EA034083B1 - Иммуномодулирующие прогениторные (имп) клетки - Google Patents

Иммуномодулирующие прогениторные (имп) клетки Download PDF

Info

Publication number
EA034083B1
EA034083B1 EA201692254A EA201692254A EA034083B1 EA 034083 B1 EA034083 B1 EA 034083B1 EA 201692254 A EA201692254 A EA 201692254A EA 201692254 A EA201692254 A EA 201692254A EA 034083 B1 EA034083 B1 EA 034083B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
cells
uti
population
receptor
detectable amounts
Prior art date
Application number
EA201692254A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201692254A1 (ru
Inventor
Аджан Реджинальд
Мартин Джон Эванс
Сабена Султан
Original Assignee
Селл Терапи Лимитед
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Селл Терапи Лимитед filed Critical Селл Терапи Лимитед
Publication of EA201692254A1 publication Critical patent/EA201692254A1/ru
Publication of EA034083B1 publication Critical patent/EA034083B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0663—Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/18—Drugs for disorders of the endocrine system of the parathyroid hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/06—Antiarrhythmics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
    • C12N5/0633—Cells of secretory glands, e.g. parotid gland, salivary glands, sweat glands, lacrymal glands
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0665—Blood-borne mesenchymal stem cells, e.g. from umbilical cord blood
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/02—Atmosphere, e.g. low oxygen conditions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/70—Undefined extracts
    • C12N2500/80—Undefined extracts from animals
    • C12N2500/84—Undefined extracts from animals from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells
    • C12N2502/115—Platelets, megakaryocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
    • C12N2506/1353—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells from bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)

Abstract

Изобретение относится к иммуномодулирующим прогениторным (ИМП) клеткам и их применению в терапии.

Description

Область техники
Изобретение относится к иммуномодулирующим прогениторным (ИМП) клеткам и их применению в терапии.
Уровень техники
Мезодермальные клетки происходят из ряда тканей и выступают в качестве поддерживающей структуры для других типов клеток. Так, например, костный мозг состоит как из гемопоэтических клеток, так и из клеток мезенхимального происхождения. Ранее были описаны и охарактеризованы два основных типа мезенхимальных клеток, а именно: (i) мезенхимальные стволовые клетки (МСК) и их предшественники и (ii) мезенхимальные клетки-предшественники (МКП), обнаруженные в костном мозге. Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) представляют собой мультипотентные зрелые стволовые клетки. МСК дифференцируются с образованием различных специализированных клеток, присутствующих в скелетных тканях. Например, они могут дифференцироваться в клетки хряща (хондроциты), клетки кости (остеобласты) и клетки жировой ткани (адипоциты).
МСК применяют в различных способах лечения, таких как лечение возрастной макулярной дегенерации (ВМД) и инфаркта миокарда. После введения пациенту МСК, как правило, мигрируют (или возвращаются) к пораженной ткани и оказывают свое терапевтическое действие посредством паракринного сигналинга и способствуя выживанию, восстановлению и регенерации прилегающих клеток в указанной пораженной ткани.
Современные способы лечения, как правило, включают инфузию смеси субтипов МСК, некоторые из которых не осуществляют эффективной миграции к целевой ткани. Это влечет за собой необходимость применения высоких доз клеток, что может привести к нецелевым побочным эффектам и побочным эффектам, связанным с вводимым объемом. МСК, как правило, получают из костного мозга, и потому получение больших количеств клеток является затруднительным.
Краткое описание изобретения
Изобретение относится к новому типу клеток, который не был ранее идентифицирован или выделен, иммуномодулирующим прогениторным клеткам. Эти ИМП клетки достаточно обособлены и отличаются от МСК и МКП по своему составу, функциям и характеристикам, обеспечивающим повышенную иммуномодулирующую активность.
Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили новые иммуномодулирующие прогениторные (ИМП) клетки, имеющие специфичный паттерн экспрессии маркеров. В частности, ИМП клетки экспрессируют MIC А/В, CD304 (нейропилин 1), CD178 (лиганд FAS), CD289 (толл-подобный рецептор 9), CD363 (сфингозин-1-фосфатный рецептор 1), CD99, CD181 (С-Х-С-хемокиновый рецептор типа 1; CXCR1), рецептор эпидермального фактора роста (EGF-R), CXCR2 и CD126. ИМП клетка экспрессирует значительно большие количества указанных маркеров, чем мезенхимальная стволовая клетка (МСК). Указанные ИМП клетки согласно настоящему изобретению могут быть выделены из мононуклеарных клеток (МК), таких как МК периферической крови. Указанные ИМП клетки способны к эффективной миграции к пораженным тканям и их восстановлению. В частности, они способны к хоумингу, адгезии, трансмиграции, пролиферации, ангиогенному действию и паракринному сигналингу.
Соответственно, согласно настоящему изобретению предложена иммуномодулирующая прогениторная (ИМП) клетка, экспрессирющая детектируемые количества MIC А/В, CD304 (нейропилина 1), CD178 (лиганда FAS), CD289 (толл-подобного рецептора 9), CD363 (сфингозин-1-фосфатного рецептора 1), CD99, CD181 (С-Х-С-хемокинового рецептора типа 1; CXCR1), рецептора эпидермального фактора роста (EGF-R), CXCR2 и CD126.
Также согласно настоящему изобретению предложены популяция из двух или более ИМП клеток согласно настоящему изобретению;
популяция иммуномодулирующих прогениторных (ИМП) клеток, в которой:
(i) по меньшей мере 90% клеток популяции экспрессирует детектируемые количества MIC А/В, (ii) по меньшей мере 60% клеток популяции экспрессирует детектируемые количества CD304 (нейропилина 1), (iii) по меньшей мере 45% клеток популяции экспрессирует детектируемые количества CD178 (лиганда FAS), (iv) по меньшей мере 10% клеток популяции экспрессирует детектируемые количества CD289 (толл-подобного рецептора 9), (v) по меньшей мере 15% клеток популяции экспрессирует детектируемые количества CD363 (сфингозин-1-фосфатного рецептора 1), (vi) по меньшей мере 20% клеток популяции экспрессирует детектируемые количества CD99, (vii) по меньшей мере 80% клеток популяции экспрессирует детектируемые количества CD181 (СХ-С-хемокинового рецептора типа 1; CXCR1), (viii) по меньшей мере 30% клеток популяции экспрессирует детектируемые количества рецептора эпидермального фактора роста (EGF-R), (xi) по меньшей мере 60% клеток популяции экспрессирует детектируемые количества CXCR2 и (х) по меньшей мере 5% клеток популяции экспрессирует детектируемые количества CD126;
- 1 034083 фармацевтическая композиция, содержащая (а) ИМП клетку согласно настоящему изобретению и (b) фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель, одну или более липосом и/или один или более микропузырьков;
способ получения популяции ИМП клеток согласно изобретению, включающий (а) культивирование мононуклеарных клеток (МК) в условиях, при которых индуцируется дифференцировка указанных МК в ИМП клетки, и (b) отбор и культивирование тех ИМП клеток, которые имеют паттерн экспрессии, описанный выше, и, тем самым, получение популяции согласно настоящему изобретению;
способ восстановления пораженной ткани пациента, включающий введение указанному пациенту популяции согласно настоящему изобретению или фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению, при этом указанная популяция или композиция содержит терапевтически эффективное количество клеток, и, тем самым, лечение указанной пораженной ткани пациента;
популяция согласно настоящему изобретению или фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению для применения в способе восстановления пораженной ткани пациента; и популяция согласно настоящему изобретению или фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению для применения в способе лечения повреждения или заболевания сердца, кости, хряща, сухожилия, связки, печени, почки или легкого пациента.
Подробное описание изобретения
Следует понимать, что различные варианты применения описанных в настоящем изобретении продуктов и способов могут быть адаптированы для конкретных нужд в данной области техники. Следует также понимать, что терминология, использованная в настоящем документе, служит исключительно в целях описания конкретных вариантов реализации настоящего изобретения и не предназначена для ограничения.
Кроме того, в описании и прилагаемой формуле изобретения неопределенные и определенные формы единственного числа включают формы множественного числа, за исключением случаев, когда в контексте явно указано иное. Так, например, термин клетка включает клетки, термин ткань включает две и более таких тканей, термин пациент включает двух и более таких пациентов и тому подобное.
Все публикации, патенты и патентные заявки, цитируемые в настоящем документе вне зависимости от того, приведены они выше или ниже, полностью включены в описание посредством ссылок.
ИМП клетка согласно настоящему изобретению.
Согласно настоящему изобретению предложена иммуномодулирующая прогениторная (ИМП) клетка. Указанная ИМП клетка экспрессирует детектируемые количества MIC А/В, CD304 (нейропилина 1), CD178 (лиганда FAS), CD289 (толл-подобного рецептора 9), CD363 (сфингозин-1-фосфатного рецептора 1), CD99, CD181 (С-Х-С-хемокинового рецептора типа 1; CXCR1), рецептора эпидермального фактора роста (EGF-R), CXCR2 и CD 126.
MIC обеспечивает адаптацию клеток и их иммунологические параметры в контексте воспаления путем снижения их восприимчивости к разрушению натуральными киллерами (NK).
CD304 (альтернативное название нейропилин 1) представляет собой корецептор фактора роста эндотелия сосудов (vascular endothelial growth factor (VEGF)) и играет важную роль в ангиогенезе, выживаемости клеток, клеточной миграции и инвазии.
CD178 (альтернативное название лиганд FAS) поддерживает клеточный фенотип и контролирует дифференцировку. Он также способен индуцировать пролиферацию клеток. Хотя лиганд FAS известен главным образом как элемент апоптозного сигналинга, было показано, что клетки, экспрессирующие FAS и лиганд FAS, устойчивы к FAS-индуцированному апоптозу.
CD289 (альтернативное название толл-подобный рецептор 9) участвует в модуляции иммунного ответа и может облегчать миграцию клеток к ткани-мишени.
Длительная активация CD363 (альтернативное название сфингозин-1-фосфатный рецептор) привела к увеличению приживления клеток in vivo. CD363 также стимулирует ангиогенез, модулирует хоуминг клеток, модулирует направленную миграцию и миграцию клеток и регулируют хемотаксис.
CD99 участвует в клеточной адгезии и трансмиграции.
Существует два класса рецепторов интерлейкина-8 (IL-8): CXCR1 (или CD181) и CXCR2. Оба типа рецепторов связывают IL-8 с высокой аффинностью, в отличие от других СХС-хемокинов. В отношении функции было показано, что CXCR1 и CXCR2 играют важную роль в пролиферации, миграции, инвазии и ангиогенезе. В пораженных тканях происходит высвобождение множества растворимых воспалительных факторов, таких как фактор, ингибирующий миграцию (migration inhibitory factor (MIF)) макрофагов и интерлейкин-8, и эти факторы могут привлекать ИМП клетки согласно изобретению (и другие клетки, участвующие в воспалении) к пораженной ткани посредством связывания с CXCR1 и/или CXCR2.
EGF-R участвует в миграции, адгезии и пролиферации клеток.
CD126 (альтернативное название IL-6R1) повышает иммунную привилегированность.
ИМП клетки согласно настоящему изобретению обладают множеством преимуществ. Ключевые из указанных преимуществ будут обобщены здесь. Тем не менее, дополнительные преимущества станут очевидными из обсуждения, приведенного ниже.
ИМП клетки согласно настоящему изобретению обеспечивают преимущество, состоящее в воз
- 2 034083 можности их применения для восстановления пораженных тканей пациентов. Указанные ИМП клетки способны эффективно мигрировать (или осуществлять хоуминг) к пораженной ткани и оказывать противовоспалительное действие в указанной ткани. Более подробное обсуждение этого вопроса приведено ниже. Одной из наиболее важных способностей ИМП клеток является способность миграции (или хоуминга) к поврежденным зонам, которая включает хемотаксис. Эта способность основана на хемокиновом сигналинге и включает такие механизмы, как качение, адгезия и трансмиграция. Противовоспалительное действие ИМП клеток способствует выживанию, восстановлению и регенерации прилегающих клеток пораженной ткани. Указанные клетки также способны оказывать паракринное влияние, такое как секреция агниогенных, хемотаксических и антиапоптотических факторов. Более подробное обсуждение этого вопроса также приведено ниже.
Как описано в более подробном обсуждении ниже, указанные ИМП клетки получают из мононуклеарных (МК) клеток, таких как периферические МК, взятые у индивидуумов, таких как человеческие индивидуумы. Поскольку ИМП клетки получают из МК, они могут быть легко получены (например, из периферической крови) и могут быть аутологичными для пациента, проходящего лечение, и, тем самым, можно избежать риска иммунологического отторжения у указанного пациента.
В принципе, возможно получение неограниченного количества ИМП клеток от единственного индивидуума, поскольку могут быть получены различные образцы МК (например, различные образцы крови). Безусловно, возможно получение очень больших количеств ИМП клеток от единственного индивидуума. Исходя из этого указанные ИМП клетки согласно настоящему изобретению могут быть получены в больших количествах.
ИМП клетки согласно настоящему изобретению получают в клинически релевантных условиях, например в отсутствие следовых количеств эндотоксинов и других веществ, загрязняющих окружающую среду, а также продуктов животного происхождения, таких как эмбриональная телячья сыворотка. Благодаря этому ИМП клетки согласно настоящему изобретению являются особенно подходящими для введения пациентам.
Поскольку ИМП клетки согласно настоящему изобретению получают из МК, они являются, по существу, гомологичными и могут быть аутологичными. Они также позволяют избежать изменчивости от донора к донору, которая часто возникает при применении МСК. Многочисленные популяции ИМП клеток согласно настоящему изобретению могут быть получены из единственного образца, взятого у пациента до начала любого другого лечения, такого как химиотерапия или лучевая терапия. Вследствие этого ИМП клетки согласно настоящему изобретению могут позволить избежать любого неблагоприятного воздействия таких способов лечения.
ИМП клетки согласно настоящему изобретению могут быть получены быстро. ИМП клетки могут быть получены из МК менее чем за 30 дней, например примерно за 22 дня.
Получение ИМП клеток из МК позволяет избежать моральных и этических аспектов, связанных с применением мезенхимальных стволовых клеток МСК, полученных из эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) человека.
ИМП клетки согласно настоящему изобретению, как правило, получают из МК человека. Таким образом, ИМП клетки согласно настоящему изобретению, как правило, представляют собой клетки человека. В качестве альтернативы указанные ИМП клетки могут быть получены из МК других животных или млекопитающих, например животных, выращиваемых в коммерческих целях, таких как лошади, крупный рогатый скот, овцы или свиньи, от лабораторных животных, таких как мыши или крысы, или от домашних животных, таких как кошки, собаки, кролики или морские свинки.
ИМП клетки согласно настоящему изобретению могут быть определены как иммуномодулирующие прогениторные клетки с помощью стандартных методов, известных в данной области техники, включая экспрессию линейно-специфичных маркеров, структурные и функциональные характеристики. Указанные ИМП клетки будут экспрессировать детектируемые количества маркеров клеточной поверхности, известные в качестве характерных для ИМП клеток. Обсуждение этого вопроса приведено ниже.
Для ИМП клеток согласно настоящему изобретению могут быть успешно пройдены тесты на дифференцировку in vitro для подтверждения принадлежности указанных клеток к мезодермальной линии дифференцировки. Такие тесты включают, но не ограничены ими, тест на адипогенную дифференцировку, тест на остеогенную дифференцировку и тест на нейрогенную дифференцировку (Zaim M. et al., Ann. Hematol. 2012 Aug; 91(8): 1175-86).
ИМП клетки согласно настоящему изобретению не являются стволовыми клетками. В частности, они не являются МСК. Они терминально дифференцированы. Хотя в правильно подобранных условиях они могут быть принудительно дифференцированы in vitro, например в клетки хряща или кости, как правило, они не дифференцируются in vivo. ИМП клетки согласно настоящему изобретению оказывают действие путем миграции к пораженной ткани и осуществления паракринного сигналинга в пораженной ткани. В частности, указанные ИМП клетки предпочтительно способны к индукции противовоспалительных эффектов в пораженной ткани. Более подробное обсуждение этого вопроса приведено ниже.
Для ИМП клеток согласно настоящему изобретению, как правило, характерна веретеновидная форма. Указанные ИМП клетки, как правило, представляют собой фибробластоподобные клетки, т.е. у этих
- 3 034083 клеток небольшое тело и несколько длинных тонких отростков. Диаметр указанных клеток, как правило, составляет от примерно 10 до примерно 20 мкм.
ИМП клетки согласно настоящему изобретению отличны от известных типов клеток, включая МСК, благодаря их паттерну экспрессии маркеров. Указанные ИМП клетки экспрессируют детектируемые количества MIC А/В, CD304 (нейропилина 1), CD178 (лиганда FAS), CD289 (толл-подобного рецептора 9), CD363 (сфингозин-1-фосфатного рецептора 1), CD99, CD181 (С-Х-С-хемокинового рецептора типа 1; CXCR1), рецептора эпидермального фактора роста (EGF-R), CXCR2 и CD126. Указанные ИМП клетки предпочтительно экспрессируют повышенные количества этих маркеров в сравнении с МСК. Это может быть определено путем сравнения уровня экспрессии/количества маркеров в ИМП клетке согласно настоящему изобретению с уровнем экспрессии/количества маркеров в МСК с помощью одинаковых техник в одинаковых условиях. Подходящие для применения МСК коммерчески доступны. МСК, применяемые для сравнения, предпочтительно представляют собой МСК человека. МСК человека коммерчески доступны от компании Mesoblast® Ltd., Osiris Therapeutics® Inc. или Lonza®. Предпочтительны МСК человека от компании Lonza®. Такие клетки применяли для сравнения в разделе Примеры. Указанные МСК могут быть получены от любого из животных или млекопитающих, рассмотренных выше.
Указанные ИМП клетки предпочтительно экспрессируют детектируемые количества MIC А/В, CD304 (нейропилина 1), CD178 (лиганда FAS), CD289 (толл-подобного рецептора 9), CD363 (сфингозин1-фосфатного рецептора 1), CD99, CD181 (С-Х-С-хемокинового рецептора типа 1; CXCR1), рецептора эпидермального фактора роста (EGF-R), CXCR2 и CD126 в сравнении с МСК. Указанные ИМП клетки предпочтительно экспрессируют повышенные количества всех десяти указанных маркеров в сравнении с МСК.
Для определения детектируемой экспрессии или повышенной экспрессии различных маркеров, рассмотренных выше (и ниже), могут быть применены стандартные способы, известные в данной области техники. Подходящие способы включают, но не ограничены ими, иммуноцитохимию, иммунохимические анализы, проточную цитометрию, такую как сортировка клеток с активированной флуоресценцией (FACS), полимеразную цепную реакцию (ПЦР), такую как ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Подходящие для применения иммунохимические анализы включают, но не ограничены ими, белковый иммуноблоттинг (Western blotting), иммуноферментный анализ (enzyme-linked immunoassays (ELISA), ИФА), метод иммуноферментных пятен (enzyme-linked immunosorbent spot (ELISPOT), методы иммуноанализа с ферментным усилением, радиоаллергосорбентные тесты (PACT), радиоиммунологические анализы, анализ связывания радиоактивного лиганда и иммунофлуоресценцию. Белковый иммуноблоттинг, ИФА и ОТ-ПЦР являются количественными методами, и потому могут быть применены для измерения уровня экспрессии различных маркеров в случае их наличия. Применение высокопроизводительной FACS (HT-FACS) описано в разделе Примеры. Экспрессию или повышенную экспрессию любого из маркеров предпочтительно осуществлять с помощью HT-FACS. Антитела и флуоресцентно меченые антитела для всего разнообразия маркеров, рассмотренных в настоящем документе, коммерчески доступны.
ИМП клетки согласно настоящему изобретению предпочтительно демонстрируют среднюю интенсивность флуоресценции (СИФ) антител, составляющую по меньшей мере 300, например по меньшей мере 350 или по меньшей мере 400, для MIC А/В, СИФ, составляющую по меньшей мере 210, например по меньшей мере 250 или по меньшей мере 300, для CD304 (нейропилина 1), СИФ, составляющую по меньшей мере 221, например по меньшей мере 250 или меньшей мере 300, для CD178 (лиганда FAS), СИФ, составляющую по меньшей мере 186, например по меньшей мере 200 или по меньшей мере 250, для CD289 (толл-подобного рецептора 9), СИФ, составляющую по меньшей мере 181, например по меньшей мере 200 или по меньшей мере 250, для CD363 (сфингозин-1-фосфатного рецептора 1), СИФ, составляющую по меньшей мере 184, например по меньшей мере 200 или по меньшей мере 250, для CD99, СИФ, составляющую по меньшей мере 300, например по меньшей мере 350 или по меньшей мере 400, для CD181 (С-Х-С-хемокинового рецептора типа 1; CXCR1), СИФ, составляющую по меньшей мере 173, например по меньшей мере 200 или по меньшей мере 250, для рецептора эпидермального фактора роста (EGF-R), СИФ, составляющую по меньшей мере 236, например по меньшей мере 250 или по меньшей мере 300, для CXCR2 и СИФ, составляющую по меньшей мере 160, например по меньшей мере 200 или по меньшей мере 250, для CD126. Средняя интенсивность флуоресценции (СИФ) представляет собой меру интенсивности, усредненный по времени поток энергии в ваттах на квадратный метр. Это единица измерения системы СИ. Главным образом, СИФ для каждого маркера измеряют с помощью HT-FACS. СИФ для каждого маркера предпочтительно измеряют с помощью HT-FACS, как описано в разделе Примеры.
В дополнение к описанным выше десяти маркерам ИМП клетки согласно настоящему изобретению, как правило, экспрессируют детектируемые количества одного или более других маркеров, приведенных в табл. 1 в разделе Примеры. Указанные ИМП клетки могут экспрессировать детектируемые количества любого числа и комбинации этих маркеров.
Указанные ИМП клетки предпочтительно экспрессируют детектируемые количества одного или более из
- 4 034083
CD267, CD47, CD51/CD61, CD49f, CD49d, CD 146, CD340, Notch2, CD49b,
CD63, CD58, CD44, CD49c, CD105, CD166, HLA-ABC, CD13, CD29, CD49e, CD73, CD81, CD90, CD98, CD147, CD151 и CD276.
Указанные ИМП клетки экспрессируют детектируемые количества одного или более из
CD10, CD111, CD267, CD47, CD273, CD51/CD61, CD49f, CD49d, CD146, CD55, CD340, CD91, Notch2, CD175s, CD82, CD49b, CD95, CD63, CD245, CD58, CD108, В2-микроглобулина, CD155, CD298, CD44, CD49c, CD105, CD166, CD230, HLA-ABC, CD13, CD29, CD49e, CD59, CD73, CD81, CD90, CD98, CD147, CD151 и CD276.
Указанные ИМП клетки могут экспрессировать детектируемые количества любого числа и комбинации этих маркеров. Указанные ИМП клетки предпочтительно экспрессируют детектируемые количества всех этих маркеров.
Указанные ИМП клетки экспрессируют детектируемые количества одного или более из
CD156b, CD61, CD202b, CD130, CD148, CD288, CD337, SSEA-4, CD349 и CD140b.
Указанные ИМП клетки более предпочтительно экспрессируют детектируемые количества одного или более из
CD156b, CD61, CD202b, CD130, CD148, CD288, CD337, SSEA-4, CD349, CD140b, CD10, CD111, CD267, CD47, CD273, CD51/CD61, CD49f, CD49d, CD146, CD55, CD340, CD91, Notch2, CD175s, CD82, CD49b, CD95, CD63, CD245, CD58, CD108, В2-микроглобулина, CD155, CD298, CD44, CD49c, CD105, CD166, CD230, HLA-ABC, CD13, CD29, CD49e, CD59, CD73,
CD81, CD90, CD98, CD147, CD151 и CD276.
Указанные ИМП клетки могут экспрессировать детектируемые количества любого числа и комбинации этих маркеров. Указанные ИМП клетки предпочтительно экспрессируют детектируемые количества всех этих маркеров.
Указанные ИМП клетки предпочтительно экспрессируют детектируемые количества одного или более из
CD72, CD133, CD192, CD207, CD144, CD41b, FMC7, CD75, CD3e, CD37,
CD158a, CD172b, CD282, CD100, CD94, CD39, CD66b, CD158b, CD40, CD35, CD15, PAC-1,
CLIP, CD48, CD278, CD5, CD103, CD209, CD3, CD197, HLA-DM, CD20, CD74, CD87, CD129, CDw329, CD57, CD163, TPBG, CD206, CD243 (BD), CD19, CD8, CD52, CD184, CD107b, CD138, CD7, CD50, HLA-DR, CD158e2, CD64, DCIR, CD45, CLA, CD38, CD45RB, CD34, CD101, CD2, CD41a, CD69, CD 136, CD62P, TCR альфа-бета, CD 16b, CD la, ITGB7, CD 154, CD70, CDw218a, CD137, CD43, CD27, CD62L, CD30, CD36, CD150, CD66, CD212, CD177, CD142, CD167, CD352, CD42a, CD336, CD244, CD23, CD45RO, CD229, CD200, CD22, CDH6, CD28, CD18, CD21, CD335, CD131, CD32, CD157, CD165, CD107a, CDlb, CD332, CD180, CD65 и CD24.
Указанные ИМП клетки могут экспрессировать детектируемые количества любого числа и комбинации этих маркеров. Указанные ИМП клетки предпочтительно экспрессируют детектируемые количества всех этих маркеров.
ИМП клетки согласно настоящему изобретению предпочтительно способны к миграции к конкретной пораженной ткани пациента. Другими словами, при введении указанных клеток пациенту с пораженной тканью, указанные клетки способны к миграции (или хоумингу) к указанной пораженной ткани. Это является преимуществом, так как означает, что указанные клетки могут быть введены стандартными путями, например внутривенно, и затем они будут направленно действовать на пораженную зону. Необходимость доставки клеток к указанной пораженной ткани отсутствует. Указанное поражение может быть обусловлено повреждением или заболеванием, как более подробно описано ниже.
Указанная конкретная ткань предпочтительно представляет собой ткань сердца, кости, хряща, сухожилия, связки, печени, почки или легкого. Это применимо не только к миграции, но также к адгезии, трансмиграции, пролиферации, противовоспалительному действию и агиогенезу, как более подробно описано ниже.
Способность ИМП клеток согласно настоящему изобретению к миграции к пораженной ткани может быть измерена с применением стандартных способов исследования, известных в данной области техники. Подходящие для применения способы включают, но не ограничены ими, геномную полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР с репортерными генами или без них) и различные способы мечения.
ОТ-ПЦР представляет собой самый эффективный и простой способ отслеживать ИМП клетки согласно настоящему изобретению, находящиеся внутри организма пациента. Для этой цели могут быть использованы маркеры трансдуцированного трансгена или собственные маркеры донора, и в нескольких
- 5 034083 исследованиях на пациентах были получены сигналы, специфичные для трансплантированных клеток. Как правило, указанные результаты являются полуколичественными.
В качестве альтернативы, ИМП клетки согласно настоящему изобретению могут быть окрашены целевым красителем, таким как флуоресцентный краситель, и возможно осуществление их мониторинга в организме пациента благодаря сигналу от этого красителя. Такие способы являются обычными в данной области техники.
Миграцию (или хоуминг), как правило, определяют путем измерения числа клеток, которые достигают пораженной ткани. Они также могут быть измерены опосредованно, путем подсчета клеток, накапливаемых в легких (а не в пораженной ткани).
В пораженных тканях сердца происходит высвобождение воспалительных хемокинов и цитокинов, таких как стромальный клеточный фактор (stromal cell-derived factor-1 (SDF-1)), интерлейкин-8 (IL-8), фактор некроза опухоли альфа (ФНО-α), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ), фактор роста эндотелия сосудов (vascular endothelial growth factor (VEGF)) и фактор роста гепатоцитов (hepatocyte growth factor (HGF)). Кроме того, инфаркт миокарда повышает уровень VEGF и эритропоэтина (erythropoietin (EPO)). CXCR4 связывается со своим лигандом SDF-1, и затем ИМП клетки согласно настоящему изобретению, экспрессирующие CXCR4, мигрируют по градиенту SDF-1, создаваемый пораженной тканью сердца. Другие пораженные ткани, такие как ткань кости, также вырабатывают SDF-1. Если конкретная пораженная ткань представляет собой ткань сердца, ИМП клетки согласно настоящему изобретению предпочтительно экспрессируют детектируемое количество CXCR4 или экспрессируют повышенное количество CXCR4 в сравнении с МСК.
Если конкретная пораженная ткань представляет собой ткань кости, ИМП клетки согласно настоящему изобретению предпочтительно экспрессируют детектируемые количества ТРФ-бета 3, костного морфогенетического белка-6 (bone morphogenetic protein-6 (BMP-6)), SOX-9, коллагена-2, CD117 (c-kit), лиганда 12 хемокина (С-С мотив) (CCL12), CCL7, интерлейкина-8 (IL-8), тромбоцитарного фактора роста A (platelet-derived growth factor-A (PDGF-A)), PDGF-B, PDGF-C, PDGF-D, фактора, ингибирующего миграцию макрофагов (MIF), IGF-1, фактора роста гепатоцитов (HGF), PDGF-Ra, PDGF-R[L CXCR4, СС-хемокинового рецептора типа 1 (CCR1), рецептора IGF-1 (IGF-1R), рецептора фактора роста гепатоцитов (HGFR), CXCL12 и NF-kB. ИМП клетки согласно настоящему изобретению, способные к хоумингу в костной ткани, предпочтительно экспрессируют повышенные количества одного или более из или даже всех из этих факторов в сравнении с мезенхимальными стволовыми клетками МСК. Детектируемая экспрессия этих маркеров может быть измерена, как описано выше.
ИМП клетки согласно настоящему изобретению предпочтительно способны прикрепляться к конкретной пораженной ткани пациента. Способы анализа прикрепления и адгезии известны в данной области техники (Humphries, Methods Mol. Biol., 2009;522:203-10).
ИМП клетки согласно настоящему изобретению предпочтительно способны к трансмиграции через эндотелий сосудов к конкретной пораженной ткани пациента. Способы анализа трансмиграции известны в данной области техники (Muller and Luscinskas, Methods Enzymol., 2008; 443: 155-176).
ИМП клетки согласно настоящему изобретению предпочтительно способны к пролиферации в конкретной пораженной ткани пациента. Способы анализа пролиферации известны в данной области техники. Такие анализы коммерчески доступны, например, от компании Life Technologies®.
ИМП клетки согласно настоящему изобретению предпочтительно способны к стимуляции ангиогенеза в конкретной пораженной ткани пациента. Способы анализа ангиогенеза известны в данной области техники (Auerback et al., Clin. Chem., 2003 Jan; 49(1):32-40).
ИМП клетки согласно настоящему изобретению предпочтительно способны оказывать противовоспалительное действие в конкретной пораженной ткани пациента. Способность ИМП клеток согласно настоящему изобретению оказывать противовоспалительное действие может быть измерена с применением стандартных анализов, известных в данной области техники. Подходящие для применения способы включают, но не ограничены ими, иммуноферментный анализ (ИФА) для определения секреции цитокинов, усиленные реакции смешанных лейкоцитов и положительную регуляцию костимулирующих молекул и маркеры созревания, определяемые с помощью проточной цитометрии. Конкретные способы, которые могут быть применены, описаны в разделе Примеры. Определяемые цитокины, как правило, представляют собой интерлейкины, такие как интерлейкин-8 (IL-8), селектины, молекулы адгезии, такие как молекула межклеточной адгезии-1 (Intercellular Adhesion Molecule-1 (ICAM-1)), и хемотаксические белки, такие как моноцитарный хемотаксический белок-1 (МСР-1) и фактор некроза опухоли альфа (ФНО-альфа). Способы анализа для этих цитокинов коммерчески доступны. Противовоспалительные факторы предпочтительно детектировать и определять с помощью анализа на платформе Luminex®, описанного в разделе Примеры. Такие анализы коммерчески доступны от компании Life Technologies®.
Указанные ИМП клетки секретируют детектируемые количества одного или более из интерлейкина-6 (IL-6), IL-8, хемокина 10 с мотивом С-Х-С (CXCL10; индуцированного интерфероном-гамма белка 10; IP-10), лиганда 2 хемокина (С-С мотив) (CCL2; моноцитарного хемотаксического белка-1; МСР-1) и
- 6 034083 лиганда 5 хемокина (С-С мотив) (CCL5; регулируемого активацией, нормально экспрессируемого и секретируемого Т-клетками; RANTES). Указанные ИМП клетки могут экспрессировать детектируемые количества любого числа и комбинации этих факторов. Указанные ИМП клетки предпочтительно секретируют все эти маркеры.
Указанные ИМП клетки предпочтительно секретируют повышенное количество одного или более из IL-6, IL-8, IP-10, МСР-1 и RANTES в сравнении с МСК. Указанные ИМП клетки могут секретировать повышенные количества любого числа и комбинации этих факторов. Указанные ИМП клетки предпочтительно экспрессируют повышенные количества всех этих маркеров.
Предпочтительно указанные ИМП клетки секретируют пониженное количество интерлейкина-10 (IL-10) и/или IL-12 в сравнении с мезенхимальными стволовыми клетками МСК. IL-10 и IL-12 представляют собой провоспалительные цитокины.
ИМП клетки согласно настоящему изобретению более предпочтительно способны к миграции к пораженной ткани пациента и оказывают противовоспалительное действие в пораженной ткани. Это позволяет эффективно вылечивать поражение и уменьшает количество клеток, необходимое для введения.
ИМП клетки согласно настоящему изобретению будут экспрессировать множество различных других маркеров в дополнение к описанным выше. Некоторые из них будут оказывать содействие ИМП клеткам в их способности мигрировать к пораженной ткани и оказывать противовоспалительное действие, достигая ее. Любая из ИМП клеток согласно настоящему изобретению может дополнительно экспрессировать детектируемые уровни одного или более из: (i) инсулиноподобного ростового фактора 1 (insulin-like growth factor-1 (IGF-1)), (ii) рецептора IGF-1; (iii) С-С-хемокинового рецептора типа 1 (CCR1), (iv) стромального клеточного фактора 1 (SDF-1), (v) гипоксия-индуцируемого фактора 1 альфа (ГИФ-1 альфа), (vi) Akt1 и (vii) фактора роста гепатоцитов (HGF) и/или гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ).
Рецепторы IGF-1 активизируют способность к миграции по градиенту IGF-1. Один из механизмов, благодаря которым IGF-1 увеличивает миграцию, заключается в увеличении количества CXCR4 на поверхности клеток, что делает их более чувствительными к сигналингу SDF-1. Обсуждение этого вопроса приведено ниже.
CCR1 представляет собой рецептор CCL7 (ранее известный как МСРЗ), который усиливает хоуминг МСК и повышает их способность к приживлению (и следовательно, можно предполагать, что они обладают тем же действием в отношении ИМП клеток согласно настоящему изобретению) и может повышать плотность капилляров поврежденного миокарда посредством паракринного сигналинга.
ГИФ-1 альфа активирует сигнальные пути, которые увеличивают доставку кислорода и активируют адаптивные способствующие выживанию ответы. Среди множества генов-мишеней ГИФ-1 альфа присутствуют эритропоэтин (ЕРО), эндотелии и VEGF (вместе с его рецептором Flk-1). ИМП клетки, экспрессирующие или экспрессирующие повышенное количество ГИФ-1 альфа, будут демонстрировать повышенную экспрессию паракринных стимуляторов, например, некоторых факторов роста эндотелия сосудов, которые могут способствовать формированию более терапевтически активного субтипа. Как более подробно описано ниже, ИМП клетки согласно настоящему изобретению могут быть прекондиционированы для формирования более терапевтически активного субтипа посредством культивирования в условиях гипоксии (содержание кислорода менее 20%), таких как, например, в условиях содержания кислорода примерно 2% или примерно 0%.
Akt1 представляет собой внутриклеточную серин/треониновую протеинкиназу, играющую ключевую роль во множестве клеточных процессов, таких как метаболизм глюкозы, клеточная пролиферация, апоптоз, транскрипция и клеточная миграция. Было показано, что гиперэкспрессия Akt1 препятствует апоптозу в МСК крыс, и она будет иметь тот же эффект в ИМП клетках согласно настоящему изобретению. Защита от апоптоза усилит терапевтическое действие указанных ИМП клеток.
Было показано, что гиперэкспрессия МСК HGF предотвращает постишемическую сердечную недостаточность за счет ингибирования апоптоза посредством кальциневрин-опосредованного пути и ангиогенеза. HGF и Г-КСФ оказывают в этом отношении синергичное действие. МСК с высоким уровнем экспрессии HGF и его рецептора c-met также обладают высокой способностью к миграции в пораженную ткань, достигаемой посредством гормонального, паракринного и аутокринного сигналинга. То же будет справедливо для ИМП клеток согласно настоящему изобретению, экспрессирующих HGF и/или Г-КСФ.
Указанные ИМП клетки могут экспрессировать детектируемые количества одного или более из (i)(vii), описанных выше. ИМП клетки согласно настоящему изобретению предпочтительно экспрессируют повышенное в сравнении с МСК количество одного или более из (i)-(vii). Способы количественного анализа для клеточных маркеров описаны выше. Детектируемая экспрессия этих маркеров и их количества могут быть определены как описано выше.
Любая из ИМП клеток согласно настоящему изобретению может экспрессировать детектируемые количества одного или более из: (i) фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), (ii) трансформирующего ростового фактора бета (ТРФ-β), (iii) инсулиноподобного фактора роста-1 (IGF-1), (iv) фактора роста фибробластов (FGF), (v) фактора некроза опухоли альфа (ФНО-α), (vi) интерферона гамма (ИФН-γ) и
- 7 034083 (vii) интерлейкина-ία (IL-Ια). Было показано, что кондиционированная среда от клеток, гиперэкспрессирующих VEGF, частично снимает симптомы сердечной недостаточности, смоделированной у хомяков. Следовательно, ИМП клетки согласно настоящему изобретению, экспрессирующие или экспрессирующие повышенное количество VEGF, будут оказывать такое же действие на пораженную ткань сердца.
Указанные ИМП клетки могут экспрессировать детектируемые количества одного или более из (i)(vii). ИМП клетки согласно настоящему изобретению могут экспрессировать повышенное в сравнении с МСК количество одного или более из (i)-(vii). Способы количественного анализа для клеточных маркеров описаны выше. Детектируемая экспрессия этих маркеров и их количества могут быть измерены как описано выше.
В обоих наборах определений, состоящих из пп.(1)-(уц), приведенных выше, может происходить экспрессия или экспрессия повышенного количества любой комбинации одного или более из (i)-(vii). Например, для каждого определения (i)-(vii) указанные ИМП клетки могут экспрессировать детектируемое количество или экспрессировать повышенное количество (О;
(ii); (iii); (iv); (v); (vi); (vii); (i) и (ii); (i) и (iii); (i) и (iv); (i) и (v); (i) и (vi); (i) и (vii); (ii) и (iii); (ii) и (iv); (ii) и (v); (ii) и (vi); (ii) и (vii); (iii) и (iv); (iii) и (v); (iii) и (vi); (iii) и (vii); (iv) и (v); (iv) и (vi);
(iv) и (vii); (v) и (vi); (v) и (vii); (vi) и (vii); (i), (ii) и (iii); (i), (ii) и (iv); (i), (ii) и (v); (i), (ii) и (vi);
(i), (ii) и (vii); (i,), (iii) и (iv); (i), (iii) и (v); (i), (iii) и (vi); (i), (iii) и (vii); (i), (iv) и (v); (i), (iv) и (vi);
(i), (iv) и (vii); (i), (v) и (vi); (i), (v) и (vii); (i), (vi) и (vii); (ii), (iii) и (iv); (ii), (iii) и (v); (ii), (iii) и |(vi); (ii), (iii) и (vii); (ii), (iv) и (v); (ii), (iv) и (vi); (ii), (iv) и (vii); (ii), (v) и (vi); (ii), (v) и (vii); (ii), (vi) и (vii); (iii), (iv) и (v); (iii), (iv) и (vi); (iii), (iv) и (vii); (iii), (v) и (vi); (iii), (v) и (vii); (iii), (vi) и (vii); (iv), (v) и (vi); (iv), (v) и (vii); (iv), (vi) и (vii); (v), (vi) и (vii); (i), (ii), (iii) и (iv); (i), (ii), (iii) и (v); (i), (ii), (iii) и (vi); (i), (ii), (iii) и (vii); (i), (ii), (iv) и (v); (i), (ii), (iv) и (vi); (i), (ii), (iv) и (vii); (i), (ii), (v) и (vi); (i), (ii), (v) и (vii); (i), (ii), (vi) и (vii); (i), (iii), (iv) и (v); (i), (iii), (iv) и (vi); (i), (iii), (iv) и (vii); (i), (iii), (v) и (vi); (i), (iii), (v) и (vii); (i), (iii), (vi) и (vii); (i), (iv), (v) и (vi); (i), (iv), (v) и (vii); (i), (iv), (vi) и (vii); (i), (v), (vi) и (vii); (ii), (iii), (iv) и (v); (ii), (iii), (iv) и (vi); (ii), (iii), (iv) и (vii); (ii), (iii), (v) и (vi); (ii), (iii), (v) и (vii); (ii), (iii), (vi) и (vii); (ii), (iv), (v) и (vi); (ii), (iv), (v) и (vii); (ii), (iv), (vi) и (vii); (ii), (v), (vi) и (vii); (iii), (iv), (v) и (vi); (iii), (iv), (v) и (vii); (iii), (iv), (vi) и (vii); (iii), (v), (vi) и (vii); (iv), (v), (vi) и (vii); (i), (ii), (iii), (iv) и (v); (i), (ii), (iii), (iv) и (vi); (i), (ii), (iii), (iv) и (vii); (i), (ii), (iii), (v) и (vi); (i), (ii), (iii), (v) и (vii); (i), (ii), (iii), (vi) и (vii); (i), (ii), (iv), (v) и (vi); (i), (ii), (iv), (v) и (vii); (i), (ii), (iv), (vi) и (vii); (i), (ii), (v), (vi) и (vii); (i), (iii), (iv), (v) и (vi); (i), (iii), (iv), (v) и (vii); (i), (iii), (iv), (vi) и vii); (i), (iii), (v), (vi) и (vii); (i), (iv), (v), (vi) и (vii);
(ii), (iii), (iv), (v) и (vi); II, iii), (iv), (v) и (vii); (ii), (iii), (iv), (vi) и (vii); (ii), (iii), (v), (vi) и (vii); (ii), (iv), (v), (vi) и (vii); (iii), (iv), (v), (vi) и vii); (i), (ii), (iii), (iv), (v) и (vi); (i), (ii), (iii), (iv), (v) и (vii);
(i), (ii), (iii), (iv), (vi) и (vii); (i), (ii), (iii), (v), (vi) и (vii); (i), (ii), (iv), (v), (vi) и (vii); (i), (iii), (iv), (v), (vi) и (vii); (ii), (iii), (iv), (v), (vi) и (vii); или (i), (ii), (iii), (iv), (v), (vi) и (vii).
Комбинации для каждого из определений (i)-(vii) независимо выбирают из этого списка.
В дополнение к любому из маркеров, описанных выше, ИМП клетки согласно настоящему изобретению предпочтительно также экспрессируют детектируемые количества LIF и/или рецепторов тромбоцитарного фактора роста (platelet-derived growth factor (PDGF)). ИМП клетки согласно настоящему изобретению предпочтительно экспрессируют повышенное в сравнении с мезенхимальными стволовыми клетками количество LIF и/или рецепторов тромбоцитарного фактора роста (PDGF). Указанные рецепторы PDGF предпочтительно представляют собой рецепторы PDGF типа А и/или рецепторы PDGF типа В. МСК с высоким уровнем экспрессии этих рецепторов могут эффективно мигрировать в зоны, где были активированы тромбоциты, такие как раны и тромбозное поражение сосудов. То же самое будет справедливо для ИМП клеток, экспрессирующих или экспрессирующих повышенное количество указанных рецепторов.
ИМП клетки согласно настоящему изобретению предпочтительно являются аутологичными. Другими словами, указанные клетки предпочтительно получают от пациента, которому указанные клетки будут введены. В качестве альтернативы указанные ИМП клетки предпочтительно являются аллогенными. Другими словами, указанные клетки предпочтительно получают от пациента иммунологически совместимого с пациентом, которому указанные клетки будут введены.
ИМП клетка согласно настоящему изобретению может быть выделена, по существу выделена, очищена или по существу очищена. Указанная ИМП клетка является выделенной или очищенной, если она полностью свободна от любых других компонентов, таких как культуральная среда, другие клетки со
- 8 034083 гласно настоящему изобретению или другие типы клеток. Указанная ИМП клетка является, по существу, выделенной, если она смешана с носителями или разбавителями, такими как культуральная среда, которые не будут препятствовать ее применению по назначению. В качестве альтернативы, ИМП клетка согласно настоящему изобретению может быть представлена в составе матрицы для роста или иммобилизована на поверхности, как описано ниже.
ИМП клетки согласно настоящему изобретению может быть выделены с помощью различных методов, включая методы, основанные на применении антител. Клетки могут быть выделены с помощью методов негативной и позитивной селекции, в основе которых лежит связывание моноклональных антител с поверхностными маркерами, представленными на поверхности указанной ИМП клетки (см. выше). Следовательно, указанные ИМП клетки могут быть обособлены с применением любого метода, основанного на применении антител, включая сортировку клеток с активированной флуоресценцией (FACS) и сепарацию клеток с помощью магнитных бусин.
Как более подробно описано ниже, указанные ИМП клетки могут быть подвергнуты воздействию ex vivo. Таким образом, указанные клетки могут быть трансфицированы или нагружены терапевтическим или диагностическим агентом, а затем применены в терапевтических целях в рамках способов согласно настоящему изобретению.
Популяция согласно настоящему изобретению.
Согласно настоящему изобретению также предложена популяция, состоящая из двух или более ИМП клеток согласно настоящему изобретению. Любое число клеток может присутствовать в указанной популяции. Популяция согласно настоящему изобретению предпочтительно содержит по меньшей мере около 5х105 ИМП клеток согласно настоящему изобретению. Указанная популяция более предпочтительно содержит по меньшей мере примерно 1х106, по меньшей мере примерно 2х106, по меньшей мере примерно 2,5 2х106, по меньшей мере примерно 5х106, по меньшей мере примерно 1х107, по меньшей мере примерно 2х107, по меньшей мере примерно 5х107, по меньшей мере примерно 1х 108 по меньшей мере примерно 2х108 ИМП клеток согласно настоящему изобретению. В некоторых случаях указанная популяция может содержать по меньшей мере примерно 1,0х107, по меньшей мере примерно 1,0х108, по меньшей мере примерно 1,0х109, по меньшей мере примерно 1,0х1010, по меньшей мере примерно 1,0х 1011 по меньшей мере примерно 1,0х 1012 ИМП клеток согласно изобретению или даже больше.
Указанная популяция, содержащая две или более ИМП клеток согласно настоящему изобретению, может содержать другие клетки в дополнение к ИМП клеткам согласно настоящему изобретению. Тем не менее, по меньшей мере 70% клеток в указанной популяции составляют ИМП клетки согласно настоящему изобретению. Более предпочтительно по меньшей мере примерно 75%, по меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере примерно 85%, по меньшей мере примерно 90%, по меньшей мере примерно 97%, по меньшей мере примерно 98% или по меньшей мере примерно 99% клеток в указанной популяции составляют ИМП клетки согласно настоящему изобретению.
Согласно настоящему изобретению также предложены конкретные популяции ИМП клеток. Согласно настоящему изобретению предложена популяция иммуномодулирующих прогениторных (ИМП) клеток, в которой:
(i) по меньшей мере 90%, предпочтительно по меньшей мере 97% и более предпочтительно по меньшей мере 97,1% клеток в указанной популяции экспрессируют детектируемые количества MIC А/В, (ii) по меньшей мере 60%, предпочтительно меньшей мере 65% и более предпочтительно меньшей мере 65,2% клеток в указанной популяции экспрессируют детектируемые количества CD304 (нейропилина 1), (iii) по меньшей мере 45%, предпочтительно меньшей мере 51% и более предпочтительно меньшей мере 51,6% клеток в указанной популяции экспрессируют детектируемые количества CD178 (лиганда FAS), (iv) по меньшей мере 10%, предпочтительно по меньшей мере 11% и более предпочтительно по меньшей мере 11,3% клеток в указанной популяции экспрессируют детектируемые количества CD289 (толл-подобного рецептора 9), (v) по меньшей мере 15%, предпочтительно по меньшей мере 18% и более предпочтительно по меньшей мере 18,7% указанной популяции экспрессируют детектируемые количества CD363 (сфингозин-1-фосфатного рецептора 1), (vi) по меньшей мере 20%, предпочтительно по меньшей мере 24% и более предпочтительно по меньшей мере 24,8% клеток в указанной популяции экспрессируют детектируемые количества CD99, (vii) по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 85% клеток в указанной популяции экспрессируют детектируемые количества CD181 (С-Х-С-хемокинового рецептора типа 1; CXCR1), (viii) по меньшей мере 30%, предпочтительно по меньшей мере 33% и более предпочтительно по меньшей мере 33,3% клеток в указанной популяции экспрессируют детектируемые количества рецептора эпидермального фактора роста (EGF-R), (ix) по меньшей мере 60%, предпочтительно по меньшей мере 68% и более предпочтительно по меньшей мере 68,8% клеток в указанной популяции экспрессируют детектируемые количества CXCR2; и
- 9 034083 (x) по меньшей мере 5%, предпочтительно по меньшей мере 7% и более предпочтительно по меньшей мере 7,05% клеток в указанной популяции экспрессируют детектируемые количества CD126.
Указанные клетки в этих предпочтительных популяциях могут дополнительно экспрессировать детектируемые количества любого из маркеров, описанных выше, относительно ИМП клеток согласно настоящему изобретению. Указанные клетки в этих предпочтительных популяциях могут обладать любыми из обеспечивающих преимущества свойств указанных ИМП клеток, описанных выше.
По меньшей мере 90%, например по меньшей мере 95%, клеток в указанной популяции предпочтительно экспрессируют детектируемые количества одного или более из
CD10, CD111,
CD267, CD47, CD273, CD51/CD61, CD49f, CD49d, CD146, CD55, CD340, CD91, Notch2, CD175s, CD82, CD49b, CD95, CD63, CD245, CD58, CD108, В2-микроглобулина, CD155, CD298, CD44, CD49c, CD105, CD166, CD230, HLA-ABC, CD13, CD29, CD49e, CD59, CD73, CD81, CD90, CD98, CD147, CD151 и CD276.
По меньшей мере 90%, например по меньшей мере 95%, клеток в указанной популяции могут экспрессировать детектируемые количества любого числа и комбинаций этих маркеров. По меньшей мере 90%, например по меньшей мере 95%, клеток в указанной популяции предпочтительно экспрессируют детектируемые количества всех этих маркеров.
По меньшей мере 80%, например по меньшей мере 85%, клеток в указанной популяции предпочтительно экспрессируют детектируемые количества одного или более из
CD156b, CD61, CD202b, CD130, CD148, CD288, CD337, SSEA-4, CD349 и CD140b.
По меньшей мере 80%, например по меньшей мере 85%, клеток указанной популяции могут экспрессировать детектируемые количества любого числа и комбинаций этих маркеров. По меньшей мере 80%, например по меньшей мере 85%, клеток в указанной популяции предпочтительно экспрессируют детектируемые количества всех этих маркеров.
По меньшей мере 70%, например по меньшей мере 75%, клеток в указанной популяции предпочтительно экспрессируют детектируемые количества одного или более из CD318, CD351, CD286, CD46, CD119 и CD132. По меньшей мере 70%, например по меньшей мере 75%, клеток в указанной популяции могут экспрессировать детектируемые количества любого числа и комбинаций этих маркеров. По меньшей мере 70%, например по меньшей мере 75%, клеток в указанной популяции предпочтительно экспрессируют детектируемые количества всех этих маркеров.
1% или менее, например 0,5% или менее, клеток в указанной популяции предпочтительно экспрессируют детектируемые количества одного или более из
CD72, CD133, CD192, CD207, CD144, CD41b, FMC7, CD75, CD3e, CD37, CD158a, CD172b, CD282, CD100, ICD94, CD39, CD66b, CD158b, CD40, CD35, CD15, PAC-1, CLIP, CD48, CD278, CD5, CD103, CD209, CD3, CD197, HLA-DM, CD20, CD74, CD87, CD129, CDw329, CD57, CD163 , TPBG, CD206, CD243 (BD), CD19, CD8, CD52, CD184, CD107b, CD138, CD7, CD50, HLA-DR, CD158e2, CD64, DCIR, CD45, CLA, CD38, CD45RB, CD34, CD101, CD2, CD41a, CD69, CD136, CD62P, TCR альфа-бета, CD16b, CDla, ITGB7, CD154, CD70, CDw218a, CD137, CD43, CD27, CD62L, CD30, CD36, CD150, CD66, CD212, CD177, CD142, CD167, CD352, CD42a, CD336, CD244, CD23, CD45RO, CD229, CD200, CD22, CDH6, CD28, CD18, CD21, CD335, CD131, CD32, CD157, CD165, CD107a, CDlb, CD332, CD180, CD65 и CD24.
1% или менее, а именно 0,5% или менее клеток в указанной популяции предпочтительно экспрессируют детектируемые количества любого числа и комбинаций этих маркеров. 1% или менее, а именно 0,5% или менее клеток в указанной популяции предпочтительно экспрессируют детектируемые количества всех этих маркеров.
В любом из вариантов реализации, описанных выше, в котором популяции определены с указанием % клеток, экспрессирующих определенные маркеры, указанная популяция предпочтительно содержит по меньшей мере 5000 клеток, например по меньшей мере 6000, по меньшей мере 7000, по меньшей мере 8000, по меньшей мере 9000, по меньшей мере 10000, по меньшей мере 20000, по меньшей мере 30000 или по меньшей мере 40000 клеток. Эти популяции могут содержать любое число клеток, описанных выше.
Любая из указанных популяций клеток, описанных в настоящем документе, может быть разбавлена другими клетками перед применением. Например, популяция может быть объединена с кровью пациента, мононуклеарными клетками (МК), МСК, прогениторными клетками мезодермальной линии дифференцировки (ПКМЛД) или их комбинацией. ПКМЛД описаны в заявке PCT/GB2012/051600 (опубликованной как WO 2013/005053).
- 10 034083
Популяции согласно настоящему изобретению обеспечивают преимущества для терапии, как описано ниже. Указанная способность производить популяции, содержащие большое число ИМП клеток согласно настоящему изобретению представляет собой одно из ключевых преимуществ согласно настоящему изобретению. Настоящее изобретение делает возможным лечение пациентов популяцией клеток, большинство из которых, если не все, эффективно мигрируют к целевой ткани и оказывают противовоспалительное действие, достигая ее. Это делает возможным применение низких доз клеток и позволяет избегать нецелевых побочных эффектов и побочных эффектов, связанных с вводимым объемом.
Популяция согласно настоящему изобретению предпочтительно гомологичны. Другими словами, все ИМП клетки в указанной популяции генетически и фенотипически идентичны. Указанная популяция предпочтительно является аутологичной или аллогенной, как описано выше.
Тем не менее, указанная популяция также может быть семиаллогенной. Семиаллогенные популяции главным образом получают из мононуклеарных клеток от двух или более пациентов, иммунологически совместимых с пациентом, которому будет введена указанная популяция. Другими словами, все клетки в указанной популяции предпочтительно являются генетически идентичными или достаточно генетически идентичными, так что популяция иммунологически совместима с пациентом, которому будет введена указанная популяция. Поскольку ИМП клетки согласно настоящему изобретению могут быть получены от пациента, они могут являться аутологичными для пациента, подлежащего лечению (т.е. генетически идентичными пациенту или достаточно генетически идентичными, чтобы быть совместимыми для введения указанному пациенту).
Популяция согласно настоящему изобретению может быть выделена, по существу, выделена, очищена или, по существу, очищена. Популяция выделена или очищена, если она полностью свободна от любых других компонентов, таких как культуральная среда и другие клетки. Указанная популяция, по существу, выделена, если к ней примешаны носители или разбавители, такие как культуральная среда, которая не будет препятствовать ее применению по назначению. Ниже более подробно рассмотрены другие носители и разбавители. По существу, выделенная или, по существу, очищенная популяция не содержит клеток, отличных от ИМП клеток согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах реализации указанная популяция согласно настоящему изобретению может быть представлена в составе матрицы для культивирования клеток или иммобилизована на поверхности, как описано ниже.
Указанную популяцию, как правило, культивируют in vitro. Методы культивирования клеток хорошо известны специалисту в данной области техники. Указанные клетки можно культивировать в стандартных условиях при 37°С, 5% CO2 в культуральной среде без сыворотки. Указанные клетки предпочтительно культивировать в условиях пониженного содержания кислорода, как более подробно описано ниже. Указанные клетки можно культивировать в любом подходящем культуральном флаконе или сосуде, включая лунки планшета, такого как стандартный 6-луночный планшет. Такие планшеты коммерчески доступны в компании Fisher scientific, компании-поставщике VWR, Nunc, Starstedt или Falcon. Как правило, вместимость лунок составляет от примерно 1 мл до примерно 4 мл.
Указанный культуральный флакон, сосуд или лунка, внутри которой указанную популяцию содержат или культивируют, могут быть модифицированы для облегчения обслуживания указанных ИМП клеток. Например, указанные культуральный флакон, сосуд или лунка могут быть модифицированы для облегчения обслуживания клеток, например путем добавления матрикса для культивирования клеток. Указанный культуральный флакон, сосуд или лунка могут быть модифицированы для обеспечения возможности прикрепления ИМП клеток или для обеспечения возможности иммобилизации ИМП клеток на поверхности. Одна или более поверхностей могут быть покрыты белками внеклеточного матрикса, такими как ламинин или коллаген, или любыми другими молекулами захвата, которые связываются с клетками и иммобилизуют или фиксируют их на поверхности (поверхностях).
Указанная популяция может быть модифицирована ex vivo с помощью любых методов, описанных в настоящем документе. Например, указанная популяция может быть трансфицирована или нагружена терапевтическими или диагностическими агентами. Затем указанная популяция может быть применена в способах лечения, более подробно описанных ниже.
Способ получения ИМП клетки согласно изобретению.
Согласно настоящему изобретению также предложен способ получения популяции согласно настоящему изобретению. Указанный способ включает культивирование мононуклеарных клеток (МК) в условиях, при которых индуцируется дифференцировка указанных МК в ИМП клетки. Указанный способ включает отбор и культивирование ИМП клеток, экспрессирующих детектируемые количества MIC А/В, CD304 (нейропилина 1), CD178 (лиганда FAS), CD289 (толл-подобного рецептора 9), CD363 (сфингозин-1-фосфатного рецептора 1), CD99, CD181 (С-Х-С-хемокинового рецептора типа 1; CXCR1), рецептора эпидермального фактора роста (EGF-R), CXCR2 и CD126. Отобранные клетки могут экспрессировать детектируемые количества или повышенные количества любого из маркеров и факторов, описанных выше, относительно клеток согласно настоящему изобретению.
Мононуклеарные клетки (МК) и способы их выделения известны в данной области техники. Указанные МК могут представлять собой первичные МК, выделенные из костного мозга. Указанные МК предпочтительно представляют собой МК периферической крови (МКПК), такие как лимфоциты и/или
- 11 034083 макрофаги. МКПК могут быть выделены из крови с помощью гидрофильного полисахарида, такого как Ficoll®. Например, МКПК могут быть выделены из крови с помощью Ficoll-Paque® (коммерчески доступная среда для фракционирования клеток крови в градиенте плотности), как описано в разделе Примеры.
Перед культивированием МК могут быть обработаны смесью для обогащения мезенхимальными стволовыми клетками. Указанная смесь предпочтительно содержит антитела, которые распознают CD3, CD14, CD19, CD38, CD66b (которые представлены на поверхности нежелательных клеток) и компонент красных кровяных телец. Такая смесь образует сшивки между нежелательными клетками и красными кровяными тельцами, формируя иммунные розетки, которые могут быть удалены с требуемых МК. Предпочтительной смесью является RosetteSep®.
Условия, подходящие для индукции дифференцировки МК в мезенхимальные клетки (ткани, в основном происходящей из мезодермы), известны в данной области техники. Например, подходящие условия описаны в публикации Capelli C. et al. (Human platelet lysate allows expansion and clinical grade production of mesenchymal stromal cells from small samples of bone marrow aspirates or marrow filter washouts. Bone Marrow Transplantation, 2007. 40: p. 785-791). Эти условия также можно применять для индукции дифференцировки МК в ИМП клетки в соответствии с настоящим изобретением.
Указанный способ предпочтительно включает культивирование МК с лизатом тромбоцитов для индукции дифференцировки МК в ИМП клетки. Словосочетание лизат тромбоцитов предназначено для обозначения комбинации природных факторов роста, содержащихся в тромбоцитах, высвобожденных посредством лизирования этих тромбоцитов. Лизис может быть осуществлен химическим способом (т.е. посредством CaCl2), посредством осмоса (с применением дистиллированной H2O) или с помощью процедур замораживания/оттаивания. Лизат тромбоцитов может быть получен из цельной крови, как описано в патенте США № 5198357. Лизат тромбоцитов предпочтительно должен быть приготовлен, как описано в заявке PCT/GB12/052911 (опубликованной как WO 2013/076507). Лизат тромбоцитов предпочтительно представляет собой лизат тромбоцитов человека.
В предпочтительном варианте реализации стадия (а) указанного способа согласно настоящему изобретению включает культивирование МК в среде, содержащей лизат тромбоцитов, в течение достаточного периода времени для индукции дифференцировки МК в ИМП клетки. Указанный достаточный период времени, как правило, составляет от примерно 15 до примерно 25 дней, предпочтительно примерно 22 дня. Указанная среда предпочтительно содержит примерно 20% или менее лизата тромбоцитов по объему, например примерно 15% или менее по объему или примерно 10% или менее по объему. Указанная среда предпочтительно содержит от примерно 5% до примерно 20% лизата тромбоцитов по объему, например от примерно 10% до примерно 15% по объему. Указанная среда предпочтительно содержит примерно 10% лизата тромбоцитов по объему.
В предпочтительном варианте реализации стадия (а) указанного способа согласно настоящему изобретению включает воздействие на МК смесью для обогащения мезенхимальными стволовыми клетками с последующим культивированием МК в среде, содержащей лизат тромбоцитов, в течение достаточного периода времени для индукции дифференцировки МК в ИМП клетки. Указанный достаточный период времени, как правило, составляет от примерно 15 до примерно 25 дней, предпочтительно примерно 22 дня.
На стадии (а) указанная среда предпочтительно представляет собой среду MEM (Minimum Essential Medium). Среда MEM коммерчески доступна в различных источниках, включая Sigma-Aldrich. Указанная среда предпочтительно дополнительно содержит одну или более добавок из гепарина, L-глутамина и пенициллина/стрептавидина (P/S). Указанный L-глутамин может быть заменен на GlutaMAX® (является коммерчески доступным в компании Life Technologies).
Как описано выше, некоторые из ИМП клеток согласно настоящему изобретению экспрессируют детектируемые количества CXCR4. Экспрессия CXCR4 является цитокин-зависимой и увеличивается при воздействии на клетки фактора стволовых клеток (СКФ), интерлейкина-6 (IL-6), Flt-3-лиганда, фактора роста гепатоцитов (HGF) и IL-3. Среда может содержать один или более из (i) SCF, (ii) IL-6, (iii) Flt3-лиганда, фактора роста гепатоцитов (iv) и (v) IL-3, например (i); (ii); (iii); (iv); (v); (i) и (ii); (i) и (iii); (i) и (iv); (i) и (v); (ii) и (iii); (ii) и (iv); (ii) и (v); (iii) и (iv); (iii) и (v); (iv) и (v); (i), (ii) и (iii); (i), (ii) и (iv); (i), (ii) и (v);
(i), (iii) и (iv); (i), (iii) и (v); (i), (iv) и (v); (ii), (iii) и (iv); (ii), (iii) и (v); (ii), (iv) и (v); (iii), (iv) и (v);
или (i), (ii), (iii), (iv) и (v).
Любой из (i)-(v) может присутствовать в количестве от примерно 10 до примерно 150 нг/мл.
Стадия (а) предпочтительно включает культивирование МК в условиях, которые обеспечивают возможность прикрепления ИМП клеток. Подходящие условия более подробно рассмотрены выше.
На стадии (а) МК предпочтительно культивируют в условиях низкого содержания кислорода. Указанные МК предпочтительно культивируют в условиях содержания менее примерно 20% кислорода (O2), например менее примерно 19%, менее примерно 18%, менее примерно 17%, менее примерно 16%, менее примерно 15%, менее примерно 14%, менее примерно 13%, менее примерно 12%, менее примерно 11%, менее примерно 10%, менее примерно 9%, менее примерно 8%, менее примерно 7%, менее примерно 6%,
- 12 034083 менее примерно 5%, менее примерно 4%, менее примерно 3%, менее примерно 2% или менее примерно 1% кислорода (O2). Указанные МК предпочтительно культивируют в условиях содержания от примерно 0% до примерно 19% O2, например от примерно 1% до примерно 15% O2, от примерно 2% до примерно 10% O2 или от примерно 5% до примерно 8% O2. Указанные МК наиболее предпочтительно культивируют в условиях содержания примерно 0% O2. Данные для % кислорода (или % O2), приведенные выше, относятся к % по объему кислорода в газе, подаваемом клеткам в культуре, например, посредством клеточного инкубатора. Не исключено, что некоторое количество кислорода может просачиваться в инкубатор или проникать при открытии дверцы.
На стадии (а) указанные МК наиболее предпочтительно культивируют в присутствии лизата тромбоцитов и в условиях низкого содержания кислорода. Такая комбинация имитирует естественные условия в пораженной ткани, что приводит к получению более здоровых и терапевтически более действенных клеток. Традиционно культивирование клеток осуществляют при 20-21% кислорода (приближенно к содержанию кислорода в атмосферном воздухе), но в человеческом теле не существует мест с таким содержанием кислорода. Эпителиальные клетки легких встречают такую концентрацию кислорода, но как только кислород растворяется и покидает легкие, она снижается до примерно 17%. Далее она снижается еще больше, до 1-2%, в большинстве тканей, но составляет всего лишь 0,1% в тканях, не содержащих сосудов, таких как хрящевая ткань в суставах.
На стадии (b) указанный способ дополнительно включает отбор и культивирование ИМП клеток, которые обладают необходимым паттерном экспрессии маркеров, описанным выше. Указанные ИМП клетки с необходимым паттерном экспрессии маркеров могут быть отобраны с помощью методов, основанных на применении антител, включая сортировку клеток с активированной флуоресценцией (FACS) и сепарацию клеток с помощью магнитных бусин. Предпочтительным является применение FACS. Более предпочтительным является применение HT-FACS.
Любой из способов культивирования ИМП клеток, описанный в отношении стадии (а), в равной степени применим к стадии (b). В частности, указанные клетки культивируют на стадии (b) в присутствии лизата тромбоцитов и в условиях низкого содержания кислорода, как описано в отношении стадии (а).
Как будет ясно из описанного выше, указанный способ согласно настоящему изобретению осуществляют в клинически релевантных условиях, т.е. в отсутствие следовых количеств эндотоксинов и других веществ, загрязняющих окружающую среду, таких как липополисахариды, липопептиды и пептидогликаны и т.д. Благодаря этому ИМП клетки согласно настоящему изобретению являются особенно подходящими для введения пациентам.
Указанные МК предпочтительно должны быть получены от пациента или аллогенного донора. Согласно настоящему изобретению также предложен способ получения популяции согласно настоящему изобретению, подходящей для введения пациенту, при этом указанный способ включает культивирование МК, полученных от пациента, в условиях, при которых индуцируется дифференцировка указанных МК в ИМП клетки, и (b) отбор и культивирование прогениторных клеток, которые обладают паттерном экспрессии, описанным выше, и, тем самым, получение популяции согласно настоящему изобретению, подходящей для введения пациенту. Указанная популяция будет аутологичной для указанного пациента и, следовательно, при имплантации не произойдет отторжения. Согласно настоящему изобретению также предложена популяция согласно настоящему изобретению, пригодная для введения пациенту и получаемая таким способом.
В качестве альтернативы, согласно настоящему изобретению предложен способ получения популяции согласно настоящему изобретению, подходящей для введения пациенту, при этом указанный способ включает культивирование МК, полученных от другого пациента, иммунологически совместимого с пациентом, которому будут введены указанные клетки, в условиях, при которых индуцируется дифференцировка указанных МК в ИМП клетки, и (b) отбор и культивирование этих ИМП клеток, которые обладают паттерном экспрессии, описанным выше, и, тем самым, получение популяции согласно настоящему изобретению, подходящей для введения пациенту. Указанная популяция будет аллогенной для указанного пациента и, следовательно, вероятность отторжения при имплантации будет снижена. Согласно настоящему изобретению также предложена популяция согласно настоящему изобретению, пригодная для введения пациенту и получаемая таким способом.
Лекарственные средства, способы и терапевтическое применение.
ИМП клетки согласно настоящему изобретению могут быть применены в способе лечения тела человека или животного. Таким образом, согласно настоящему изобретению предложена ИМП клетка согласно настоящему изобретению или популяция согласно настоящему изобретению для применения в способе лечения тела человека или животного путем терапии. В частности, настоящее изобретение относится к применению ИМП клеток согласно настоящему изобретению или популяции согласно настоящему изобретению для восстановления пораженной ткани пациента. Настоящее изобретение также относится к применению ИМП клеток согласно настоящему изобретению или популяции согласно настоящему изобретению для лечения повреждений сердца, кости, хряща, сухожилия, связки, печени, почки или легкого или заболевания пациента.
Согласно настоящему изобретению предложен способ восстановления пораженной ткани пациента,
- 13 034083 включающий введение указанному пациенту популяции согласно настоящему изобретению, при этом указанная популяция содержит терапевтически эффективное количество клеток, и, тем самым, лечение указанной пораженной ткани пациента. Согласно изобретению также предложена популяция согласно настоящему изобретению для применения в восстановлении пораженной ткани указанного пациента. Согласно настоящему изобретению также предложено применение популяции согласно настоящему изобретению в производстве лекарственного средства для восстановления пораженной ткани пациента.
Указанная ткань предпочтительно имеет мезодермальное происхождение. Указанная ткань более предпочтительно представляет собой ткань сердца, кости, хряща, сухожилия, связки, печени, почки или легкого.
Указанное поражение ткани может возникать в результате повреждения или заболевания. Указанное повреждение или заболевание предпочтительно представляет собой повреждение или заболевание сердца, кости, хряща, сухожилия, связки, печени, почки или легкого пациента. Согласно настоящему изобретению также предложен способ лечения повреждения или заболевания сердца, кости, хряща, сухожилия, связки, печени, почки или легкого пациента, включающий введение указанному пациенту популяции согласно настоящему изобретению, при этом указанная популяция содержит терапевтически эффективное количество клеток, и, тем самым, лечение указанной пораженной ткани пациента. Согласно настоящему изобретению также предложена популяция согласно настоящему изобретению для применения в лечении повреждения или заболевания сердца, кости, хряща, сухожилия, связки, печени, почки или легкого пациента. Согласно настоящему изобретению также предложено применение популяции согласно настоящему изобретению в производстве лекарственного средства для лечения повреждения или заболевания сердца, кости, хряща, сухожилия, связки, печени, почки или легкого пациента.
Указанное повреждение или заболевание сердца предпочтительно выбраны из инфаркта миокарда (ИМ), гипертрофии левого желудочка, гипертрофии правого желудочка, эмболии, сердечной недостаточности, врожденного порока сердца, заболевания клапана сердца, аритмии или миокардита.
ИМ повышает уровни VEGF и ЕРО, высвобождаемых миокардом. Кроме того, ИМ связан с воспалительной реакцией, и инфарктная ткань также высвобождает фактор, ингибирующего миграцию макрофагов (MIF), интерлейкин (IL-6) и KC/Gro-α. Экспрессия CCL7 (ранее известный как МСРЗ), CXCL1, CXCL2 значительно повышена в сердце после инфаркта миокарда (ИМ), и они могут быть вовлечены в регуляцию приживления и хоуминга МСК в инфарктном миокарде.
В модели инфаркта миокарда на мышах было показано значительное увеличение экспрессии гена IL-8, главным образом в первые 2 дня после ИМ. Примечательно, что повышение экспрессии IL-8 преимущественно происходило в области инфаркта и пограничной зоне и лишь в гораздо меньшей степени в уцелевшем миокарде. При активации CXCR2 MIF демонстрирует хемокиноподобные функции и действует как основной регулятор мобилизации воспалительных клеток и атерогенеза.
Указанное повреждение или заболевание кости предпочтительно выбраны из перелома, перелома Салтера-Харриса, перелома по типу зеленой ветки, костной шпоры, краниосиностоза, синдрома Коффина-Лоури, прогрессирующей оссифицирующей фибродисплазии, фиброзной дисплазии, болезни Фонга (или ногте-надколенного синдрома), гипофосфатазии, синдрома Клиппеля-Фейля, метаболического заболевания кости, ногте-надколенного синдрома, остеоартрита, деформирующего остеита (или костной болезни Педжета), фиброзно-кистозного остеита (или Osteitis fibrosa, или костной болезни фон Реклингаузена), лобкового остеита, конденсирующего остеита (или Osteitis condensans), конденсирующего остеита подвздошной кости, рассекающего остеохондрита, несовершенного остеогенеза, остеомаляции, остеомиелита, остеопении, остеопетроза, остеопороза, остеонекроза, поротического гиперостоза, первичного гиперпаратиреоза, почечной остеодистрофии, рака кости, поражения кости, связанного с метастатическим раком, болезни Горама-Стаута, первичного гиперпаратиреоза, периодонтальной болезни и асептического разрыхления протезированных суставов. Рак кости может представлять собой саркому Юинга, множественную миелому, остеосаркому (гигантскую опухоль кости), остеохондрому или остеокластому. Метастатический рак, который приводит к поражению кости может представлять собой рак груди, рак простаты, рак почки, рак легкого и/или Т-клеточный лейкоз взрослых.
Если пораженная ткань представляет собой ткань сердца или ткань кости, указанные ИМП клетки в популяции предпочтительно экспрессируют детектируемые количества CD29, CD44, CD73, CD90, CD105, CD271, CXCR1, CXCR2 и CXCR4 и не экспрессируют детектируемые количества CD14, CD34 и CD45. Если конкретная пораженная ткань представляет собой ткань кости, ИМП клетки в популяции предпочтительно экспрессируют детектируемые количества ТРФ-бета 3, костного морфогенетического белка-6 (ВМР-6), SOX-9, коллагена-2, CD117 (c-kit), лиганда 12 хемокина (С-С мотив) (CCL12), CCL7, интерлейкина-8 (IL-8), тромбоцитарного фактора роста A (PDGF-A), PDGF-B, PDGF-C, PDGF-D, фактора, ингибирующего миграцию макрофагов (MIF), IGF-1, фактора роста гепатоцитов (HGF), PDGF-Ra, PDGF-Ρβ. CXCR4, С-С-хемокинового рецептора типа 1 (CCR1), рецептора IGF-1 (IGF-1R), рецептора фактора роста гепатоцитов (HGFR), CXCL12 и NF-кВ и не экспрессируют детектируемые количества CD14, CD34 и CD45.
Заболевание или расстройство может представлять собой периодонтальную болезнь, эндометриоз
- 14 034083 или разрывы мениска.
Во всех случаях ИМП клетки согласно настоящему изобретению предпочтительно получены от указанного пациента или аллогенного донора. При получении ИМП клеток согласно настоящему изобретению от пациента следует подтвердить, что иммунная система пациента не отторгает указанные ИМП клетки сами по себе. Любая разница между донором и реципиентом в конечном итоге вызовет выведение ИМП клеток, но не раньше, чем они восстановят по меньшей мере часть пораженной ткани.
Настоящее изобретение относится к введению пациенту терапевтически эффективного количества ИМП клеток согласно настоящему изобретению. Терапевтически эффективное количество представляет собой количество, которое облегчает один или несколько симптомов поражения, заболевания или повреждения. Терапевтически эффективное количество предпочтительно представляет собой количество, которое восстанавливает пораженную ткань или лечит заболевание или повреждение. Подходящие количества более подробно рассмотрены ниже.
ИМП клетки согласно настоящему изобретению могут быть введены любому подходящему пациенту. Указанный пациент, как правило, представляет собой пациента-человека. Указанный пациент может представлять собой любое из животных или млекопитающих, упомянутых выше относительно источника ИМП клеток.
Указанный пациент может представлять собой ребенка, подростка или взрослого. О наличии у пациента пораженной ткани может быть известно, или существует подозрение о наличии у него пораженной ткани. Пациент может быть восприимчивым к или подверженным риску соответствующего заболевания или повреждения. Например, у пациента может быть генетическая предрасположенность к сердечной недостаточности.
Настоящее изобретение может быть применено в сочетании с другими средствами и веществами для восстановления пораженных тканей или обеспечения облегчения боли. В некоторых случаях ИМП клетки согласно настоящему изобретению могут быть введены одновременно, последовательно или по отдельности с другими веществами, которые предназначены для восстановления пораженных тканей или обеспечения облегчения боли. Указанные ИМП клетки могут быть применены в сочетании с существующими способами лечения пораженных тканей, и их можно, например, свободно сочетать с такими способами лечения. Таким образом, настоящее изобретение может быть применено для повышения эффективности существующих способов лечения пораженных тканей.
Настоящее изобретение предпочтительно относится к применению ИМП клеток, нагруженных или трансфицированных терапевтическим и/или диагностическим агентом. Терапевтический агент может помогать восстанавливать пораженные ткани. Диагностический агент, например флуоресцентная молекула, может помогать определить местоположение ИМП клетки в организме пациента. Указанные ИМП клетки могут быть нагружены или трансфицированы с применением любого способа, известного в данной области техники. Нагрузка ИМП клеток может быть произведена in vitro или ex vivo. В каждом случае указанные ИМП клетки могут просто находиться в контакте с агентом в культуре. В качестве альтернативы ИМП клетки могут быть нагружены агентом с помощью связующего вещества для доставки, такого как липосомы. Такие связующие вещества известны в данной области техники.
Трансфекция ИМП клеток может быть произведена in vitro или ex vivo. В качестве альтернативы стабильная трансфекция может быть произведена на стадии МК, что позволяет ИМП клеткам, экспрессирующим трансген, дифференцироваться из них. Указанные ИМП клетки трансфицированы нуклеиновой кислотой, кодирующей указанный агент. Например, могут быть использованы вирусные частицы или другие векторы, кодирующие указанный агент. Способы для этого известны в данной области техники.
Указанная нуклеиновая кислота служит основой для экспрессии указанного агента в ИМП клетках. Молекула указанной нуклеиновой кислоты будет предпочтительно содержать промотор, который функционально связан с последовательностью, кодирующей указанный агент, и который активен в ИМП клетках или который может быть активирован в ИМП клетках.
В конкретном предпочтительном варианте реализации нуклеиновая кислота, кодирующая указанный агент, может быть доставлена с помощью вирусных частиц. Указанные вирусные частицы могут содержать молекулы направленной доставки для обеспечения эффективной трансфекции. Указанные молекулы направленной доставки, как правило, будут представлены полностью или частично на поверхности вируса для того, чтобы молекулы были способны к направленной доставке вируса к ИМП клеткам.
В таких вариантах реализации может быть применен любой подходящий вирус. Указанный вирус может, например, представлять собой ретровирус, лентивирус, аденовирус, аденоассоциированный вирус, вирус осповакцины или вирус герпеса. В конкретном предпочтительном варианте реализации указанный вирус может представлять собой лентивирус. Указанный лентивирус может представлять собой модифицированный ВИЧ, подходящий для применения в доставке генов. Указанный лентивирус может представлять собой вектор на основе вируса иммунодефицита африканских обезьян (ВИО), вируса иммунодефицита кошек (ВИК) или вируса инфекционной анемии лошадей (ИНАН). Указанный вирус может представлять собой вирус лейкемии мышей Молони (ВЛММ). Вирусы, применяемые в изобретении, предпочтительно являются дефицитными по репликации.
Применение вирусных частиц не является обязательным. Может быть применен любой вектор, спо
- 15 034083 собный к транфекции ИМП клеток согласно настоящему изобретению, например, обычно применяемой трансфекции плазмидной ДНК или РНК.
Захват конструкции из нуклеиновой кислоты может быть повышен путем нескольких известных методик трансфекции, например, включающих применение трансфекционных агентов. Примеры этих агентов включают катионные агенты, например фосфат кальция и DEAE-декстран, и липофектанты, например реагенты Lipofectamine, Fugene и Transfectam.
Клетка может быть нагружена или трансфицирована в надлежащих условиях. Указанные клетка и агент или вектор могут, например, находиться в контакте в течение периода времени от пяти минут до десяти дней, предпочтительно от часа до пяти дней, более предпочтительно от пяти часов до двух дней и даже более предпочтительно от двенадцати часов до одного дня.
Согласно настоящему изобретению также предложены ИМП клетки, которые были нагружены или трансфицированы агентом, описанным выше. Такие ИМП клетки могут быть применены в терапевтических вариантах реализации согласно настоящему изобретению.
В некоторых вариантах реализации МК могут быть получены от пациента, преобразованы в ИМП клетки с помощью настоящего изобретения, нагружены или трансфицированы in vitro и затем возвращены в организм того же самого пациента. В таких случаях ИМП клетки, применяемые в настоящем изобретении, будут представлять собой аутологичные клетки и будут полностью совместимы с организмом пациента. В предпочтительном случае клетки, применяемые в настоящем изобретении получены от пациента и обработаны ex vivo и возвращены в организм того же самого пациента.
Фармацевтические композиции и введение.
Согласно настоящему изобретению также предложена фармацевтическая композиция, содержащая ИМП клетку согласно настоящему изобретению или популяцию согласно настоящему изобретению в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем, (ii) одну или более липосом и/или (iii) один или более микропузырьков. Указанная композиция может содержать (i); (ii); (iii); (i) и (ii); (i) и (iii); (ii) и (iii); или (i), (ii) и (iii). Указанную ИМП клетку или популяцию предпочтительно содержат в себе одна или более липосом и/или один или более микропузырьков. Может присутствовать любое количество липосом и/или микропузырьков. Любые числовые значения, рассмотренные выше относительно популяции согласно настоящему изобретению, в равной степени применимы к указанным липосомам и/или микропузырькам. Липосома или микропузырек может содержать одну ИМП клетку или более одной ИМП клетки.
Указанная композиция может содержать любую из ИМП клеток или популяций, упомянутых в настоящем документе и в некоторых вариантах реализации молекулы нуклеиновой кислоты, векторы или вирусы, описанные в настоящем документе. Согласно настоящему изобретению предложен способ восстановления пораженных тканей пациента, включающий введение пациенту эффективного количества фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению. Любой из рассмотренных выше терапевтических вариантов реализации в равной мере применим к данному варианту реализации.
Различные композиции согласно настоящему изобретению могут быть составлены с помощью любого подходящего способа. Получение составов клеток со стандартными фармацевтически приемлемыми носителями и/или вспомогательными веществами может быть осуществлено с применением способов, являющихся обычными в области фармации. Точная природа состава будет зависеть от ряда факторов, включая клетки для введения и желательный путь введения. Подходящие виды составов полностью описаны в справочнике Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Edition, Mack Publishing Company, Eastern Pennsylvania, USA.
Указанные клетки могут быть введены любым путем. Подходящие пути включают, но не ограничены ими, внутривенный, внутримышечный, внутрибрюшинный или другие адекватные пути введения. Если пораженная ткань представляет собой ткань сердца, указанные клетки могут быть введены эндомиокардиальным, эпимиокардиальным, внутрижелудочковым, интракоронарым, внутриартериальным, интраперикардиальным или внутривенным путем или ретроградным путем через коронарный синус. Если пораженная ткань представляет собой ткань кости, указанные клетки могут быть введены внутрикостным путем или в зону повреждения, например перелома или заболевания. Если пораженная ткань представляет собой ткань хряща, сухожилия, связки, печени, почек или легкого, клетки могут быть введены непосредственно в указанную ткань. Если пораженная ткань представляет собой ткань легкого, клетки могут быть введены внутрилегочным путем. Если пораженная ткань представляет собой ткань печени или почек, клетки могут быть введены внутрибрюшинным путем. Клетки предпочтительно вводят внутривенно.
Композиции могут быть приготовлены совместно с физиологически приемлемым носителем или разбавителем. Как правило, такие составы приготовлены в виде жидких суспензий клеток. Клетки могут быть смешаны со вспомогательным веществом, которое фармацевтически приемлемо и совместимо с активным ингредиентом. Подходящие вспомогательные вещества представляют собой, например, воду, солевой раствор, декстрозу, глицерин и тому подобное, а также их комбинации.
Кроме того, при необходимости фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению могут содержать незначительные количества вспомогательных веществ, таких как смачивающие или
- 16 034083 эмульгирующие агенты, pH-буферирующие агенты и/или адъюванты, которые повышают эффективность. Указанная композиция предпочтительно содержит человеческий сывороточный альбумин.
Одним из подходящих носителей или разбавителей является Plasma-Lyte А®. Это стерильный, непирогенный изотонический раствор для внутривенного введения. Каждые 100 мл содержит 526 мг хлорида натрия, Фармакопея США (NaCl); 502 мг глюконата натрия (C6H11NaO7); 368 мг тригидрата ацетата натрия, Фармакопея США (C2H3NaO2-3H2O); 37 мг хлорида калия, Фармакопея США (KCl); и 30 мг хлорида магния, Фармакопея США (MgCl2-H2O). Он не содержит антимикробных агентов. Значение pH отрегулировано с помощью гидроксида натрия. Значение pH составляет 7,4 (6,5-8,0).
Указанные ИМП клетки предпочтительно содержат в себе одна или несколько липосом и/или один или несколько микропузырьков. Подходящие липосомы известны в данной области техники. Подходящие липосомы описаны, например, в публикациях Akbarzadeh et al., Nanoscale Research Letters 2013, 8:102 и Meghana et al., International Journal Of Pharmaceutical And Chemical Sciences, 2012, 1(1): 1-10. Липиды, подходящие для применения при формировании липосом, описаны ниже относительно микропузырьков.
Микропузырьки, их формирование и биомедицинское применение известны в данной области техники (например, Sirsi and Borden, Bubble Sci. Eng. Technol., Nov 2009; 1(1-2): 3-17). Микропузырьки представляют собой пузырьки диаметром менее одного миллиметра и более одного микрометра. Микропузырьки, применяемые в настоящем изобретении, предпочтительно имеют диаметр 8 мкм или менее, например диаметр 7 мкм или менее, диаметр 6 мкм или менее, диаметр 5 мкм или менее, диаметр 4 нм или менее, диаметр 3 мкм или менее или диаметр 2 мкм или менее.
Указанные микропузырьки могу быть сформированы из любого вещества. Общий состав микропузырьков представляет собой газовое ядро, стабилизированное оболочкой. Газовое ядро может содержать воздух или тяжелый газ, например перфторуглерод, азот или перфторпропан. Тяжелые газы менее растворимы в воде, и поэтому с меньшей долей вероятности из микропузырька происходит их утечка, приводящая к разрушению микропузырька. Микропузырьки с ядрами из тяжелого газа обычно дольше сохраняются в сосудистом русле.
Указанная оболочка может быть сформирована из любого вещества. Материал оболочки предпочтительно содержит белок, поверхностно-активное вещество, липид, полимер или их смесь.
Подходящие белки, включают, но не ограничены ими, альбумин, лизоцим и авидин. Белки в оболочке могут быть химически сшиты, например, посредством связи цистеин-цистеин. Другие типы сшивок известны в данной области техники.
Подходящие поверхностно-активные вещества включают, но не ограничены ими, сорбитол, сорбитан монопальмитат (например, SPAN-40), полисорбатные детергенты (такие как TWEEN-40), смеси SPAN-40 и TWEEN-40 и стеарат сахарозы (моно- и диэфир).
Подходящие полимеры включают, но не ограничены ими, альгинатные полимеры, двойные сложноэфирные полимеры этилидена, сополимер поли(П.Г-лактид-со-гликолид) (PLGA), поли(виниловый спирт) (PVA), сополимер полиперфтороктилоксикарбонил-поли(молочная кислота) (PLA-PFO) и другие блок-сополимеры. Блок-сополимеры представляют собой полимерные материалы, в которых две или более мономерных субъединиц полимеризуются вместе с образованием единой полимерной цепи. Блоксополимеры, как правило, обладают свойствами, которые определены каждой мономерной субъединицей. Однако блок-сополимер может обладать уникальными свойствами, которыми полимеры, образованные из отдельных субъединиц, не обладают. Блок-сополимеры могут быть сконструированы таким образом, что одна из мономерных субъединиц является гидрофобной (т.е. липофильной), в то время как другая (ие) субъединица (ы) гидрофильна (ы) в водных средах. В этом случае блок-сополимер может обладать амфифильными свойствами и может формировать структуру, которая имитирует биологическую мембрану. Блок-сополимер может быть диблоковым (состоящим из двух мономерных субъединиц), но также могут быть построены из более чем двух мономерных субъединиц для формирования более сложных структур, которые ведут себя как амфифилы. Сополимер может представлять собой триблоковый, тетраблоковый или пентаблоковый сополимер. Блок-сополимеры также могут быть сконструированы из субъединиц, которые не классифицированы как липидная составляющая вещества; например, гидрофобный полимер может быть выполнен из силоксановых или других мономеров не на основе углеводородов. Гидрофильные составные части блок-сополимера также могут обладать низкой способностью к связыванию белка, которая позволяет образовывать мембрану, обладающую высокой устойчивостью при воздействии неочищенных биологических образцов. Эта единица группы головки также может быть получена из неклассических липидных групп головки.
Может быть применено любое липидное вещество, которое формирует микропузырек. Липидная композиция выбрана таким образом, что микропузырек обладает требуемыми свойствами, такими как поверхностный заряд, плотность упаковки или механические свойства. Указанная липидная композиция может содержать один или несколько различных липидов. Например, указанная липидная композиция может содержать до 100 липидов. Указанная липидная композиция предпочтительно содержит от 1 до 10 липидов. Указанная липидная композиция может содержать липиды естественного происхождения и/или
- 17 034083 искусственные липиды.
Указанный липид, как правило, состоит из группы головки, межфазного фрагмента и двух групп гидрофобного хвоста, которые могут быть одинаковыми или различными. Подходящие группы головки включают, но не ограничены ими, нейтральные группы головки, такие как диацилглицериды (ДГ) и церамиды (ЦМ); цвиттерионные группы головки, такие как фосфатидилхолин (ФХ), фосфатидилэтаноламин (ФЭ) и сфингомиелин (СМ); отрицательно заряженные группы головки, такие как фосфатидилглицерин (ФГ); фосфатидилсерин (ФС), фосфатидилинозитол (ФИ), фосфорные кислоты (ФК) и кардиолипин (КЛ); и положительно заряженные группы головки, такие как триметиламмония пропан (ТАП). Подходящие межфазные фрагменты включают, но не ограничены ими, межфазные фрагменты естественного происхождения, таких как фрагменты на основе глицерина или церамида. Подходящие группы гидрофобного хвоста включают, но не ограничены ими, насыщенные углеводородные цепи, такие как лауриновая кислота (н-додеканоловая кислота), миристиновая кислота (н-тетрадекановая кислота), пальмитиновая кислота (н-гексадекановая кислота), стеариновая кислота (н-стеариновая кислота) и арахидоновая (н-эйкозаноидная); непредельные углеводородные цепи, такие как олеиновая кислота (цис-9октадеаноидная); и разветвленные углеводородные цепи, такие как фитаноил. Длина цепи и положение и количество двойных связей в непредельных углеводородных цепях может варьировать. Длина цепи и положение и количество боковых цепей, таких как метальные группы, в разветвленной углеводородной цепи может варьировать. Группы гидрофобного хвоста могут быть связаны с межфазным фрагментом посредством эфирной или сложноэфирной связи.
Указанные липиды также могут быть химически модифицированы. Группы головки или хвоста указанных липидов могут быть химически изменены. Подходящие липиды, группы головки которых были химически модифицированы включают, но не ограничены ими, ПЭГ-модифицированные липиды, такие как 1,2-диацил-8и-глицеро-3-фосфоэтаноламин-Н-[метокси(полиэтиленгликоль)-2000]; функционализированные ПЭГ-липиды, такие как 1,2-дистеароил-8и-глицеро-3-фосфоэтаноламин-Н-[биотинил(полиэтиленгликоль)-2000]; и липиды, модифицированные для конъюгации, такие как 1,2-диолеоилsn-глицеро-З -фосфоэтаноламин-N-(сукцинил) и 1,2-дипальмитоил-8и-глицеро-3 -фосфоэтаноламин-N(биотинил). Подходящие липиды, группы хвоста которых были химически модифицированы, включают, но не ограничены ими, полимеризуемые липиды, такие как 1,2-бис(10,12-трикозадиноил)^и-глицеро-3фосфохолин; фторированные липиды, такие как 1-пальмитоил-2-(16-фторпальмитоил)^и-глицеро-3фосфохолин; дейтерированные липиды, такие как 1,2-дипальмитоил-О62^и-глицеро-3-фосфохолин; и липиды с простой эфирной связью, такие как 1,2-ди-О-фитонил^и-глицеро-3-фосфохолин. Указанные липиды могут быть химически модифицированы или функционализированы для облегчения связывания лигандов, рецепторов или антител, как описано выше.
Указанная липидная композиция может содержать одну или более добавок, которые будут влиять на свойства микропузырька. Подходящие добавки включают, но не ограничены ими, жирные кислоты, такие как пальмитиновая кислота, миристиновая кислота и олеиновая кислота; жирные спирты, такие как пальмитиновый спирт, миристиновый спирт и олеиновый спирт; стерины, таких как холестерин, эргостерин, ланостерин, ситостерин и стигмастерин; лизофосфолипиды, например 1-ацил-2-гидрокси^иглицеро-3-фосфохолин; и церамиды.
Оболочка микропузырьков предпочтительно сформирована из фосфолипидов. Подходящие фосфолипиды известны в данной области техники.
Существует несколько коммерчески доступных составов микропузырьков с липидными оболочками, таких как Defmity (Lautheus Medical Imagrng) и Sooovuc® (Bracco Diagиostics).
Указанный микропузырек также может быть сформирован из гибридного полимерного поверхностно-активного вещества, которое обеспечивает формирование полиэлектролитных многослойных (РЕМ) оболочек на предварительно полученном микропузырьке. Указанный предварительно полученный микропузырек покрыт заряженным поверхностно-активным веществом или слоем белка, который служит в качестве субстрата для осаждения РЕМ. Технологию сборки слой-за-слоем применяют для последовательной адсорбции противоположно заряженных полиионов на оболочку микропузырька. Например, РЕМ могут быть осаждены на микропузырьки с помощью поли(аллиламина гидрохлорида) (РАН) и поли(стиролсульфоната) (PSS) для образования полиионной пары. РЕМ-микропузырьки с фосфолипидами, содержащими катионную группу головки триметиламмония пропан (ТАР) в качестве подлежащей оболочки и ДНК и поли(Е-лизин) (PLL) в качестве полиионной пары, также были разработаны.
Указанные микропузырьки, как правило, образованы путем создания межфазной поверхности между газом и веществом оболочки микропузырька. Может быть использовано любое из описанных выше веществ. Некоторые вещества, такие как фосфолипиды, спонтанно формируют микропузырьки. Фосфолипиды самостоятельно собираются в микропузырьки. Другие вещества требуют соникации межфазной поверхности, т.е. применения звуковой энергии или звуковых волн к межфазной поверхности. Как правило, применяют ультразвуковые волны. Подходящие способы соникации известны в данной области техники.
Указанный микропузырек может быть нагружен ИМП клетками после формирования микропузырька или во время формирования микропузырька.
- 18 034083
Указанные ИМП клетки вводят способом, допустимым для данной лекарственной формы, и в количестве, которое будет терапевтически эффективно. Количество, которое должно быть введено, зависит от субъекта, подлежащего лечению, возможностей иммунной системы субъекта и степени необходимого восстановления. Точное количество ИМП клеток, которое необходимо вводить, может зависеть от решения лечащего врача и может быть индивидуальным для каждого субъекта.
Субъекту может быть введено любое подходящее количество клеток. Например, может быть введено по меньшей мере или примерно 0,2х106, 0,25х106, 0,5х106, 1,5х106, 4,0х106 или 5,0х106 клеток на кг массы тела пациента. Например, может быть введено по меньшей мере или примерно 105, 106, 107, 108, 109 клеток. В качестве ориентира число клеток согласно настоящему изобретению, которое необходимо вводить, может составлять от 105 до 109, предпочтительно от 106 до 108. Как правило, каждому пациенту вводят до 2х108 ИМП клеток. Может быть введено любое из конкретных количеств, рассмотренных выше в отношении популяции согласно настоящему изобретению. В подобных случаях, когда клетки введены или присутствуют, для содействия выживанию клеток может присутствовать питательная среда. В некоторых случаях клетки согласно настоящему изобретению могут быть предоставлены в замороженных аликвотах, и такие вещества, как ДМСО, могут присутствовать для содействия выживанию во время замораживания. Такие замороженные клетки, как правило, будут разморожены, а затем помещены в буфер или среду для ведения культуры или для введения.
Г ибридная композиция.
Одна или более ИМП клеток согласно настоящему изобретению могут стать частью гибридной композиции, как описано в заявке на патент Соединенного Королевства, поданной одновременно с настоящей заявкой (CTL Ref: FIBRE1), и быть предпочтительно введены пациенту как часть такой композиции. В частности, согласно изобретению предложена гибридная композиция, которая содержит:
(a) одно или более биосовместимых волокон;
(b) одну или более ИМП клеток согласно настоящему изобретению; и (c) один или более биосовместимых компонентов, которые (i) прикрепляют одну или более терапевтических клеток к одному или более указанных волокон и/или заключают в себе одну или более терапевтических клеток и одно или более указанных волокон и/или (ii) способны прикреплять указанную композицию к ткани.
Указанная гибридная композиция согласно настоящему изобретению содержит одно или более биосовместимых волокон. Волокно является биосовместимым, если оно не вызывает каких-либо нежелательных реакций или побочных эффектов, при контакте с поврежденной тканью.
Любое количество биосовместимых волокон может присутствовать в указанной композиции. Указанная композиция может содержать только одно волокно. Указанная композиция, как правило, содержит из более чем одно волокно, например по меньшей мере 2, по меньшей мере 5, по меньшей мере 10, по меньшей мере 20, по меньшей мере 30, по меньшей мере 40, по меньшей мере 50, по меньшей мере 100, по меньшей мере 200, по меньшей мере 500, по меньшей мере 1000 волокон или даже больше волокон.
Подходящие биосовместимые волокна известны в данной области техники. Одно или несколько биосовместимых волокон могут быть природными или синтетическими. Предпочтительные биосовместимые волокна включают, но не ограничены ими, целлюлозные волокна, коллагеновые волокна, коллаген-гликозаминогликановые волокна, желатиновые волокна, волокна фиброина шелка, одно или более фибриновых волокон, хитозановые волокна, волокна крахмал, альгинатные волокна, гиалуроновые волокна, полоксамерные волокна или их комбинацию. Указанный глюкозаминогликан предпочтительно представляет собой хондроитин. Указанная целлюлоза предпочтительно представляет собой карбоксиметилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу или метилцеллюлозу. Полоксамер предпочтительно представляет собой плюроновую кислоту, необязательно Pluronic F-127.
Если в указанной композиции присутствует более одного такого волокна, популяция волокон может быть однородной. Другими словами, все из указанных волокон в популяции могут быть волокнами одного и того же типа, например целлюлозными волокнами. В качестве альтернативы популяция волокон может быть неоднородной. Другими словами, популяция волокон может содержать различные типы волокон, такие целлюлозные волокна и коллагеновые волокна.
Указанные одно или более волокон могут иметь любую длину. Указанные одно или более волокон предпочтительно имеют примерно такую же длину, как глубина поражения ткани, которая подлежит лечению с помощью указанной композиции. Длина одного или более волокон предпочтительно разработана таким образом, что указанная композиция может проникнуть в пораженную ткань до предписанной глубины. Одно или более волокон могут иметь любую длину. Нижний предел длины одного или более волокон, как правило, определен диаметром одной или более терапевтических клеток. Подходящие значения длины включают, но не ограничены ими, по меньшей мере 1 мкм в длину, по меньшей мере 10 мкм в длину, по меньшей мере 100 мкм в длину, по меньшей мере 500 мкм в длину, по меньшей мере 1 мм в длину, по меньшей мере 10 мм (1 см) в длину, по меньшей мере 100 мм (10 см) в длину, по меньшей мере 500 мм (50 см) в длину или по меньшей мере 1000 мм (100 см или 1 м) в длину. Одно или более волокон могут быть даже длиннее. Например, указанные одно или более волокон могут иметь длину до 5
- 19 034083 или 10 м, например, при применении для восстановления повреждений вдоль кишечного тракта человека, или даже длиннее, при применении для более крупных животных, таких как лошади. Длина одного или более волокон, как правило, определена их целевым назначением и/или их пригодностью к манипуляциям, например выполняемым хирургом, роботом или другими средствами, например посредством магнита.
Указанные одно или более волокон могут быть заряженными. Указанные одно или более волокон предпочтительно положительно заряжены. Указанные одно или более волокон предпочтительно отрицательно заряжены.
Указанные одно или более волокон могут быть магнитными. Указанные одно или более волокон могут быть модифицированы для включения одного или более магнитных атомов или групп. Это делает возможной магнитную направленную доставку указанной композиции. Указанные магнитные атомы или группы могут быть парамагнитными или суперпарамагнитными. Подходящие атомы или группы включают, но не ограничены ими, атомы золота, атомы железа, атомы кобальта, атомы никеля и хелатирующие металлы группы, такие как нитрилотриуксусная кислота, содержащие любые из этих атомов. Хелатирующие металлы группы могут, например, включать группу, выбранную из -С(=О)О-, -С-О-С-, -С(=О), -NH-, -C(=O)-NH, - C(=O)-CH2-I, -S (=О)2- и -S-.
Указанная композиция также содержит один или более биосовместимых компонентов. Указанные один или более биосовместимых компонентов: (i) прикрепляют одну или более терапевтических клеток к одному или более волокон и/или заключают в себе одну или более терапевтических клеток и одно или более волокон и/или (ii) способны прикреплять указанную композицию к ткани. Указанные одно или более биосовместимых компонентов могут: (а) прикреплять одну или более терапевтических клеток к одному или более волокнам, (b) заключать в себе одну или более терапевтических клеток и одно или более волокон, (с) быть способными прикреплять указанную композицию к ткани, (d) прикреплять одну или более терапевтических клеток к одному или более волокнам и заключать в себе одну или более терапевтических клеток и одно или более волокон, (е) прикреплять одну или более терапевтических клеток к одному или более волокнам и быть способными прикреплять указанную композицию к ткани, (f) заключать в себе одну или более терапевтических клеток и одно или более волокон и быть способными прикреплять указанную композицию к ткани или (g) прикреплять одну или более терапевтических клеток к одному или более волокнам, заключать в себе одну или более терапевтических клеток и одно или более волокон и быть способными прикреплять указанную композицию к ткани.
Компонент является биосовместимым, если он не вызывает каких-либо нежелательных реакций или побочных эффектов при контакте с поврежденной тканью.
В указанной композиции может присутствовать любое количество биосовместимых компонентов. Указанная композиция, как правило, содержит только один компонент или два компонента. Указанная композиция может содержать более двух компонентов, например по меньшей мере 3, меньшей мере 5, меньшей мере 10, меньшей мере 20, по меньшей мере 30, меньшей мере 40, меньшей мере 50 или даже большее число компонентов.
Указанные один или более биосовместимых компонентов предпочтительно содержат биосовместимый адгезив, который прикрепляет одну или более терапевтических клеток к одному или более волокнам. Указанный биосовместимый адгезив может прикреплять одну или более терапевтических клеток (а) к поверхности одного или более волокон (b) ко внутренней части одного или более волокон или (с) как к поверхности, так и ко внутренней части одного или более волокон.
Указанный биосовместимый адгезив может быть натуральным или синтетическим. Подходящие биосовместимые адгезивы известны в данной области техники. Подходящие биосовместимые адгезивы включают, но не ограничены ими, фибрин, фибриновый гель, интегрин, интегриновый гель, кадгерин и кадгериновый гель.
Указанные один или более биосовместимых компонентов предпочтительно содержат биосовместимый гель, в котором заключены одна или более терапевтических клеток и одно или более волокон. Подходящие биосовместимые гели известны в данной области техники. Указанный биосовместимый гель может быть природным или синтетическим. Предпочтительные биосовместимые гели включают, но не ограничены ими, целлюлозный гель, коллагеновый гель, желатиновый гель, фибриновый гель, хитозановый гель, крахмальный гель, альгинатный гель, гиалуроновый гель, агарозный гель, полоксамерный гель или их комбинацию.
Указанный целлюлозный гель может быть образован любой из разновидностей целлюлозы, рассмотренных выше. Концентрация полимера целлюлозы предпочтительно составляет от примерно 1,5 мас./мас.% до примерно 4,0 мас./мас.%, например от примерно 2,0 мас./мас.% до примерно 3,0 мас./мас.%. Указанный полимер целлюлозы предпочтительно имеет молекулярную массу, составляющую от примерно 450000 до примерно 4000000, например от примерно 500000 до примерно 3500000, от примерно 500000 до примерно 3000000 или от примерно 750000 до примерно 2500000 или от примерно 1000000 до примерно 2000000.
Полоксамерный гель предпочтительно представляет собой гель плюроновой кислоты, при необходимости гель Pluronic F-127.
- 20 034083
Указанный адгезив или гель предпочтительно имеет вязкость в диапазоне от 1000 до 500000 мПа-с (сП) при комнатной температуре, например от примерно 1500 до примерно 450000 мПа-с при комнатной температуре, от примерно 2000 до примерно 400000 мПа-с при комнатной температуре, от примерно 2500 до примерно 350000 мПа-с при комнатной температуре, от примерно 5000 до примерно 300000 мПа-с при комнатной температуре, от примерно 10000 до примерно 250000 мПа-с при комнатной температуре, от примерно 50000 до примерно 200000 мПа-с при комнатной температуре или от примерно 50000 до примерно 150000 мПа-с при комнатной температуре.
Вязкость представляет собой меру сопротивления адгезива и/или геля, деформации за счет напряжения сдвига или напряжения растяжения. Вязкость может быть измерена с применением любого способа, известного в данной области техники. Подходящие способы включают применение вискозиметра или реометра, но не ограничены им.
Комнатная температура, как правило, составляет от примерно 18°С до примерно 25°С, например от примерно 19°С до примерно 24°С или от примерно 20°С до примерно 23°С или от примерно 21°С до примерно 22°С. Комнатная температура предпочтительно составляет любое из значений: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 и 25°С. Наиболее предпочтительно измерять вязкость при 25°С.
Указанные один или более биосовместимых компонентов предпочтительно содержат биосовместимый адгезив, который прикрепляет одну или более терапевтических клеток к одному или более волокнам, и биосовместимый гель, в котором заключены одна или более терапевтических клеток и одно или более волокон. Например, указанная композиция может содержать фибриновый гель, который прикрепляет одну или более терапевтических клеток к одному или более волокнам и целлюлозный гель, в котором заключены одна или более терапевтических клеток и одно или более волокон.
В любом из вариантов реализации, рассмотренных выше, биосовместимый адгезив и/или биосовместимый гель предпочтительно содержит лизат тромбоцитов. Например, адгезив и/или гель могут представлять собой гель лизата тромбоцитов. Словосочетание лизат тромбоцитов предназначено для обозначения комбинации природных факторов роста, содержащихся в тромбоцитах, высвобожденных посредством лизирования этих тромбоцитов. Лизис может быть осуществлен химическим способом (т.е. посредством CaCl2), посредством осмоса (с применением дистиллированной H2O) или с помощью процедур замораживания/оттаивания. Лизат тромбоцитов может быть получен из цельной крови, как описано в патенте США № 5198357. Лизат тромбоцитов предпочтительно должен быть приготовлен, как описано в заявке PCT/GB12/052911 (опубликованной как WO 2013/076507). Например, он может быть приготовлен путем подвергания популяции тромбоцитов по крайней мере одному циклу замораживаниеоттаивание, в котором стадию замораживания каждого цикла осуществляют при температуре, меньшей или равной -78°С.
Указанный адгезив и/или гель предпочтительно содержат: (а) лизат тромбоцитов, (b) по меньшей мере один фармацевтически приемлемый полимер и (с) по меньшей мере одно фармацевтически приемлемое положительно заряженное химическое соединение, выбранное из группы, состоящей из лизина, аргинина, гистидина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, аланина, метионина, пролина, серина, аспарагина, цистеина, полиаминокислот, протамина, аминогуанидина, ионов цинка и ионов магния, при этом указанная композиция представляет собой водный гель, имеющий вязкость в диапазоне от 1000 до 500000 мПа-с (сП) при комнатной температуре. Указанный фармацевтически приемлемый полимер предпочтительно представляет собой целлюлозу или полоксамер. Это может быть любая из разновидностей из целлюлозы и полоксамеров, рассмотренных выше.
Указанный лизат тромбоцитов предпочтительно представляет собой лизат тромбоцитов человека. Лизат тромбоцитов более подробно рассмотрен выше.
Указанную гибридная композицию предпочтительно содержат в себе одна или более липосом и/или один или более микропузырьков. Такие структуры известны в данной области техники.
Нижеследующие примеры иллюстрируют изобретение.
Примеры
Пример 1. Выделение из костного мозга и периферической крови и наращивание ИМП клеток.
Образец костного мозга разводили буферным физиологическим раствором Хэнка и наслаивали на Ficoll-Paque для выделения мононуклеарных клеток (МК) путем центрифугирования. Указанные МК затем снова ресуспендировали в буферном физиологическом растворе Хэнка и подсчитвали с помощью исключающего анализа с применением 0,4% трипанового синего для оценки жизнеспособности клеток. Клетки высевали в культуральные флаконы Т25 (в 5 мл среды для культивирования клеток, аМЕМ, GlutaMAX, пенициллин-стрептомицин, лизат тромбоцитов, гепарин) и инкубировали при 37° С, 5% СО2. На день 8 указанную среду заменяли. Проводили ежедневный мониторинг клеток на предмет ИМПподобных клеток и, если они присутствовали, их отбирали с помощью раствора для диссоциации клеток в соответствии с инструкциями производителя и пересевали в те же среды, что указано выше. Клетки криоконсервировали на пассаже 2 в культуральной среде с 10% диметилсульфоксида при -80°С и хранили в жидком азоте для последующего применения.
Пример 2. Анализ методом HT-FACS.
- 21 034083
Анализ методом высокопроизводительной сортировки клеток с активированной флуоресценцией (HT-FACS) представляет собой высокопроизводительную скрининговую платформу, которая может быстро характеризовать фенотип клеточной поверхности клеток в суспензии, с более чем 370 маркерами клеточной поверхности, включенными в настоящее время в панель. Эта платформа прошла тщательную проверку и была выполнена на многих типах человеческих тканей и клеток. Указанная панель состоит из 375 антител, специфичных к поверхности клеток человека, нанесенных на поверхности лунок 96луночных планшетов.
Задача состояла в определении профиля экспрессии поверхностного антигена ИМП клеток человека согласно настоящему изобретению и МСК человека, полученных от компании Lonza®. Платформа высокопроизводительной FACS (HT-FACS) позволяет проводить скрининг 375 поверхностных антигенов.
Одну ампулу криоконсервированных ПК-МСК (1х106 клеток/мл) высевали в культуральный флакон Т75 см2, содержащий 15 мл среды CTL (37°С, 5% СО2). Клетки выращивали до достижения монослоем конфлюэнтности 80-90%, заменяя среду каждые 2-3 дня. Для пассирования клеток среду удаляли и клетки дважды промывали PBS. Клетки обрабатывали 3 мл раствора трипсина 0,25% до открепления. Восемь миллилитров среды добавляли для инактивации трипсина и клетки собирали центрифугированием при 400 g в течение 5 мин. Клетки ресуспендировали в 5 мл среды и высевали в культуральный флакон Т175 см2, содержащий 30 мл среды CTL (37°С, 5% СО2). Было необходимо от 8 до 10 культуральных флаконов Т175 см2 с конфлюэнтностью 80-90% для сбора 20-30 миллионов клеток (на пассаже 4) для проведения скрининга методом HT-FACS. Для получения достаточного количества событий для каждого антитела при анализе методом проточной цитометрии оптимальным является количество жизнеспособных клеток, составляющее примерно 20 миллионов клеток. Для сбора клеток среду удаляли и клетки дважды промывали PBS. Клетки обрабатывали 5 мл раствора трипсина 0,25% до открепления. Среду (8 мл) добавляли для инактивации трипсина и сбора клеток. Клетки центрифугировали при 400 g в течение 5 мин. Содержащий клетки осадок ресуспендировали (одноклеточная суспензия) в общей сложности в 5 мл HBSS (сбалансированного солевого раствора Хэнка без кальция/магния, с 2 мМ EDTA и 1% BSA). Для определения общего числа жизнеспособных клеток с помощью исключающего красителя (0,2% трипанового синего) использовали одну аликвоту образца (10 мкл).
100 мкл образца загружали в каждую лунку (примерно 40000 клеток в лунке для обеспечения сбора от 10000 до 20000 событий при проведении анализа методом FACS). Образцы пропускали через BD FACSDiva с дополнительно установленным BD High Throughput Sampler (автоматизированным дозатором). Анализ данных, полученных в ходе анализа методом проточной цитометрии, выполняли с помощью программного обеспечения FlowJo. Результаты представляли на графиках и в электронной таблице Excel, содержащей значения процента положительных клеток и медианной интенсивности флуоресценции (МИФ) для каждого антитела.
Результаты анализа методом HT-FACS
№ Маркер Альтернативное название: % ИМП % МСК Lonza®
1 BLTR-1 6,7 1,37
2 В2- микроглобули н 99,8 100
3 СА9 Карбоангидраза 9 5,22 0
4 CDH3 Кадгерин-З/Р-кадгерин 2,93 0,475
5 CDH6 Кадгерин-6 0,6 0,235
6 CDH11 Кадгерин-11 61,6 0,88
7 CDw93 Н,5 4,75
8 CDwl98 CCR8 10,6 5,17
9 CDwl99 CCR9 17,2 2,54
10 CDw210 Альфа-субъединица рецептора интерлейкина 10,8 0,622
- 22 034083
10 (IL 1 ORA)
11 CDw218a Рецептор 1 интерлейкина-18 (IL18R1) 0,384 0
12 CDw329 Иммуноглобулин-подобный лектин, связывающий сиаловую кислоту 9 (Siglec-9) 0,182 0
13 CDla 0,338 0,28
14 CDlb 0,766 0,745
15 CDlc 15,7 0,926
16 CDld R3G1 2,7 0
17 CD2 LFA-2 0,292 0,526
18 CD3 0,158 0
19 CD3e 0,087 0
20 CD4 1,И 0,157
21 CD5 Leu-1 0,151 0,34
22 CD6 1,04 2,68
23 CD7 GP40/Leu-9 0,239 0,24
24 CD8 0,214 0
25 CD8b 4,34 0,705
26 CD9 ВТСС-1 38,1 51,9
27 CD10 Неприлизин (NEP) / общий антиген острого лимфобластного лейкоза (CALLA) 90,6 87,1
28 CDlla ITGAL, LFA-1 1,57 0
29 CDllb Интегрин альфа-М (ITGAM) 6,24 0
30 CDllc Интегрин альфа-Х (ITGAX) 1,8 0
31 CD13 Аланинаминопептидаза (ANPEP) 100 100
32 CD14 8,03 6,25
33 CD15 SSEA-1 0,137 0,474
34 CD16 Fc-рецептор 10,1 3,73
35 CD 16b Низкоаффинный рецептор Fc-фрагмента IgG, тип ШЬ (FCGR3B) 0,331 0
36 CD17 Лактозилцерамид (LacCer) 20,9 0,462
37 CD18 Интегрин бета-2 0,65 0
38 CD19 0,21 0
- 23 034083
39 CD20 0,176 0
40 CD21 Рецептор комплемента типа 2 (Сг2)/рецептор вируса Эпштейна-Барра (EBV R) 0,66 0
41 CD22 BL-CAM/Siglec-2 0,596 0
42 CD23 Низкоаффинный Fc-рецептор иммуноглобулина эпсилон (FCER2) 0,551 0,234
43 CD24 0,987 4
44 CD25 Альфа-субъединица рецептора интерлейкина- 2 (IL2RA) 1,44 1,67
45 CD26 Дипептидилпептидаза IV (DPP4) 21,3 6,33
46 CD27 Член 7 суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли (TNFRSF7) 0,409 0
47 CD28 0,643 0
48 CD29 Интегрин бета-1 (ITGB1) 100 100
49 CD30 Член 8 суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли (TNFRSF8) 0,446 0
50 CD31 РЕСАМ 1,29 0,214
51 CD32 Низкоаффинный рецептор Fc-фрагмента иммуноглобулина гамма, тип ПЬ 0,698 3,46
52 CD33 Siglec-3 1,25 0,372
53 CD34 0,287 0,885
54 CD35 Рецептор комплемента типа 1 (Crl) 0,134 0
55 CD36 Гликопротеин тромбоцитов 4/рецептор тромбоспондина 0,458 3,57
56 CD37 Тетраспанин-26 (TSPAN26) 0,0917 0,182
57 CD38 АДФ-рибозилциклаза 1 0,28 0
58 CD39 Эктонуклеозид трифосфат дифосфогидролаза НТФаза 1 0,126 21,8
59 CD40 Член 5 суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли (TNFRSF5) 0,132 3,12
60 CD41a 0,293 0
61 CD41b 0,075 0
- 24 034083
62 CD42a Гликопротеин тромбоцитов IX 0,528 0,131
63 CD42b Альфа-цепь гликопротеина тромбоцитов lb 7,29 0
64 CD43 Лейкосиалин 0,406 1,81
65 CD44 Эпикан 99,9 99,7
66 CD45 Тирозиновая протеинфосфатаза С рецепторного типа, общий лейкоцитарный антиген 0,271 0
67 CD45RA 5,18 2,99
68 CD45RB 0,283 0,671
69 CD45RO 0,57 0
70 CD46 Мембранный кофакторный белок, трофобластный общий лейкоцитарный антиген 78,1 22,5
71 CD47 Антигенный детерминантный белок клеточной поверхности ОАЗ 92,3 99,9
72 CD48 SLAM F2 0,141 0,125
73 CD49a Интегрин альфа-1 (ITGA1) 24 51,5
74 CD49b Интегрин альфа-2 (ITGA2) 97,7 45,8
75 CD49c Интегрин альфа-3 (ITGA3) 99,9 99,6
76 CD49d Интегрин альфа-4 (ITGA4) 93,7 26
77 CD49e Интегрин альфа-5 (ITGA5) 100 99,8
78 CD49f Интегрин альфа-6 (ITGA6) 93,3 24,1
79 CD50 ICAM-3 0,244 0,8
80 CD51/CD61 92,7 68
81 CD52 Антиген CAMPATH-1 0,218 0,128
82 CD53 1,66 0,292
83 CD54 ICAM-1 23,1 23,7
84 CD55 Фактор ускорения распада комплемента 94,5 52,5
85 CD56 NCAM 3,05 4,71
86 CD57 Член 1 подсемейства лектиноподобных рецепторов типа G 0,193 0
87 CD58 LFA-3 99,7 98,1
- 25 034083
88 CD59 G 100 100
89 CD60b 34 10,9
90 CD61 Интегрин бета-3 ITGB3 81,8 56,7
91 CD62E Лиганд Е-селектина 2,33 1,03
92 CD62L Лиганд L-селектин 0,432 0,151
93 CD62P Лиганд Р-селектин 0,325 0,924
94 CD63 Ассоциированный с лизосомами мембранный белок 3 (LAMP-3) 99,1 95,8
95 CD64 Высокоафинный Fc-рецептор иммуноглобулина гамма тип I (Рс-гамма-RI) 0,263 0,225
96 CD65 0,825 0
97 CD65s 7,62 0,539
98 CD66 Бета-1-гликопротеин беременности PSGB1 0,474 0,737
99 CD66b 0,129 0
100 CD66c Молекула клеточной адгезии 6 связанная с раковоэмбриональным антигеном 23,4 7,33
101 CD66d Молекула клеточной адгезии 3 связанная с раковоэмбриональным антигеном 2,06 0,322
102 CD66e Молекула клеточной адгезии 5 связанная с раковоэмбриональным антигеном 56,1 13,6
103 CD69 Молекула, индуцирующая активацию (МИА) 0,296 0,279
104 CD70 Член 7 суперсемейства лигандов фактора некроза опухоли (TNFSF7) 0,36 0,187
105 CD71 Белок-рецептор трансферрина 1 51 4,71
106 CD72 0,036 0,334
107 CD73 5'-нуклеотидаза / SH3/SH4 100 99,8
108 CD74 Гамма-цепь антигена гистосовместимости класса IIHLA 0,177 0,587
109 CD75 Бета-гал актозид-альфа-2,6-сиалилтрансфераза 0,0789 0,304
ПО CD77 Лактозилцерамид-4-альфагалактозилтрансфераза 7,15 2,4
111 CD79a Альфа-цепь белка ассоциированного с 15,4 0,45
- 26 034083
комплексом рецепторов антигенов В-клеток
112 CD79b Бета-цепь белка ассоциированного с комплексом рецепторов антигенов В-клеток 4,87 0,317
113 CD80 Активационный антиген В7-1 2,94 4,57
114 CD81 Тетраспанин-28 100 99,9
115 CD82 Тетраспанин-27 96,3 82,7
116 CD83 27,9 1,34
117 CD84 SLAM F5 7,94 4,1
118 CD85a Член 3 подсемейства лейкоцитарных иммуноглобулиноподобных рецепторов типа В (LIR-3) 6,76 0,971
119 CD85d Член 2 подсемейства лейкоцитарных иммуноглобулиноподобных рецепторов типа В (LIR-3) 17 0,98
120 CD85g Член 4 подсемейства лейкоцитарных иммуноглобулиноподобных рецепторов типа А 47,2 6,15
121 CD85h Член 2 подсемейства лейкоцитарных иммуноглобулиноподобных рецепторов типа A (LILRA2) 15,6 0
122 CD85j Член 1 подсемейства лейкоцитарных иммуноглобулиноподобных рецепторов типа В (LIR-1) 20,6 0,221
123 CD86 24,7 0,702
124 CD87 Рецептор активатора плазминогена урокиназного типа (uPAR) 0,178 1,61
125 CD88 Рецептор 1 хемотаксического анафилотоксина С5а 1,32 0,352
126 CD89 Fc- рецептор иммуноглобулина альфа 5,73 0,244
127 CD90 Мембранный гликопротеин Thy-1 100 99,3
128 CD91 Белок 1 ассоциированный с рецептором липопротеинов низкой плотности (LRP-1) 95,5 63,4
- 27 034083
129 CD92 Белок 1 подобный переносчику холина 35,4 33,3
130 CD94 Антиген натуральных клеток-киллеров CD94 KLRD1 0,121 0,321
131 CD95 CD95L (лиганд) /Член 6 суперсемейства лигандов фактора некроза опухоли (TNFSF6) 98,9 66,7
132 CD96 Белок-антиген повышенной поздней экспрессии на поверхности активированных Т-клеток 21 2,63
133 CD97 1,64 0,434
134 CD98 Малая субъединица 1 активатора транспорта больших нейтральных аминокислот 100 99,9
135 CD99 Гликопротеин Е2 поверхности Т-клеток 24,8 0,224
136 CD100 Семафорин-40 0,103 0,132
137 CD101 Член 2 суперсемейства иммуноглобулинов (IgSF2) 0,29 0
138 CD 102 ICAM-2 9,24 2,91
139 CD103 Интегрин альфа-Е (ITGAE) 0,152 0,297
140 CD 104 Интегрин бета-4 (ITGB4) 4,06 99,3
141 CD 105 Эндоглин (SH2) 99,9 100
142 CD106 VCAM 6,93 4,64
143 CD107a Ассоциированный с лизосомами мембранный белок 1 (LAMP-1) 0,717 0,337
144 CD107b Ассоциированный с лизосомами мембранный гликопротеин 2 (LAMP-2) 0,221 0,225
145 CD108 Семафорин-7А 99,7 78
146 CD109 1,89 0,253
147 CD110 Рецептор тромбопоэтина (TPO-R) 55,6 16,6
148 CD111 Медиатор проникновения вируса герпеса С 90,7 0
149 CD112 Связанный с рецептором вируса полиомиелита белок 2 12,1 0,64
150 CD114 Рецептор гранулоцитарного колониестимулирующего фактора 54,9 4,83
- 28 034083
(ГКСФР/КСФЗР)
151 CD115 Макрофагальный колониестимулирующий фактор 1 рецептор КСФ-1 рецептор (КСФ-1-Р) 8,41 0
152 CD116 Альфа субъединица рецептора гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора ГМ-КСФ-Ральфа 17 2,61
153 CD117 Рецептор фактора тучных/стволовых клеток Kit (c-kit) 31,5 2,56
154 CD118 Рецептор лейкемия-ингибирующего фактора (LIF-R) 67,4 0
155 CD119 Рецептор 1 интерферона гамма (ИФНгаммаР) 78,5 24,8
156 CD120a Член 1А суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли (TNFR1) 38,1 0
157 CD 120b Член 1В суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли (TNFR2) 1,Н 0,297
158 CD121b Рецептор типа 2 интерлейкина-1 (IL1R2) 39,8 2,75
159 CD 122 Бета-субъединица рецептора интерлейкина-2 (IL2RB) 41,7 4,56
160 CD123 Альфа-субъединица рецептора интерлейкина- 3 (IL3RA) 46,9 7,06
161 CD 124 Альфа-субъединица рецептора интерлейкина- 4 (IL4RA) 1,52 0,225
162 CD125 Альфа-субъединица рецептора интерлейкина- 5 (IL5RA) 19,5 0
163 CD126 Альфа-субъединица рецептора интерлейкина 6 (IL-6R 1) 7,05 0,709
164 CD127 Альфа-субъединица рецептора интерлейкина- 7 (IL7RA) 18,5 12,5
165 CD129 Рецептор интерлейкина-9 (IL9R) 0,178 0
166 CD130 Бета-субъединица рецептора интерлейкина-6 (IL6RB) 83,6 8,15
- 29 034083
167 CD131 Общая бета-субъединица рецепторов цитокинов 0,684 0
168 CD132 Общая гамма-субъединица рецепторов цитокинов (IL2RG) 78,8 3,43
169 CD133 АС-133 (проминин-1) 0,054 0
170 CD134 Член 4 суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли (TNFSF4) 8,15 1,29
171 CD135 Рецепторная тирозиновая протеинкиназа FLT3 5,18 0,575
172 CD136 Рецептор стимулирующего макрофаги белка (MSP-R) 0,302 0
173 CD137 Член 9 суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли (TNFRSF9) 0,392 0
174 CD137L Мышиный? 13,5 15,6
175 CD138 Синдекан-1 (SYND1) 0,227 0
176 CD140a Рецептор тромбоцитарного фактора роста альфа (PDGFRA) 4,1 0,98
177 CD 140b Рецептор тромбоцитарного фактора роста бета (PDGFRB) 89,1 97,8
178 CD141 Т ромбомо дулин 21 0,385
179 CD 142 Тканевой фактор/тромбопластин 0,478 0,555
180 CD143 Ангиотензинпревращающий фермент (АПФ) 29,3 0
181 CD 144 Кадгерин-5 0,0728 0,159
182 CD146 MUC18 94,2 89,5
183 CD147 Базигин 100 100
184 CD148 Рецепторная тирозиновая протеинкиназа эта 84,6 0
185 CD150 Сигнальная молекула лимфоцитарной активации (SLAMF-1) 0,467 0,364
186 CD151 РЕТА-3 100 99,9
187 CD152 Цитотоксический Т-лимфоцитарный антиген 4 (CTLA-4) 6,45 5,87
188 CD153 Член 8 суперсемейства лигандов фактора некроза опухоли (TNFSF8) 10,9 1,19
- 30 034083
189 CD154 Лиганд CD40 0,357 0,893
190 CD155 Рецептор вируса полиомиелита (PVR) 99,8 100
191 CD156b Белок 17, содержащий домены дезинтегрина и металлопротеиназ (ADAM-17) 81 36,4
192 CD157 АДФ-рибозилциклаза-2/Антиген стромы костного мозга 1 (BST-1) 0,713 6,33
193 CD158a Иммуноглобулиноподобный рецептор клетоккиллеров 2DL1 0,0919 0,22
194 CD158b Иммуноглобулиноподобный рецептор клетоккиллеров 2DL2 0,129 0,195
195 CD158b2 Иммуноглобулиноподобный рецептор клетоккиллеров 2DL3 2,54 0
196 CD158d Иммуноглобулиноподобный рецептор клетоккиллеров 2DL4 56,3 1,56
197 CD158e2 Иммуноглобулиноподобный рецептор клетоккиллеров 3DL1 0,254 0
198 CD158f Иммуноглобулиноподобный рецептор клетоккиллеров 2DL5A 25 0
199 CD158i Иммуноглобулиноподобный рецептор клетоккиллеров 2DS4 21,9 3,12
200 CD159a NKG2-A/NKG2-B интегральный мембранный белок типа II (KLR-C1) 6,57 0,462
201 CD159c NKG2-C интегральный мембранный белок типа II (KLR-C2) 2,44 0,917
202 CD160 1,07 0,9
203 CD161 Член 1 подсемейства лектиноподобных рецепторов клеток-киллеров типа В (KLRB1) 5,95 3,64
204 CD 162 Гликопротеиновый лиганд 1 Р-селектина (PSGL-1) 13,2 4,41
205 CD163 Богатый цистеином скэвенджер-рецептор типа 1 белок М130 0,197 0
206 CD 164 Коровый белок сиаломуцина 24 (MUC-24) Н,9 27
- 31 034083
207 CD165 0,716 3,55
208 CD166 Молекула адгезии активированных лейкоцитов 99,9 99,8
209 CD167 Рецептор с дискодиновым доменом типа 2 (DDR2) 0,496 7,69
210 CD169 Сиалоадгезин/Siglec-l 1,76 0,178
211 CD170 Иммуноглобулин-подобный лектин, связывающий сиаловую кислоту 5 (Siglec-5) П,9 74,3
212 CD171 Молекула адгезии нервных клеток LI (NCAM- L1) 1,9 0
213 CD172a Субстрат нерецепторных тирозиновых протеинфосфатаз 1 (SHP-1) 61,8 3,33
214 CD 172b Сигнальный регуляторный белок бета-1 (SIRP-beta-1) 0,0955 0,285
215 CD172g Сигнальный регуляторный белок гамма (SIRPgamma) 14,5 7,14
216 CD175s 96,2 27,1
217 CD177 Аллоантиген нейтрофилов человека 2а (HNA2а) 0,477 0,46
218 CD178 CD95L (лиганд) /Член 6 суперсемейства лигандов фактора некроза опухоли (TNFSF6) 51,6 0,49
219 CD179a 6,31 1,84
220 CD180 0,824 0,478
221 CD181 CXCR1 85 2,55
222 CD182 CXCR2 68,8 4,31
223 CD183 CXCR3 3,08 0
224 CD184 CXCR4 0,219 0,775
225 CD185 CXCR5 6,04 1,39
226 CD186 CXCR6 1,48 41,5
227 CD191 CCR1 12,6 0
228 CD 192 CCR2 0,0662 0,0497
229 CD193 CCR3 51 8,16
- 32 034083
230 CD 194 CCR4 7ЛЗ 0
231 CD195 CCR5 1,02 1,94
232 CD196 CCR6 46,3 2,8
233 CD197 CCR7 0,159 0
234 CD200 OX-2 мембранный гликопротеин (МОХ-1) / (МОХ-2) 0,594 0,912
235 CD201 Эндотелиальный рецептор протеина С 55,7 0,858
236 CD202b Рецептор ангиопоэтина-1 TIE2/TEK 82,7 23,2
237 CD203c Член 3 семейства эктону клеотидироф осф атаз/ф осф одиэстераз (ENPP3) 8,66 0
238 CD204 Макрофагальный скэвенджер-рецептор типов I и II (MSR1) 13,7 1,44
239 CD205 Лимфоцитарный антиген 75 (Ly-75) 4,94 0
240 CD206 Маннозный рецептор макрофагов 1 (MMR) 0,205 0
241 CD207 Член К доменного семейства 4 лектинов типа С (Лангерин) 0,0679 2,7
242 CD208 Ассоциированный с лизосомами мембранный гликопротеин 3 (LAMP-3) 3,27 0
243 CD209 0,153 0
244 CD212 Субъединица бета-1 рецептора интерлейкина- 12 (IL12RB1) 0,476 0,127
245 CD213a2 Субъединица альфа-2 рецептора интерлейкина-13 (IL13RA2) 8,7 8
246 CD215 Альфа-субъединица рецептора интерлейкина- 15 14,6 0,86
247 CD217 Рецептор интерлейкина-17 типа A(IL17RA) 29,8 35,8
248 CD218b Акцессорный белок рецептора интерлейкина- 18 (IL-18 R-beta) 23,4 0,463
249 CD220 Рецептор инсулина IR 2,93 1,5
250 CD221 Рецептор инсулиноподобного фактора роста 1 IGF-1R 3,16 1,1
- 33 034083
251 CD222 Рецептор инсулиноподобного фактора роста 2 IGF-2R 8,09 0,768
252 CD223 Белок, кодируемый геном активации лимфоцитов 3 (LAG-3) 38,9 0
253 CD226 Акцессорная молекула DNAX 1 (DNAM-1) 1,15 0,22
254 CD227 Муцин-1 (MUC-1) 4,87 5,79
255 CD229 Поверхностный антиген Т-лимфоцитов Ly-9 0,579 5,56
256 CD230 Основной прионовый белок (РгР) 99,9 100
257 CD231 Тетраспанин-7 (TSPAN-7) 34,2 34,8
258 CD234 Антиген Даффи/хемокиновый рецептор (DARC) 7,7 0,397
259 CD235a Гликофорин-А 55,8 5,П
260 CD243 (ВС) 20,8 2,31
261 CD243 (BD) 0,208 0
262 CD244 Рецептор натуральных клеток-киллеров 2В4 0,548 0
263 CD245 99,2 13,3
264 CD249 Глутамиламинопептидаза (ЕАР) 19,7 0
265 CD252 Член 4 суперсемейства лигандов фактора некроза опухоли (TNFSF7) 21,4 20,6
266 CD253 Член 10 суперсемейства лигандов фактора некроза опухоли (TNFSF10) 44,1 7,07
267 CD254 RANKL, TNFSF11 12,3 3,85
268 CD255 10,1 0,437
269 CD256 Член 13 суперсемейства лигандов фактора некроза опухоли (TNFSF13) 7,94 0,792
270 CD257 Член 13В суперсемейства лигандов фактора некроза опухоли (TNFSF13B) 63,2 5,03
271 CD258 Член 14 суперсемейства лигандов фактора некроза опухоли (TNFSF14) 3,17 0
272 CD261 Член 10А суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли (TNFRSF10A) 30,3 21,4
273 CD262 Член 10В суперсемейства рецепторов фактора 12,1 4,55
- 34 034083
некроза опухоли (TNFRSF10B)
274 CD263 Член ЮС суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли (TNFRSF10C) 1,47 0
275 CD264 Член 10D суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли (TNFRSF10D) 44,9 9,09
276 CD267 Член 13В суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли (TNFRSF13B) 91,8 36,6
277 CD268 Член 13С суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли / (BAFF-R) 64,6 13,5
278 CD269 Член 17 суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли (TNFRSF17) 8,51 2,4
279 CD270 Член 14 суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли 31,6 8,79
280 CD271 Высокоафинный рецептор фактора роста нервов (NGFR) 1,63 10,4
281 CD272 В- и Т-лимфоцитарный аттенюатор 33,2 12,3
282 CD273 Лиганд 2 запрограммированной клеточной гибели 1 92,4 51,7
283 CD274 Лиганд 1 запрограммированной клеточной гибели 1 23,9 1,12
284 CD275 Лиганд ICOS 26 0,904
285 CD276 4Ig-B7-H3 100 97,8
286 CD277 Член А1 суперсемейства 3 бутирофилина 1,55 0
287 CD278 Индуцибельный костимулятор Т-клеток 0,147 0,0836
288 CD279 Белок запрограммированной клеточной гибели 1 5,5 0,492
289 CD281 Толл-подобный рецептор 1 54,7 2,12
290 CD282 Толл-подобный рецептор 2 0,101 0,529
291 CD283 Толл-подобный рецептор 3 68,9 6,92
292 CD284 Толл-подобный рецептор 4 7,94 0,84
293 CD286 Толл-подобный рецептор 6 76,9 Н,4
294 CD288 Толл-подобный рецептор 8 85,6 Н,2
- 35 034083
295 CD289 Толл-подобный рецептор 9 11,3 0,359
296 CD290 Толл-подобный рецептор 11 45,1 9,5
297 CD292 Рецептор типа 1А костного морфогенетического белка 2,39 0,522
298 CD294 Рецептор 2 простагландина D2 8,81 34,1
299 CD295 Рецептор лептина (Lep-R) 49 73,7
300 CD298 Бета-3 субъединица натрий/калий транспортирующая АТФаза 99,8 98,9
301 CD299 Член М доменного семейства 4 лектинов типа С 29,5 1,07
302 CD300a СМРР35-подобная молекула 8 (CLM-8) 1,82 0,222
303 CD300c СМРР35-подобная молекула 6 (CLM-6) 37,3 3,76
304 CD300e СМРР35-подобная молекула 2 (CLM-2) 38,7 0,697
305 CD301 Член А доменного семейства 10 лектинов типа С 3,39 0,626
306 CD303 Член С доменного семейства 4 лектинов типа С 66,8 3,33
307 CD304 Нейропилин-1 (NRP-1) 65,2 0,502
308 CD305 Ассоциированный с лейкоцитами иммуноглобулиноподобный рецептор 1 (LIAR-1) 4,12 0,972
309 CD307 7,08 0,305
310 CD309 VEGFR2 / FLK-1 / KDR 34,4 14,2
311 CD312 Содержащий EGF-подобный модуль муциноподобный гормон-рецептор-подобный 2 24,8 12,2
312 CD314 NKG2-D интегральный мембранный белок типа II 38,5 11,6
313 CD317 Антиген стромы костного мозга 2 48,9 25
314 CD318 Содержащий CUB-домен белок 1 71,7 12,3
315 CD319 Член 7 семейства SLAM 27,8 21,9
316 CD321 Узловая молекула адгезии A (JAM-А) 3,81 5,04
- 36 034083
317 CD322 Узловая молекула адгезии В (JAM-B/2) 4,37 0,248
318 CD324 Кадгерин-1 17,2 0,387
319 CD325 Кадгерин-2 / N-кадгерин 3,83 0,501
320 CD326 Молекула адгезии эпителиальных клеток (ЕРСАМ) 18,1 0,463
321 CD328 Siglec-7 32 1,99
322 CD332 FGFR2 0,814 0,181
323 CD333 FGFR3 7,78 1,01
324 CD334 FGFR4 1,35 1,76
325 CD335 NCR1 0,669 0,274
326 CD336 NCR2 0,544 0,212
327 CD337 87,3 26,4
328 CD338 Член 2 суперсемейства G транспортеров АТФсвязывающих кассет 49 19,5
329 CD339 «Зазубренный» белок типа 1 (jagged-1) 1,76 1,22
330 CD340 Рецепторная тирозиновая протеинкиназа егЬВ- 2 94,9 41
331 CD344 Frizzled 4 65,5 17,5
332 CD349 Frizzled 9 87,6 80,3
333 CD351 FCAMR 76,4 28,1
334 CD352 SLAM-6 0,518 0,394
335 CD354 TREM-1 13,6 1,66
336 CD355 Цитотоксическая и регуляторная молекула Тклеток 10,4 1,24
337 CD357 Член 18 суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли 10,4 1,95
338 CD358/DR6 45,1 7,63
339 CD360 (BD) 24,9 3,53
340 CD360 (BL) 33 4,5
341 CD362 Синдекан-2 14,7 0,774
342 CD363 Сфингозин-1-фосфатный рецептор 1 18,7 0,757
343 CLA 0,277 9,23
- 37 034083
344 CLIP 0,138 0
345 DCIR 0,264 0,15
346 EGF-R 33,3 2,02
347 FMC7 0,0776 0
348 HLA-ABC 99,9 99,8
349 HLA-A2 3,52 20,9
350 HLA-DM 0,172 0,14
351 HLA-DR 0,247 0,481
352 НРС 2,14 6,31
353 ITGB7 0,34 0,159
354 LTBR Член 3 суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли 34,5 87,6
355 MIC А / В 97,1 0,328
356 Notchl 20,5 4,01
357 Notch2 95,8 22,8
358 Notch3 5,37 2,15
359 РАС-1 0,137 0,971
360 Подопланин 8,81 2,91
361 SSEA-1 20,7 0,395
362 SSEA-1 87,4 2,44
363 Stro-1 18,5 6,27
364 TCR альфа- бета 0,327 0,195
365 TCR гамма- дельта 52,9 П,1
366 TPBG 0,197 0,178
367 VB8 TCR 25,1 3,93
368 VD2 TCR 13,2 12,1
369 fMLP-R П,4 0,641
Пример 3. Анализ на платформе Luminex.
Анализ на платформе Luminex применяли для количественного определения цитокинов в кондиционированной среде от клеток Lonza и культур ИМП клеток. Данные представлены в пг/мкг РНК для стандартизации данных, имеющих отношение к клеток в е
пг/мкг РНК
Цитокин/хемокин МСК ИМП Результат
IL-6 162,4 596 Увеличение
IL-8 6,9 59,8 Увеличение
IP-10 1,4 13,7 Увеличение
МСР-1 75,8 322,5 Увеличение
RANTES 1,07 125,3 Увеличение
IL-10 0,8 0,1 Снижение
IL-12 (р70) 41,6 21,9 Снижение

Claims (12)

1. Иммуномодулирующая прогениторная (ИМП) клетка, экспрессирующая на своей поверхности детектируемые количества MIC А/В, CD304 (нейропилина 1), CD178 (лиганда FAS), CD289 (толлподобного рецептора 9), CD363 (сфингозин-1-фосфатного рецептора 1), CD99, CD181 (С-Х-С-хемокинового рецептора типа 1; CXCR1), рецептора эпидермального фактора роста (EGF-R), CXCR2 и CD126.
2. ИМП клетка по п.1, отличающаяся тем, что указанная ИМП клетка является аутологичной или аллогенной.
3. Популяция иммуномодулирующих прогениторных (ИМП) клеток, в которой:
(i) по меньшей мере 90% клеток в указанной популяции экспрессируют на своей поверхности детектируемые количества MIC А/В, (ii) по меньшей мере 60% клеток в указанной популяции экспрессируют на своей поверхности детектируемые количества CD304 (нейропилина 1), (iii) по меньшей мере 45% клеток в указанной популяции экспрессируют на своей поверхности детектируемые количества CD178 (лиганда FAS), (iv) по меньшей мере 10% клеток в указанной популяции экспрессируют на своей поверхности детектируемые количества CD289 (толл-подобного рецептора 9), (v) по меньшей мере 15% клеток в указанной популяции экспрессируют на своей поверхности детектируемые количества CD363 (сфингозин-1-фосфатного рецептора 1), (vi) по меньшей мере 20% клеток в указанной популяции экспрессируют на своей поверхности детектируемые количества CD99, (vii) по меньшей мере 80% клеток в указанной популяции экспрессируют на своей поверхности детектируемые количества CD181 (С-Х-С-хемокинового рецептора типа 1; CXCR1), (viii) по меньшей мере 30% клеток в указанной популяции экспрессируют на своей поверхности детектируемые количества рецептора эпидермального фактора роста (EGF-R), (ix) по меньшей мере 60% клеток в указанной популяции экспрессируют на своей поверхности детектируемые количества CXCR2, и (x) по меньшей мере 5% клеток в указанной популяции экспрессируют на своей поверхности детектируемые количества CD126, причём указанная популяция содержит по меньшей мере две ИМП клетки по п.1.
4. Популяция по п.3, где:
(i) по меньшей мере 97% клеток в указанной популяции экспрессируют на своей поверхности детектируемые количества MIC А/В, (ii) по меньшей мере 65% клеток в указанной популяции экспрессируют на своей поверхности детектируемые количества CD304 (нейропилина 1), (iii) по меньшей мере 51% клеток в указанной популяции экспрессируют на своей поверхности детектируемые количества CD178 (лиганда FAS), (iv) по меньшей мере 11% клеток в указанной популяции экспрессируют на своей поверхности детектируемые количества CD289 (толл-подобного рецептора 9), (v) по меньшей мере 18% клеток в указанной популяции экспрессируют на своей поверхности детектируемые количества CD363 (сфингозин-1-фосфатного рецептора 1), (vi) по меньшей мере 24% клеток в указанной популяции экспрессируют на своей поверхности детектируемые количества CD99, (vii) по меньшей мере 85% клеток в указанной популяции экспрессируют детектируемые количества CD181 (CXCR1), (viii) по меньшей мере 33% клеток в указанной популяции экспрессируют детектируемые количества рецептора эпидермального фактора роста (EGF-R), (ix) по меньшей мере 68% клеток в указанной популяции экспрессируют детектируемые количества CXCR2, и (x) по меньшей мере 7% клеток в указанной популяции экспрессируют детектируемые количества CD126.
5. Популяция по п.3, отличающаяся тем, что указанная популяция включает по меньшей мере 5000 клеток, по меньшей мере 50000 клеток или по меньшей мере 250000 клеток.
6. Фармацевтическая композиция для восстановления повреждённой ткани у пациента, содержащая ИМП клетку по любому из пп.1, 2 или популяцию по любому из пп.3-5, и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.
7. Способ получения популяции ИМП клеток по любому из пп.3-5, включающий: (i) культивирование мононуклеарных клеток (МК) в течение от 15 до 25 дней в среде, содержащей лизат тромбоцитов, менее чем 20% кислорода (O2) и в условиях, при которых происходит адгезия ИМП клеток и индуцируется дифференцировка указанных МК в ИМП клетки, и (ii) отбор и культивирование тех ИМП клеток, которые имеют паттерн экспрессии, указанный в любом из пп.3-5.
- 39 034083
8. Способ по п.7, согласно которому МК представляют собой мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) или первичные МК, выделенные из костного мозга.
9. Применение популяции по любому из пп.3-5 для восстановления поврежденной ткани у пациента или лечения заболевания сердца, кости, хряща, сухожилия, связки, печени, почки или легкого пациента.
10. Применение по п.9, где указанное заболевание сердца выбрано из инфаркта миокарда, гипертрофии левого желудочка, гипертрофии правого желудочка, эмболии, сердечной недостаточности, врожденного порока сердца, заболевания клапана сердца, аритмии или миокардита.
11. Применение по п.9, где указанная популяция является аутологичной или аллогенной.
12. Применение фармацевтической композиции по п.6 для восстановления поврежденной ткани у пациента или лечения заболевания сердца, кости, хряща, сухожилия, связки, печени, почки или легкого пациента.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
EA201692254A 2014-06-12 2015-06-09 Иммуномодулирующие прогениторные (имп) клетки EA034083B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB1410504.3A GB201410504D0 (en) 2014-06-12 2014-06-12 Immuno-modulaltory progenitor (IMP) cell
PCT/GB2015/051673 WO2015189587A1 (en) 2014-06-12 2015-06-09 Immuno-modulatory progenitor (imp) cell

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201692254A1 EA201692254A1 (ru) 2017-06-30
EA034083B1 true EA034083B1 (ru) 2019-12-25

Family

ID=51266501

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201692254A EA034083B1 (ru) 2014-06-12 2015-06-09 Иммуномодулирующие прогениторные (имп) клетки

Country Status (24)

Country Link
US (2) US20170080029A1 (ru)
EP (2) EP2984163B1 (ru)
JP (2) JP6185657B2 (ru)
KR (2) KR20160029092A (ru)
CN (1) CN105473711A (ru)
AU (1) AU2015273271B2 (ru)
CA (1) CA2951492C (ru)
CY (1) CY1119093T1 (ru)
DK (1) DK2984163T3 (ru)
EA (1) EA034083B1 (ru)
ES (1) ES2622397T3 (ru)
GB (1) GB201410504D0 (ru)
HK (1) HK1219504A1 (ru)
HR (1) HRP20170657T1 (ru)
HU (1) HUE033392T2 (ru)
IL (2) IL249298B (ru)
LT (1) LT2984163T (ru)
MA (1) MA38860B1 (ru)
MY (1) MY181994A (ru)
PL (1) PL2984163T3 (ru)
PT (1) PT2984163T (ru)
SG (1) SG11201610355PA (ru)
WO (1) WO2015189587A1 (ru)
ZA (1) ZA201608402B (ru)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201513996D0 (en) 2015-08-07 2015-09-23 Cell Therapy Ltd Immuno-oncology mesodermal progenitor (IOMP) cell
WO2017168170A1 (en) * 2016-03-31 2017-10-05 Cell Therapy Limited Immuno-modulatory progenitor (imp) cell expressing one or more of cd3, cd3e, cd8, cd8b, cd4, cd5, cd6 and cd7
JP7108537B2 (ja) * 2016-04-27 2022-07-28 ロート製薬株式会社 Ｃｄ２０１、ｃｄ４６、ｃｄ５６、ｃｄ１４７及びｃｄ１６５からなる群より選択される少なくとも１種の細胞表面マーカーを発現する間葉系幹細胞及びその調製方法、並びに上記間葉系幹細胞を含む医薬組成物及びその調製方法
CN106267161A (zh) * 2016-09-30 2017-01-04 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种干细胞制剂及其制备方法和应用
CN107184602B (zh) * 2017-06-01 2020-06-30 刘未斌 一种治疗肿瘤的药物组合
EP3653700A4 (en) * 2017-07-13 2021-04-14 National University Corporation Tokyo Medical and Dental University TENDON OR ARTIFICIAL LIGAMENT TISSUE PRODUCED BY A THREE-DIMENSIONAL MECHANOSIGNAL CELL CULTURE SYSTEM
CN108660203A (zh) * 2018-05-18 2018-10-16 大连医科大学附属第医院 Cxcr2基因在心脏相关疾病中的用途
US20210115139A1 (en) * 2018-05-30 2021-04-22 Genome And Company Pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, containing cd300e inhibitor as active ingredient
EP3804736A4 (en) * 2018-06-05 2022-03-30 Medipost Co., Ltd. PHARMACEUTICAL COMPOSITION WITH MESENCHYMAL STEM CELLS AS AN EFFECTIVE INGREDIENT TO PREVENT OR TREAT AN INFLAMMATORY DISEASE
GB201900554D0 (en) 2019-01-15 2019-03-06 Cell Therapy Ltd Mesodermal killer (mk) cell
WO2020148520A1 (en) 2019-01-15 2020-07-23 Cell Therapy Limited Mesodermal killer (mk) cell
CN110314173A (zh) * 2019-07-17 2019-10-11 中国医科大学附属第一医院 一种用于治疗骨关节炎的细胞制剂及其制备方法
EP4054595A4 (en) * 2019-11-07 2023-11-15 Massachusetts Eye and Ear Infirmary CULTURED AUTOLOGOUS LIMBAL EPITHELIAL CELLS (CALEC) TRANSPLANTATION
WO2024080661A1 (ko) * 2022-10-12 2024-04-18 (주) 엘피스셀테라퓨틱스 신규한 혈관 형성 줄기세포
WO2024078729A1 (en) * 2022-10-14 2024-04-18 University College Cork - National University Of Ireland, Cork Placenta expressed proteins for use in the treatment of tendon injury

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE8801537D0 (sv) 1988-04-26 1988-04-26 Ellco Food Ab Cellodlingsmedium samt forfarande for dess framstellning
EP2506867B1 (en) * 2009-12-02 2014-10-08 Cardio3 Biosciences S.A. Pharmaceutical compositions for the stimulation of stem cells.
US20130189741A1 (en) * 2009-12-07 2013-07-25 Cellscript, Inc. Compositions and methods for reprogramming mammalian cells
HUE039236T2 (hu) 2011-07-06 2018-12-28 Cell Therapy Ltd Mezodermális eredetû progenitorsejtek
SG2014011209A (en) 2011-11-23 2014-05-29 Cell Therapy Ltd Platelet lysate gel

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"ESGCT and FSGT Collaborative Congress Helsinki, Finland September 17–20, 2015 Abstracts", HUMAN GENE THERAPY, MARY ANN LIEBERT, XP055215257, ISSN: 10430342, DOI: 10.1089/hum.2015.29008.abstracts *
ABDI REZA; ET AL: "Immunomodulation by mesenchymal stem cells: a potential therapeutic strategy for type 1 diabetes.", DIABETES, AMERICAN DIABETES ASSOCIATION, US, vol. 57, no. 7, 1 July 2008 (2008-07-01), US, pages 1759 - 1767, XP008098188, ISSN: 0012-1797, DOI: 10.2337/db08-0180 *
ALMA J. NAUTA AND WILLEM E. FIBBE: "Hnmunomodulatory properties of mesenchymal stromal cells", BLOOD, THE AMERICAN SOCIETY OF HEMATOLOGY, US, vol. 110, no. 10, 1 November 2007 (2007-11-01), US, pages 3499 - 3506, XP007913721, ISSN: 0006-4971, DOI: 10.1182/blood-2007-02-069716 *
CAPELLI C, ET AL: "Human platelet lysate allows expansion and clinical grade production of mesenchymal stromal cells from small samples of bone marrow aspirates or marrow filter washouts", BONE MARROW TRANSPLANTATION, NATURE PUBLISHING GROUP, GB, vol. 40, no. 8, 1 October 2007 (2007-10-01), GB, pages 785 - 791, XP002545732, ISSN: 0268-3369, DOI: 10.1038/sj.bmt.1705798 *
HEBA ABDELRAZIK, GRAZIA M. SPAGGIARI, LAURA CHIOSSONE, LORENZO MORETTA: "Mesenchymal stem cells expanded in human platelet lysate display a decreased inhibitory capacity on T- and NK-cell proliferation and function", EUROPEAN JOURNAL OF IMMUNOLOGY, WILEY-VCH, vol. 41, no. 11, 1 November 2011 (2011-11-01), pages 3281 - 3290, XP055053525, ISSN: 00142980, DOI: 10.1002/eji.201141542 *
KAREN ENGLISH: "Mechanisms of mesenchymal stromal cell immunomodulation", IMMUNOLOGY AND CELL BIOLOGY, UNIVERSITY OF ADELAIDE, vol. 91, no. 1, 1 January 2013 (2013-01-01), pages 19 - 26, XP055208784, ISSN: 08189641, DOI: 10.1038/icb.2012.56 *
KARUSSIS, D. KASSIS, I. KURKALLI, B.G.S. SLAVIN, S.: "Immunomodulation and neuroprotection with mesenchymal bone marrow stem cells (MSCs): A proposed treatment for multiple sclerosis and other neuroimmunological/neurodegenerative diseases", JOURNAL OF NEUROLOGICAL SCIENCES., ELSEVIER SCIENTIFIC PUBLISHING CO, AMSTERDAM., NL, vol. 265, no. 1-2, 11 January 2008 (2008-01-11), NL, pages 131 - 135, XP022419440, ISSN: 0022-510X *
YOO, K.H. ; JANG, I.K. ; LEE, M.W. ; KIM, H.E. ; YANG, M.S. ; EOM, Y. ; LEE, J.E. ; KIM, Y.J. ; YANG, S.K. ; JUNG, H.L. ; SUNG, K.: "Comparison of immunomodulatory properties of mesenchymal stem cells derived from adult human tissues", CELLULAR IMMUNOLOGY., ACADEMIC PRESS, SAN DIEGO, CA., US, vol. 259, no. 2, 1 January 2009 (2009-01-01), US, pages 150 - 156, XP026614283, ISSN: 0008-8749, DOI: 10.1016/j.cellimm.2009.06.010 *

Also Published As

Publication number Publication date
ZA201608402B (en) 2019-04-24
KR20160029092A (ko) 2016-03-14
MY181994A (en) 2021-01-18
WO2015189587A1 (en) 2015-12-17
MA38860A (fr) 2016-02-17
JP6185657B2 (ja) 2017-08-23
HUE033392T2 (en) 2017-12-28
US20170080029A1 (en) 2017-03-23
US20190142869A1 (en) 2019-05-16
EA201692254A1 (ru) 2017-06-30
IL262827A (en) 2018-12-31
HK1219504A1 (zh) 2017-04-07
HRP20170657T1 (hr) 2017-06-30
CA2951492A1 (en) 2015-12-17
MA38860B1 (fr) 2017-09-29
EP3211069A1 (en) 2017-08-30
PT2984163T (pt) 2017-05-09
PL2984163T3 (pl) 2017-08-31
EP2984163B1 (en) 2017-02-01
AU2015273271B2 (en) 2020-12-17
KR20180004319A (ko) 2018-01-10
CY1119093T1 (el) 2018-01-10
AU2015273271A1 (en) 2016-12-22
NZ727129A (en) 2021-02-26
JP2017200474A (ja) 2017-11-09
IL249298A0 (en) 2017-02-28
CA2951492C (en) 2022-12-06
IL249298B (en) 2018-11-29
CN105473711A (zh) 2016-04-06
GB201410504D0 (en) 2014-07-30
ES2622397T3 (es) 2017-07-06
JP2016525342A (ja) 2016-08-25
SG11201610355PA (en) 2017-01-27
EP2984163A1 (en) 2016-02-17
LT2984163T (lt) 2017-05-10
DK2984163T3 (en) 2017-05-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2984163B1 (en) Immuno-modulatory progenitor (imp) cell
US10829739B2 (en) Progenitor cells of mesodermal lineage
US10316291B2 (en) Immuno-oncology mesodermal progenitor (ioMP) cell
EP3154599B1 (en) Hybrid composition
JP2022520777A (ja) ｉｎ ｖｉｖｏでの免疫細胞の増殖をブースト可能なアジュバント
NZ727129B2 (en) Immuno-modulatory progenitor (imp) cell
US20230047325A1 (en) Mesodermal killer (mk) cell
WO2017168170A1 (en) Immuno-modulatory progenitor (imp) cell expressing one or more of cd3, cd3e, cd8, cd8b, cd4, cd5, cd6 and cd7
WO2021204204A1 (zh) 一种转染抗原基因的细胞疫苗及相关免疫细胞

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM