PT2780461T - Processo enzimático para a produção de copolímeros de hidroxialcanoatos utilizando duas matérias-primas diferentes - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

"PROCESSO ENZIMÁTICO PARA A PRODUÇÃO DE COPOLÍMEROS DE HIDROXIALCANOATOS UTILIZANDO DUAS MATÉRIAS-PRIMAS DIFERENTES" A presente invenção relaciona-se com um processo para a produção microbiana de copoliésteres, em particular copolimeros de hidroxialcanoato microbianos, a partir de duas matérias-primas diferentes contendo sacarose.

Antecedentes da invenção.

Poli-hidroxialcanoatos (PHAs) são uma família de biopoliésteres sintetizados e acumulados em células bacte-rianas como armazenamento de carbono e energia. Os biopoliésteres podem ser fundidos e moldados como plásticos convencionais, mas biodegradam completamente no ambiente. Uma vez que os bioplásticos PHA são produzidos a partir de matérias-primas renováveis, o consumo de combustíveis fósseis e as emissões de gases com efeito de estufa são muito inferiores às dos homólogos derivados do petróleo.

Poli-(3-hidroxibutirato), habitualmente identificado como P3HB ou PHB, é o PHA mais comum formado por microorganismos a partir de hidratos de carbono, e pode ser representado pela seguinte fórmula:

A formação de outros PHAs necessita muitas vezes de precursores ou de substratos estruturalmente relacionados. Os monómeros de hidroxialcanoato gerados através do metabolismo em espécies microbianas nativas são habitualmente 3-hidroxialcanoatos (3HAs) na configuração R devido à estereoespecificidade das enzimas na biossíntese de PHA.

Devido à alta estereoregularidade, os biopoliés-teres exibem algumas propriedades únicas tal como actividade óptica, biodegradabilidade, biocompatibilidade e elevada cristalinidade de alguns polímeros de PHA. Por exemplo, ο P3HB tem uma elevada cristalinidade até 70%, resultando num material rígido com elevada temperatura de fusão (180 °C) , elevado módulo elástico (3,5 GPa), elevada resistência à tracção (43 MPa), mas baixo alongamento à ruptura (5%). Tem portanto aplicações limitadas. A ductilidade do P3HB pode ser melhorada introduzindo grupos laterais volumosos, tal como grupos etilo, no esqueleto do poliéster, para formar um copoliéster, poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato), habitualmente identificado como P3HB3HV ou PHBV, tendo a fórmula:

Comparando com ο ΡΗΒ, um copoliéster PHBV (HB:HV=90:10) tem cristalinidade inferior (60%), menor ponto de fusão (140 °C) , menor módulo de elasticidade (0,8 GPa), menor resistência à tracção (20 MPa), mas alongamento à ruptura mais elevado (50%) . Os monómeros 3HV, no entanto, podem ser incorporados na rede cristalina de P3HB, um fenómeno designado por isodimorfismo que reduz a função do grupo etilo (ver e.g. o artigo por P.J. Barham, P. Barker, S.J. Organ, FEMS Microbiol. Lett. 103: 289-298 (1992)).

Por incorporação de um monómero longo, tal como 4-hidroxibutirato (4HB) no esqueleto de PHA, a cristalinidade pode também ser reduzida, e assim as propriedades do material podem ser modificadas. Por exemplo, um copoliéster, P3HB4HB (3HB:4HB=84:16), tendo a fórmula:

tem uma cristalinidade de 45%, módulo de elasticidade de 26 MPa, e alongamento à ruptura de 400% (ver o artigo de Z. Zhu, P. Dakwa, P. Tapadia, R.W. Whitehouse, S.Q. Wang, Macromolecules 36: 4891-4897. (2003)). O monómero longo parece bastante eficaz a melhorar a ductilidade dos copoliésteres. Um conteúdo elevado de 4HB, no entanto, resulta num módulo de elasticidade baixo e cristalização lenta.

Um terpoliéster, poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidro-xivalerato-co-4-hidroxivalerato) (3HB:3HV:4HV = 0,8:69,2:30) -habitualmente identificado como P3HB3HV4HV ou PHBVV - tendo a fórmula:

foi sintetizado a partir de ácido 4-cetovalérico utilizando a bactéria P. putida GPpl04. O terpoliéster é solidificado muito lentamente a partir da fusão, o que pode representar um grande desafio para o processamento térmico e a fabricação do bioplástico (ver o artigo de V, Gorenflo, G. Schmack, R. Vogel e A. Steinbuchel, Bromacrornolecules, 2: 45-57 (2001)), O solidifica muito lentamente a partir da fusão, o que pode representar um grande desafio ao processamento térmico e ao fabrico do bioplástico (ver o artigo de V. Gorenflo, G. Schmack, R. Vogel e A. Steinbuchel, Biomacromolecules, 2: 45-57 (2001)).

Na biossíntese microbiana de PHA, os monómeros de 3HV, 4HB e 4HV derivam muitas vezes de precursores ou produtos quimicos com estrutura relacionada tal como ácido propiónico, 1,4-butanodiol e ácido 4-cetovalérico, quer como fonte única de carbono quer como co-substrato com fontes comuns de carbono tal como glucose. Os precursores, no entanto, são frequentemente muito mais caros do que a glucose ou os hidratos de carbono, contribuindo assim notavelmente perna elevar os custos de produção dos bioplásticos de PHA. Raistonía eutropha é um produtor de PHA representativo e pode acumular polímeros de PHA até 70-80% em peso da massa celular. Este gram.-negat.ivo aeróbico, não esporulado, cresce em fontes simples de carbono e sais minerais. Na presença de glucose e ácido propiónico ou ácido valérico, a R. eutropha sintetiza copolímeros de P3HB3HV com um conteúdo de 3HV de 5 a 25% molar. Devido à incorporação relativamente ineficiente dos ácidos orgânicos no esqueleto de PHA, uma concentração elevada de ácido é frequentemente mantida no meio de cultura, resultando numa toxicidade elevada para as células.

Na Patente US No. 5.364.778 é revelada uma possível solução para o problema anterior, em que um processo microbiológico para a produção se copolímeros compreendendo unidades de monómero HB e HV utilizando uma bactéria de acumulação de PHB que não é capaz de crescimento significativo quando cultivada sob condições não limitativas do crescimento num substrato constituído essencialmente por um componente HV. Assim, pelo menos parte da cultura é levada a. cabo em condições limitativas de crescimento, i.e. em condições em que um requisito essencial para o crescimento mas não para a acumulação de copolímero seria limitado. Sob tais condições de limitação do crescimento a tendência da bactéria para produzir e acumular homopolímero de PHB seria evitada, e a produção e a acumulação de copolímero contendo HV seriam induzidas.

Sm Matt Jaremko e Jian Yu (Journal of Biotechnology, Julho cle 20x1, páginas 113-122), é revelada a bioconversão de ácido levulínico com enzimas brutas de Cupriavidus necator, mostrando a evidência directa da formação de acetilo-CoA e propionilo-CoA a partir de ácido levulínico. Os resultados do estudo revelaram ainda os intermediários metabólicos iniciais através dos quais a C. necator sintetiza um copolímero de PHA constituído principalmente por monómeros 3HB e 3HV.

Jian Yu et ai. (J. Biobased Materials and Energy, 2009, pp. 113-122) revela a síntese de biopoliéster e a regulação de proteínas em Ralstonia eutropha em ácido levulínico e seus derivados a partir da refinação da biomassa, corn particular referência à conversão e biossíntese do ácido levulínico em poli-hidroxialcanoatos.

Jian Yu et al (Bioresource Technology, 2008, pp-8042-8048) revela a utilização de hidrolisado de bagaço pela Ralstonia eutropha,

Jian Yu et al (Green Polymer Chemistry, 2010, pp-161-173) revela a utilização de ácido 4-cetovalérico por uma estirpe tolerante de Ralstonia eutropha.

Sumário da invenção O Requerente enfrentou o problema da produção de poliésteres biodegradáveis com uma combinação de resistên cia e ductilidade de material de modo a torná-los adequados parôi uma ampla gama de aplicações. 0 requerente concentrou os seus esforços nos copolímeros de hidroxialcanoato, e particularmente nos terpolímeros de PHBVV, cuja produção por fermentação microbiana., como apresentado acima, apresenta muitos inconvenientes, principalmente devido ao custo elevado dos precursores orgânicos para os monómeros 3HV e 4HV, a incorporação ineficiente de monómeros de HV no esqueleto de poliéster, à toxicidade de precursores orgânicos para as células microbianas e aos elevados custos de produção do processo global.

Deve notar-se que, na presente descrição e reivindicações, o termo "copolímero" (ou "copoliéster") inclui qualquer polímero (ou poliéster) constituído por pelo menos dois comonómeros diferentes, em particular inclui ambos os copolímeros, nomeadamente os polímeros formados por dois monómeros diferentes (tal como P3HB3HV e P3HB4HB) e terpolímeros, nomeadamente polímeros formados por três monómeros diferentes (tal como P3HB3HV4HV). 0 Requerente verificou que os copolímeros de hidroxialcanoato podem ser produzidos de modo eficaz por fermentação microbiana de matérias-primas de sacarose, que são pré-tratadas por hidrólise ácida de modo a transformar a sacarose em glucose e frutose, que por sua vez são convertidas em ácido 4-cetovalérico para dar uma mistura de monossacarídeos e precursores orgânicos para a síntese microbiana de copolímeros de hidroxialcanoato.

Assim, a presente invenção relaciona-se com um processo para a produção de copolirfLerv''s hj_droxj.a-L.ca noato, como revelado na reivindicação 1/ r4ue compreende. (i) pré-tratamento de uma matéria-prima contendo sacarose numa solução ácida; (ii) alimentar um biorreator contendo células microbianas produtoras de poli-hidroxialcanoato com a matéria-prima pré-tratada; (iii) cultivo as células microbianas produtoras de poli-hidroxialcanoato para formar uma massa. celular contendo os copolímeros de hidroxialcanoato; (iv) recuperação cios copolímeros cte nidroxial canoa to a partir da massa celular, em que duas misturas de alimentação pré-tratadas diferentes são transferidas para o biorreactor, a primeira contendo glucose e frutose e substancialmente desprovida de ácido 4-cetovalérico, a segunda contendo glucose e ácido 4-cetovalérico e suhstancialmente desprovida de frutose 0 passo de pré-tratamento num meio acídico é de preferência levado a cabo por: (i-a) acidificação da matéria-prima contendo sacarose para se atingir um valor de pH desde 1,0 ate 4,0, de preferência desde 2,0 até 3,0; e (ι-b) aquecimento da matéria-prima acidificada contendo sacarose a uma temperatura desde 70 °C até 250 °C, de preferência desde 100 °C até 200 °C. O passo de pré-tratamento tem a função principal de hidrolisar a sacarose em glucose e frutose, que por sua vez são convertidas em ácido 4-cetovalérico para dar uma mistura de monossacarídeos e precursores orgânicos para a síntese microbiana de copolímeros de hidroxialcanoato e em particular os terpolímeros de PHBVV. Uma vez que as células microbianas funcionam como "mini-fábricas" individuais nas quais apenas as moléculas de substrato são transportadas, metabolizadas e sintetizadas em polímeros PHA, não são necessários processos complexos e dispendiosos de purificação dos substratos obtidos a partir do passo de pré-tratamento. As soluções podem ser utilizadas directamente como as soluções de alimentação para a biossíntese microbiana de PHA. Os biopoliésteres acumulados nas células podem ser facilmente recuperados a partir de meio aquoso para uma purificação adicional. A formação in-situ do precursor a partir de hexoses resultou como sendo muito eficaz para os passos subsequentes da biossíntese microbiana, com. custos muito inferiores em relação à adição de precursores orgânicos puros, tal como ácido valérico e ácido 4-cetovalérico.

Antes da fermentação do PHA, as misturas de alimentação ou o meio devem ser esterilizados para remover espécies do tipo selvagem que iriam competir com as células produtoras de PHA para a fonte de carbono e nutrientes, resultando num baixo rendimento em PHA e numa quantidade substancial de biomassa diferente de PHA a ser removida. De acordo com a presente invenção, o passo de pré-tratamento é também uma operação de esterilização que tem. efeitos benéficos para a biossintese microbiana subsequente e consome pouca energia extra em comparação com uma fermentação convencional de PHA. Além disso, a solução pré-tratada de açúcar é directamente utilizada para a produção de copolimero de hidroxialcanoato 'para economizar o custo de operações adicionais para a purificação de hidratos de carbono e precursores orgânicos.

Descrição detalhada da invenção.

Por "matéria-prima contendo sacarose" entende-se qualquer substrato que possa ser metabolizado por células microbianas produtoras de PHA, que contém sacarose, possivelmente em mistura com outros hidratos de carbono, e que pode ser obtido a partir do processamento de matérias-primas vegetais orgânicas, tal como sumo de frutos, , melaços de cana de açúcar, açúcar de polpa de beterraba, melaço de beterraba e outros semelhantes. A matéria-prima, para além. da sacarose e possivelmente outros hidratos de carbono, pode conter factores de crescimento orgânico adicionais, N, P e/ou outros minerais como nutrientes para o crescimento celular. 0 passo de pré-tratamento é de preferência levado a cabo numa autoclave ou num reactor. A acidificação da matéria-prima é preferencialmente conseguida por adição de uma substância ácida, de preferência um éLcido de Brõnsted tal como ácido clorídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico ou misturas destes, numa quantidade de modo a obter o valor de pH desejado como indicado acima. Deve ter-se em conta que os sólidos habitualmente presentes na matéria-prima contendo sacarose, que derivam do processamento prévio da matéria-prima vegetal, podem ter uma forte capacidade de tamponamento, nomeadamente são capazes de reagir ou combinar com iões H+ de modo a reduzir a concentração de protões livre e assim a acidez geral. Assim, a quantidade de uma substância ácida a ser adicionada à matéria-prima pode ser expressa como a razão Hi/sólido, nomeadamente como a quantidade de iões Hi (mmole) que deve ser adicionada à matéria-prima para 0-0 ter o valor desejado de pH por unidade de peso (g) de sólidos presentes na matéria-prima. Habitualmente, a quantidade acima varia entre 0,1 e 3,0 mmole de H+./q, mais preferencialmente entre 0,3 e 1,5 mmole de H+/g.

De acordo com uma forma de realização preferida, a matéria-prima de inicial é previamente diluída de modo a obter uma concentração de sólidos de 5% a 30% em peso, mais preferencialmente de 10% a 20% em peso, uma vez que com concentrações de sólidos mais elevadas (50% ou superior) a formação de subprodutos indesejáveis, tal como huminas ou carvões, pode ocorrer durante o passo de hidrólise térmica. Além disso, outros subprodutos menores podem ser gerados por hidrólise térmica da sacarose, glicose e frutose, tal como ácido fórmico, ácido acético, hidroximetilfurfural (HMF), que podem inibir o crescimento celular e a formação de PHA quando as suas concentrações atingem níveis eleva-dos: controlando as condições de reacção de acordo com a presente invenção, a formação desses subprodutos pode ser substancialmente reduzida de modo a evitar efeitos indesejáveis de inibição celular, 0 passo de pré-tratamento é de preferência levado a cabo durante um período de tempo suficiente para se dar a hidrólise de sacarose em glucose e frutose e sl subsequente conversão das mesmas em ácido 4-cetovalérico para dar uma mistura de monossacarídeos e precursores orgânicos. De preferência, o passo de pré-tratamento é levado a cabo durante um período de tempo desde 15 min até 12 horas, rnais preferencialmente cie 30 min a 6 horas.

Antes de alimentar o biorreactor, a matéria-prima pré-tratada é de preferência arrefecida até a temperatura ambiente (e.g. de 20 °C a 35 °C) e depois directamente introduzida no biorreactor (ou fermentador). De acordo com uma forma de realização preferida, a matéria-prima pré-tratada é gradualmente adicionada para alimentar as células microbianas de acordo com uma estratégia de alimentação apropriada, que é importante para controlar o crescimento celular, a biossíntese cie polímero e a composição de copolímero. Este último é de grande importância para determinar as propriedades dos copolímeros de PHA assim obtidos. Tendo em consideração que o comportamento da célula não é linear cora o tempo, a taxa de alimentação da matéria-prima pré-tratada é preferencialmente não constante ao longo do tempo. Por exemplo, após uma primeira adição de uma matéria-prima pré-tratada no início da fermentação, não são feitas mais adições durante um certo tempo (e.g. durante cerca de 8-15 horas), de modo a permitir o crescimento celular e para manter as concentrações de glucose e de ácido 4-cetovalérico dentro de valores relativamente baixos (de preferência, de 0 a 20 g/L para a glucose e de 0 a 2 g/L para o ácido 4-cetovalérico) . Depois, a adição de uma matéria-prima pré-tratada pode ser reiniciada a uma taxa substancialmente constante.

De modo a controlar a. composição do copolímero, o biorreactor é alimentado com duas matérias-primas de alimentação pré-tratadas diferentes, preparadas por pré-tratamento de matérias-primas contendo sacarose como descrito acima, a primeira contendo glucose e frutose e substancialmente desprovida de ácido 4-cetovalérico, a segunda contendo glucose e ácido 4-cetovalérico e substancialmente desprovida de frutose. A primeira matéria-prima pré-tratada é inicialmente transferida de modo a promover o crescimento celular, mantendo uma razão C/N não superior a 10 (teor de nutrientes de azoto elevado) (o ácido 4-cetovalérico e outros subprodutos são mais inibidores das células do que os açúcares, e pode resultar numa baixa densidade celular). Durante esta fase, é formadcL uma pequena quantidade de PHB (geralmente inferior a 10% em peso da massa celular) . Em seguida, inicia-se a alimentação com a segunda matéria- prima pré-tratada para formar copoliésteres. Também durante esta segunda fase, é preferível continuar a alimentação com a primeira matéria-prima pré-tratada juntamente cora a segunda, de modo a controlar a composição de monómero cie copolímero e assim as propriedades do material. Como mencionado acima, um teor muito elevado do conteúdo cie 3HV e 4HV pode resultar em algumas desvantagens tal corno resistência e taxa de cristalização reduzidas. 0 biorreactor contém célulcis microbianas produtoras de poli-hidroxialcanoato, tal como células da estirpe de Ralstonia eutropha. 0 passo de cultivo pode ser levado a cabo em. condições de pH e temperatura adequadas para. a fermentação. Geralmente, a temperatura é mantida numa gama de 25 °C a 45 °C, de preferência de 30 °C a 35 °C; o valor de pH é de preferência mantido num valor entre 6,0 e 7,5, mais preferencialmente entre 6,5 e 7,0.

Tendo em conta que a matéria-prima pré-tratada é uma solução ácida, de modo a controlar o valor de pH durante o passo de cultura, é de preferência adicionada uma substância básica ao biorreactor, tal como uma solução aquosa de amoníaco, que é gradualmente adicionada de modo a manter o valor de pH dentro do intervalo desejado. A amónia adicionada também fornece nutriente azotado para o crescimento celular. Outras soluções alcalinas, tal como hidróxido de sódio e/ou hidróxido de potássio, podem substituir a solução de amónio para controlar a relação de carbono para azoto (C/N) no meio de cultura. A recuperação dos copolímeros de hrdroxxaicanoato da massa celular pode ser levada a cabo de acordo com técnicas conhecidas, como descrito, por exemplo, na Patente US No. 7.514.525 e Pedido de Publicação de Patente Internacional WO 2011/045625. EXEMPLO 1 (comparativo).

Um sumo concentrado de beterraba açucareira contendo 69% p de sólidos totais e 65% p de sacarose foi acidificado com uma solução de HC1 (30% p) numa quantidade correspondendo a 0,56 mmole de H+/g de sólidos. O sumo de beterraba pré-acidifiçado foi ainda diluído com água para se obter uma concentração de sólido total de 20% p. O sumo de beterraba anterior acidificado e diluído foi tratado a 170°C e durante um tempo total de 10 horas. As concentrações de glucose, ácido fórmico, ácido 4-cetovalérico (4-KVA) e 5-hidroximetilfurfural (HMF) foram monitorizadas ao longo do tempo analisando amostras de sumo tratado (por HPLC). Os resultados são apresentados no gráfico da Figura 1 como aqui anexado. A partir de destes resultados, parece que a concentração de 4-KVA era substancialmente estável após 4 horas de pré-tratamento, enquanto a concentração de HMF, um produto secundário que pode ser prejudicial ao crescimento celular e à formação do PHA, foi reduzida a menos de 10 g/L por aumento da duração do pré-tratamento. A solução de hidrólise assim obtida foi utilizada para o cultivo de uma estirpe de R. eutropha para a produção de PHA. A solução continha 81 g/L de glucose, 36 g/L de 4-KVA, 16 g/L de ácido fórmico, 4 g/L de HMF e 2 g/L de ácido acético. Esta foi utilizada directamente como solução de alimentação do biorreator sem neutralização nem desintoxicação. A cultura foi levada a cabo num biorreactor de bancada sob condições controladas (30 °C, oxigénio dissolvido > 10% do ar saturado e pH 6,4-6,8). O pH médio foi controlado com uma solução de amoníaco (15%) e a solução de hidrólise ácida. Começando com 1100 mL de solução mineral para nutrientes básicos de crescimento celular, a solução de hidrolisado foi introduzida no biorreactor.

Os volumes acumulados dos vários componentes que alimentam o biorreactor ao longo do tempo são descritos na Figura 2 como aqui anexado.

Correspondendo à estratégia de alimentação da Figura 2, as variações temporais da densidade celular, do conteúdo em PHA e a% molar de 3HB, 3HV e 4HV do PHA são apresentadas na Figura 3. O monómero predominante no PHBW é 3HB (71-74% molar), seguido por 3HV (23-26% molar), enquanto o 4HV é um componente minoritário (2-3% molar). Utilizando uma solução de hidrólise, a composição química do PHBW pode ser controlada a um nível constante na fermentação de PHA.

Na Figura 4 o espectro de 1H-kMN do PHtsVV obtido é apresentado. EXEMPLO 2 (invenção).

Uma primeira solução hidrolisada (Solução A) foi preparada por hidrólise térmica de uma solução de melaços de cana de açúcar (20% p de sacarose, pH 2,6) a 120 °C durante 40 min. Os hidrolisados predominantes foram glucose e frutose com quantidades desprezáveis de ácido acético, HMF e ácido 4-cetovalérico. Uma segunda solução hidrolisada (Solução B) foi obtida a partir de uma solução de beterraba açucareira com hidrólise térmica a 170 °C durante 5 horas (ver Exemplo 1, Figura 1). Os hidrolisados predominantes foram glucose (91 g/L) e ácido 4-cetovalérico (32 g/L) . Os produtos minoritários incluem ácido fórmico (14 g/L), HMF (6 g/L), ácido acético (1 g/L) . Não foi detectada frutose na Solução B.

Começando com uma mineral solução (1100 mL) inicial, o biorreactor foi operado em modo fed-batch com a estratégia de alimentação das Soluções A e B como representado na Figura 5, em que os volumes acumulados (mL) Soluções A e B com o tempo assim como a razão C/N estimada a partir do carbono da sacarose original e do N-amónia adicionada.

Correspondendo à estratégia de alimentação da Figura 5, as variações temporais da densidade celular, do conteúdo de PHA e a% molar de 3HB, 3HV e 4HV do PHA são apresentadas na Figura 6. Comparando com o Exemplo 1 (Figura 3), o conteúdo total de 3HB aumentou (88,4% molar) enquanto os conteúdos de 3HV (11,0% molar) e de 4HV (0,6% molar) foram reduzidos. Isto é esperado porque a Solução A é substancialmente desprovida de ácido 4-cetovalérico foi introduzida no inicio e no fim da cultura fed-batch. De facto, quando foi utilizada a Solução A como a única fonte de carbono, P3HB, um homopoliéster, foi formado a partir de glucose e frutose (dados não mostrados aqui). EXEMPLO 3 (invenção).

Os P3HB e P3HB3HV4HV puros obtidos de acordo com o Exemplo 2 (3HB:3HV:4HV = 88,4:11:0,6) foram extraídos em clorofórmio quente a partir da massa celular liofilizada. Os polímeros dissolvidos foram separados por precipitação a partir de clorofórmio por adição gradual de metanol até à formação de precipitados brancos (75% metanol e 25% clorofórmio). Os polímeros foram filtrados e secos ao ar e depois numa estufa para utilização posterior.

Cristalização a partir de fusão.

Os P3HB e P3HB3HV4HV purificados foram fundidos a 180 °C ou 160 °C respectivamente, em condições ambientais durante aproximadamente 10 min e em seguida foram colocados de imediato na janela de um espectrómetro de Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR) equipado com reflec-tância total atenuada (ATR). Quando os polímeros fundidos foram arrefecidos, as absorções de IV foram monitorizadas em para medir a cristalização dos biopoliésteres. A cristalinidade dos biopolímeros foi medida ao número de onde de 1184 cm-1 e representada em relação ao tempo de arrefecimento. Os resultados são apresentados na Figura 7. 0 P3HB tem uma cristalinidade mais elevada e taxa de cristalização mais rápida do que o PHBVV. A presença de 11% molar de 3-HV e 0, 6% molar de 4-HV nos esqueletos de PHA não só reduz a cristalinidade mas também retarda o processo de cristalização do PHBVV. Uma vez que a solidificação lenta dos PHA fundidos pode causar um problema no processamento térmico dos bio-plásticos, o controlo da composição química do PHBVV é portanto essencial para produzir um bioplástico com as propriedades térmicas e mecânicas desejadas.

Ensaios de tracção.

Foram preparados filmes de PHB e PHBVV dissolvendo o PHA purificado em clorofórmio quente. As soluções, após arrefecimento até à temperatura ambiente, foram despejadas sobre superfícies limpas de vidro formando filmes finos (cerca de 0,3 mm) . Os filmes foram deixados envelhecer ao ar durante 5, 15 e 25 dias. Os filmes foram cortados em tiras finas (10 mm) com aproximadamente 3-4 mm2 de área de secção e um comprimento inicial de 25 mm. As tiras foram colocadas numa máquina de ensaio de tracção e foram postas cargas até à falha por ruptura. As propriedades mecânicas são apresentadas na Tabela 1: TABELA 1

Os testes anteriores revelaram claramente que o P3HB é um material rígido com um módulo de elasticidade elevado e alongamento à ruptura baixo, enquanto o P3HB3HV4HV tem um módulo de elasticidade relativamente baixo mas um alongamento à ruptura elevado. Os resultados também indicam que os filmes devem ser envelhecidos 25 dias antes do teste de tracção para permitir a evaporação completa do solvente e a cristalização das moléculas de PHA. Comparando com o alongamento à ruptura (ductilidade) do PHB (5%) e do PHBV (3HB:3HV = 90:10) (50%) como descrito na literatura, o PHBVV (3HB:3HV:4HV = 88,4:11,0:0,6) obtido de acordo com a presente invenção apresenta uma ductilidade mais elevada (105%) do que o PHBV, provavelmente devido à presença de uma pequena quantidade de 4HV que perturba a cristalinidade do PHBV.

Claims (14)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Processo para produção copolímeros de hidroxi-alcanoato, que compreende: (i) pré-tratamento de uma matéria-prima contendo sacarose numa solução ácida; (ii) alimentação de um biorreactor com uma matéria-prima pré-tratada contendo células microbianas produtoras de poli-hidroxialcanoato; (iii) cultivo das células microbianas produtoras de poli-hidroxialcanoato para formar uma massa celular contendo os copolímeros de hidroxialcanoato; (iv) recuperação dos copolímeros de hidroxialcanoato da massa celular; em que duas misturas de alimentação pré-tratadas diferentes são transferidas para o biorreactor, a primeira contendo glucose e frutose e substancialmente desprovida de ácido 4-cetovalérico, o segundo contendo glucose e ácido 4-cetovalérico e substancialmente desprovida de frutose.
2. 2. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o passo de pré-tratamento num meio acídico é levado a cabo por: (i-a) acidificação da matéria-prima contendo sacarose para atingir um valor de pH desde 1,0 até 4,0; e (i-b) aquecimento da matéria-prima acidificada contendo sacarose a uma temperatura desde 70°C até 250°C.
3. 3. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a matéria-prima contendo sacarose é obtida a partir do processamento de matérias-primas veqetais orqânicas, tal como sumos de fruta, melaços de cana de açúcar, açúcar de polpa de beterraba, melaços de beterraba, e outros semelhantes.
4. 4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que no passo de pré-tratamento a matéria-prima é acidificada por adição de uma substância ácida.
5. 5. Processo de acordo com a reivindicação 4, em que a substância ácida é um ácido de Brõnsted seleccionado de: ácido clorídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, e misturas destes.
6. 6. Processo de acordo com a reivindicação 4, em que a substância ácida é adicionada à matéria-prima com uma razão H+/sólido desde 0,1 até 3,0 mmole de H+/g.
7. 7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a matéria-prima inicial é previamente diluída de modo a obter uma concentração de sólidos desde 5% até 30% em peso.
8. 8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o passo de pré-tratamento é levado a cabo durante um tempo desde 15 min até 12 horas.
9. 9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a matéria-prima pré-tratada, antes de alimentar o biorreactor, é arrefecida até à temperatura ambiente e em seguida é directamente introduzida no biorreactor.
10. 10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a matéria-prima pré-tratada é introduzida no biorreactor de acordo com uma estratégia de alimentação pré-determinada, de modo a controlar o crescimento celular, biossíntese polimérica e composição do copolimero.
11. 11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o passo de cultivo é levado a cabo em condições de pH e temperatura adequadas para a fermentação.
12. 12. Processo de acordo com a reivindicação 11, em que o passo de cultivo é levado a cabo a uma temperatura desde 25°C até 45°C.
13. 13. Processo de acordo com a reivindicação 11, em que o passo de cultivo é levado a cabo a um valor de pH desde 6,0 até 7,5.
14. 14. Processo de acordo com a reivindicação 13, em que, para manter o valor de pH durante o passo de cultivo, é adicionada uma substância básica ao biorreactor.