PT2236612E - Biblioteca de oligonucleótidos que codifica para péptidos aleatórios - Google Patents

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Descrição "Biblioteca de oligonucleótidos que codifica para péptidos aleatórios" A invenção diz respeito à produção de bibliotecas de oligonucleótidos que codificam para péptidos aleatórios, vectores e células hospedeiras contendo tais bibliotecas e kits para a produção de tais bibliotecas. Técnicas combinatórias para a produção de péptidos encontram-se disponíveis desde 1960 e incluem sintese em fase sólida de péptidos e para além disso, processos paralelos de sintese de fase sólida desenvolvidos nos anos 80.

Tais técnicas foram revistas no artigo de Pinilla C., et al. (Nature Medicine (2003), Vol. 9, páginas 118-122). A produção de bibliotecas de ADN que codificam para diferentes péptidos é em si bem conhecida do estado da técnica. Bibliotecas de genes aleatórias têm pouco em comum com bibliotecas genómicas convencionais ou bibliotecas de ADNc. Bibliotecas convencionais são constituídas por clones que cobrem colectivamente um genoma/transcriptoma completo e são geralmente rastreadas por hibridização de ácidos nucleicos. Em contraste, as bibliotecas aleatórias contêm geralmente variações de um gene ou de um fragmento de um gene que é pesquisado para uma nova actividade.

Os genes aleatórios são expressos e pesquisados convencionalmente por exemplo, através de técnicas com fagos, bactérias ou de exposição in vitro.

Convencionalmente, técnicas padrão de aleatorização de genes obrigam à clonagem de um excesso de genes utilizando codões NNN ou NNG/T, em que N = A, C, G e T, 64 ou 32 codões têm que ser respectivamente clonados para assegurar a representação de todos os 20 aminoácidos. Inicialmente, estes 2 números podem aparecer relativamente pequenos, mas se consideramos posições aleatórias múltiplas existe uma relação exponencial entre o número de genes clonados e o número de proteínas obtidas. Hine et al descreveram previamente um processo alternativo para produzir bibliotecas de ADN, de aleatorização "MAX", em que duas ou mais posições são aleatórias de modo a que todos os 20 aminoácidos ou um seu subconjunto estejam representados (publicação PCT WO 00/15777) . Esta metodologia necessita de um conjunto de oligonucleótidos para cada posição a ser aleatorizada que são hibridizados para formar um molde, aleatorizados convencionalmente (NNN) nas posições adequadas. Esta estratégia permite que cada aminoácido seja codificado apenas uma vez no conjunto de oligonucleótidos, assim o número de genes únicos gerados é equivalente ao número de proteínas codificadas independentemente do número de posições de aleatorização. Apesar desta tecnologia representar uma melhoria significativa em relação a técnicas tradicionais, permanece uma percentagem relativamente elevada de codões não-MAX (indesejáveis) (—10%) nas posições aleatorizadas. Para além disso, devido às restrições do processo de hibridização apenas pequenas quantidades das construções de ADN são produzidas que são difíceis de manipular, particularmente, quando codificam para subconjuntos de aminoácidos.

Posteriormente Hine et al. melhoraram esta tecnologia eliminando virtualmente a presença de sequências indesejáveis e aumentaram o rendimento em ADN (Hine, A.V., Hughes, M.D., Nagel, D.A., Ashraf, M. e Santos, A.F. (2002). MAX Codon Gene Libraries. WO 03/106679; Hughes M.D., Nagel D.A., Santos A.F., Sutherland A.J. e Hine A.V. (2003). Removendo a redundância de bibliotecas de genes aleatórios. J. Mol. Biol. 331 (5), 973-979). Esta metodologia utiliza alguns oligonucleótidos adicionais que se hibridizam com uma cadeia molde mas também 3 disponibilizam uma extensão que não é complementar à cadeia molde. Isto permite a amplificação selectiva da cadeia de codificação necessária aumentando assim o rendimento e minimizando sequências indesejáveis. 0 problema associado com processos do estado da técnica tem sido a produção de mais do que dois codões aleatorizados contíguos. Isto é importante para permitir extensões de vários aminoácidos numa sequência a ser aleatorizada. Variações dos processos descritos, por exemplo, em W003/106679 permitem apenas que dois codões contínuos sejam aleatorizados, uma vez que necessitam a utilização de sequências de oligonucleótidos flanqueantes para se hibridizarem com as cadeias molde. Além disso, tais processos necessitam que uma cadeia molde aleatória seja produzida antes da utilização dos oligonucleótidos selecionados. Potencialmente, isto limita o número de codões que podem ser aleatorizados devido à complexidade/massa do oligonucleótido molde.

Os inventores testaram várias técnicas para tornar aleatórios três ou mais oligonucleótidos consecutivos que demonstrou ser difícil de efectuar, ou alternativamente produzir alguns resultados satisfatórios. Estes incluíram a tentativa de ligação de três ou mais trinucleótidos MAX num oligonucleótido de cadeia simples utilizando ligase de ARN. Esta última técnica demonstrou funcionar muito mal e uma posterior amplificação por PCR conduziu a manchas em que espécies individuais não puderam ser isoladas pelos inventores. A adição de codões MAX contendo 3 nucleótidos ligados directamente à extremidade romba de um oligonucleótido também demonstrou ser difícil. A técnica agora identificada e descrita pelos inventores permite inesperadamente a produção de codões contíguos aleatórios sem ser necessário produzir oligonucleótidos molde aleatórios. 4 É descrito um processo para produzir uma biblioteca de oligonucleótidos compreendendo uma pluralidade de oligonucleótidos possuindo cada oligonucleótido na biblioteca pelo menos uma posição pré-determinada, um codão de aleatorização seleccionado a partir de um grupo definido de codões, os codões no dito grupo definido codificam para diferentes aminoácidos, compreendendo o dito processo os passos de: (a) disponibilizar um ou vários oligonucleótidos de iniciação de cadeia dupla; (b) disponibilizar uma pluralidade de oligonucleótidos de aleatorização diferentes de cadeia dupla compreendendo: (i) uma cadeia de codificação, compreendendo a cadeia de codificação um codão de aleatorização; e (ii) uma cadeia não codificante substancialmente complementar, em gue cada oligonucleótido de aleatorização de cadeia dupla compreende uma seguência nucleótidica que codifica para um local de reconhecimento de endonuclease de restrição capaz de ser reconhecido por uma endonuclease de restrição, sendo a endonuclease de restrição capaz de cindir o oligonucleótido de aleatorização a montante ou a jusante do local de reconhecimento da endonuclease num local de cisão pré-determinado para criar um corte de extremidade romba; (c) ligação de cada oligonucleótido de iniciação de cadeia dupla a um oligonucleótido de aleatorização de cadeia dupla para formar os oligonucleótidos ligados; (d) amplificação dos oligonucleótidos ligados; 5 (e) digestão dos oligonucleótidos ligados com a endonuclease de restrição para formar uma pluralidade de oligonucleótidos aleatórios de cadeia dupla, cada um compreendendo numa extremidade um codão de aleatorização (e a sua sequência complementar); e, opcionalmente, (f) Uso dos oligonucleótidos aleatórios de cadeia dupla como oligonucleótidos de iniciação e repetindo os passos do processo (a) a (e) e eventualmente o passo (f) para produzir uma pluralidade de oligonucleótidos de cadeia dupla aleatórios compreendendo cada um codão de aleatorização adicional.

Os oligonucleótidos aleatorizados diferem por posuirem diferentes codões de aleatorização.

Os oligonucleótidos utilizados são preferencialmente ADN, contudo podem ser utilizados outros nucleótidos de cadeia dupla, tais como ARN, ou análogos de ADN ou ARN.

Preferencialmente, os oligonucleótidos de iniciação de cadeia dupla compreendem uma extremidade romba à qual estão ligados os oligonucleótidos aleatorizados de cadeia dupla. 0 codão de aleatorização na cadeia de codificação e o codão complementar na cadeia não codificante formam preferencialmente uma extremidade romba nos oligonucleótidos de aleatorização e encontram- se preferencialmente ligados à extremidade romba do oligonucleótido iniciador de cadeia dupla.

Pelo menos uma porção do oligonucleótido de iniciação ao qual se liga o codão de aleatorização pode codificar uma parte de um gene ou outra sequência nucleótidica que codifica para uma sequência de aminoácidos pré-determinada.

Preferencialmente, os oligonucleótidos de aleatorização e os oligonucleótidos de iniciação são ligados por ADN ligase. As ADN ligases são bem conhecidas do estado da técnica. Por exemplo, E. coli e fago T4 codificam para uma enzima, ADN 6 ligase que sela cortes de cadeia simples entre oligonucleótidos adjacentes numa cadeia dupla de ADN. Os requisitos das diferentes enzimas são bem conhecidos. Por exemplo, a enzima T4 necessita de ATP, enquanto a enzima de E. coli necessita de NAD+. Em cada caso, o cofactor é cindido e forma um complexo de enzima-AMP. 0 complexo liga-se a qualquer um dos lados das cadeias de ADN a serem ligados e forma uma ligação covalente entre um fosfato 5' numa cadeia e um grupo OH-3' na cadeia adjacente.

Assim, preferencialmente pelo menos uma das extremidades 5' dos oligonucleótidos a serem ligados compreende um grupo fosfato para permitir que oligonucleótidos sejam ligados por uma ADN ligase.

Preferencialmente, pelo menos ambas as extremidades 5' dos oligonucleótidos a serem ligados compreende um grupo fosfato.

Preferencialmente a cadeia adjacente ao(s) grupo(s) fosfato(s) vai conter um grupo 3'-OH. 0 local de cisão pré-determinado para a endonuclease encontra-se imediatamente adjacente ao codão de aleatorização.

Os oligonucleótidos ligados podem ser amplificados, por exemplo, por PCR utilizando iniciadores complementares por ex. a sequências nos oligonucleótidos de iniciação. 0 produto PCR produzido pode ser purificado e isolado, por exemplo, utilizando técnicas convencionais tais como a de electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) e excisão da banda relevante de ADN antes do isolamento do ADN e digestão com a endonuclease de restrição.

Preferencialmente o passo (f) é seguido uma ou várias vezes para ser utilizado com uma biblioteca de oligonucleótidos compreendendo uma pluralidade de oligonucleótidos, possuindo cada oligonucleótido e biblioteca pelo menos dois codões contíguos aleatórios. Mais 7 preferencialmente, o número de codões aleatorizados contidos na biblioteca é de 3 ou mais, mais preferencialmente de 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 codões.

Preferencialmente o processo disponibiliza a ligação de um oligonucleótido de terminação de cadeia dupla com o oligonucleótido de iniciação após ter sido adicionado o número necessário de codões aleatórios. O oligonucleótido de terminação pode compreender uma sequência nucleótidica pré-determinada compreendendo um local de reconhecimento de endonuclease de restrição para permitir à sequência nucleótidica aleatorizada ser cindida num gene de interesse. Alternativamente, por exemplo, o oligonucleótido de terminação pode codificar para um fragmento não aleatório de um gene de interesse.

Uma sequência nucleótidica ligada ao codão de aleatorização do oligonucleótido de aleatorização pode ser diferente em cada ciclo de adição de codões aleatorizados. Isto é cada conjunto de oligonucleótidos de aleatorização utilizado em cada ciclo de passos (a) a (f), quando o processo é repetido para se adicionar codões de aleatorização adicionais pode conter uma sequência diferente ligada ao codão de aleatorização. Isto permite que oligonucleótidos de cadeia dupla aleatórios obtidos após cada ciclo de adição aleatória de codões sejam amplificados selectivamente por PCR com um iniciador complementar à sequência diferente. Espera-se que isto reduza a necessidade de purificação por PAGE entre diferentes ciclos de adição aleatória de codões.

Preferencialmente o local de reconhecimento da endonuclease de restrição é: 5'-GAGTCNNNNNA-3' (SEQ. ID. No. 1) 3'-CTCAGNNNNNA-5' (SEQ. ID. No. 2) em que 8 Ν = qualquer nucleótido Λ = local de cisão da endonuclease de restrição.

Um tal local da endonuclease de restrição tem sido identificado como sendo reconhecido por duas endonucleases de restrição:

Mlyl que é obtida a partir da New England Biolabs, Inc. e Schl disponível em Fermentas Life Sciences. As duas enzimas são produzidas por diferentes microrganismos. Mlyl, por exemplo é descrita na US 6,395,531 e é encontrado em Micrococcus lylae. Ambas as endonucleases reconhecem a sequência de ADN de cadeia dupla 5'-GAGTC 3' e cindem 5 bases de ADN a jusante gerando extremidades rombas. Contudo, pode também ser utilizada qualquer endonuclease de restrição que se liga a uma sequência de endonuclease de restrição, mas que cinde num local adjacente ou num local alguns nucleótidos a montante ou a jusante da sequência de reconhecimento para permitir a separação do codão de aleatorização. A codificação genética de aminoácidos diferentes é bem conhecida, por exemplo o código genético de codões em ARNm transcrito da cadeia do codão de ADN é: 9

9 U C A G uuu - | Phe ucu - UAU Tyr ugu η Cys U u uuc - ucc Ser UAC J UGC C UUA H Leu UCA UAA* Stop UGA* Stop A UUG - UCG J UAG* Síop UGG m Trp G cm ~ CCU -1 CAU -j His CGU “ U c cuc Leu ccc Pro CAC CGC Arg C CUA CCA CAA η Gb CGA A cm J CCG ” CAG J CGG G AUU η ACU “ AAU η Asa AGU " ; Ser U A AUG Ife ACC Thr AAC AGC C AUA J ACA AAA η Lys AGA ” 1 Arg A AUG** Met ACG - AAG AGG - J G GUU - GCU - GAU “1 Asp GGU ” U 0 GUC Vai GCC Ala GAC J GGC Gfy c GUA GCA GAA η Gb GGA A GUG**“ GCG - - GAQ uuu J9L * Cadeia de terminação ou codões de "não-sentido" **Também utilizado para especificar o iniciador formil-Met-tARNMet. 0 tripleto Vai GUG é por isso "ambíguo" por codificar tanto para a valina como para a metionina.

Pro and Gly) ,

Ser,

Os diferentes aminoácidos codificados pelos diferentes codões possuem propriedades diferentes. Nalgumas circunstâncias pode ser desejável focalizar a biblioteca em diferentes grupos de aminoácidos com propriedades semelhantes. Assim, os codões são preferencialmente seleccionados. Por exemplo, podem ser focalizados para aminoácidos muito hidrofóbicos (tais como Vai, Ile, Leu, Met, Phe, Trp ou Cys), aminoácidos menos hidrofóbicos (Ala, Tyr, His, Thr, 10 aminoácidos parcialmente hidrofóbicos (Arg e Lys), aminoácidos contendo enxofre (Cys), aminoácidos carregados positivamente (Arg, His e Lys), aminoácidos carregados negativamente (Asp e Glu) , etc. Alternativamente podem ser selecionados para evitar um determinado aminoácido tal como Pro ou Cys.

Preferencialmente pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 codões de aleatorização diferentes são utilizados em cada ciclo de adição de codão de aleatorização.

Nem todos os codões são utilizados de forma eficiente em determinado organismo. Assim, preferencialmente os codões são selecionados especificamente para permitirem à biblioteca de ADN aleatorizada ser utilizada eficientemente em qualquer célula hospedeira utilizada para expressar a biblioteca de ADN e produzir péptidos a partir dela. Os problemas associados com a não utilização de bibliotecas aleatorizadas eficientemente são resumidos no artigo de Hughes M.D., et al. (J. Mol. Biol. (2003), Vol. 331, pages 973-979).

Preferencialmente, os codões são seleccionados para codões preferidos para a expressão de cada aminoácido num organismo selecionado. Por exemplo, para E. coli, os codões

são preferencialmente GCG (A) , TGC (C), GAT (D), GAA (E), TTT

(F), GGC (G) , CAT (H) , ATT (I), AAA (K) , CTG (L) , ATG (M) , AAC

(N) , CCG (P), CAG (Q) , CGC (R) , AGC (S), ACC (T) , GTG (V), TGG (W) e TAT (Y). As letras entre parêntesis indicam o aminoácido codificado pelo codão.

Preferencialmente, a extremidade 3' da cadeia de codificação compreende um grupo bloqueante para evitar uma ligação não produtiva de, por exemplo, cópias múltiplas de oligonucleótidos de aleatorização. 0 grupo de bloqueio pode ser selecionado a partir de um aminoácido, um grupo fosfato, um residuo glicerilo, um grupo tiol, ou por exemplo, um residuo de polietileno glicol. 11

Para além disso, ou alternativamente, a cadeia de não codificação pode compreender na sua extremidade 5', um ou vários nucleótidos que se prolongam para além da extremidade 3' da cadeia de codificação complementar. Isto reduz novamente o número de ligações não produtivas que ocorrem.

Preferencialmente, os processos da invenção compreendem adicionalmente os passos de: (g) disponibilizar um oligonucleótido de iniciação aleatória de cadeia dupla produzido através de um processo de acordo com a reivindicação anterior; (h) disponibilizar um oligonucleótido pré-definido compreendendo: (i) uma cadeia de codificação, compreendendo a cadeia de codificação um codão pré-definido que codifica para um aminoácido pré-definido; e (ii) uma cadeia não codificante substancialmente complementar, em que um oligonucleótido pré-definido compreende uma sequência nucleotidica que codifica para um local de reconhecimento de uma endonuclease de restrição capaz de ser reconhecido por uma endonuclease de restrição, sendo a endonuclease de restrição capaz de cindir o oligonucleótido pré-definido a montante ou a jusante do local de reconhecimento da endonuclease num local de cisão pré-determinado para criar um corte de extremidade romba; (i) ligação do oligonucleótido de iniciação de cadeia dupla de aleatorização ao oligonucleótido pré-definido para formar um oligonucleótido ligado. (j) amplificar o oligonucleótido ligado e, 12 (k) digerir o oligonucleótido ligado com a endonuclease de restrição para formar um oligonucleótido aleatório compreendendo numa extremidade o codão pré-definido. 0 codão pré-definido encontra-se preferencialmente numa extremidade do oligonucleótido pré-definido.

Isto permite a inserção de um aminoácido conhecido numa posição pré-determinada do péptido produzido pelas bibliotecas de oligonucleótidos. A vantagem desta técnica é que permite que o efeito de qualquer aminoácido naquela biblioteca pré-definida seja estudado. Exemplos de tais bibliotecas de varrimento posicionai são discutidos, por exemplo, no artigo por Pinilla (Nature Medicine (2003), Vol. 9, páginas 118-122). 0 processo da invenção permite que a produção de tais bibliotecas de varrimento de posição seja conseguida de forma relativamente rápida e de forma relativamente fácil. São adicionados um ou vários codões aleatórios a uma extremidade do codão pré-definido utilizando os processos da invenção. 0 local de reconhecimento da endonuclease de restrição, endonuclease de restrição, grupo bloqueante e/ou grupos de extensão opcional da extremidade 3' da cadeia não codificante podem ser os definidos acima. O oligonucleótido aleatorizado compreendendo o codão pré-definido pode então ser utilizado como um oligonucleótido iniciador para adicionar um ou vários codões aleatórios adicionais.

Preferencialmente, a cadeia de codificação do oligonucleótido de aleatorização utilizado no processo da invenção compreende a sequência: (i) 5' XXXa(N)a R' (N)b- B 3' ou (ii) 5'-(N)bR(N)aAXXX-3' em que: 13 XXX é um codão de aleatorização, N é qualquer nucleótido, a é um inteiro de 0 a 10, preferencialmente 5, b é um inteiro de 0 a 40, preferencialmente de 1 a 20, ou preferencialmente de 1 a 10, Λ é o local de cisão da endonuclease de restrição, R' é o complemento inverso da sequência do local de reconhecimento da endonuclease de restrição, R é a sequência do local de reconhecimento da endonuclease de restrição, B pode-se encontrar, ou não presente e quando presente pode ser seleccionado a partir de -OH, -NH2, fosfato, um residuo glicerilo, um tiol, e um residuo de polietilenoglicol. O segundo oligonucleótido aleatório (ii) pode ser utilizado para se ligar à extremidade 5' do oligonucleótido iniciador.

Preferencialmente, os oligonucleótidos obtidos através dos processos da invenção são inseridos num vector de expressão adequado. Vectores de expressão, por exemplo para expressar os péptidos codificados pelos oligonucleótidos são bem conhecidos do estado da técnica. Por exemplo, bibliotecas de expressão de fagos nas quais os oligonucleótidos são inseridos na sequência nucleótidica que codifica para as proteinas do revestimento do fago, de forma a que os péptidos codificados por eles sejam expressos à superfície das partículas do fago, são bem conhecidos do estado da técnica. Além disso, vectores de expressão de superfície bacterianos, vectores de expressão de leveduras e outros vectores de expressão eucariótica são bem conhecidos do estado da técnica.

Preferencialmente, os oligonucleótidos de aleatorização utilizados em cada ciclo de adição de codão diferem por possuírem uma sequência diferente, (N)b. Isto é, num primeiro 14 ciclo os oligonucleótidos de aleatorização possuem uma primeira sequência (N)b com diferentes codões de aleatorização. Num segundo ciclo seguinte, os oligonucleótidos de aleatorização possuem uma segunda sequência (N)b' ligada a codões de aleatorização. Isto permite que oligonucleótidos de aleatorização obtidos após cada ciclo de adição de codão de aleatorização seja amplificado com um iniciador especifico da sequência (N)b- ou (N)b.

Preferencialmente, o vector de expressão é inserido numa célula hospedeira de expressão adequada, tal como uma célula bacteriana (por ex. E. coli), levedura etc. A célula hospedeira expressa o péptido codificado pela biblioteca de ADN que é então utilizado para a continuação do estudo. São também disponibilizados processos para produzir uma biblioteca de péptidos aleatórios compreendendo a expressão da biblioteca de oligonucleótidos obtida, através de um processo de acordo com a invenção.

As bibliotecas de proteinas obtidas através dos processos são também disponibilizadas. A invenção também disponibiliza uma biblioteca de oligonucleótidos aleatórios compreendendo uma pluralidade de oligonucleótidos, possuindo cada oligonucleótido 3 ou mais codões MAX contíguos aleatórios que representam uma utilização óptima de codões de um organismo pré-determinado, e em que os codões MAX são diferentes entre os diferentes membros da biblioteca.

Preferencialmente, a biblioteca aleatória compreende 1 ou 2, mais preferencialmente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 codões MAX. São também disponibilizados kits para produzir um oligonucleótido, através de um processo de acordo com a invenção.

Preferencialmente, o kit compreende uma pluralidade de oligonucleótidos de aleatorização diferentes compreendendo: 15 (i) uma cadeia de codificação, compreendendo a cadeia de codificação um codão de aleatorização; e (ii) uma cadeia não codificante substancialmente complementar, em que cada oligonucleótido de aleatorização de cadeia dupla compreende uma sequência nucleótidica que codifica para um local de reconhecimento de endonuclease de restrição capaz de ser reconhecido por uma endonuclease de restrição, sendo a endonuclease de restrição capaz de cindir o oligonucleótido de aleatorização a montante ou a jusante do local de reconhecimento da endonuclease num local de cisão pré-determinado para criar um corte de extremidade romba. Preferencialmente, o local de reconhecimento é: 5'-GAGTCNNNNNA-3' (SEQ. ID. No. 1) 3'-CTCAGNNNNNA-5' (SEQ. ID. No. 2) em que - N = qualquer nucleótido Λ = local de cisão da endonuclease de restrição. 0 kit pode compreender adicionalmente uma enzima de restrição capaz de cindir o oligonucleótido de aleatorização e o local de cisão pré-determinado. Preferencialmente, a endonuclease de restrição é seleccionada a partir de Schl e Mlyl.

Preferencialmente, os codões de aleatorização consistem em codões MAX que representam a utilização de codões óptima por um organismo de interesse pré-determinado, ou de uma selecção pré-determinada dos ditos codões MAX. A cadeia de codificação é preferencialmente do oligonucleótido de aleatorização de cadeia dupla compreendendo uma extremidade 5' e uma extremidade 3', a extremidade 3' da cadeia de codificação compreende um grupo de bloqueio. 16

Preferencialmente, o grupo de bloqueio é seleccionado a partir de um grupo amino, um grupo fosfato, um residuo glicerilo, um grupo tiol e um residuo de polietileno glicol.

Preferencialmente a cadeia de não codificação compreende uma extremidade 3' e uma extremidade 5', a extremidade 5' da cadeia de não codificação que se prolonga um ou vários nucleótidos para além da extremidade 3' da cadeia de codificação complementar.

Preferencialmente, a cadeia de codificação compreende a sequência: (i) 5' XXXa (N)aR(N)b-B 3' ou (ii) 5'-(N)bR(N)aAXXX-3' em que: XXX é um codão de aleatorização, N é qualquer nucleótido, a é um inteiro de 0 a 10, preferencialmente 5, b é um inteiro de 0 a 40, preferencialmente de 1 a 20, ou preferencialmente de 1 a 10, A é o local de cisão da endonuclease de restrição, R' é o complemento inverso da sequência do local de reconhecimento da endonuclease de restrição, R é a sequência do local da endonuclease de restrição, B pode-se encontrar, ou não presente e quando presente pode ser seleccionado a partir de -OH, -NH2, fosfato, um residuo glicerilo, um tiol, e um residuo de polietilenoglicol. 0 kit pode compreender adicionalmente um oligonucleótido pré-definido compreendendo: 17 (i) uma cadeia de codificação, compreendendo a cadeia de codificação um codão pré-definido que codifica para um grupo amino pré-definido; e (ii) uma cadeia não codificante substancialmente complementar, em que o oligonucleótido pré-definido compreende uma sequência nucleótidica que codifica para um local de reconhecimento de uma endonuclease de restrição capaz de ser reconhecido por uma endonuclease de restrição, sendo a endonuclease de restrição capaz de cindir o oligonucleótido pré-definido a montante ou a jusante do local de reconhecimento da endonuclease num local de cisão pré-determinado para criar um corte de extremidade romba. A invenção também disponibiliza células hospedeiras compreendendo uma biblioteca de ADN possível de obter através de um processo de acordo com a invenção e/ou utilizando um kit de acordo com a invenção. Os kits podem ser utilizados para produzir bibliotecas peptídicas para pesquisar o efeito de diferentes sequências em, por exemplo, na ligação de ligandos ou o efeito na actividade biológica do péptido. A invenção vai agora ser descrita, apenas a título de exemplo fazendo referência às figuras seguintes. A Fig. 1 apresenta esquematicamente um processo para produzir sequências de ADN contendo codões MAX em posições pré-determinadas de acordo com a presente invenção. A Fig. 2 apresenta a distribuição de codões MAX e codões não MAX em posições pré-determinadas nas sequências de ADN produzidas, através do processo da presente invenção. A Fig. 3 apresenta um diagrama esquemático indicando um processo alternativo da invenção em que os codões MAX são adicionados na extremidade oposta do oligonucleótido de iniciação em relação aquela apresentada na Figura 1. 18

Exemplo A Figura 1 apresenta um esquema do processo utilizado para gerar uma biblioteca de ADN aleatória contendo codões MAX em sete posições pré-determinadas. MAX representa um codão que representa um dos 20 codões favorecidos em E. coli. NH2 representa um grupo amino presente na extremidade 3' deste oligonucleótido para minimizar as ligações não produtivas. A caixa cinzenta representa o local da endonuclease de restrição Mlyl.

Os passos principais envolvidos na produção de biblioteca são: 1. Hibridisação dos pares complementares de oligonucleótidos 2. Ligação do iniciador A e aleatorização dos oligonucleótidos B. 3. Amplificação por PCR do produto de ligação

4. Digestão com Mlyl e purificação do produto por PAGE do produto C 5. Repetição do processo acima para se conseguir o número desejado de posições aleatórias contíguas. 6. Clonagem das construções de ADN num vector adequado

Hibridisação, ligação e clonagem foram efectuadas como se descreve abaixo e as construções foram transformadas em células E. coli DH5a (genótipo: F' 80dlacZ(lacZYA-argF)U169 deoR recAl endAl hsdR17(rK-, mK+)phoA supE44 - thi-1 gyrA96 relAl/F' proAB+ lacIqZM15 TnlO (tetr)) quimicamente competentes que foram induzidas para receberem ADN por choque de calor.

Os clones foram isolados e ADN plasmídico foi recuperado. A inserção de ADN foi sequenciada para estabelecer as sequências presentes em posições pré-determinadas. 19

Qualquer célula hospedeira adequada, e de facto vectores de expressão alternativos, podem ser utilizados em vez desta estirpe de E. coli.

Materiais de Métodos Síntese do ADN de iniciação

Um par completamente complementar de oligonucleótidos de ADN de iniciação foi sintetizado pela MWG Biotech. Síntese de oligonucleótidos de aleatorização

Pares completamente complementares de oligonucleótidos de aleatorização foram sintetizados pela MWG Biotech. Oligonucleótidos de aleatorização foram desenhados para codificar um único codão MAX na extremidade 5' e um grupo amino na extremidade 3' da cadeia de codificação. A cadeia de não codificação não foi modificada por amino.

Fosforilação

Reacções de fosforilação 5' das cadeias de codificação dos oligonucleótidos de aleatorização foram efectuadas num volume final de 50 μΐ a não ser que especificado de outro modo. As reacções consistiram em tampão IX ligase (NEB - New England Biolabs), 10 unidades de T4 PNK, 300pmoles de ADN e água para dar um volume final de 50 μΐ. A reacção foi incubada a 37°C durante 30 minutos e depois a reacção foi parada aumentando a temperatura para 65°C durante 20 min.

Hibridização

Reacções de hibridização foram efectuadas utilizando quantidades iguais de dois oligonucleótidos. 0 volume final da 20 reacção foi 50 μΐ. Esta reacção foi aquecida a 95°C e mantida aquela temperatura durante 2 min. Deixou-se a temperatura descer l°C/min até aos 4°C para permitir a hibridização das sequências complementares.

Ligações

Ligações de terminal rombo foram efectuadas entre o iniciador e um conjunto de 20 oligonucleótidos de aleatorização. As ligações foram efectuadas utilizando quantidades iguais de oligonucleótidos directos e inversos (50pmoles), 1 X tampão de ligase (NEB), 10 unidades ligase (NEB) e água até um volume final de 2011. A reacção foi incubada a 26°C de um dia para o outro.

Reacção em cadeia da polymerase (PCR)

As reacções PCR continham 1 unidade de Pfu polymerase (Promega) , 50 pmoles de cada um dos iniciadores de PCR, 1 μΐ de iniciador, 200 μΐ de dNPT, 1 x de tampão Pfu, e água desmineralizada para perfazer o volume até 100 μΐ. O ADN foi amplificado utilizando as condições seguintes: 94°C durante 30 segundos, O 0 00 durante 30 segundos, 72 °C durante um minuto durante 35 ciclos. As reacções foram completadas a 72°C durante 7 minutos e as amostras armazenadas a 4 °C.

Extracção de ADN com fenol clorofórmio

Um volume de 0,1 de acetato de sódio 3 M (pH 5,2) foi adicionado ao ADN e misturado em vórtice para purificação. A seguir foi adicionado um volume de fenol/clorofórmio/álcool isoamilico (25:24:1), e a amostra foi colocada em vórtice e centrifugada durante 2 min a 14000 rpm. A fase aquosa contendo ADN foi removida cuidadosamente para um tubo limpo de 21 microcentrífuga. Foi adicionado um volume de clorofórmio e a mistura resultante foi colocada em vórtice e centrifugada durante 2 min a 14000 rpm. A fase aquosa foi removida para um tubo limpo de microcentrifuga e adicionou-se 2 volumes de etanol à temperatura do gelo e a amostra foi centrifugada em vórtice. O tubo de microcentrifuga foi colocado a -20°C de um dia para o outro ou a -70°C durante 1 hora e depois deixado congelar antes da centrifugação durante 20 minutos a 14000 rpm. 0 sobrenadante foi removido e o agregado de ADN foi lavado com 200 μΐ de etanol a 70%. O sobrenadante foi removido e o agregado foi deixado secar ao ar antes de ser novamente suspenso em água destilada. As amostra foram armazenadas a -20°C durante o tempo necessário.

Produtos da digestão de restrição de ADN

Os produtos da digestão de restrição foram colocados 1 x em tampão adequado (de acordo com as instruções do fabricante) com 0,1 μg/ μΐ de ADN, 10 unidades de enzima de restrição e perfez-se a solução até 20 il com água destilada. Os produtos de digestão de restrição foram incubados a 37°C ou a 55°C durante duas horas de acordo com o recomendado pelo fabricante. A temperatura foi então aumentada até 65°C durante 20 minutos para desnaturar a enzima. Foram colocados produtos de digestão dupla da mesma forma utilizando o tampão mais adequado para a combinação das enzimas.

Electroforese em gel de acrilamida

Foram preparados geles desnaturantes PAGE dissolvendo 21 g de ureia, 12,5 ml de acrilamida a 40% (proporção 19:1 acrilamida: bisacrilamida) , 5 ml de TBE (10 x) (base tris 0,9 M, ácido bórico 0,9 M e EDTA 20 mM) perfazendo o volume final com 50 ml 22 de água. A mistura foi agitada vigorosamente até a ureia se ter dissolvido, adicionou-se 600 μΐ de persulfato de amónio a 10% e seguidamente 80 μΐ de TEMED (Ν,Ν,Ν', Ν', tetraetilmetileno diamina). O equipamento de electroforese foi regulado de acordo com as instruções do fabricante e o gel foi vertido e colocado. As amostras foram então carregadas no gel e uma voltagem de 20V/cm foi aplicada durante aproximadamente 3 horas. O gel foi então removido das placas de vidro e colocado em tampão 1 x TBE com brometo de etidio com uma concentração de 2 pg/ml. A mistura foi então colocada num agitador a 150 rpm e deixado durante cinco minutos. O gel foi então removido do tampão e fotografado sob luz UV. Quando foi necessário PAGE não desnaturante o gel foi efectuado da mesma maneira, mas a ureia foi omitida.

Eluição de ADN por PAGE A banda de interesse foi excisada do gel e colocada numa coluna de eluição ADN/proteina. Adicionou-se à coluna tampão 1 x TAE (100 mM de base Tris, ácido acético 19 mM e EDTA 0,2 mM) e fechou-se bem a tampa para evitar qualquer fuga. A coluna foi então imersa num tanque de electroforese com gel cheio com tampão 1 x TAE. Uma voltagem de 15 V/cm foi aplicada durante 20 min para permitir que o ADN seja eluido do gel. Após 20 min a corrente foi invertida durante 30 s para libertar o ADN da membrana da coluna de eluição para o tampão e a coluna foi removida do suporte. O tampão foi removido cuidadosamente da coluna de eluição e o ADN foi precipitado.

Adicionou-se 0,1 volumes de acetato de sódio 3 M (pH 5,2) e 2 μΐ de tinta de agregado foi adicionada ao tampão extraido. Adicionou-se dois volumes de etanol a 100% e a amostra foi centrifugada em vórtice e incubada à temperatura ambiente durante 1 min. A amostra foi então centrifugada a 14000 rpm durante cinco minutos, o sobrenadante foi removido, 23 e o agregado foi lavado com 200 il de etanol a 7 0%. O sobrenadante foi removido e o agregado foi seco antes de ser novamente suspenso numa quantidade adequada de água duplamente destilada.

Preparação de E. coli quimicamente competente (DH5cQ

Uma colónia única de E. coli (DH5cx) foi inoculada com lOml de SOB e incubada de um dia para o outro a 37°C num agitador a 250 rpm. 8 ml de uma cultura de um dia para o outro foi transferida para 800 ml de LB. Isto foi incubado a 37°C num agitador a 250 rpm até a cultura se encontrar a meio caminho da fase log (DO550 de ~0.45) . As células foram então arrefecidas em gelo durante 30 minutos e depois agregadas por centrifugação a 4°C. O sobrenadante foi então removido e as células foram novamente suspensas pipetando cuidadosamente em 264 ml de RF1 (lOOmM RbCl, 50mM MnCl2, 30mM de acetato de potássio, lOmM CaCl2, 15% de glicerol, ajustados para pH 5.8 com ácido acético 0,2 M) . As células que foram novamente suspensas foram então incubadas em gelo durante uma hora. As células foram novamente agregadas e o sobrenadante foi removido. As células foram novamente suspensas em 64 ml de RF2 (MOPS 10 mM (ácido 4-morfolinopropanosulfónico), RbCl 10 mM, 75mM CaCl2, 15% de glicerol, ajustadas para pH 6.8 com NaOH) e incubadas em gelo durante 15 minutos. Foram dispensadas em aliquotas de 200 μΐ em tubos de microcentrifuga e incubadas em gelo durante 15 minutos. Foram dispensadas em aliquotas de 200 μΐ em tubos de microcentrifuga que foram congelados rapidamente em azoto liquido e armazenados a -70°C durante o tempo necessário.

Transformação 24

As E. coli (DH5a) competentes foram congeladas em gelo e adicionou-se 100 μΐ à mistura de ligação (20 μΐ) agitou-se em vórtice e deixou-se incubar em gelo durante 30 minutos. As células foram aquecidas por choque de calor a 37°C durante 45 segundos e voltaram para o gelo por mais dois minutos. Adicionou-se 100 μΐ de 2 X LB às células e deixou-se incubar a 37°C num agitador a 250 rpm durante 1 hora. Adicionou-se 10 μΐ de IPTG e 50 μΐ de 2% X-gal às células antes de serem aplicadas em meio selectivo.

Preparação de plasmídeos de ADN

Foram preparados plasmídeos de ADN para sequenciação utilizando o kit miniprep Promega Wizard de acordo com as instruções do fabricante.

Sequenciação de ADN

Sequenciação automatizada de ADN foi efectuada pelo laboratório de Genómica da Universidade de Birmingham num sequenciador ABI 3700.

Resultados A figura 2 mostra a distribuição dos diferentes codões MAX obtidos nas posições pré-determinadas nos clones isolados. Um total de 156 clones foi sequenciado dando um total de 1092 posições de codificação MAX. Todas as 20 sequências de codificação foram representadas nos clones analisados. A coluna marcada "não-Max" diz respeito a codões que surgiram, mas que não foram especificados na mistura de aleatorização. A coluna marcada com "N" diz respeito aqueles codões, cuja sequência não poude ser determinada devido à falta de clareza 25 na sequenciação. A coluna marcada "Del" diz respeito aqueles codões que não se encontravam presentes ou continham uma supressão. A técnica tem sido utilizada nesta fase para produzir pelo menos sete codões contíguos aleatorizados.

Numa concretização alternativa o codão MAX pode ser adicionado na extremidade oposta do oligonucleótido de iniciação.

Conclusão A técnica disponibiliza um processo de produção de oligonucleótidos aleatórios possuindo codões aleatórios.

Processo Alternativo A Figura 3 apresenta um processo alternativo de adição de codões MAX. Os codões MAX são adicionados à extremidade oposta do oligonucleótido de iniciação em relação ao apresentado na Figura 1. As anotações são as mesmas que na Figura 1. Isto demonstra que a técnica pode ser utilizada para introduzir codões MAX em cada extremidade de uma cadeia de codificação. A purificação por PAGE encontra-se entre parêntesis tal como nesta, e de facto no sistema apresentado na Figura 1, a necessidade de PAGE pode ser reduzida utilizando diferentes oligonucleótidos de aleatorização com diferentes sequências a montante ou a jusante do codão MAX em cada ciclo de adição do codão MAX. Isto permite que oligonucleótidos aleatórios de cadeia dupla obtidos após cada ciclo de adição de codão sejam amplificados selectivamente por PCR com um iniciador complementar à sequência diferente.

Listagem das Sequências <110> Aston University <120> Oligonucleotide Library Encoding Randomised Peptides 26 <130> P713229PCT <150> GB0515131.1 <151 > 2005-07-22 <160>2 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211 > 10

<212> DNA <213> Artificial <220> <223> restriction endonuclease recognition site <220> <221 > misc_feature <222> (6)..(10) <223> n is a, c, g, t or u <400> 1 gagtcnnnnn 10 <210> 2 <211 > 10 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> restriction endonuclease recognition site <220> <221 > misc-feature <222> (1)..(5) <223> n is a, c, g, t or u <400>2 nnnnngactc

Lisboa, 23 de Agosto de 2012.

Claims (13)

1 Re ivindi cações 1. Kit para produzir uma biblioteca de oligonucleótidos, compreendendo a biblioteca uma pluralidade de oligonucleótidos possuindo cada oligonucleótido pelo menos duas posições pré-determinadas, um codão de aleatorização selecionado a partir de um grupo definido de codões, codificando os codões do grupo definido de codões para aminoácidos diferentes, e em que cada oligonucleótido na biblioteca possui pelo menos dois codões de aleatorização contiguos; compreendendo o kit uma pluralidade de oligonucleótidos de aleatorização de cadeia dupla diferentes compreendendo: (i) uma cadeia de codificação, compreendendo a cadeia de codificação um codão de aleatorização; e (ii) uma cadeia não codificante substancialmente complementar, em que cada oligonucleótido de aleatorização de cadeia dupla compreende uma sequência nucleótidica que codifica para um local de reconhecimento de endonuclease capaz de ser reconhecido por uma endonuclease de restrição, sendo a endonuclease de restrição capaz de cindir o oligonucleótido de aleatorização a montante ou a jusante do local de reconhecimento num local de cisão pré-determinado para criar um corte de extremidade romba; e em que o local de cisão da endonuclease pré-determinado encontra-se adjacente ao codão de aleatorização.

2. Kit de acordo com a reivindicação 1, em que o local de reconhecimento da endonuclease de restrição é: 5'-GAGTCNNNNNA-3'(SEQ. ID. No. 1) 3'-CTCAGNNNNNA-5' (SEQ. ID. No. 2) em que - N = qualquer nucleótido 2 Λ = local de cisão da endonuclease de restrição.

3. Kit de acordo com as reivindicações 1 ou 2 compreendendo uma enzima de restrição capaz de cindir o oligonucleótido de aleatorização num local de cisão pré-determinado.

4. Kit de acordo com a reivindicação 3, em que a endonuclease de restrição é seleccionada a partir de Schl e Mlyl.

5. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que os codões de randomização consistem em codões MAX que representam a utilização de codão óptima de um organismo de interesse pré-determinado ou de uma selecção pré-determinada dos ditos codões MAX.

6. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, compreendendo a cadeia de codificação do oligonucleótido de aleatorização de cadeia dupla uma extremidade 5' e uma extremidade 3' , compreendendo a extremidade 3' da cadeia de codificação um grupo bloqueante.

7. Kit de acordo com a reivindicação 6, em que o grupo bloqueante é seleccionado a partir de um grupo amino, grupo fosfato, um residuo glicerilo, um grupo tiol e um residuo de polietileno glicol.

8. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que a cadeia não codificante compreende uma extremidade 3' e uma extremidade 5', prolongando-se a extremidade 5' da cadeia não codificante um ou vários nucleótidos para além da extremidade 3' da cadeia de codificação complementar. 3

9. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que a cadeia de codificação compreende a sequência: (i) 5' XXXa(N)a R' (N)b- B 3' ou (ii) 5' - (N) bR (N) ΒΛΧΧΧ_3' em que: XXX é um codão de aleatorização, N é qualquer nucleótido, a é um inteiro de 0 a 10, preferencialmente 5, b é um inteiro de 0 a 40, preferencialmente de 1 a 20, ou preferencialmente de 1 a 10, A é o local de cisão da endonuclease de restrição, R' é o complemento inverso do local de reconhecimento da sequência da endonuclease de restrição, R é a sequência do local da endonuclease de restrição, B pode-se encontrar, ou não presente e quando presente pode ser seleccionada a partir de -OH, -NH2, fosfato, um residuo glicerilo, um grupo tiol, e um residuo de polietilenoglicol.

10. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9 compreendendo adicionalmente um oligonucleótido pré-definido compreendendo: (i) uma cadeia de codificação, compreendendo a cadeia de codificação um codão pré-definido que codifica para um grupo amino pré-definido; e (ii) uma cadeia não codificante substancialmente complementar , em que o oligonucleótido pré-definido compreende uma sequência nucleótidica que codifica para um local de reconhecimento de uma endonuclease de restrição capaz de ser reconhecido por uma endonuclease de restrição, sendo a endonuclease de restrição capaz de cindir 0 oligonucleótido pré-definido a montante ou a jusante do local de 4 reconhecimento da endonuclease num local de cisão pré-determinado para criar um corte de extremidade romba.

11. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10 compreendendo adicionalmente um oligonucleótido de terminação possuindo uma sequência pré-definida.

12. Biblioteca de oligonucleótidos aleatórios compreendendo uma pluralidade de oligonucleótidos de cadeia dupla, possuindo cada oligonucleótido 3 ou mais codões contíguos aleatórios MAX que representam a utilização óptima de codões por um organismo pré-determinado, em que os codões MAX são diferentes entre os diferentes membros da biblioteca.

13. Célula hospedeira compreendendo uma bilioteca de ADN de acordo com a reivindicação 12. Lisboa, 23 de Agosto de 2012.