PT2299977E - Lipossomas para distribuição de fármacos e métodos para preparação destes - Google Patents

Lipossomas para distribuição de fármacos e métodos para preparação destes Download PDF

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Sune Allan Petersen
Fredrik Melander
Jonas Rosager Henriksen
Kent Jorgensen
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Description

1
DESCRIÇÃO
"LIPOSSOMAS PARA DISTRIBUIÇÃO DE FÁRMACOS E MÉTODOS PARA PREPARAÇÃO DESTES"
Antecedentes da invenção
Os lipossomas são esferas microscópicas que foram desenvolvidos como veiculos/sistemas de distribuição de fármacos na década de 1980. Os primeiros produtos farmacêuticos baseados em lipossomas foram aprovados para utilização comercial na década de 1990.
Os lipossomas têm três compartimentos distintos que podem ser utilizados para transportar vários compostos tais como, por exemplo, fármacos: O compartimento aquoso interior; a bicamada hidrófoba, e a inter-fase polar do folheto interno e externo. Dependendo da natureza química do composto a encapsular este será localizado num dos compartimentos. Atualmente, existem diversas formulações lipossoma-fármaco parentéricas disponíveis no mercado. Os fármacos solúveis em água tendem a localizar-se no compartimento aquoso dos lipossomas, e exemplos de fármacos encapsulados em lipossomas são, por exemplo, doxorrubicina (Doxil), doxorrubicina (Myocet) e daunorrubicina (DaunoXone) . Exemplos de fármacos intercalados na membrana do lipossoma são, por exemplo, anfotericina B (AmBisome), anfotericina (Albelcet B) , benzoporfirina (Visudyne) e muramiltripéptido-fosfatidiletanolamina (Junovan). A tecnologia de lipossomas tem assim proporcionado soluções inteligentes para resolver desafios em farmacologia tais 2 como por exemplo aumentar da solubilidade do fármaco, reduzir a toxicidade do fármaco, melhorar a libertação direcionada do fármaco, etc. A propriedade dos lipossomas como veiculos de distribuição de fármacos é crucialmente dependente da sua carga superficial, permeabilidade, solubilidade, estabilidade, etc., que é significativamente influenciada pelos lipidos compreendidos na composição dos lipossomas. Além disso, o fármaco a encapsular no lipossoma pode precisar de outros requisitos a considerar na preparação de uma formulação de lipossomas estável.
Considerações sobre a segurança e eficácia de fármacos requerem que as formulações de lipossomas mantenham as suas propriedades, isto é, permaneçam estáveis, do momento da preparação até à administração. Além disso, é desejável que tais formulações estejam intactas durante o transporte no sujeito tratado até alcançarem o local alvo, onde o fármaco é especificamente libertado. Assim, existe ainda a necessidade de obtenção de melhores formulações de lipossomas. WO 90/11781 descreve lipossomas compreendendo fosfatidilcolina (50% mol), fosfatidilglicerol (30% mol) e colesterol (20% mol). Os agentes terapêuticos que podem ser distribuídos compreendem fatores de crescimento, esteroides, antioxidantes, agentes anti-inflamatórios não esteroides e antibióticos. Os lipossomas são preparados através do método de película e podem ser hidratados com tampão (contendo fosfato, cálcio 0,9 mM e magnésio 0,49 mM) após remoção do solvente orgânico. 3
Em WO 2004/087105 são descritos lipossomas compreendendo distearoilfosfatidilcolina (DSPC) e distearoilfosfatidilglicerol (DSPG) onde está aprisionada carboplatina.
Sumário da invenção
Num primeiro aspeto, a presente invenção proporciona lipossomas que são úteis para distribuição de agentes bioativos, tais como produtos terapêuticos de acordo com a reivindicação 1. Entre outros, os lipossomas da presente invenção são capazes de distribuir a sua carga a locais de maior atividade de fosfolipase secretora A2 (sPLA2) , porque a fosfolipase A2(PLA2) hidrolisará os lipidos do lipossoma. Assim, os lipossomas da invenção podem ser, por exemplo utilizados em relação a terapia de cancro. Um segundo aspeto da invenção é uma formulação lipossómica compreendendo o lipossoma da invenção. Ainda outro aspeto é um método de produção de uma formulação de lipossomas da invenção.
Descrição da invenção
Breve Descrição do(s) Desenho(s) A invenção é explicada em detalhe abaixo com referência ao(s) desenho(s), nos quais A Figura 1 ilustra o espectro de UV de oxaliplatina guardada em solução contendo sacarose a 10% e gluconato de cálcio 1 mM durante armazenamento à temperatura ambiente. A Figura 2 ilustra a absorvância relativa (dia/dia 0) a 254 nm para oxaliplatina guardada numa solução contendo 4 sacarose a 10% e gluconato de cálcio 1 mM durante armazenamento à temperatura ambiente (Figura 1). A Figura 3 ilustra o efeito de concentrações variáveis de gluconato de cálcio no vazamento de lipossomas (DSPC/DSPG/DSPE-PEG2000 a 70/25/5% mol) contendo cisplatina (A) ou oxaliplatina (B) após 24 horas de armazenamento em meio celular (McCoy) a 37°C (eixo principal). O grau inicial de encapsulamento (DOE) está marcado no eixo secundário. A Figura 4 ilustra a citotoxicidade de cisplatina encapsulada em lipossomas (DSPC/DSPG/DSPE-PEG2000 a 70/25/5% mol) contendo gluconato de cálcio 1 mM. Células de carcinoma do cólon HT-29 foram tratadas durante 6 horas (37°C) com cisplatina ou cisplatina encapsulada em lipossomas, na presença ou ausência de SPLA2. A Figura 5 ilustra a citotoxicidade de oxaliplatina encapsulada em lipossomas (DSPC/DSPG/DSPE-PEG2000 a 70/25/5% mol) contendo concentrações variáveis de gluconato de cálcio (A) gluconato de cálcio 5 mM, (B) gluconato de cálcio 1 mM, (C) gluconato de cálcio 0,1 mM, (D) gluconato de cálcio 0,01 mM, e (E) gluconato de cálcio 0 mM. Células de carcinoma do cólon HT-29 foram tratadas durante 6 horas (37°C) com oxaliplatina ou oxaliplatina encapsulada em lipossomas na presença ou ausência de SPLA2. A Figura 6 ilustra a citotoxicidade de cisplatina encapsulada em lipossomas (DSPC/DSPG/DSPE-PEG2000 a 70/25/5% mol) contendo concentrações variáveis de gluconato de cálcio. Células de carcinoma do cólon HT-29 foram 5 tratadas durante 24 horas (37°C) com cisplatina na presença ou ausência de SPLA2.
Figura 7. Alterações no tamanho das partículas em função da concentração de cálcio para lipossomas com oxaliplatina encapsulada (DSPC/DSPG/DSPE-PEG2000 a 70/25/5% mol) não contendo cálcio após 24 h à temperatura ambiente. A concentração de lípidos foi mantida a 0,84 mM.
Figura 8. Vazamento da formulação de oxaliplatina encapsulada em lipossomas (DSPC/DSPG/DSPE-PEG2000 a 70/25/5% mol) não contendo cálcio após 24 h à temperatura ambiente em função da concentração de cálcio. A concentração de lípidos foi mantida a 0,84 mM.
Figura 9. Dependência do tempo da intensidade de fluorescência de LUV de DSPC/DSPG/DSPE-PEG contendo NBD-PE a 0,5% mol a 25°C. A seta indica a adição de ditionite, cálcio e Triton-X100.
Figura 10. Alterações no tamanho das partículas do passo de ultrassons até após o Io passo de diálise (sacarose a 10%) em função de DSPG nas formulações lipossómicas de oxaliplatina contendo DSPE-PEG2000 a 5% mol e DSPC.
Figura 11. Alterações no tamanho das partículas do Io passo de diálise (sacarose a 10%) até após o 2° passo de diálise (sacarose a 10% + gluconato de cálcio) em função de DSPG nas formulações lipossómicas de oxaliplatina contendo DSPE-PEG2000 a 5% mol e DSPC.
Figura 12. Alterações no tamanho das partículas dos ultrassons até após o 2o passo de diálise (sacarose a 10% 6 + /- gluconato de cálcio) em função de DSPG nas formulações lipossómicas de oxaliplatina contendo DSPC e DSPE-PEG2000 a 5% mol.
Figura 13. Razão da contagem de iões (Pt195/P31) para formulações lipossómicas de oxaliplatina contendo DSPE- PEG2000 a 5% mol e quantidades vaiáveis de DSPC e DSPG após o Io passo de diálise (solução de sacarose a 10%).
Figura 14. Razão da contagem de iões (Pt195/P31) para formulações lipossómicas de oxaliplatina contendo DSPE- PEG2000 a 5% mol e quantidades variáveis de DSPC e DSPG após o 2o passo de diálise (solução de sacarose a 10% ± gluconato de cálcio 1 mM).
Figura 15. % da diferença na razão da contagem de iões (Pt195/P31) para formulações dialisadas em solução sem cálcio em comparação com formulações dialisadas com cálcio (ver Figura 14).
Figura 16. Concentração de Pt no dialisado após a 2a diálise (solução de sacarose a 10% ± gluconato de cálcio 1 mM) de formulações lipossómicas de oxaliplatina contendo DSPE-PEG2000 a 5 mol% e quantidades variáveis de DSPC e DSPG.
Figura 17. Correlação entre o tamanho final dos lipossomas e a concentração de oxaliplatina nas formulações. Formulações lipossómicas de oxaliplatina (DSPE-PEG2000 a 5% mol, e quantidades variáveis de DSPC e DSPG) foram preparadas com ou sem gluconato de cálcio 1 mM durante a diálise (ver Figura 14). 7
Figura 18. Estabilidade de formulações lipossómicas de oxaliplatina (DSPE-PEG2000 a 5% mol, e concentrações variáveis de DSPC e DSPG) em meio celular de McCoy (incubação de 24 h a 37°C).
Figura 19. 1.-6. Varrimentos de DSC de formulação de oxaliplatina encapsulada em lipossomas (DSPC/DSPG/DSPE-PEG2000 a 60/35/5% mol) sem a presença de gluconato de cálcio. Velocidade de varrimento: 20°C/h.
Figura 20. Varrimento de DSC (Io varrimento) de formulações de oxaliplatina encapsulada em lipossomas contendo DSPE-PEG2000 a 5% mol e concentrações variáveis de DSPC e DSPG e sem a presença de gluconato de cálcio. Velocidade de varrimento: 20°C/h.
Figura 21. 1.-6. Varrimentos de DSC de formulação de oxaliplatina encapsulada em lipossomas (DSPC/DSPG/DSPE-PEG2000 a 60/35/5% mol) com gluconato de cálcio 1 mM no exterior. Velocidade de varrimento: 20°C/h.
Figura 22. Varrimento de DSC (Io varrimento) de formulações de oxaliplatina encapsulada em lipossomas contendo DSPE-PEG2000 a 5% mol e concentrações variáveis de DSPC e DSPG com gluconato de cálcio 1 mM no exterior. Velocidade de varrimento: 20°C/h.
Figura 23. Concentração de Pt em tampão de dialisado após a) Io passo de diálise e b) 2o passo de diálise (solução de sacarose a 10% contendo gluconato de cálcio 1 mM) de lipossomas com oxaliplatina encapsulada.
Figura 24. 1.-6. Varrimentos de DSC em formulação de oxaliplatina encapsulada em lipossomas (DSPC/DSPG/DSPE-PEG2000 a 60/35/5% mol) com gluconato de cálcio 1 mM tanto no interior como no exterior. Velocidade de varrimento: 20 °C/h.
Figura 25. Varrimento de DSC (Io varrimento) de formulações de oxaliplatina encapsulada em lipossomas contendo DSPE-PEG2000 a 5% mol e concentrações variáveis de DSPC e DSPG com cálcio 1 mM tanto no interior como no exterior. Velocidade de varrimento: 20°C/h.
Lipossoma da invenção
Uma abordagem para a obtenção de libertação de fármacos desencadeada em por exemplo doenças cancerosas é utilizar elevados niveis de fosfolipase secretora A2 (sPLA2) na proximidade de tecidos cancerosos. Assim, através do desenho cuidadoso da composição lipidica dos lipossomas, estes podem ser tornados degradáveis através de sPLA2 uma vez acumulados no tumor para proporcionar uma libertação desencadeada.
Um objeto da presente invenção é proporcionar lipossomas e formulações lipossómicas de maior estabilidade, que possam distribuir a sua carga (por exemplo, um fármaco) no local alvo com reduzida distribuição incontrolada e/ou libertação demasiado cedo devido à permeabilidade da membrana do lipossoma. Outro objeto é proporcionar lipossomas e formulações lipossómicas com uma maior estabilidade durante o armazenamento.
Lipidos aniónicos do lipossoma. 9
Num primeiro aspeto, o lipossoma compreende entre 25% e 45% (mol/mol), de um lipido aniónico. Os presentes inventores tiveram em conta que o teor de lipido aniónico afeta caracteristicas importantes do lipossoma, tais como a taxa de hidrólise de lípidos mediada por SPLA2 do lipossoma, e também a resposta imunitária ao lipossoma. À medida que o teor de lípidos aniónicos aumenta, o mesmo acontece com a velocidade de hidrólise de lípidos por SPLA2 (e a libertação do fármaco) . Demonstrou-se que uma taxa razoável de hidrólise pode ser alcançada através de um teor de lípidos aniónicos entre 25% e 45%. Assim, numa forma de realização, o teor de lipido aniónico é de pelo menos 25%. Noutra forma de realização, o teor de lipido aniónico é de não mais de 45%. Ainda noutra forma de realização, o teor de lipido aniónico do lipossoma é selecionado a partir do grupo que consiste em entre 25% e 45%, 25-42%, 28% e 42%, 30% e 40%, 32% e 38%, e 34 % e 36%. Quando se refere a teor %, trata-se da % mol/mol, a menos que especificamente mencionado em contrário.
Tal como mencionado, também a resposta imunitária contra os lipossomas é afetada pelo teor de lipido aniónico. Assim, a velocidade de eliminação do lipossoma no corpo pode ser reduzida através da manutenção do teor de lipido aniónico no lipossoma abaixo de um certo nível e os presentes inventores reconheceram que o teor de lipido aniónico no lipossoma pode ser utilizado para estabelecer um equilíbrio entre a velocidade de hidrólise de sPLA2 e a eliminação pelo sistema reticuloendotelial.
De preferência o lipido aniónico é um fosfolípido e, de preferência, o fosfolípido é selecionado a partir do grupo 10 que consiste em PI (fosfatidilinositol) , PS (fosfatidilserina) , DPG (bisfosfatidilglicerol) , PA (ácido fosfatidico), PEOH (álcool fosfatidilico), e PG (fosfatidilglicerol) . De maior preferência, o fosfolipido aniónico é PG.
Polímeros hidrófilos
Numa forma de realização preferida, o lipossoma compreende ainda um polimero hidrófilo selecionado a partir do grupo que consiste em PEG [poli(etilenoglicol)], PAcM [poli(N-acriloilmorfolina)], PVP [poli(vinilpirrolidona)], PLA [poli(láctido)], PG [poli(glicólido)], ΡΟΖΟ [poli(2-metil-2-oxazolina)], PVA [poli(álcool vinilico)], HPMC (hidroxipropilmetilcelulose), PEO [poli(óxido de etileno)], quitosano [poli(D-glucosamina)], PAA [poli(aminoácido)], poliHEMA [Poli (2-hidroxietilmetacrilato) ] e copolimeros destes.
De maior preferência o polimero é PEG com um peso molecular entre 100 Da e 10 kDa. Particularmente preferidos são tamanhos de PEG de 2-5 kDa (PEG2000 a PEG5000) , e mais preferido é PEG2000. A inclusão de polimeros nos lipossomas é bem conhecida dos peritos na técnica e pode ser utilizada para aumentar a semivida dos lipossomas na corrente sanguinea, presumivelmente através da redução da eliminação pelo sistema reticuloendotelial.
De preferência, o polimero é conjugado com o grupo frontal da fosfatidiletanolamina. Outra opção é a ceramida (apesar deste lipido não ser hidrolisável por PLA2) . 11 0 lípido conjugado com polímero está de preferência presente numa quantidade de pelo menos 2%. De maior preferência, a quantidade é de pelo menos 5% e não mais de 15%. Ainda de preferência, a quantidade de lípido conjugado com polímero é de pelo menos 3% e não mais de 6%. Os lipossomas contendo fosfolípidos aniónicos e ^2,5% de DSPE-PEG2000 têm uma maior tendência para se agregarem na presença de cálcio. Isto pode ser habitualmente observado através da formação de um gel altamente viscoso. Os lipossomas contendo fosfolípidos aniónicos e >7,5% fazem com que os lipossomas sedimentem ou se separem em fases. Assim, outra janela preferida está entre 2,5% e 7,5%.
Componentes lipidicos de carga neutra no lipossoma
De preferência, o lipossoma compreende também um fosfolípido sem carga selecionado a partir do grupo que consiste em fosfolípidos zwitteriónicos compreendendo PC (fosfatidilcolina) e PE (fosfatidiletanolamina). Ainda de preferência, o fosfolípido zwitteriónico é PC.
Em contraste com o fosfolípido aniónico, o fosfolípido zwiteriónico serve como um componente lipídico hidrolisável por SPLA2 de carga neutra no lipossoma. Através da combinação de fosfolípido zwiteriónico e aniónico no mesmo lipossoma, é possível ajustar para uma densidade de carga superficial desejada que satisfaça tanto uma hidrólise por SPLA2 suficientemente elevada como uma baixa velocidade de eliminação no sangue. A quantidade de fosfolípido zwitteriónico no lipossoma está de preferência entre 40% e 75% e de maior preferência entre 50 e 70%. 12 Éter-fosfolipidos
Alguns ou todos os fosfolípidos podem ser éter- fosfolípidos.
Assim, podem ancorar uma ligação éter em vez de uma ligação éster na posição sn-1 da estrutura do glicerol do fosfolipido. Quando sPLA2 hidrolisa este tipo particular de fosfolípidos, são produzidos liso-fosfolípidos mono-éter e estes são tóxicos para por exemplo células de cancro. Isto é os éter-fosfolipidos podem ser observados como pró-fármacos de liso-fosfolípidos mono-éter e os lipossomas da invenção podem ser utilizados para distribuir tais pró-fármacos no ambiente enriquecido com sPLA2 de células de cancro, onde os pró-fármacos são ativados através de hidrólise por sPLA2. Os éter-fosfolipidos foram descritos em EP 1254143 e WO 2006/048017.
Outros pró-fármacos A porção libertada do lípido através de sPLA2 para criar um lisolípido pode também ser um fármaco. Assim, um lipossoma pode compreender pró-fármacos de lisolípidos mono-éter, pró-fármacos libertados do lípido através de sPLA2 e outros agentes terapêuticos, tal como adicionalmente descrito abaixo.
Agente estabilizante O lipossoma pode também ser estabilizado através da inclusão de colesterol como componente da membrana no lipossoma. No entanto, quantidades elevadas de colesterol no lipossoma têm um efeito negativo na hidrólise por PLA2 e, portanto, o lipossoma compreende não mais de 10% de colesterol. De preferência, o lipossoma compreende menos de 13 1% de colesterol, menos de 0,1% ou não compreende qualquer colesterol. O comprimento da cadeia alquilo dos lípidos constituindo o lipossoma pode ser ajustado para uma velocidade de hidrólise por PLA2 óptima e um vazamento minimo de composto aprisionado para fora do lipossoma. De preferência, as cadeias de alquilo são cadeias C18 ou C16 saturadas.
Os lipossomas da invenção são preparados através do método do terceiro aspeto, em que os lipossomas são estabilizados através de exposição a catiões bivalentes.
Tal como descrito acima, os lipossomas podem compreender pró-fármacos de liso-lipidos mono-éter e/ou da porção libertada a partir do lipido através de sPLA2 para criar o lisolipido.
Os lipossomas compreendem um composto bioativo tal como um agente terapêutico (fármaco) , o qual não é um pró-fármaco de lisofosfolipido mono-éter ou lisofosfolipido mono-éter. O lipossoma pode também compreender pró-fármacos de lisofosfolipido mono-éter e um agente terapêutico. Os compostos bioativos são pequenas moléculas. Uma classe de compostos de particular interesse são agentes anti-tumorais de moléculas pequenas tais como os derivados de antraciclina, cisplatina, oxaliplatina, carboplatina, doxorrubicina, paclitaxel, 5-fluoruracilo, exisulind, ácido cis-retinóico, sulfureto de suldinac, metotrexato, bleomicina e vincristina. Outra classe de particular interesse é a de antibióticos e antifúngicos e ainda outra classe é a de agentes anti-inflamatórios, tais como esteroides e não-esteroides. 0 lipossoma pode compreender 14 1, 2, 3 ou mais compostos bioativos diferentes. Numa forma de realização preferida, o lipossoma compreende apenas 1 componente bioativo. 0 lipossoma pode compreender um agente de diagnóstico. Por "agente de diagnóstico" entenda-se um agente que suporta a localização do tecido alvo e/ou o diagnóstico da doença e/ou condição. Exemplos não limitantes podem ser agentes de contraste, micropartículas, agentes radioativos, agentes alvo específicos, tais como por exemplo agentes que se ligam especificamente a marcadores associados à doença e/ou condição, etc. É evidente para um perito na técnica que, em algumas formas de realização, a invenção se refere a uma formulação de lipossomas em que o lipossoma compreende pelo menos um fármaco bem como um agente de diagnóstico.
Caracteristicas físico-químicas dos lipossomas 0 lipossoma pode ser unilamelar ou multilamelar. De preferência, o lipossoma é unilamelar. 0 diâmetro do lipossoma deve ser entre 50 e 400 nm, de preferência entre 80 e 160 nm, e de maior preferência entre 90 e 120 nm.
De preferência, o índice de Poli-Dispersibilidade (PDI) da formulação lipossómica do segundo aspeto da invenção não deve exceder 0,2 e de maior preferência deve ser 0,15 ou menos, ou ainda de preferência 0,10 ou menos. Um valor de PDI neste intervalo expressa uma distribuição de tamanhos das partículas relativamente estreita na formulação.
Tal como será claro a partir do acima exposto, é preferível que pelo menos um dos lipidos constituindo o lipossoma seja um substrato para SPLA2 quando presente no lipossoma. 15
Numa forma de realização, o lipossoma compreende lípidos que são hidrolisados por SPLA2 na posição sn-3, em vez de na posição sn-2. Tais lipidos não naturais e lipossomas compreendendo lipidos não naturais foram divulgados em WO 2006/048017.
Os lipossomas estão presentes na formulação lipossómica do segundo aspeto. Assim, foram estabilizados através de exposição a catiões bivalentes, tal como descrito no segundo aspeto. Numa forma de realização, os lipossomas apenas foram expostos a catiões bivalentes após a formação. Isto é, o interior dos lipossomas não contém catiões bivalentes. Noutra forma de realização, apenas o interior dos lipossomas compreende catiões bivalentes. A presença de catiões bivalentes associados aos lipossomas da presente invenção não é diretamente verificável. No entanto, os presentes inventores descreveram parâmetros que são indicativos de se os lipossomas foram estabilizadas através de catiões bivalentes.
O varrimento de DSC de oxaliplatina lipossómica (DSPC/DSPG/DSPE-PEG2000 a 70/25/5% mol), na ausência de um catião bivalente dá uma única temperatura de transição observada como um pico. Se o varrimento for repetido, a temperatura de transição é deslocada para temperaturas mais elevadas, o que pode ser devido à libertação de oxaliplatina para o exterior dos lipossomas ao passar a temperatura de transição (Figura 19) . Varrimentos de DSC repetidos de lipossomas que tenham sido expostos a um catião bivalente têm uma temperatura de transição mais constante. Assim, numa forma de realização, os lipossomas da invenção são caracteristicos por varrimentos de DSC 16 repetidos do lipossoma darem uma temperatura de transição que difere em não mais de 2°C entre o primeiro e o segundo varrimento. Noutra forma de realização, os lipossomas da invenção são característicos por os varrimentos de DSC repetidos dos lipossomas darem uma temperatura de transição que difere menos entre o primeiro e o segundo varrimento do que a temperatura de transição de lipossomas de controlo com a mesma composição.
Um varrimento de DSC de oxaliplatina lipossómica (DSPC/DSPG/DSPE-PEG2000 a 70/25/5% mol) estabilizada através de exposição a um catião bivalente dá uma temperatura de transição de fases separadas (dois picos no varrimento; ver por exemplo Figura 22). Assim, numa forma de realização dos lipossomas da invenção, os lipossomas são caracteristicos por um varrimento de DSC dos lipossomas dar uma temperatura de transição de fase separadas.
Além disso, a temperatura de transição dos lipossomas é deslocada para temperaturas mais elevadas através da exposição a catiões bivalentes e um método de determinação de se os lipossomas (de teste) foram expostos a um catião bivalente tal como cálcio é através da determinação da temperatura de transição de lipossomas de controlo com a mesma composição que os lipossomas de teste, em que os referidos lipossomas de controlo não foram expostos a um catião bivalente. Assim, numa forma de realização, os lipossomas da invenção são caracteristicos por terem uma temperatura de transição mais elevada do que os lipossomas de controlo com a mesma composição que não tenham sido expostos a catiões bivalentes. 17
Noutra forma de realização, os lipossomas da invenção são caracteristicos por o tamanho médio dos lipossomas não diminuir mais de 10% e de preferência não mais de 5%, quando são expostos a cálcio 1 mM. Se não tiverem sido previamente expostos a cálcio, encolhem quando expostos a cálcio. Um modo de testar se os lipossomas de teste foram expostos a cálcio é através da comparação com lipossomas de controlo com a mesma composição, em que se sabe que não foram expostos a cálcio. Assim, numa forma de realização, os lipossomas da invenção são caracteristicos por apresentarem um grau de encolhimento quando expostos a cálcio 1 mM que é menor do que o grau de encolhimento para lipossomas de controlo com a mesma composição, que não foram anteriormente expostos a catiões bivalentes.
Formulação lipossómica
Um segundo aspeto da invenção é uma formulação lipossómica compreendendo lipossomas da invenção. De preferência, a formulação compreende também um catião bivalente a uma concentração de pelo menos 0,1 mM. Os presentes inventores descobriram que a presença de um catião bivalente (ou a exposição prévia a um) estabiliza os lipossomas da formulação conduzindo a reduzido vazamento do composto bioativo para fora dos lipossomas. No entanto, sabe-se que a concentração de catião bivalente não deve exceder 10 mM e não deve exceder 5 mM uma vez que tais concentrações podem conduzir a agregação dos lipossomas e viscosidades elevadas indesejáveis. A concentração de catião bivalente não é superior a 1 mM e, de preferência, a concentração de catião bivalente está entre 0,1 mM e 1 mM (Figura 3). Um catião bivalente preferido é cálcio. 18
Numa forma de realização preferida, o catião bivalente é selecionado a partir do grupo que consiste em magnésio (Mg2+) , ferro (Fe2+) , cálcio (Ca2+) , berilio (Be2+) , magnésio (Mg2+) , estrôncio (Sr2+) , bário (Ba2+) e rádon (Ra2+) . Vários catiões bivalentes foram testadas (dados não mostrados) e os melhores efeitos são observados com Ca2+, portanto na formulação é preferível Ca .
Além disso, sabe-se também que o contra-ião de Ca e importante nalguns casos. Portanto, numa forma de realização, o contra-ião é selecionado a partir do grupo que consiste em aniões volumosos, tais como um sal orgânico, de preferência selecionados a partir do grupo que consiste em gluconato, propionato ou lactato. De maior preferência, o contra-ião é gluconato. 0 catião bivalente pode ser distribuído no interior do lipossoma, no exterior do lipossoma, ou tanto no interior como no exterior do lipossoma. 0 catião bivalente pode, portanto, estar presente na solução de hidratação e/ou na solução em que a formulação de lipossomas é purificada, suspensa e/ou armazenada. Numa forma de realização preferida, o catião bivalente é distribuído no exterior do lipossoma, mas não no interior do lipossoma. Nesta forma de realização, o catião bivalente pode ser adicionado após a formação do lipossoma. A concentração de sal de cálcio a empregar pode depender de cada formulação de lipossomas e do fármaco. Sais tais como, por exemplo, CaCl2 ou NaCl são muitas vezes necessários a certas concentrações para estabilizar os lipossomas. No entanto, a oxaliplatina é instável na presença de alguns 19 sais, tais como, por exemplo, NaCl, e a cisplatina é instável na presença de sais de fosfatos ou em água pura. Assim, o tipo de sal selecionado e a sua concentração terão um impacto significativo nas propriedades de formação de vesículas e, por conseguinte, dependendo do fármaco a encapsular, devem ser selecionados vários sais e utilizadas diferentes concentrações salinas para a preparação de uma formulação de lipossomas.
De preferência, o índice de Poli-Dispersibilidade (PDI) da formulação lipossómica não deve exceder 0,2 e de maior preferência ser 0,10 ou menos. Um valor de PDI neste intervalo expressa uma distribuição de tamanhos das partículas relativamente estreita na formulação.
Conservação da formulação de lipossomas
Numa forma de realização preferida, a formulação lipossómica compreende ainda um agente crio- e/ou lio-protetor .
Durante o armazenamento dos lipossomas os fosfolípidos podem ser submetidos a hidrólise. Uma maneira simples de prevenir a decomposição dos fosfolípidos na formulação de lipossomas é através de congelação ou secagem por congelação. A congelação pode no entanto induzir vazamento da formulação do lipossoma e resultar na libertação do fármaco encapsulado. A adição de um agente crio-protetor pode ser necessária para evitar ou reduzir o vazamento a partir da preparação de lipossomas após congelação. Assim, a formulação de lipossomas pode ainda compreender um agente crio-protetor. Exemplos de agentes que podem ser utilizados 20 como agentes crio-protetores podem ser, sem limitação, dissacáridos tais como sacarose, maltose e/ou trealose. Tais agentes podem ser utilizados em várias concentrações, dependendo da preparação e do agente selecionado, de modo a obter-se uma solução isotónica. O lipossoma pode também ser liofilizado, armazenado e reconstituído de modo a que uma porção substancial do seu conteúdo interno seja mantida. A desidratação de lipossomas requer geralmente a utilização de um agente lio-protetor, tal como um dissacárido (sacarose, maltose ou trealose), tanto na interface interior como exterior da bicamada do lipossoma. Considera-se geralmente que este composto hidrófilo previne o rearranjo dos lípidos na formulação de lipossomas, de modo a que o tamanho e o conteúdo sejam mantidos durante o procedimento de secagem e ao longo da subsequente reconstituição. Qualidades apropriadas para tais agentes protetores de secagem são que estes possuam caracteristicas químicas estéricas que preservem o espaçamento intramolecular dos componentes da bicamada do lipossoma. Método de preparação de uma formulação lipossómica
Um terceiro aspeto da invenção é um método de preparação de uma formulação lipossómica compreendendo os passos: a) Preparação de uma mistura de lípidos através da dissolução de lípidos selecionados num solvente orgânico b) Hidratação do produto do passo a) com um solvente de hidratação aquoso de modo a formar lipossomas c) Remoção do solvente orgânico do passo a) antes da adição do solvente de hidratação aquoso ou após a adição do solvente de hidratação aquoso. 21
De preferência, o solvente orgânico é removido antes da adição do solvente de hidratação. 0 método compreende ainda mistura de alto cisalhamento para reduzir o tamanho dos lipossomas. 0 método pode ainda compreender um passo de extrusão dos lipossomas produzidos no passo c) através de um filtro para produzir lipossomas de um certo tamanho médio. 0 método pode também compreender um passo de sujeição da formulação lipossómica a ultrassons para produzir lipossomas de um certo tamanho.
Os lipossomas podem ser carregados com pelo menos um agente terapêutico através da solubilização do fármaco no solvente orgânico ou do solvente de hidratação utilizado para preparar os lipossomas.
Alternativamente, o agente terapêutico ionizável pode ser carregado em lipossomas formando primeiro os lipossomas, estabelecendo um potencial eletroquímico, por exemplo por meio de um gradiente de pH, através da camada mais externa do lipossoma, e em seguida adicionando o agente terapêutico ionizável ao meio aquoso externo ao lipossoma.
Numa forma de realização preferida, o solvente de hidratação compreende um catião bivalente a uma concentração de pelo menos 0,1 mM e de maior preferência a uma concentração compreendida entre 0,1 mM e 5 mM e ainda de preferência entre 0,1 mM e 1 mM. De preferência, o catião bivalente é Ca2+. Noutra forma de realização, o solvente de hidratação não compreende um catião bivalente. 22
Nesta forma de realização, prefere-se que a fase aquosa exterior seja mudada para uma outra fase aquosa exterior compreendendo um catião bivalente tal como descrito abaixo.
Noutra forma de realização, o método compreende ainda um passo de mudança da fase aquosa exterior da formulação. Inicialmente, a fase aquosa compreenderá o solvente de hidratação. A fase aquosa exterior pode ser mudada através de centrifugação, ultrafiltração, diálise, ou semelhante, para preparar uma formulação lipossómica compreendendo lipossomas numa solução de composição definida da fase aquosa exterior. De preferência, os compostos bioativos (agentes terapêuticos) estão apenas presentes dentro ou ligados aos lipossomas, e não como compostos livres em solução. De preferência, o encapsulamento do fármaco nos lipossomas deve ser >70%, de maior preferência >95% e de ainda preferência >99%. O grau de encapsulamento do fármaco é a razão de fármaco encapsulado para a quantidade total de fármaco na formulação.
Numa forma de realização preferida, a fase aquosa exterior é mudada para outra fase aquosa exterior compreendendo um catião bivalente a uma concentração de pelo menos 0,1 mM e, de maior preferência, a uma concentração entre 0,1 mM e 5 mM e ainda de preferência entre 0,1 mM e 1 mM. De preferência, o catião bivalente é Ca2+.
Os presentes inventores descobriram que os lipossomas vazam inicialmente composto aprisionado quando expostos a cálcio. Além disso, os lipossomas condensam para dar partículas de menor diâmetro. No entanto, após o vazamento inicial os lipossomas expostos a Ca2+ exibem reduzido vazamento tal como observado, por exemplo, no caso de incubação em meio 23 celular (por exemplo, meio de McCoy, Figura 3). Devido ao vazamento inicial, diálise e/ou centrifugação são normalmente feitas para separar os lipossomas do material vazado. Pode também ser feita filtração.
Numa forma de realização preferida do segundo aspeto, a formulação lipossómica é produzida através do método do terceiro aspeto.
Medicamentos
Um quinto aspeto da invenção é o lipossoma do primeiro aspeto ou a formulação lipossómica do segundo aspeto para utilização como medicamento.
Um sexto aspeto da invenção é o lipossoma do primeiro aspeto ou a formulação lipossómica do segundo aspeto utilizados para tratamento de condições em que a atividade de PLA2 é aumentada. Tais condições são por exemplo cancro e doenças inflamatórias.
Exemplos
Exemplo 1: Preparação de Cisplatina encapsulada em lipossomas e Oxaliplatina encapsulada em lipossomas. A Cisplatina encapsulada em lipossomas e a Oxaliplatina encapsulada em lipossomas são formulações lipossoma-fármaco em que o fármaco cisplatina ou oxaliplatina está encapsulado no compartimento aquoso do lipossoma. As formulações lipossómicas de fármacos são constituídas pelo fármaco encapsulado numa mistura de lípidos feita de mPEG2000-disteoril-fosfatidiletanolamina (DSPE-PEG2000) a 5% mol; disterorilfosfatidilglicerol (DSPG) a 25% mol; e 24 disteorilfosfatidilcolina (DSPC) a 70% mol. O procedimento específico para cada formulação está delineado abaixo.
Cisplatina encapsulada em lipossomas
Os fosfolípidos foram dissolvidos em clorofórmio/metanol 9:1 (v/v). O solvente das misturas de lípidos dissolvidos foi então evaporado num banho-maria a 65°C até à secura visual, sob uma corrente de azoto gasoso. As amostras foram melhor secadas sob vácuo de um dia para o outro. O líquido de hidratação (solução de cloreto de sódio e gluconato de cálcio, ambas a concentrações variáveis) contendo cisplatina foi adicionado à mistura de lípidos seca a uma temperatura de 65°C-70°C para a preparação de vesículas multilamelares (MLV). As suspensões lipídicas foram mantidas a 65-70°C durante pelo menos 30 min para assegurar uma hidratação completa. Durante este período, as suspensões lipídicas foram sujeitas a vórtice a cada 5 min. Foram preparadas grandes vesículas unilamelares (LUV) através da sujeição das MLV a ultrassons durante 5 min. a 65°C, seguido de extrusão através de filtros de policarbonato com um tamanho de poro de 100 nm a 65-70°C. As LUV foram posteriormente transferidas para cassetes de diálise (MWCO: 10 kDa) para remover a cisplatina não aprisionada.
Oxaliplatina encapsulada em lipossomas
Os fosfolípidos foram dissolvidos em clorofórmio/metanol a 9:1. As misturas de lípidos dissolvidos foram então evaporadas em banho-maria a 65°C até à secura visual, sob uma corrente de azoto. As amostras foram melhor secadas sob vácuo de um dia para o outro. 25 0 tampão de hidratação (solução de sacarose a 10% com concentrações variáveis de diferentes sais de cálcio) contendo oxaliplatina foi adicionado à mistura de lipidos seca para a preparação de vesiculas multilamelares (MLV). As suspensões lipidicas foram mantidas a 65-70°C durante pelo menos 30 min para assegurar uma hidratação completa. Durante este período, as suspensões lipidicas foram sujeitas a vórtice a cada 5 min. Grandes vesículas unilamelares (LUV) foram subsequentemente preparadas através da sujeição das MLV a ultrassons durante 5 min. a 65-70°C, seguido de extrusão através de filtros de policarbonato com um tamanho de poro de 100 nm a 65-70°C. As LUV foram posteriormente transferidas para cassetes de diálise (MWCO: 10 kDa) para remover a oxaliplatina não aprisionada.
As estimativas para o teor de Pt exterior para a Oxaliplatina encapsulada em lipossomas ou a Cisplatina encapsulada em lipossomas são baseadas no equilíbrio de amostras seguido de um passo de separação através de filtração em centrífuga. O teor de Pt é quantificado através da utilização de ICP-MS. TABELA 1: Teor de cisplatina em formulação lipossómica de cisplatina com um teor variável de Gluconato de cálcio.
Gluconato de cálcio (mM) Teor de cisplatina (mg/mL) 0 1,10 0,10 0,49 1,00 0,77 TABELA 2: Teor de oxaliplatina na formulação lipossómica de oxaliplatina com um teor variável de Gluconato de cálcio. 26
Gluconato de cálcio (mM) Teor de oxaliplatina (mg/mL) 0 0,40 0,01 0,45 O \—1 k·. o 0,82 1,00 1,24 5, 00 1,01
Exemplo 2: Estabilidade da oxaliplatina em solução de hidratação. A oxaliplatina foi dissolvida numa solução de hidratação contendo sacarose a 10% e gluconato de cálcio 1 mM (10 mg/mL). A sacarose foi adicionada para obter uma osmolaridade correspondendo aproximadamente à concentração salina fisiológica. A estabilidade de oxaliplatina na solução de hidratação foi seguida por medição de UV. As amostras foram tomadas continuamente durante o armazenamento à temperatura ambiente. A concentração da amostra medida foi de 0,1 mg/mL de oxaliplatina. Para seguir a estabilidade da oxaliplatina foi realizado um varrimento de 200-350 nm (Figura 1) e a absorvância a 254 nm foi comparada durante o armazenamento (Figura 2). Grandes alterações na absorvância a 254 nm estão geralmente relacionadas com a decomposição de oxaliplatina, a qual pode ser facilmente observada através da dissolução de oxaliplatina em soluções contendo iões hidróxido e/ou cloreto. Vários componentes tampão comuns, tais como fosfato, citrato, acetato, etanolamina foram também testados, mas foi no entanto observado que diminuíam a absorvância a 254 nm (dados não mostrados) . A oxaliplatina dissolvida em solução de sacarose a 10% contendo gluconato de cálcio 1 mM mostrou não ter praticamente nenhuma decomposição durante o armazenamento à temperatura ambiente durante pelo menos 35 dias. 27
Exemplo 3: Estabilidade da oxaliplatina encapsulada em lipos somas. A estabilidade de formulações de oxaliplatina encapsulada em lipossomas (DSPC/DSPG/DSPE-PEG2000 a 70/25/5% mol) foi examinada através da medição do vazamento passivo de espécies de platina a partir da formulação armazenada em meios celulares (McCoy, Figura 5A) , a 37°C. Amostras foram tomadas at=0et=24 horas. O vazamento a partir de lipossomas foi relatado como sendo a diferença entre o teor de platina na fase aquosa exterior imediatamente após a adição ao meio celular e após 24 horas de incubação a 37°C.
Determinação do grau de encapsulamento: 1. 50 pL de formulação lipossómica são diluídos em McCoy até um volume total de 5 mL. 2. O tubo contendo a formulação diluída é armazenado a 37°C durante 24 h. 3. 2 mL da amostra diluída (Oh e 24h) são carregados em filtros Millipore Centricon YM-30, que são centrifugados durante 20 min a 15°C e 2500 g. 4. 200 pL de filtrado são recolhidos e diluídos até um volume total de 2 mL utilizando McCoy. 5. 200 pL de amostra diluída são adicionalmente diluídos até um volume total de 2 mL. 6. 0 teor de Pt das amostras é medido através de ICP-MS. A curva padrão é preparada em Meio de McCoy.
Este meio celular foi utilizado para a avaliação subsequente do efeito citotóxico da Oxaliplatina encapsulada em lipossomas em células de carcinoma do cólon HT-29. Um maior vazamento a partir dos lipossomas após armazenamento no meio celular resulta em citotoxicidade inespecífica. A formulação deve ter uma citotoxicidade 28 mínima quando não tenha sido submetida a hidrólise por sPLA2. Concentrações variáveis de gluconato de cálcio (0-5 mM) na formulação de Oxaliplatina encapsulada em lipossomas foram examinadas quanto à sua capacidade para estabilizar os lipossomas (Figura 5).
Foi claramente demonstrado que as formulações preparadas com uma concentração crescente de gluconato de cálcio até 5 mM aumentaram a estabilidade da Oxaliplatina encapsulada em lipossomas em meio de McCoy uma vez que o vazamento dos lipossomas diminuiu (Figura 3) . O grau inicial de encapsulamento (medido imediatamente após a adição ao meio celular) também aumentou com concentrações crescentes de gluconato de cálcio. Para examinar se o efeito estabilizador observado do gluconato de cálcio na formulação de lipossomas estava relacionado com o cálcio ou o gluconato, foi ainda examinado se outros compostos contendo cálcio ou gluconato eram capazes de estabilizar a formulação de Oxaliplatina encapsulada em lipossomas. Tal como demonstrado na tabela abaixo, foi evidente que outros compostos de cálcio foram também capazes de estabilizar a formulação de lipossomas, enquanto o gluconato de sódio não o foi. Lactato de cálcio e propionato de cálcio têm um efeito estabilizador semelhante sobre a formulação em comparação com o gluconato de cálcio. Estes resultados sugerem que o cálcio é responsável pelo efeito estabilizador sobre as formulações de lipossomas. TABELA 3: Teste de diferentes sais
Formulação de oxaliplatina Oxaliplatina DOE DOE Vazamento encapsulada em lipossomas (mg/mL) Γ+ II o t=24h (%) (DSPD/DSPG/DSPE-PEG2000 a (%) (%) 29 70/25/5% mol) Gluconato de sódio 1 mM 0, 64 68 55 13 Lactato de cálcio 1 mM 0,80 99 98 1 Propionato de cálcio 1 mM 1,22 99 98 1
Foi ainda examinado como a formulação de lipossomas era afetada pela presença de gluconato de cálcio apenas no interior ou no exterior. Tal como demonstrado na tabela abaixo, foi bem evidente que a formulação de lipossomas contendo cálcio apenas no interior não é muito boa para estabilizar a formulação de oxaliplatina em lipossomas. Ter cálcio apenas no exterior foi demonstrado estabilizar a formulação de lipossomas bastante bem. TABELA 4: Teste da localização do gluconato de cálcio
Formulação de oxaliplatina encapsulada em lipossomas (DSPD/DSPG/DSPE-PEG2000 a 70/25/5% mol) Oxaliplatina (mg/mL) DOE t=0h (%) DOE t=24h (%) Vazamento (%) Gluconato de cálcio 1 mM, interior 0, 61 68 46 22 Gluconato de cálcio 1 mM, exterior 0, 64 96 92 4 Gluconato de cálcio 1 mM, interior + exterior 1,51 100 99 1
Exemplo 4: Éter-lipidos anticancro
Foram utilizados éter-fosfolipidos para preparar uma formulação de lipossomas de oxaliplatina encapsulada numa mistura de lipidos (l-0-octadecil-2-octadecanoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol (1-0-DSPG) a 25% mol, 1-0-octadecil-2-octadecanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (1-0- DSPC) a 70% mol e dioctadecanoil-sn-glicero-3- 30 fosfoetanolamina-N-[metoxi-(polietilenoglicol)2000] (DSPE-PEG2000) a 5% mol) numa solução contendo sacarose a 10% e gluconato de cálcio 1 mM.
Após armazenamento em meio de McCoy a 37 °C durante 24 horas, foi observado um vazamento de oxaliplatina de apenas 4%.
Exemplo 5: Citotoxicidade de oxaliplatina encapsulada em lipossomas. A atividade citotóxica da oxaliplatina encapsulada em lipossomas foi avaliada em células de carcinoma do cólon (HT-29) (Figura 5). A linha celular HT-29 não tem a capacidade de segregar PLA2. Oxaliplatina livre foi utilizada como referência. As células HT-29 foram tratadas durante 6h com oxaliplatina ou Oxaliplatina encapsulada em lipossomas na presença ou ausência de PLA2. PLA2 de uma fonte externa tal como liquido lacrimal foi adicionada para mostrar que tinha ocorrido libertação completa de oxaliplatina. Com uma formulação lipossómica estável as HT-29 não devem ser afetadas pela presença de tal. Para libertar a oxaliplatina do lipossoma é necessária a presença de uma fonte de PLA2. No entanto, com formulações de lipossomas instáveis pode ocorrer vazamento e, assim, afectar as células HT-29, apesar da ausência de PLA2. É evidente que quando a concentração de gluconato de cálcio na formulação é maior o vazamento do lipossoma diminui. Os resultados estão bem correlacionados com o estudo de estabilidade in vitro (Figura 3B) onde se observa que o vazamento dos lipossomas pode ser reduzido através do aumento da concentração de gluconato de cálcio. 31
Exemplo 6. Estabilidade de formulações llpossómlcas de clsplatlna contendo gluconato de cálcio
Objetivo:
Examinar a estabilidade de formulações lipossómicas de cisplatina (DSPC/DSPG/DSPE-PEG20 0 0 a 70/25/5% mol) contendo gluconato de cálcio em meio de McCoy. 0 objectivo é o de encontrar uma formulação que tenha um vazamento minimo em meio de McCoy.
Protocolo:
As formulações de lipossomas (50 pL) foram misturadas com 4 950 pL de meio de McCoy e incubadas a 37°C durante 24 h. Amostras foram tomadas a t=0 e t=24 h. A formulação de cisplatina é preparada com concentrações variáveis de gluconato de cálcio.
Grau de encapsulamento: 1. 50 pL de formulação lipossómica são diluídos em McCoy até um volume total de 5 mL. 2. 0 tubo contendo a formulação diluída é armazenado a 37°C durante 24 h. 3. 2 mL da amostra diluída (Oh e 24h) são carregados em filtros Millipore Centricon YM-30, que são centrifugados durante 20 min a 15°C e 2500 g. 4. 200 pL de filtrado são recolhidos e diluídos até um volume total de 2 mL utilizando McCoy. 5. 200 pL de amostra diluída são adicionalmente diluídos até um volume total de 2 mL. 6. O teor de Pt das amostras é medido através de ICP-MS. A curva padrão é preparada em meio de McCoy.
Resultados: 32
Formulação Fora t=0 (ppm) DOE t=0h (%) Fora 24 ppm DOE t=24h (%) Total (ppm) Vazamento (%) Cisplatina lipossómica gluconato de cálcio 10 0 μΜ 9 98 30 92 390 5 Cisplatina lipossómica Gluconato de cálcio 1 mM 2 99 12 96 338 3
As formulações de cisplatina encapsulada em lipossomas contendo 100 μΜ e 1 mM de gluconato de cálcio tiveram um reduzido grau de vazamento, em comparação com as observações anteriores, feitas com formulações preparadas sem a presença de gluconato de cálcio.
Este meio celular foi utilizado para a avaliação subsequente do efeito citotóxico da Cisplatina encapsulada em lipossomas em células de carcinoma do cólon HT-29 (Figura 4 e Figura 6). É evidente que quando a concentração de gluconato de cálcio na formulação é aumentada o vazamento a partir do lipossoma diminui. Os resultados estão bem correlacionados com o estudo de estabilidade in vitro (Figura 3A) onde se observou que o vazamento dos lipossomas pode ser diminuído através do aumento da concentração de gluconato de cálcio.
Exemplo 7. Efeito do cálcio na formulação de Oxaliplatina encapsulada em lipossomas
Objectivo: Examinar o efeito da adição ou diluição da formulação de Oxaliplatina encapsulada em lipossomas com uma solução de gluconato de cálcio. 33 A formulação de Oxaliplatina encapsulada em lipossomas foi preparada sem cálcio (sacarose a 10% no interior e exterior). A formulação de Oxaliplatina encapsulada em lipossomas foi diluida em concentrações variáveis de cálcio (concentração de lipidos mantida a 0,84 mM). As amostras foram equilibradas 24h, e o grau de encapsulamento (DOE; %) e o tamanho das partículas foram medidos.
Uma suspensão de lipossomas (70/25/5% mol, PC/PG/PE-PEG) contendo 1,2-dipalmitoil-fosfatidiletanolamina a 0,5% mol com a sonda fluorescente 7-nitrobenz-2-oxa-l,3-diazol-4-ilo covalentemente ligado ao grupo frontal (NBD-PE) (Fluka, Buchs, Suiça) foi preparada em sacarose a 10%. As moléculas da sonda NBD foram excitadas a 465 nm e o pico do comprimento de onda de emissão foi observado a 535 nm utilizando um espectrofluorímetro SLM DMX-1000. Uma aliquota de 2,5 mL em suspensão de lipidos 0,1 mM preparada de fresco foi colocada numa cuvete a temperatura constante (25°C), e equilibrou-se durante 5 minutos antes da adição do extintor irreversível ditionito à fase aquosa externa. Uma mistura rápida da amostra foi alcançada nas cuvetes com uma barra de agitação magnética. O decaimento dependente do tempo da intensidade da fluorescência foi monitorizado após a adição de 30 pL de ditionito de sódio preparado de fresco (Na2S2C>4 1 M em solução de reserva de tampão Trizma 1 M) . Após 300 s são adicionados 30 pL de Gluconato de cálcio 10 mM. A subsequente adição de 10 pL de Triton X-100 a 10% às preparações de lipossomas resultou na extinção completa da fluorescência de NBD-PE em segundos.
Resultados
Tabela 1. Análise do tamanho das partículas da formulação lipossómica de oxaliplatina (DSPC/DSPG/DSPE-PEG2000 a 34 70/25/5% mol) armazenada a várias concentrações de gluconato de cálcio (24 h à temperatura ambiente) . Teor lipidico mantido a 0,84 mM.
Cone. de Ca2+ [μΜ] Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3 Média DP 0 115, 9 111,4 111 112,7667 2,720907 1 114,3 113, 1 113, 1 113,5 0,69282 5 109, 7 110,2 110,1 110 0,264575 10 108,5 107,5 107,5 107,8333 0,57735 50 103, 8 101,5 101, 9 102,4 1,228821 100 101,2 102, 9 100,5 101,5333 1,234234 500 97,2 98,48 99, 05 98,24333 0,947435 1000 101, 8 103,5 101, 9 102,4 0,953939 5000 109, 4 107,4 106, 5 107,7667 1,484363
Tabela 2. Análise de Pt de Oxaliplatina encapsulada em lipossomas (DSPC/DSPG/DSPE-PEG2000 a 70/25/5% mol) armazenada em várias concentrações de gluconato de cálcio (24 h à temperatura ambiente). Teor lipidico mantido a 0,84 mM.
Cone. de Ca2+ [μΜ] Fora [ppm] Total [ppm] Vazamento (%) 0 1,41 61,06 2,32 1 1,42 64,87 2,19 5 1,59 62,41 2,55 10 1, 90 62,20 3,06 50 7, 60 61,83 12,29 100 12,73 100,49 12, 67 500 22,41 68,89 32,53 1000 21, 67 67,89 31, 91 5000 22,03 67, 67 32,55 35 Pôde observar-se que o tamanho das partículas dos lipossomas diminuiu durante o armazenamento em soluções contendo concentrações variáveis de cálcio (Figura 7) . 0 vazamento a partir da formulação aumentou com um aumento do cálcio no exterior (Figura 8). A adição de cálcio à formulação contendo a sonda NBD-PE, que tinha sido extinta, não induziu mais extinção (Figura 9). Os resultados indicam que a adição de cálcio não induz permeabilidade transiente. Estes dados indicam que o cálcio condensa a membrana lipossómica, o que faz com que o tamanho das partículas diminua e causa a libertação do fármaco.
Exemplo 8. Efeito de Ca2+ na formulação lipossómica de oxaliplatina; parte I
Objetivo:
Examinar o efeito de ter apenas cálcio na fase aquosa exterior de várias formulações lipossómicas contendo DSPC, DSPG e DSPE-PEG2000 em termos de tamanho das partículas, Pt total, DOE e estabilidade. Para seguir a possível interação entre Ca2+ e oxaliplatina com as membranas, foram realizadas DSC nas diferentes formulações.
Protocolo
Cinco formulações lipossómicas de oxaliplatina diferentes foram preparadas sem cálcio no interior. Os teores em DSPG e DSPC foram variados nas formulações lipossómicas, como se segue: 1. PC/PG/PE-PEG a 80:15:5% mol 2. PC/PG/PE-PEG a 70:25:5% mol 3. PC/PG/PE-PEG a 60:35:5% mol 4. PC/PG/PE-PEG a 50:45:5% mol 5. PC/PG/PE-PEG a 40:55:5% mol 36 4 ml de Oxaliplatina encapsulada em lipossomas foram sujeitos a ultrassons (1 min/mL) a 75°C, seguido de arrefecimento para precipitar a oxaliplatina em excesso. 0 sobrenadante foi transferido para câmaras de diálise (MWCO: 10 kDa) e dialisado contra uma solução de sacarose a 10%. 1,75 ml foram enchidos em cada câmara. A amostra dialisada foi dividida em duas porções e uma foi mais dialisada num gobelé contendo solução de sacarose a 10%, e a outra foi dialisada num gobelé contendo solução de sacarose a 10% contendo gluconato de cálcio 1 mM.
Os tamanhos das partículas foram seguidos após ultrassons, e depois de cada passo de diálise.
Os termogramas das formulações lipossómicas ( + /-Gluconato de cálcio) são comparados. O vazamento durante o Io e o 2o passo de diálise foi monitorizado para as formulações lipossómicas. A estabilidade das formulações lipossómicas de oxaliplatina foi testada em meio de McCoy (24h, 37°C) .
Resultados
Ver Figuras 10-22.
Análise do tamanho das partículas (tamanho dado em nm) % PG Após ultrassons 1° passo de diálise (-cálcio) 2o passo de diálise (-cálcio) 2o passo de diálise (+cálcio) 15 100,2 ± 1,6 98,5 ± 1,5 102,8 ± 1,5 94,8 ± 1,4 25 97,4 ±0,6 98,5 ± 0,5 112,6 ± 1,3 94,8 ± 0,5 35 105,7 ± 0,7 112,6 ± 1,7 122,5 ± 0,8 103,5 ± 1,1 45 80,8 ± 0,9 87,7 ± 0,5 98,3 ±0,6 80,5 ± 0,8 55 82,5 ± 0,5 89,0 ± 0,6 104,4 ± 1,9 81,4 ± 1,3 37
Análise de Pt
Io passo de diálise (-cálcio) % PG Fora (ppm) DOE (%) Total (ppm) Razão da contagem de iões (Pt195/P31) 15 25, 24 96,3 674,1 10,55 25 31,673 96, 6 941, 9 12,18 35 39,472 96, 6 1178,1 14,54 45 54,115 94,2 927,4 11,07 55 43, 60 95, 1 898,0 10,93 2° passo de diálise (-cálcio) % PG Fora (ppm) DOE (%) Total (ppm) Razão da contagem de iões (Pt195/P31) 15 16,046 97,6 680 10,46 25 21,027 97,1 733 11,52 35 24,574 97,0 815 13,58 45 24,478 95,0 485 10,85 55 28,71 96, 1 743 11,06 2° passo de diálise (+cálcio) % PG Fora (ppm) DOE (%) Total (ppm) Razão da contagem de iões (Pt195/P31) 15 9, 919 98,0 495 8,49 25 14,137 97,3 517 7,18 35 11,258 98,1 599 7,91 45 18,464 94,3 324 4,45 55 17,036 94,0 285 4,09
Estabilidade no meio celular de McCoy
Sem cálcio na solução de diálise % PG Fora t=0 (ppm) DOE t=0 (%) Fora t=24h (ppm) DOE t= 24h (%) Total (ppm) 15 95, 5 84,70 149,3 76, 08 624,2 25 214,7 27,37 166,3 43,74 295,7 35 184,1 55, 77 271,6 34,74 416,2 45 168,3 58,73 242,0 40,65 407,7 55 320,5 47,51 356,2 41,65 610,5 38
Com cálcio na solução de diálise % PG Fora t=0 (ppm) DOE t=0 (%) Fora t=24h (ppm) DOE t= 24h (%) Total (ppm) 15 2,8 99, 44 13,2 97,36 498,8 25 2,5 99,35 12,1 96, 80 377,2 35 6,4 98,07 13,4 95, 94 330,9 45 9,8 96,33 46,7 82,58 268,0 55 19,3 90,73 23,0 88,95 207,6
Discussão
As formulações foram preparadas sem cálcio no interior, e com ou sem cálcio no exterior.
Observa-se que o tamanho das partículas aumenta através do aumento do teor de PG até PG a 45% em solução contendo apenas sacarose (Figura 10). Ao contrário disto, através da adição de gluconato de cálcio 1 mM no exterior observa-se que o tamanho das partículas diminui (Figura 11). Observou-se que a formulação possuindo o teor mais elevado de PG possui a maior variação no tamanho das partículas na ausência de Ca2+ (Figuras 11+12). Não há praticamente nenhuma perda de oxaliplatina entre a Ia e a 2a diálise se a solução de diálise for sacarose a 10% em ambos os passos de diálise (com base na Razão da contagem de iões (Pt195/P31) ) . Comparando os níveis de Pt/P da Figura 14, para as formulações contendo cálcio não é observada uma diminuição entre o Io e o 2 o passo de diálise.
Se estiver presente cálcio durante a diálise não é observada uma perda de oxaliplatina, em comparação com a formulação dialisada em solução de sacarose a 10%. Com o 39 aumento do teor de PG na formulação observa-se uma diminuição na oxaliplatina. 0 DOE (%) é geralmente mais elevado para a formulação com menor teor de PG, quando dialisada a mesma quantidade de tempo.
Representando graficamente o tamanho das partículas e a concentração total de Pt (Figura 17) , parece haver uma correlação. Com um tamanho de partícula crescente observa-se um maior teor de Pt independentemente da composição lipídica (teor variável de DSPC e DSPG).
Os lipossomas dialisados em solução contendo gluconato de cálcio são estáveis em meio de McCoy, enquanto a formulação dialisada em sacarose a 10% teve grande vazamento de oxaliplatina quando exposta a Meio de McCoy (Figura 18). O varrimento de DSC de uma formulação de Oxaliplatina encapsulada em lipossomas de PG a 35% mostrou que não era possível repetir o varrimento da formulação quando não estava presente cálcio (Figura 19) . Para cada novo varrimento a temperatura de transição aumentou continuamente. Quando estava presente cálcio no exterior da formulação, a temperatura de transição permanecia constante para cada novo varrimento (Figura 21) . Além disso, com um teor mais elevado de PG houve um aumento na temperatura de transição (Figura 20). A temperatura de transição para a formulação de Oxaliplatina encapsulada em lipossomas está no intervalo de 60-70°C. Assim, recomenda-se que a temperatura de extrusão seja mantida a 70°C. 40
Exemplo 9. Efeito de Ca2+ na formulação lipossómica de oxaliplatina; parte II
Objectivos:
Examinar o efeito de ter cálcio tanto no interior como no exterior de várias formulações lipossómicas contendo DSPC, DSPG e DSPE-PEG2000 em termos de tamanho das partículas, Pt total, DOE e estabilidade. Para seguir a possivel interação entre Ca2+ e oxaliplatina com as membranas, foram realizadas DSC em diferentes formulações.
Protocolo:
Foram preparadas quatro formulações lipossómicas diferentes de oxaliplatina com gluconato de cálcio no interior. O conteúdo de DSPC e DSPG foi variado na formulação lipossómica como se segue: 6. PC/PG/PE-PEG a 70:25:5% mol 7. PC/PG/PE-PEG a 60:35:5% mol 8. PC/PG/PE-PEG a 50:45:5% mol 9. PC/PG/PE-PEG a 40:55:5% mol 4 ml de Oxaliplatina encapsulada em lipossomas foram sujeitos a ultrassons (1 min/mL) a 75°C, seguido de arrefecimento para precipitar o excesso de oxaliplatina. O sobrenadante é transferido para câmaras de diálise (MWCO 3500), e dialisado contra solução de sacarose a 10% contendo gluconato de cálcio 1 mM. 3 mL são enchidos em cada câmara. Após 24h a câmara de diálise é transferida para um gobelé novo contendo sacarose a 10% e gluconato de cálcio 1 mM. O tamanho das partículas é seguido após ultrassons e após cada passo de diálise. 41
Os termogramas das formulações lipossómicas são comparados. 0 vazamento durante o Io e o 2o passo de diálise é monitorizado para as formulações lipossómicas. A estabilidade das formulações lipossómicas de oxaliplatina é testada em meio de McCoy (24h, 37 °C) .
Resultados
Ver Figuras 23-25.
Análise do tamanho das partículas (Tamanho dado em nm) % de PG Após ultrassons 1° passo de diálise (+cálcio) 2 passo de diálise (+cálcio) 25 102,8+1,18 95,5+ 0,81 96,2 + 0,91 35 143,1+3,78 123,9+1,52 127,7 +0,70 45 95,510,48 87,5+0,49 89,9 1 0,75 55 93,9+0,99 93,9+0,50 99,9 + 0,62
Análise de Pt Ia Diálise % PG Fora (ppm) DOE (%) Total (ppm) Razão da contagem de iões (Pt195/P31) 25 3,5002 91,6 418,549 11,05 35 3,2822 96, 8 1010,823 13, 95 45 4,8387 88,6 423,221 6,40 55 4,957 84,6 322,473 6,19 2a diálise % PG Fora (ppm) DOE (%) Total (ppm) Razão da contagem de iões (Pt195/P31) 25 5,499 99,3 762,9 8,49 35 7,103 99,5 1346,8 13, 84 45 8,057 98,5 526,62 6, 36 55 16, 29 97,2 579,596 5, 98 42
Pt no dialisado % PG Ia diálise (ppm) 2a diálise (ppm) 25 34,63 0,45 35 30,2 0,46 45 37,6 0,64 55 39,1 0,9
Estabilidade em McCoy % DSPG Fora t=0 DOE t=0 Fora t=24h DOE t=24h Total (ppm) (%) (ppm) (%) (ppm) 25 16,02 98,4 13,02 97,1 442,1 35 8,39 99, 1 16,70 98,4 1024,1 45 9,23 97,8 16,56 95, 6 377,6 55 16,02 94,9 23,25 92,7 316,4
Conclusão geral:
As formulações foram preparadas com cálcio no interior e no exterior.
Após o primeiro passo de diálise o tamanho das partículas dos lipossomas diminui para todas as formulações. Do primeiro para o segundo passo de diálise é observado um aumento no tamanho das partículas. Aparentemente, não existe uma correlação entre a composição lipidica e as alterações no tamanho das partículas.
Para todas as formulações preparadas não foi observada uma razão Pt/P mais elevada quando era incluído gluconato de cálcio no interior.
Os varrimentos de DSC de uma formulação de Oxaliplatina encapsulada em lipossomas de DSPG a 35% mostraram que a temperatura de transição permaneceu constante para cada novo varrimento (Figura 24) . Além disso, com um teor mais 43 elevado de PG parece haver um aumento transição (Figura 25). 0 DOE (%) é habitualmente mais elevado com menor teor de DSPG, quando dialisada de tempo.
Lisboa, 31 de Agosto de 2012 na temperatura de para a formulação a mesma quantidade

Claims (26)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Lipossoma compreendendo: entre 25% e 45% (mol/mol) de um lípido aniónico, menos de 10% de colesterol (mol/mol) e um agente terapêutico selecionado a partir do grupo que consiste em agentes antitumourais de molécula pequena, antibióticos, antifúngicos, e agentes anti-inflamatórios em que o lipossoma foi exposto a um catião bivalente a uma concentração entre 0,1 mM e 1 mM.
2. Lipossoma da reivindicação 1 compreendendo menos de 1% de colesterol (mol/mol).
3. Lipossoma de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o lipido aniónico é selecionado a partir do grupo que consiste em fosfatidilinositol, fosfatidilserina, bisfosfatidilglicerol, ácido fosfatidico, álcool fosfatidilico e fosfatidilglicerol.
4. Lipossoma de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o lipido aniónico é fosfatidilglicerol.
5. Lipossoma de qualquer uma das reivindicações anteriores compreendendo um polímero hidrófilo selecionado a partir do grupo de poli(etilenoglicol), poli(N- acriloilmorfolina) , poli (vinilpirrolidona) , poli(láctido) , poli (glicólido), poli(2-metil-2-oxazolina), poli (álcool vinílico), hidroxipropilmetilcelulose, poli(óxido de etileno), quitosano, poli(D-glucosamina), poli(aminoácido), Poli(2-hidroxietilmetacrilato) e copolímeros destes. 2
6. Lipossoma da reivindicação 5, em que o polímero é PEG com um peso molecular entre 100 Da e 10 kDa.
7. Lipossoma de qualquer uma das reivindicações 5 e 6, em que o polímero é conjugado com o grupo frontal da fosfatidiletanolamina.
8. Lipossoma da reivindicação 7, em que a quantidade de lípido conjugado com polímero está entre 2,5% e 7,5% (mol/mol).
9. Lipossoma de qualquer uma das reivindicações anteriores compreendendo ainda um fosfolípido sem carga selecionado a partir do grupo que consiste em fosfatidilcolina e fosfatidiletanolamina.
10. Lipossoma de qualquer uma das reivindicações anteriores não compreendendo colesterol.
11. Lipossoma de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que as cadeias alquilo dos lípidos são cadeias C18 saturadas.
12. Lipossoma de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o agente terapêutico é um agente antitumoural de molécula pequena selecionado a partir do grupo que consiste em derivados de antraciclina, cisplatina, oxaliplatina, carboplatina, doxorrubicina, paclitaxel, 5-fluoruracilo, exisulind, ácido cís-retinóico, sulfureto de suldinac, metotrexato, bleomicina e vincristina. 3 3 reivindicações oxaliplatina ou
13. Lipossoma de qualquer uma das anteriores, em que o agente terapêutico é cisplatina.
14. Lipossoma de anteriores, em que Unilamelar. qualquer uma das reivindicações o lipossoma é uma Grande Vesicula
15. Lipossoma de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o lipossoma tem um diâmetro entre 80 e 120 nm.
16. Lipossoma de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que pelo menos um dos lípidos no lipossoma é um substrato para SPLA2.
17. Lipossoma de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o catião bivalente é Ca2+.
18. Formulação lipossómica compreendendo lipossomas de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-16 e entre 0,1 mM e 1 mM de um catião bivalente.
19. Formulação lipossómica da reivindicação 18, em que o catião bivalente é Ca2+.
20. Formulação lipossómica de qualquer uma das reivindicações 18-19, em que o índice de Poli-Dispersibilidade é 0,20 ou menos.
21. Método para a preparação de uma formulação lipossómica de acordo com qualquer uma das reivindicações 18-20 compreendendo os passos de: 4 a. Preparação de uma mistura de lípidos através da dissolução de lipidos selecionados num solvente orgânico b. Hidratação do produto do passo a) com um solvente de hidratação aquoso para formar lipossomas c. Remoção do solvente orgânico do passo a) antes da adição do solvente de hidratação aquoso ou após a adição do solvente de hidratação aquoso.
22. Método da reivindicação 21, em que o solvente orgânico é removido antes da adição do solvente de hidratação.
23. Método de qualquer uma das reivindicações 21-22 compreendendo ainda um passo de sujeição da formulação lipossómica a ultrassons para produção de lipossomas de um certo tamanho.
24. Método de qualquer uma das reivindicações 21-23, em que o solvente de hidratação compreende um catião bivalente a uma concentração entre 0,1 mM e 1 mM.
25. Método de qualquer uma das reivindicações 21-24 compreendendo ainda um passo de mudança da fase aquosa exterior para outra fase aquosa exterior compreendendo um catião bivalente a uma concentração de 0,1 mM e 1 mM.
26. Método de qualquer uma das reivindicações 21-25, em que o catião bivalente é Ca2+. Lisboa, 31 de Agosto de 2012
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