL (37 °C, C02 a 5%) . Cultivaram-se as células até confluência de 80-90%, mudando o meio cada 2-3 dias. Para passagem das células, removeu-se o meio e lavaram-se as células duas vezes com PBS. As células foram tratadas com 3 ml de tripsina a 0,25% até descolarem. Adicionou-se oito ml de meio para inativar a tripsina e recolheram-se as células por centrifugação a 400 g durante 5 min. Ressuspenderam-se as células em 5 ml de meio e inocularam-se num frasco T175 cm2 contendo 30 mL de meio CTL (37 °C, C02 a 5%). Foram necessários entre 8 a 10 frascos T175 cm2 a 80-90% de confluência para recolher 20-30 milhões de células (na passagem 4) para o rastreio por HT-FACS. De modo a obter um número suficiente de "eventos" de citometria de fluxo por anticorpo, foi ótimo aproximadamente 20 milhões de células viáveis. Para recolher as células, removeu-se o meio e lavaram-se as células duas vezes com PBS. Trataram-se as células com 5 ml de tripsina a 0,25% até descolarem. Adicionou-se meio (8 ml) para inativar a tripsina e recolher as células. As células foram centrifugadas a 400 g durante 5 min. Os sedimentos celulares foram ressuspensos (suspensão de célula única) em 5 ml de HBSS total (solução salina equilibrada de Hank sem cálcio/magnésio, suplementada com EDTA 2 mM e BSA a 1%). Usou-se uma alíquota da amostra (10 μΐ) para determinar o número total de células viáveis por utilização de corante de exclusão (azul de tripano a 0,2%) .

Carregou-se 100 μΐ de amostra para cada poço (cerca de 40 000 células por poço, assegurando a recolha de 10 000 a 20 000 eventos em FACS). As amostras foram processadas num BD FACSDiva atualizado com um BD High Throughput Sampler (amostrador automatizado). A análise dos dados de citometria de fluxo foi efetuada usando o utilitário FlowJo. Os resultados foram obtidos como gráficos e uma folha de Excel contendo a percentagem de células positivas e a intensidade de fluorescência média (MFI) para cada anticorpo.

Tabela 1 - Resultados da análise de HT-FACS

Exemplo 3 - Ensaio de luminex

Usou-se um ensaio de luminex para quantificar diferentes citocinas no meio condicionado de células Lonza e de culturas de células IMP. Os dados apresentam-se como pg/yg de ARN, de modo a padronizar os dados relevantes ao número de células em cultura.

Lisboa, 2017-04-26

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Célula progenitora imunomoduladora (IMP), em que a célula expressa, à sua superfície, níveis detetáveis de MIC A/B, CD304 (neuropilina 1) , CD178 (ligando de FAS), CD289 (recetor do tipo Toll 9) , CD363 (recetor de esfingosina-1- fosfato 1), CD99, CD181 (recetor de quimiocina CXC de tipo 1; CXCR1), recetor do fator de crescimento epidérmico (EGF-R), CXCR2 e CD12 6.
2. Célula IMP de acordo com a reivindicação 1, em que: (a) a célula IMP é capaz de migrar, aderir, proliferar, tendo efeitos anti-inflamatórios e/ou promovendo angiogénese num tecido danificado específico, num doente; (b) a célula IMP é capaz de transmigrar através do endotélio vascular para um tecido danificado específico, num doente; (c) a célula IMP é capaz de migrar, aderir, proliferar, tendo efeitos anti-inflamatórios e/ou promovendo angiogénese em tecido danificado cardíaco, ósseo, de cartilagem, de tendão, de ligamento, do fígado, do rim ou do pulmão, num doente; ou (d) a célula IMP é capaz de transmigrar através do endotélio vascular para tecido danificado cardíaco, ósseo, de cartilagem, de tendão, de ligamento, do fígado, do rim ou do pulmão, num doente.
3. Célula IMP de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que: (a) a célula IMP é capaz de se diferenciar para uma célula mesodérmica in vitro; (b) a célula IMP é autóloga ou alogénica; e/ou (c) a célula IMP é carregada ou transfetada in vitro ou ex vivo com um agente terapêutico e/ou de diagnóstico.
4. População de duas ou mais células IMP de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores.
5. População de células proqenitoras imunomoduladoras (IMP) , em que (i) pelo menos 90% das células na população expressa, à sua superfície, níveis detetáveis de MIC A/B, (ii) pelo menos 60% das células na população expressa, à sua superfície, níveis detetáveis de CD304 (neuropilina 1), (iii) pelo menos 45% das células na população expressa, à sua superfície, níveis detetáveis de CD 178 (liqando de FAS) , (iv) pelo menos 10% das células na população expressa, à sua superfície, níveis detetáveis de CD289 (recetor do tipo Toll 9), (v) pelo menos 15% da população expressa à sua superfície níveis detetáveis de CD363 (recetor de esfinqosina-l-fosfato D , (vi) pelo menos 20% das células na população expressa, à sua superfície, níveis detetáveis de CD99, (vii) pelo menos 80% das células na população expressa, à sua superfície, níveis detetáveis de CD181 (recetor de quimiocina C-X-C de tipo 1; CXCR1), (viii) pelo menos 30% das células na população expressa, à sua superfície, níveis detetáveis de recetor do fator de crescimento epidérmico (EGF-R), (xi) pelo menos 60% das células na população expressa, à sua superfície, níveis detetáveis de CXCR2 e (x) pelo menos 5% das células na população expressa, à sua superfície, níveis detetáveis de CD126.
6. População de acordo com a reivindicação 5, em que (a)(i) pelo menos 97% das células na população expressa, à sua superfície, níveis detetáveis de MIC A/B, (ii) pelo menos 65% das células na população expressa, à sua superfície, níveis detetáveis de CD304 (neuropilina 1), (iii) pelo menos 51% das células na população expressa, à sua superfície, níveis detetáveis de CD178 (ligando de FAS), (iv) pelo menos 11% das células na população expressa, à sua superfície, níveis detetáveis de CD289 (recetor do tipo Toll 9), (v) pelo menos 18% da população expressa, à sua superfície, níveis detetáveis de CD363 (recetor de esfingosina-l-fosfato 1), (vi) pelo menos 24% das células na população expressa, à sua superfície, níveis detetáveis de CD99, (vii) pelo menos 85% das células na população expressa níveis detetáveis de CD181 (CXCR1), (viii) pelo menos 33% das células na população expressa níveis detetáveis de recetor do fator de crescimento epidérmico (EGF-R) , (ix) pelo menos 68% das células na população expressa níveis detetáveis de CXCR2 e (x) pelo menos 7% das células na população expressa níveis detetáveis de CD 126; (b) pelo menos 90% das células na população expressa, à sua superfície, níveis detetáveis de um ou mais, ou todos, de CD10, CD111, CD267, CD47, CD273, CD51/CD61, CD49f, CD49d, CD146, CD55, CD340, CD91, Notch2, CD175s, CD82, CD49b, CD95, CD63, CD245, CD58, CD108, B2-microglobulina, CD155, CD298, CD44, CD4 9c, CD105, CD166, CD230, HLA-ABC, CD13, CD29, CD49e, CD59, CD73, CD81, CD90, CD98, CD147, CD151 e CD276; (c) pelo menos 80% das células na população expressa, à sua superfície, níveis detetáveis de um ou mais, ou todos, de CD156b, CD61, CD202b, CD130, CD148, CD288, CD337, SSEA-4, CD349 e CD140b; (d) pelo menos 70% das células na população expressa, à sua superfície, níveis detetáveis de um ou mais, ou todos, de CD318, CD351, CD286, CD46, CD119 e CD132; (e) 1% ou menos das células na população expressa, à sua superfície, níveis detetáveis de um ou mais, ou todos, de CD72, CD133, CD192, CD207, CD144, CD41b, FMC7, CD75, CD3e, CD37, CD158a, CDl72b, CD282, CD100, CD94, CD39, CD66b, CD158b, CD40, CD35, CD15, PAC-1, CLIP, CD48, CD278, CD5, CD103, CD209, CD3, CD197, HLA-DM, CD20, CD74, CD87, CD129, CDw329, CD57, CD163, TPBG, CD206, CD243 (BD), CD19, CD8, CD52, CD184, CD107b, CD138, CD7, CD5 0, HLA-DR, CDl58e2, CD64, DCIR, CD45, CLA, CD38, CD45RB, CD34, CD101, CD2, CD41a, CD69, CD136, CD62P, TCR alfa beta, CD16b, CDla, ITGB7, CD154, CD70, CDw218a, CD137, CD43, CD27, CD62L, CD30, CD36, CD150, CD66, CD212, CD177, CD142, CD167, CD352, CD42a, CD336, CD244, CD23, CD45RO, CD229, CD200, CD22, CDH6, CD28, CD18, CD21, CD335, CD131, CD32, CD157, CD165, CD107a, CDlb, CD332, CD180, CD65 e CD24; (f) a população tem as propriedades definidas na reivindicação 2 ou 3; e/ou (g) a população compreende pelo menos 5 000 células, pelo menos 50 000 células ou pelo menos 250 000 células.
7. Composição farmacêutica compreendendo (a) uma célula IMP de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou uma população de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6 e (b) um transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável, um ou mais lipossomas e/ou uma ou mais microbolhas.
8. Método de produzir uma população de células IMP de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, compreendendo (1) cultivar células mononucleares (MC) durante desde 15 a 25 dias num meio compreendendo lisado plaquetário, com oxigénio (02) a menos de 20% e sob condições que permitam que as células IMP adiram para induzir as MC a diferenciarem para células IMP e (ii) recolher e cultivar essas células IMP que têm um padrão de expressão tal como definido na reivindicação 1 e produzindo assim uma população de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6.
9. Método de acordo com a reivindicação 8, em que: (a) as MC são células mononucleares de sangue periférico (PBMC); e/ou (b) as MC são obtidas de um doente ou de um dador alogénico.
10. População de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6 ou uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 7 para uso num método para reparar um tecido danificado num doente ou tratar uma lesão ou doença cardíaca, óssea, da cartilagem, do tendão, do ligamento, do fígado, do rim ou do pulmão num doente.
11. População da reivindicação 10 para uso de acordo com a reivindicação 10, em que: (i) o tecido danificado é derivado da mesoderme; (ii) o tecido danificado é tecido cardíaco, ósseo, da cartilagem, do tendão, do ligamento, do fígado, do rim ou do pulmão; e/ou (iii) o tecido danificado é danificado por lesão ou doença; ou (i) a lesão ou doença cardíaca é selecionada de enfarte do miocárdio, hipertrofia ventricular esquerda, hipertrofia ventricular direita, êmbolos, insuficiência cardíaca, cardiopatia congénita, doença das válvulas cardíacas, arritmia e miocardite e/ou a população é produzida usando MC obtidas do doente ou de um dador alogénico; ou (ii) a lesão ou doença óssea é selecionada de fratura, fratura de Salter-Harris, fratura em "galho verde", obstrução óssea, craniossinostose, síndrome de Coffin-Lowry, fibrodisplasia ossificante progressiva, displasia fibrosa, doença de Fong (ou síndrome de unha-patela), hipofosfatasia, síndrome de Klippel-Feil, doença óssea metabólica, síndrome de unha-patela, osteoartrite, osteite deformante (ou doença óssea de Paget), osteite fibrosa cística (ou osteite fibrosa ou doença óssea de Von Recklinghausen), osteite púbica, osteite condensante, osteite condensante do ilíaco, osteocondrite dissecante, osteogénese imperfeita, osteomalácia, osteomielite, osteopenia, osteopetrose, osteoporose, osteonecrose, hiperostose porótica, hiperparatiroidismo primário, osteodistrofia renal, cancro ósseo, uma lesão óssea associada a cancro metastático, doença de Gorham Stout, hiperparatiroidismo primário, doença periodontal e descolamento assético das substituições de articulações e/ou a população é produzida usando MC obtidas do doente ou de um dador alogénico.
12. População da reivindicação 10 para uso de acordo com a reivindicação 10 ou 11, em que a população é produzida usando MC obtidas do doente ou de um dador alogénico. Lisboa, 2017-04-26