BR0207356B1 - Processo de produção de polihidroxibutirato e seu copolímero polihidroxibutirato-co-hidroxivalerato a partir de hidrolisados de bagaço de cana-de-açúcar - Google Patents

Description

“PROCESSO DE PRODUÇÃO DE POLIHIDROXIBUTIRATO E SEU COPOLÍMERO POLIHIDROXIBUTIRATO-CO-HIDROXIVALERATO A PARTIR DE HIDROLISADOS DE BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR” A presente invenção descreve processo para obtenção de polihidroxibutirato e polihidroxibutirato-co-hidroxivalerato, por via microbiana, empregando como principal matéria-prima o hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar e os principais açúcares nele contidos. O acúmulo intracelular de grânulos de polihidroxialcanoatos (PHA) em diversas bactérias ocorre, em geral, quando há excesso de fonte de carbono e energia disponíveis, e limitação de, pelo menos, um nutriente essencial à multiplicação celular (Brandi, et ai, 1990). A função atribuída a estes materiais, dentro da célula, é a de reserva de carbono, energia ou equivalentes redutores (Anderson & Dawes, 1990). Os grânulos podem representar até 80% da massa seca celular. PHA também foram detectados como constituintes da membrana celular citoplasmática, complexados a cálcio e polifosfato, ou, ainda, associados a proteínas (Reusch & Gruhn, 1997). A descoberta desse grupo de polímeros (PHA) é atribuída ao microbiologista Maurice Lemoigne do Instituto Pasteur de Paris e data de 1926, quando a presença de P3HB foi observada em bactérias do gênero Bacillus (Lemoigne, 1926).

Durante décadas, esse grupo de polímeros não passou de uma curiosidade acadêmica, sendo que somente em 1962 foram publicadas as primeiras patentes apresentando suas propriedades termoplásticas (Baptist 1962a; 1962b). Nessa mesma época, ocorreu a primeira tentativa de produção de poli-3-hidroxibutirato (P3HB) pela empresa W. R. Grace Co. que, devido à baixa eficiência dos processos de produção e extração, e conseqüente alto custo, não obteve sucesso (Holmes, 1985).

Durante muitos anos ο P3HB permaneceu como único constituinte de PHA conhecido. Em 1964, Davis identificou o ácido 3-hidroxi-2-butenóico como constituinte de PHA produzido por Nocardia, e, posteriormente em 1974, a partir de estudos com lodo de esgoto, a presença de novos constituintes, ácidos 3-hidroxivalérico, 3-hidroxihexanóico e 3-hidroxiheptanóico, foi verificada (Wallen & Davis, 1972, Wallen & Rohwedder, 1974).

Em 1976, a empresa Imperial Chemical Industries (ICI) retomou a avaliação da produção do P3HB como uma alternativa aos plásticos gerados a partir de matérias-primas derivadas do peiróieo, entretanto, observou-se que ο P3HB apresentava-se muito duro e quebradiço, limitando suas aplicações (Holmes, 1985). A partir da constatação de que a incorporação de unidades 3-hidroxivalerato (3HV) possibilitava modular gradativamente as propriedades físicas e mecânicas do polímero produzido e, deste modo, ampliar o espectro de aplicações possíveis. Em 1981, foi depositada uma patente e iniciou-se o segundo grande empreendimento para a produção de PHA, empregando Ralstonia eutropha, com a comercialização do homopolímero P3HB, bem como do copolímeros P3HB-CO-3HV, com o nome comercial de Biopol® (Byrom, 1990). A estrutura básica do homopolímero P3HB está apresentada na Figura 1 e a do copolímero de poli-3-hidroxibutirato-co- 3-hidroxivalerato está na Figura 2.

Para a inserção da grande maioria dos monômeros na estrutura final do polímero, freqüentemente é necessário fornecer um substrato estruturalmente relacionado ao monômero (Steinbüchel, 1991 a, b; Steinbüchel & Valentin, 1995). Assim sendo, para a obtenção de polímero contendo unidades de 3HV, por exemplo, para a maioria das bactérias, deve-se fornecer ácido valérico ou propiônico no meio de cultura.

Em 1988, os genes codificadores das enzimas responsáveis pela síntese de P3HB em Ralstonia eutropha foram clonados em Escheríchia coli (Slater et ai, 1988; Schubert et ai, 1988) e, até 1999, a clonagem já havia sido realizada em pelo menos 18 bactérias diferentes (Rehm & Steinbüchel, 1999).

Em 1992, foram publicados os primeiros trabalhos descrevendo a produção de PHA em plantas (Poirier et ai, 1992).

No início da década de 90, iniciaram-se estudos no Brasil a cerca da produção de P3HB a partir de açúcar de cana (Rodrigues et al., 1995, Gomez et al., 1996, Gomez et al., 1997; Taciro et al., 1997; Pradella et al., 2000; Silva et al., 2000). Como resultado, no final da década de 90, obteve-se um processo de produção de poli-3-hidroxibutirato (P3HB) e seu copolímero poli-3-hidrobutirato-co-3-hidroxivalerato (P3HB-CO-3HV), utilizando como fonte de carbono principal cana-de-açúcar, resultando na patente (BR 9103116-8) “Processo para produzir pcühidrcxialcanoatcs a partir de açúcares extraídos da cana-de-açúcar”, caracterizada por o mosto de fermentação ser preparado a partir dos componentes açucarados caldo misto, caldo clarificado, xarope concentrado, concentrado e invertido, mel de primeira, mel final ou melaço e açúcar cristalizado bruto, contendo misturas de sacarose, glicose e frutose em qualquer proporção e as condições limitantes de crescimento bacteriano são obtidas pela limitação da concentração de amônia.

Em 1999, a empresa americana Monsanto, que investia e priorizava a produção de PHA em plantas desativou este ramo de atividade (Gemgros & Slater, 2000). O baixo custo de produção do açúcar e o excedente energético das usinas de açúcar e álcool viabilizam economicamente a produção integrada destes polímeros no Brasil, e em setembro de 2000 foi inaugurada a PHB Industrial, empresa constituída para produzir e comercializar a produção brasileira de plástico biodegradável com capacidade inicial de 50 toneladas / ano e já em fase de ampliação (Nonato et ai, 2001).

Outro resultado relevante foi a descoberta de uma nova espécie bacteriana, que foi denominada Burkholderia saccharí (Brâmer et al., 2001), na qual também já foi feito um melhoramento genético para aumentar sua capacidade produtora (Silva et al., 2000). O uso de substratos mais baratos e organismos alternativos para a produção de PHA, entre os quais a xilose oriunda de hidrolisados, têm sido também recentemente estudados. Em 1996, No Simpósio Internacional de Polímeros Bacterianos (ISBP), realizado em 1966 na Suíça, W.J. Page elaborou uma revisão sobre o assunto, que é apresentada resumida na Tabela 1. (Page, 1997).

Tabela 1. Produção de PHAa partir de biomassa renovável A manipulação genética de espécies, construindo-se linhagens recombinantes com a introdução de novas capacidades, também tem sido objeto de estudos, entre os quais podemos citar Buchholz (1994), que construiu transconjugantes de A. eutrophus capazes de utilizar xilose para o crescimento e Nichols et al. (2001) que construíram mutantes de E. coli capazes de fermentar glicose, xilose e arabinose sozinhos ou em mistura, evitando a repressão catabólica na fermentação de mistura de açúcares para a produção de etanol.

Um trabalho de isolamento e seleção de bactérias capazes de utilizar xilose, glicose e hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar foi elaborado pelo IPT - instituto de Pesquisas Tecnológicas do Estado de São Paulo, tendo sido selecionadas linhagens produtoras tanto de P3HB como do copolímero P3HB-co-3HV empregando-se carboidratos e ácido propiônico, como mostrado na Tabela 2.

Tabela 2. Linhagens bacterianas selecionadas capazes de produzir P3HB e P3HB-co-SHV. A otimização dos processos biotecnológicos, assim como a utilização de novas estratégias de fermentação, como é o caso do desenvolvimento de processos em dois estágios (Tanaka et ai, 1995), é outra estratégia que tem sido utilizada.

Madeiras e sub-produtos da agricultura, os mais abundantes recursos materiais renováveis, são materiais lignocelulósicos formados por lignina e carboidratos. Aproximadamente 70% do peso seco da lignocelulose é carboidrato: hemicelulose (20 a 60%) e celulose (20 a 50%) (Martinez et ai, 2000), sendo esta última o maior componente e o mais estudado (Chandrakant & Bisaria, 1998).

Celulose é o substrato orgânico mais comum na natureza, sintetizado pelas plantas e algumas bactérias, e se encontra na parede celular, juntamente com a lignina e a hemicelulose. A hemicelulose é um substrato complexo, um heterossacarídio (polímero β-glicosídico) composto de diferentes monômeros de carboidratos, tais como galactose, xilose, arabinose, manose e glicose, ligados de diferentes maneiras ao esqueleto principal. O uso de materiais lignocelulósicos para processos biológicos, visando a sua conversão a etanol, PHA e outros produtos de interesse, requerem primeiramente a liberação da celulose e hemicelulose do complexo formado com a lignina, seguindo-se a despolimerização destes polímeros de carboidrato para produzir açúcares livres e, finalmente, o processo de conversão microbiana desta mistura formada de hexoses e pentoses ao produto desejado (Lee, 1997; Chandrakant & Bisaria, 1998).

Para tornar o uso de materiais lignocelulósicos mais interessante e economicamente viável na obtenção de produtos formados por microrganismos, é essencial que o agente biológico seja capaz de converter todos ou a maioria dos açúcares gerados na hidrólise daqueles materiais, além de idealmente resistir a compostos inibitórios usualmente resultantes dos pré-tratamentos apresentados. Embora a composição do hidrolisado possa variar dependendo do método empregado para pré-tratamento e hidrólise, há nele grande quantidade de xilose e glicose. O uso de glicose por microrganismos, para produzir etanol, já é bastante conhecido e o uso de xilose vem sendo ainda estudado (Alterthum & Ingram, 1989; Takahashi, 1996), tendo em vista ser este um açúcar de mais difícil fermentação por microrganismos (Lee, 1997). No caso da produção de PHA, pode-se dizer que o quadro é semelhante, já que o uso de sacarose, glicose e frutose para a sua produção foi amplamente estudado, havendo um grande número de microrganismos descritos na literatura capazes de fazer esta transformação, bem como processo industrial claramente estabelecido (Gomez et ai, 1996, Rodrigues et ai, 1995, Silva et ai, 2000).

Existe potencial para se fazer a hidrólise enzimática de materiais lignocelulósicos, que apresentaria a vantagem de não gerar, ou gerar menos, componentes tóxicos para o posterior uso por microrganismos (Palmqvist & Hanh-Hagerdal, 2000). A hidrólise com ácido sulfúrico diluído (Rodrigues et al., 2001) vem sendo aplicada para converter o bagaço de cana-de-açúcar, permitindo sua utilização como fonte de carbono em processos fermentativos para a produção de substâncias como xilitol (Felipe et al., 1998) e etanol (Carvalho Lima, 2001), entre outras. Porém, durante tais processos de hidrólise, uma mistura complexa de substâncias tóxicas aos microrganismos é gerada, na qual incluem-se acetatos, furanos (furfural e hidroximetilfurfural), ácidos alifáticos (fórmico e levulínico), compostos fenólicos e aromáticos (Clark e Markie, 1984, Felipe et al., 1997). Essas substâncias tóxicas precisam ser removidas ou ter suas concentrações reduzidas para que o hidrolisado possa ser efetivamente usado em processos de bioconversão (Rodrigues et al., 2001). Aos processos de eliminação ou redução dessas substâncias tóxicas nos hidrolisados denominou-se destoxificação.

Segundo Palmqvist & Hanh-Hagerdal (2000), os processos de destoxificação podem ser divididos em três grandes grupos: métodos biológicos, baseados no tratamento com enzimas; métodos físicos, que se utilizam de rotoevaporação seguida ou não de extração por solvente; e, os métodos químicos, que consistem no ajuste de pH, visando a precipitação de compostos tóxicos e posterior adsorção com carvão ativo. Várias são as publicações encontradas sobre destoxificação de hidrolisados: Clark e Marck (1984), Wilson et al. (1989), Olsson et al. (1995), Parajo et al. (1996), Larsson et al. (1999), Palmqvist & Hanh-Hagerdal (2000), Martinez et al. (2000), Guaragna et al. (1996) (in Carvalho Lima, 2001). Mais especificamente sobre hidrolisado de bagaço de cana, Alves et al. (1996), (in Carvalho Lima, 2001), utilizaram um tratamento nos hidrolisados de bagaço de cana-de-açúcar com Ca(OH)2 ou NaOH, H2SO4 ou H3PO4 combinado com carvão ativo, mostrando que a produção e produtividade de xilitol é favorecida após tratamento com carvão ativo. Lourdes et al. (1998) estudaram 0 pré-tratamento de hidrolisados de bagaço de cana-de-açúcar para a produção de xilitol, através de um extenso estudo empregando a técnica de projeto-experimento, mostrando que as melhores condições para a fermentação de Candida guilliermondii foram obtidas aumentando 0 pH a 7 com CaO, seguindo-se redução deste a 5,5 com Η3ΡΟ4 e posterior adição de 2,4% de carvão ativo. Segundo esses autores, esse tratamento reuniu a concentração de furfural e hidroxi metil furfural (HMF) no hidrolisado, porém, não houve diminuição significativa de ácido acético.

Rodrigues et al. (2001) estudaram a influência do pH, temperatura e concentração do hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar para a remoção de compostos voláteis e não voláteis. Os resultados do estudo mostraram que o processo de evaporação com o intuito de aumentar a concentração dos açúcares, associado com o tratamento de adição de carvão ativo, diminui a concentração de ácido acético, furfural e HMF quase completamente, independente do pH, temperatura e adição de carvão ativo durante o processo de evaporação. O processo de produção de P3HB e seus copolímeros a partir de diferentes fontes de carbono tem sido bastante citado na literatura. Valores de biomassa total da ordem de 100 g/L com concentração de polímero na biomassa de 60 a 70% em cerca de 40 a 50 h tem sido obtidos, utilizando-se como fonte de carbono glicose, xarope de sacarose invertida, ácido oléico entre outras, com limitação de nitrogênio, fósforo ou oxigênio, havendo revisões devotadas ao tema (Lee, 2000, Braunegg, et al., 1998). A literatura relata também trabalhos de otimização do processo fermentativo da produção de P3HB e P3HB-CO-3HV a partir de cana-de-açúcar (Rocha et al., 2001;Taciro, et al., 1997; Pereira et al., 1996; Piccoli et al., 1996; Taciro etal., 1995).

Bertrand et al. (1990) utilizaram Pseudomonas pseudoflava ATCC 33668, meio de cultura sintético composto por xilose, arabinose e glicose e meio de cultura composto pela fração hemicelulósica de hidrolisado de Populus deltoides. Para os meios sintéticos, o máximo teor de P3HB alcançado foi 23% m/m para glicose e 27% m/m para xilose. Entretanto, a velocidade específica máxima de crescimento (μχ,ηβχ) para glicose foi de 0,58 h'1 e para xilose somente 0,13 h'1. Similarmente, a velocidade específica de produção de P3HB máxima (ppmax) para glicose foi de 0,11 h'1 e 0,03 h'1 para xilose. O fator de conversão substrato a P3HB (Yp3hb/s) foi 0,04 g/g, independentemente da fonte de carbono utilizada. A produção de P3HB não era associada ao crescimento celular e μρ,^χ foi observado por um curto período de tempo logo após a exaustão de nitrogênio do meio, sugerindo, segundo os autores, que uma pequena adição de nitrogênio durante o acúmulo podería estender o período de qp3HBmax- Para o meio complexo, o crescimento de P. pseudoflava foi totalmente inibido quando se empregou meio contendo mais que 30% v/v de hidrolisado.

Poucos são os estudos relativos à produção de P3HB que fazem uso de hidrolisado de resíduos hemicelulósicos ou os açúcares resultantes da hidrólise destes resíduos (xilose, arabinose e glicose) como fontes de carbono.

Ramsay et al. (1995) avaliaram a capacidade de P. cepacia ATCC 17759 utilizar xilose para produção de P3HB. Experimentos em batelada com meio sintético revelaram os seguintes parâmetros cinéticos: pxmax = 0,22 h'1; ppmax = 0,072 h'1; Yp3hb/s = 0,11 g/g e 45% m/m de máximo teor de P3HB. A produção de P3HB era totalmente não associada ao crescimento celular e pPmax se manteve por um curto período de tempo. A baixa conversão de fonte de carbono a P3HB foi atribuída ao alto valor de coeficiente de manutenção encontrado, cerca de dez vezes maior que para Alcaligenes eutrophus (0,199 g/gLh contra 0,019 g/gLh). Sugeriu-se que o uso de hidrolisado de celulose com Yp3hb/s= 0,11 g/g poderia conduzir a processo de produção de P3HB tão econômico quanto àquele empregando sacarose como fonte de carbono, supondo custo do hidrolisado e da sacarose, respectivamente, US$ 69 e US$ 794/tonelada de açúcar equivalente.

Young et al. (1994) obtiveram teor de P3HB de 49% p/p e Yp3hb/s = 0,11 g/g empregando P. cepacia com xilose como fonte de carbono.

Lee (1998) realizou estudos de seleção de linhagens recombinantes de Escherichia coli que continham os genes de síntese de polihidroxialcanoatos de Alcaligenes eutrophus, utilizando meio de cultura sintético com xilose como fonte de carbono. A linhagem TG1, albergando o plasmídio pSY107, acumulou respectivamente cerca de 65% e 74% de P3HB p/p quando o meio sintético (xilose 20 g/L) era suplementado com 0,5 g/L de extrato de levedura ou 10 g/L de hidrolisado de soja. Ypshb/s encontrados foram, respectivamente, 0,19 e 0,23 g/g.

Desse modo, convém destacar que o estado da técnica mostra que a produção de P3HB tem sido realizada a partir de xilose, glicose e misturas destes carboidratos em diversas proporções, empregando-os em grau de alta pureza, não utilizando diretamente hidrolisados hemicelulósicos, e sempre em condições de cultivo com baixa concentração celular, menor que 10 g/L, obtendo-se produtividades de P3HB até cerca de 0,1 g/Lh (Tabela 3), tornando o processo em grande escala inviável técnica e economicamente.

Tabela 3: Quadro resumo dos resultados da produção de P3HB a partir de hidrolisado de resíduos celulósicos ou açúcares resultantes da hidrólise destes resíduos. H.S.A.: hidrolisado de semente de algodão; H.S.: hidrolisado de soja.

Embora teores elevados de P3HB tenham sido reportados empregando-se E. coli recombinante (Tabela 2), pode haver dificuldades significativas para cultivar este microrganismo dada a necessidade da manutenção da estabilidade de plasmídio, sendo muitas vezes necessário o uso de antibióticos, além do alto custo de investimento de capital para cultivo de organismo geneticamente modificado (OGM) em larga escala visando atender exigências impostas pela legislação de biossegurança, vigente no país. A presente invenção descreve processo que emprega linhagens bacterianas (Tabela 1) isoladas pelo IPT, ou mutantes delas derivadas, que utilizam diretamente hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar e/ou carboidratos nele presentes para obtenção de polihidroxibutirato (P3HB), bem como o copolímero P3HB-co-3HV quando se adiciona ácido propiônico ou valérico aos substratos acima mencionados. O processo presentemente descrito, consegue atingir altas concentrações de biomassa seca, maiores que 40 g/L, teores de polímero superiores a 50% e produtividades de polímero muito superiores aos apresentados na literatura, tornando, assim, o processo de produção destes polímeros a partir de hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar e/ou carboidratos nele presentes, viável técnica e economicamente. O hidrolisado pode ser obtido por hidrólise enzimática, sem gerar tantos compostos tóxicos, bem como outras e quaisquer formas de hidrólise que liberem pentoses e/ou glicose.

No caso do uso do hidrolisado de bagaço-de-cana que contenha compostos tóxicos para as bactérias, uma etapa de destoxificação deverá preceder o seu cultivo no biorreator. O hidrolisado pode ser concentrado ou não, e, quando necessário, concentra-se o hidrolisado, na faixa de 2 a 20 vezes ou mais, empregando-se rotoevaporador e/ou banho-maria. Após esta etapa, adiciona-se CaO e/ou Ca(OH)2 acrescidos ou não de NaOH até se atingir pH entre 9 a 12, preferencialmente 10. Abaixar então o pH entre 3 a 7, preferencialmente 6 com ácido mineral, isto é, H2SO4, HCI, H3PO4 ou HCIO4. Na última etapa de destoxificação, quando necessário, adicionar carvão ativo numa relação entre 2 a 20% (p/v), preferencialmente 5%, com tempo de adsorção de 5 minutos a 3 horas, preferencialmente 15 minutos. A temperatura para esta etapa pode variar de 20 a 60 °C, mantendo-se preferencialmente 25 °C, com agitação entre 50 a 1500 rpm, preferencialmente 150 rpm.

Qualquer das linhagens apresentadas na Tabela 1, preservadas em laboratório, são estriadas em meio agar nutriente (5 g/L peptona, 3 g/L extrato de carne, 15-20 g/L agar), incubadas por 20 a 72 h entre 25 e 37 °G, preferencialmente entre 30 e 32 °C, e semeadas em recipiente com meio líquido de caldo nutriente ( 5 g/L peptona, 3 g/L extrato de carne) incubadas em agitador rotativo entre 150 e 250 rpm e temperatura entre 25 e 37 °C, preferencialmente entre 30 e 32 °C, por tempo suficiente para se obter uma concentração de microrganismos entre 0,1 e 3 g/L em base seca.

Tabela 4 -Composição dos meios de cultura utilizados em g /L. (1) Concentração inicial de xilose e glicose por batelada.

Solução de elementos traços: H3B03 0,3 g/L; CoCl2.6H20 0,2 g/L, ZnS04.7H20 0,1 g/L; MnCI2.4H20 30,0 mg/L, NaMoO4.2H20 30, 0 mg/L , NiCI2.6H20,20,0 mg/L e CuS045H20 10,0 mg/L

Utilizam-se os açúcares na sua forma pura ou o hidrolisado com as concentrações correspondentes destes açúcares. A cultura em caldo nutriente é utilizada para inocular recipientes contendo Meio mineral básico, conforme mostrado na Tabela 4, e incubadas, em agitador rotativo nas mesmas condições do cultivo anterior. Em seguida, o cultivo em Meio mineral básico é utilizado para inocular um biorreator agitado e aerado, sendo que a relação entre os volumes pode variar de 1 a 25%, estando preferencialmente entre 3 a 10%. O biorreator possui em seu interior o meio de cultura denominado Meio mineral, também mostrado na Tabela 4, previamente esterilizado e operado nas seguintes condições: pH entre 5,0 e 8,0, preferencialmente entre 6,5 e 7,5, temperatura entre 25 e 40 °C, preferencialmente entre 28 e 34 °C, oxigênio dissolvido superior a 10% da saturação do meio de cultura, preferencial mente entre 15 e 60%. Preferencialmente entre 12 e 24 h de incubação, o conteúdo do biorreator é transferido para um biorreator de volume maior, respeitando-se a relação entre volumes 2 a 25%, preferencialmente entre 5 a 15%.

Biorreatores de volumes crescentes, possuindo o Meio mineral (Tabela 4), poderão ser utilizados com o objetivo de atingir o volume necessário para inocular o biorreator final de produção, respeitando-se os valores percentuais de fração de inóculo entre as passagens. O “PROCESSO DE PRODUÇÃO DE POLIHIDROXIBUTIRATO E SEU COPOLÍMERO POLIHIDROXIBUTIRATO-CO-HIDROXIVALERATO A PARTIR DE HIDROLISADOS DE BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR”, objeto desta patente, pode ser conceituado como dividido em quatro etapas: Na primeira etapa, os microorganismos de qualquer uma das linhagens apresentadas na Tabela 1, preservadas em laboratório, são estriados e incubados operando-se como descrito anteriormente.

Na segunda etapa do processo, o objetivo é a obtenção de uma população bacteriana apta a acumular eficientemente o PHA. Para tanto, é importante atingir concentrações significativas da bactéria, geralmente superiores a 30 g/L, mas por vezes sendo necessário atingir até 100 g/L. O biorreator principal, deve possuir meio de cultura esterilizado em seu interior, o Meio mineral descrito na Tabela 4. As concentrações de todos os nutrientes do Meio mineral, mostradas na Tabela 4, são calculadas segundo a concentração de biomassa desejada ao final da segunda fase do processo. 0 biorreator principal é operado nas seguintes condições: pH entre 5,5 e 8,0, preferencialmente entre 6,5 e 7,5, temperatura entre 25 e 40 °C, preferencial mente entre 28 e 35 °C, e concentração de oxigênio dissolvido acima de 10% da saturação no meio de cultura, conseguido pela manipulação da freqüência de agitação dos impelidores e da vazão de ar comprimido injetada no biorreator e. alternativamente, pelo enriquecimento da corrente de ar de entrada no biorreator com oxigênio puro ou, ainda, pela pressurização do biorreator entre 0,5 a 2,0 bar de pressão manométrica, preferencialmente até 1,0 bar de pressão manométrica. O pH do biorreator principal é controlado pela adição de uma solução de hidróxido de amônia diluída ou amônia gasosa de tal forma que a concentração do íon NH4+ do meio de cultura permaneça entre 250 e 2000 mg/l. Após a exaustão da fonte de carbono no meio de cultura, novas adições em batelada, ou batelada alimentada da fonte de carbono pura ou em solução concentrada ao biorreator, podem ser realizadas a partir de um reservatório através de uma bomba de vazão controlada como, por exemplo não restritivo, uma bomba peristáltica. Quando realizada em batelada alimentada, a vazão deve ser previamente estabelecida de modo que a concentração da fonte de carbono seja tal que permita um crescimento com limitação das fontes de carbono e sem limitação em oxigênio. Altemativamente, a vazão de alimentação pode ser controlada automaticamente através de um mecanismo de análise em tempo real das fontes de carbono remanescentes no meio de cultura como, em exemplo não limitante, descrito por Moo Young & Chisti (1994). O objetivo dessa etapa do processo é a produção na maior concentração possível de biomassa de bactéria no biorreator, e que pode ser limitada pelos fatores, isoladamente ou combinados, exaustão da capacidade de transferência de oxigênio do biorreator e esgotamento da capacidade volumétrica do biorreator. A concentração final de biomassa nessa fase deve ser entre 25 e 100 g/l, recomendando-se acima de 30 g/l. A terceira etapa do processo, que é a de produção do polímero propriamente dita, inicia-se após a limitação, de forma isolada ou combinada, dos nutrientes magnésio, fósforo, nitrogênio ou oxigênio. A limitação imposta ao sistema pode ocorrer simultaneamente ou sucessivamente. Para os dois primeiros elementos, a limitação pode ser, de forma não restritiva, previamente programada através da quantidade dos sais que carreiam esses elementos quando da preparação do meio de cultura para o biorreator principal. Para o nitrogênio, a limitação pode ser imposta, de forma não restritiva, pela troca da solução de controle de pH de hidróxido de amônio ou amênia gasosa por uma outra base forte qualquer como, por exemplo não limitante, hidróxido de sódio ou potássio. No caso do oxigênio, pela limitação do fornecimento de ar, de tal forma que o oxigênio dissolvido seja mantido abaixo de 10% da saturação, preferencialmente abaixo de 5%.

Para produção de P3HB e P3HB-CO-3HV, uma ou mais fontes de carbono, em solução, são adicionadas a partir de um reservatório através de uma bomba de vazão controlada como, por exemplo não limitante, uma bomba peristáltica. A vazão de alimentação é previamente calculada de tal forma que não haja inibição pelas fontes de carbono. Essa alimentação pode ser suplementada com ácido propiônico ou qualquer outro produto que atue como precursor para obtenção do copolímero P3HB-CO-3HV, como por exemplo ácidos carboxílicos, álcoois e hidrocarbonetos com número ímpar de átomos de carbono na cadeia principal.

Altemativamente, a vazão de alimentação pode ser controlada automaticamente através de um mecanismo de análise em tempo real das fontes de carbono remanescentes no meio de cultura como, por exemplo não limitante, descrito por Moo Young & Chisti., 1994. Também, altemativamente, considerando que o consumo de pelo menos um dos substratos fornecido como fonte de carbono produz alteração no pH do meio de cultivo, que é restabelecido com nova adição da fonte de carbono, a alimentação desta pode ser controlada por bomba peristáltica cujo funcionamento é acionado pelo sistema de controle de pH.

Esta etapa prossegue até que se acumulem altos teores de polímero, preferencialmente representando mais que 30% da biomassa seca. A quarta etapa do processo é a separação e purificação do polímero, onde a biomassa produzida na etapa anterior é aquecida (entre 75 e 100 °C) e resfriada rapidamente até temperatura próxima à ambiente, concentrada por meios convencionais (centrifugação, filtração ou sedimentação) e o material polimérico é extraído utilizando um solvente orgânico seguido de precipitação do polímero por um agente orgânico não solvente. Alternativamente, e dependendo de sua aplicação final, o polímero pode ser extraído por rompimento celular, utilizando enzimas líticas comerciais, como proteasaes üpases e lacases, entre outras. Também, alternativamente, a utilização combinada de solventes e enzimas pode ser utilizada. Posteriormente, o material deve ser submetido à filtração, sedimentação ou centrifugação. A seguir são apresentados exemplos não limitantes do processo de produção, objeto desta patente.

Exemplo 1 Seguindo as etapas do processo como já descritas, as linhagens B. cepacia IPT 048 e B. saccharí IPT 101 foram multiplicadas em meio de cultura onde o hidrolisado do bagaço de cana-de-açúcar destoxificado foi utilizado como fonte de carbono. A composição do meio de cultura é o descrito na tabela 4 (Meio mineral). Hidróxido de amônio foi a base utilizada para o controle de pH do biorreator em 7,0 na segunda etapa do processo e na terceira essa base foi trocada por hidróxido de sódio. A produção de até 60% da biomassa seca em polímero foi induzida por meio da limitação no meio de cultura da fonte de nitrogênio, com fornecimento de fonte de carbono. O material produzido foi concentrado por métodos convencionais (filtração, centrifugação, sedimentação), e utilizou-se clorofómio para a extração do polímero. A mistura foi filtrada, e seguida por uma operação de secagem dos grânulos. B. cepacia IPT 048 se multiplicou a uma velocidade específica máxima de crescimento (pxmax) de 0,36 h'1 e o fator de conversão de fonte de carbono em polímero (Yp3hb/s) obtido foi de 0,3 g/g, atingindo 53 % em biomassa seca de teor de polímero. Já para a linhagem B. saccharí IPT 101 obteve-se pxmax de 0,25 h'1, Yp3hb/s de 0,4 g/g e teor de polímero de 62% da biomassa seca. A figura 3 apresenta a evolução do teor de P3HB obtido para as duas linhagens.

Exemplo 2 As linhagens B. cepacia IPT 048 e B. sacchari IPT 101 foram multiplicadas em meio de cultura onde a principal fonte de carbono foram xilose e glicose, principais carboidratos presentes no hidrolisado do bagaço de cana-de-açúcar. A composição do meio de cultura utilizado foi a mesma do exemplo 1 exceto que a produção de até 60% da biomassa seca em polímero foi induzida por meio da limitação no meio de cultura da fonte de fósforo, com fornecimento de fonte de carbono. Como no exemplo anterior o material produzido foi concentrado por métodos convencionais (filtração, centrifugação, sedimentação), e utilizou-se clorofómio para a extração do polímero. A mistura foi filtrada, e seguida por uma operação de secagem dos grânulos.

Para o exemplo em questão, o procedimento para a obtenção de alta densidade de células utilizou uma concentração de sais minerais de cerca de 6 vezes a concentração do Meio mineral (Tabela 4). A linhagem B. sacchari IPT 101 apresentou pxmax de 0,25 h'1, Yp3hb/s de 0,22 g/g e atingiu ao final do ensaio 60 g/L de biomassa com 58% de teor de polímero na biomassa seca. A linhagem B. cepacia IPT 048 apresentou pxmax de 0,30 h'1, Yp3hb/s de 0,19 g/g e ao final do ensaio uma concentração de biomassa de 57 g/L com cerca de 57% de teor de polímero na biomassa seca. O teor de polímero e a concentração de biomassa para as linhagens B. cepacia IPT 048 e B. sacchari IPT 101 estão ilustradas nas figuras 4 e 5 respectivamente.

Exemplo 3 Diferentes linhagens foram multiplicadas em meio de cultura utilizando xilose (o principal carboidrato presente no hidrolisado) como principal fonte de carbono. A composição do meio de cultura e o nutriente limitante para induzir o acúmulo de polímero foram os mesmos empregados no exemplo 1, exceto a fonte de carbono . Ácido propiônico foi adicionado como precursor para obtenção do copolímero P3HB-co-3HV. Como nos exemplos anteriores o material produzido foi concentrado por métodos convencionais (filtração, centrifugação, sedimentação), e utiüzou-se clorofómio para a extração do polímero. A mistura foi filtrada, g seguida por uma operação de secagem dos grânulos.

Dependendo da linhagem empregada, foram obtidos diferentes teores de polímero acumulado, bem como composições monoméricas distintas, como ilustrado na Tab. 5.

Claims (6)

1. “PROCESSO DE PRODUÇÃO DE POLIHIDROXIBUTIRATO E SEU COPOLÍMERO POLIHIDROXIBUTIRATO-CO-HIDROXIVALERATO A PARTIR DE HIDROLISADOS DE BAGAÇO DE CANA DE AÇÚCAR”, caracterizado por o uso de hidrolisado de cana de açúcar e constituído de etapas em que micro-organismos pertencentes às linhagens Burkholderia cepacia, Achromobacter sp, Burkolderia sacarí; e seus mutantes, capazes de utilizar esse hidrolisado como fonte de carbono para produzir polihidroxibutirato e seu copolímero polihidroxibutirato-co-hidroxivalerato, são multiplicados em escalas progressivas, sendo a primeira aquela em que são estriados e incubados; a segunda etapa de aumento de população microbiana; a terceira etapa de produção de polímero pela limitação de nutrientes; e, a quarta etapa de separação e purificação do polímero, onde: a) Em uma primeira etapa, os micro-organismos são estriados em meio nutriente sólido e incubados por 20 a 72 horas em temperatura entre 25 e 37 °C e, em seguida, semeados em recipientes com meio nutriente líquido e incubados por tempo suficiente para se obter uma concentração de micro-organismos entre 0,1 a 3,0 g/L em base seca, em temperatura na faixa de 25 a 37 °C e sob agitação de 150 a 250 rpm; b) Em uma segunda etapa, procede-se o aumento de população de micro-organismos em meio de cultura mineral contendo os carboidratos resultantes da hidrólise do bagaço de cana de açúcar e nutrientes para aporte de N, P, K, S, Mg, O, Mn, Co, Zn, Mb, Ni, Cu e B, sendo esse aumento da população limitado pelos fatores, isoladamente ou combinados, de exaustão da capacidade de transferência de oxigênio e esgotamento da capacidade volumétrica do recipiente; c) Em uma terceira etapa, procede-se a produção do polímero iniciando-se pela limitação, de forma isolada ou combinada e simultânea ou sucessiva, dos nutrientes Mg, P, N e O, com fornecimento contínuo ou intermitente de carboidratos resultantes da hidrólise do bagaço de cana de açúcar; com suplementação ou não de ácidos carboxílicos, álcoois ou hidrocarbonetos com número impar de carbono na cadeia principal, atuantes como precursor para obtenção do produto, até que se acumulem altos teores do polímero em relação a biomassa seca; sendo as limitações de magnésio e fósforo realizadas pelo fornecimento programado desses nutrientes e ocorrer a concentrações de magnésio inferiores a 20 mg/L, de fósforo inferiores a 10 mg/L, de nitrogênio pelo controle de pH do meio de cultura com um álcali que não possua nitrogênio na sua composição ou pela concentração de nitrogênio menor que 200 mg/L e do oxigênio pela manutenção do oxigênio dissolvido abaixo de 10% da saturação; d) Em uma quarta etapa procede-se a separação e purificação do polímero, sendo a biomassa aquecida entre 75 e 100 °C e resfriada rapidamente até temperatura próxima ao ambiente para rompimento celular, e em seguida o polímero é concentrado por meios convencionais e extraído da massa por meio de um solvente orgânico seguido de precipitação por um agente orgânico não solvente e recuperado por método convencional de separação.

2. “PROCESSO DE PRODUÇÃO DE POLIHIDROXIBUTIRATO E SEU COPOLÍMERO POLIHIDROXIBUTIRATO-CO-HIDROXIVALERATO A PARTIR DE HIDROLISADOS DE BAGAÇO DE CANA DE AÇÚCAR”, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser utilizado um hidrolisado de bagaço de cana de açúcar obtido por hidrólise enzimática ou outras formas que liberem glicose, xilose, arabinose e misturas desses componentes em quaisquer proporções e por realizar, quando necessário, sua destoxificação.

3. “PROCESSO DE PRODUÇÃO DE POLIHIDROXIBUTIRATO E SEU COPOLÍMERO POLIHIDROXIBUTIRATO-CO-HIDROXIVALERATO A PARTIR DE HIDROLISADOS DE BAGAÇO DE CANA DE AÇÚCAR”, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por a destoxificação consistir em concentrar, se necessário, o hidrolisado acima de 2 vezes e adicionar CaO ou Ca(OH)2 ou ambos acrescidos ou não de NaOH até atingir pH entre 8 e 12; baixar esse pH entre 3 e 7 com um ácido mineral, como H2S04, HCI, H3PO4, ou HCIO4, e adicionar, se necessário, carvão ativo na relação 2 a 20% em volume com tempo de adsorção de 5 a 180 minutos, tudo sob agitação de 50 a 1500 rpm e temperatura entre 20 e 60 °C.

4. “PROCESSO DE PRODUÇÃO DE POLIHIDROXIBUTIRATO E SEU COPOLÍMERO POLIHIDROXIBUTIRATO-CO-HIDROXIVALERATO A PARTIR DE HIDROLISADOS DE BAGAÇO DE CANA DE AÇÚCAR”, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a cultura em meio mineral ser utilizada para inocular outros recipientes nas mesmas condições de cultivo anterior, numa relação volumétrica entre 1 e 25%, e o meio de cultura ser previamente esterilizado, com pH entre 5 e 8,0, em temperatura entre 25 e 40 °C, oxigênio dissolvido superior a 10% da saturação e o tempo de incubação necessário para se recompor a concentração celular desejada.

5. “PROCESSO DE PRODUÇÃO DE POLIHIDROXIBUTIRATO E SEU COPOLÍMERO POLIHIDROXIBUTIRATO-CO-HIDROXIVALERATO A PARTIR DE HIDROLISADOS DE BAGAÇO DE CANA DE AÇÚCAR”, de acordo com a reivindicação 4 , caracterizado por o pH da cultura de microorganismos ser mantido entre 5,0 e 8,0 através da adição de uma solução de hidróxido de amônio diluído ou amônia gasosa, de modo que a concentração de NH4+ permaneça entre 250 e 2000 mg/L e ou por uma base forte.

6. “PROCESSO DE PRODUÇÃO DE POLIHIDROXIBUTIRATO E SEU COPOLÍMERO POLIHIDROXIBUTIRATO-CO-HIDROXIVALERATO A PARTIR DE HIDROLISADOS DE BAGAÇO DE CANA DE AÇÚCAR”, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o polímero poder ser também extraído por rompimento celular pela utilização de enzimas líticas ou pela combinação de solventes e enzimas.