PT1907548E

PT1907548E - Biblioteca de oligonucleótidos que codificam péptidos aleatórios

Info

Publication number: PT1907548E
Application number: PT06765007T
Authority: PT
Inventors: Mohammed Ashraf; Marcus Daniel Hughes; Anna Victoria Hine
Original assignee: Univ Aston
Priority date: 2005-07-22
Filing date: 2006-07-18
Publication date: 2012-01-24
Also published as: ES2378561T3; ES2391159T3; CA2616252C; ATE529517T1; EP1907548B1; EP2236612A8; DK1907548T3; EP2236612A1; US8357638B2; PT2236612E; CA2616252A1; PL2236612T3; EP2236612B1; EP1907548A1; DK2236612T3; WO2007010243A1; US20090264313A1; US20130130938A1; GB0515131D0

Description

DESCRIÇÃO

BIBLIOTECA DE OLIGONUCLEÓTIDOS QUE CODIFICAM PÉPTIDOS ALEATÓRIOS A presente invenção tem por objecto a produção de bibliotecas de oligonucleótidos que codificam péptidos aleatórios, vectores e células hospedeiras que contêm essas bibliotecas e kits para a produção dessas bibliotecas.

As técnicas combinatórias para a produção de péptidos estão disponíveis desde a década de 1960 e incluíram sínteses em fase sólida de péptidos e, adicionalmente, os processos paralelos de sínteses em fase sólida desenvolvidos na década de 1980. Essas técnicas são analisadas no artigo de Pinilla C., et al. (Nature Medicine (2003), vol. 9, páginas 118-122). A produção de bibliotecas de ADN que codificam para diferentes péptidos é por si só bem conhecida na técnica. As bibliotecas de genes aleatórios têm pouco em comum com as bibliotecas convencionais de ADN genómico ou de ADNc. As bibliotecas convencionais consistem em clones que, colectivamente, cobrem todo um genoma/transcriptoma e geralmente são rastreadas através da hibridação de ácidos nucleicos. Pelo contrário, as bibliotecas aleatórias geralmente contêm variações de um gene ou de um fragmento de um gene, que é pesquisado quanto à sua nova actividade. Os genes aleatórios são expressos e pesquisados convencionalmente, por exemplo, por técnicas de visualização de fagos, bactérias ou por técnicas de visualização ín vítro. 1

Convencionalmente, as técnicas padrão de aleatorização de genes obrigam à clonagem de um excesso de genes usando quer os codões NNN ou NNG/T em que N = A, C, G e T, devem ser clonados 64 ou 32 codões, respectivamente, para garantir a representação de todos os 20 aminoácidos. À primeira vista, estes números podem parecer relativamente pequenos, mas se considerarmos múltiplas posições de aleatorização existe uma relação exponencial entre o número de genes clonados e o número de proteínas obtidas. Hine et al já descreveram, anteriormente, um processo alternativo para a produção de bibliotecas de ADN, a aleatorização de "MAX", no qual duas ou mais posições são aleatorizadas de forma que todos os 2 0 aminoácidos ou um seu subconjunto estejam representados (publicação da PCT da WO 00/15777). Esta metodologia requer um conjunto de oligonucleótidos, para cada posição a ser aleatorizada, que são hibridados com uma matriz, convencionalmente (NNN) aleatorizada nas posições adequadas. Esta abordagem permite que cada aminoácido seja codificado apenas uma vez dentro dos conjuntos de oligonucleótidos, daí o número de genes exclusivos gerados ser equivalente ao número de proteínas codificadas, independentemente do número de posições de aleatorização. Embora esta metodologia represente uma melhoria significativa em relação às técnicas tradicionais, há ainda uma percentagem relativamente elevada de codões não MAX (indese j ados) (~ 10 %) nas posições aleatorizadas. Além disso, devido às restrições do processo de hibridação, produzem-se apenas pequenas quantidades das estruturas de ADN, o que é difícil de manipular particularmente quando se codificam subconjuntos de aminoácidos.

Posteriormente, Hine et al fizeram melhorias a esta metodologia que praticamente eliminam a presença de sequências indesejadas e aumentam o rendimento de ADN 2 (Hine, A.V., Hughes, M.D., Nagel, D.A., Ashraf, M. e Santos, A.F. (2002). Bibliotecas de genes de codões MAX. WO 03/106679; Hughes M.D., Nagel D.A., Santos A.F., Sutherland A.J. e Hine A.V. (2003) . Removing the redundancy from randomised gene libraries. J. Mol. Biol. 331 (5), 973-979). Esta metodologia utiliza alguns oligonucleótidos adicionais que hibridam com a hélice matriz, mas também proporcionam uma extensão que não é complementar da hélice matriz. Isto permite a amplificação selectiva da hélice de codificação necessária, aumentando assim a produção e minimizando as sequências indesejadas. O problema associado aos processos da técnica anterior tem sido a produção de mais de dois codões contíguos aleatórios. Isto é importante para permitir alongamentos de vários aminoácidos numa sequência a ser aleatorizada. As variações dos processos descritos, por exemplo, na WO 03/106679 só permitem a aleatorização de dois codões contínuos dado que requerem o uso de sequências de oligonucleótidos de flanqueio para hibridar com as hélices matrizes. Além disso, esses processos requerem a produção de uma hélice matriz aleatória, a ser produzida antes de se usar os oligonucleótidos da selecção. Potencialmente, isto limita o número de codões que se podem aleatorizados, devido à complexidade/massa do oligonucleótido matriz.

Os requerentes tentaram uma série de técnicas nas quais se tornam aleatórios três ou mais oligonucleótidos consecutivos que provaram ser difíceis de realizar ou, alternativamente, produzem alguns resultados satisfatórios. Essas técnicas incluíram a tentativa de ligar três ou mais trinucleótidos MAX aleatoriamente num oligonucleótido de hélice simples utilizando ligase do ARN. Esta última técnica provou funcionar muito mal e a amplificação 3 posterior por RCP levou ao aparecimento de manchas em que as espécies individuais não podiam ser isoladas pelos requerentes. A adição de codões MAX, contendo 3 nucleótidos, ligados directamente na extremidade cega de um oligonucleótido também provou ser difícil. A técnica agora identificada e descrita pelos requerentes permite, inesperadamente, a produção de codões contíguos ao acaso, sem a necessidade de produzir oligonucleótidos de uma matriz aleatória. A presente invenção tem por objecto um processo para produzir uma biblioteca de oligonucleótidos, tal como definido na reivindicação 1.

Os oligonucleótidos aleatórios diferem por terem diferentes codões de aleatorização.

Os oligonucleótidos utilizados são, preferencialmente, ADN, no entanto podem utilizar-se outros nucleótidos de hélice dupla, como ARN ou análogos de ADN ou de ARN.

De preferência, os oligonucleótidos iniciais, de hélice dupla, compreendem uma extremidade cega à qual se ligam os oligonucleótidos de hélice dupla aleatórios. 0 codão de aleatorização na hélice de codificação e o codão complementar na hélice não codificante formam, de preferência, uma extremidade cega nos oligonucleótidos de aleatorização e ligam-se, preferencialmente, à extremidade cega do oligonucleótido inicial de hélice dupla.

Pelo menos uma porção do oligonucleótido de iniciação, a que se liga o codão de aleatorização pode codificar uma 4 parte de um gene ou outra sequência de nucleótidos que codifica uma sequência de aminoácidos pré-determinada.

De preferência, os oligonucleótidos aleatórios e os oligonucleótidos iniciais estão ligados por uma ligase de ADN. As ligases de ADN são bem conhecidas na técnica. Por exemplo, a E. coli e o fago T4 codificam uma enzima, a ligase de ADN, que veda os cortes pontuais das hélices simples entre oligonucleótidos adjacentes numa cadeia de ADN de hélice dupla. Os requisitos das diferentes enzimas são bem conhecidos. Por exemplo, a enzima T4 requer ATP, enquanto a enzima E. coli requer NAD+. Em cada caso, divide-se o co-factor e forma um complexo enzimático com AMP. 0 complexo liga cada um dos lados das hélices de ADN a serem unidas e faz uma ligação covalente entre um 5'-fosfato numa hélice e um grupo 3'-OH na hélice adjacente.

Assim, de preferência, pelo menos uma das extremidades 5' dos oligonucleótidos a serem ligados compreende um grupo fosfato para permitir que os oligonucleótidos sejam ligados por uma ligase de ADN.

De preferência, ambos as extremidades 5' dos oligonucleótidos a serem ligadas compreendem um grupo fosfato. De preferência, a hélice adjacente ao grupo fosfato conterá um grupo 3'-OH. 0 local de clivagem pré-determinado para a endonuclease é imediatamente adjacente ao codão de aleatorização.

Os oligonucleótidos ligados podem ser amplificados, por exemplo, por RCP usando iniciadores complementares, por exemplo, das sequências nos oligonucleótidos iniciais. 5 0 produto da RCP produzido pode ser purificado e isolado, por exemplo, usando técnicas convencionais, tais como electroforese em gel de poliacrilamida (EGPA) e excisão da banda relevante do ADN antes do isolamento do ADN e digestão com a endonuclease de restrição. A etapa (f) é seguida uma ou mais vezes para ser usada com uma biblioteca de oligonucleótidos compreendendo uma pluralidade de oligonucleótidos, tendo cada oligonucleótido e a biblioteca pelo menos dois codões contíguos aleatórios. Mais preferencialmente, o número de codões aleatórios contidos na biblioteca é de 1 ou mais, ainda mais preferencialmente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 codões.

Preferencialmente, o processo providencia a ligação de um oligonucleótido de finalização, de hélice dupla, ao oligonucleótido de iniciação, depois de se ter adicionado o número necessário de codões aleatórios. O oligonucleótido de finalização pode incluir uma sequência pré-definida de nucleótidos compreendendo um sítio de reconhecimento de uma endonuclease de restrição para permitir que a sequência de nucleótidos aleatórios seja excisada-unida num gene de interesse. Alternativamente, por exemplo, o oligonucleótido de finalização pode codificar um fragmento não aleatório de um gene de interesse.

Uma sequência de nucleótidos ligada ao codão de aleatorização do oligonucleótido aleatório pode ser diferente em cada ciclo de adição dos codões de aleatorização. Isto é, cada conjunto de oligonucleótidos aleatorizados utilizado em cada ciclo de etapas (a) a (f), quando o processo é repetido para adicionar mais codões de aleatorização, pode conter uma sequência diferente ligada ao codão aleatorizado. Isto permite que os oligonucleótidos 6 de hélice dupla, aleatorizados, obtidos após cada ciclo de adição de codões aleatórios, sejam selectivamente amplificados por RCP com um iniciador complementar da sequência diferente. Espera-se que isto reduza a necessidade de purificação por EGPA entre os ciclos de adição aleatória de codões.

Preferencialmente, o sitio de reconhecimento e o sitio de clivagem da endonuclease de restrição são: 5’-GAGTCNNNNNA-3’ (SEQ.ID. No. 1) 3’-CTCAGNNNNNA-5’ (SEQ.ID. No. 2) em que - N = qualquer nucleótido Λ= o sitio de clivagem da endonuclease de restrição.

Um desses sítios da endonuclease de restrição já foi identificado como sendo reconhecido por duas endonucleases de restrição: Mlyl, que se obteve no New England Biolabs, Inc. e SchI, disponível no Fermentas Life Sciences. As duas enzimas são produzidas por diferentes microrganismos. A Mlyl, por exemplo, está descrita na US 6.395.531 e encontra-se na Mícrococcus lylae. Ambas as endonucleases reconhecem a sequência de ADN de hélice dupla 5'-GAGTC-3' e cliva 5 bases de ADN a jusante, gerando extremidades cegas. Contudo, também se pode utilizar qualquer endonuclease de restrição que se ligue a uma sequência de endonuclease de restrição mas corta adjacente a um certo número ou num 7 certo número de nucleótidos a montante ou a jusante da sequência de reconhecimento para permitir a separação do codão de aleatorização. 0 código genético para diferentes aminoácidos é bem conhecido, por exemplo, o código genético para codões no ARNm transcrito da hélice do ADN do codão é:

u C A G uuu ~ ¥m ucu - UÀU η Tir UGU η Cis U u uue J UCC Ser UAC J UGC C UUA Leu UCA UAA* Paragem UGA* Paragem A UUG UCG J UAG* Paragem UGG Tro G euu - ccu - CAU -j Hs CGU ~ U c cuc Leu CCC 1 Pro CAC CGC Arç c CUA CCA CAA “Ί m CGA A CUG J GCG CAG ' CGG G AUU ” ACU “ ÁAU ~ Asn AGU " Ser U A AUC He ACC Tre AAC AGC J c AUA J AÇA AAA “ Lis AGA " Arg A am** Met ACG ™ AAG ~ AGG - G GUU - GCU ~ GAU - Ϊ Asp GGU “ U 0 GUC Vai <3CC Ate GAC ” J GGC Gli C GUA OCA GAÀ ” 1 GhJ GGA A GUG**· GCG ~ GAG “ J GGG ~ G * Terminação da cadeia ou codões "anti-paralelos" ** Também utilizado para especificar o iniciador formil-Met-ARNtMet. 0 tripleto GUG de Vai é por isso "ambíguo" pelo facto de codificar tanto a valina como a metionina

Os diferentes aminoácidos codificados por codões diferentes possuem propriedades diferentes. Nalgumas circunstâncias pode ser desejável concentrar a biblioteca em diferentes grupos de aminoácidos com propriedades semelhantes. Assim, de preferência, seleccionam-se os codões. Por exemplo, podem focar-se em aminoácidos muito hidrofóbicos (tal como Vai, Ile, Leu, Met, Fen, Trp ou Cís) , aminoácidos menos hidrofóbicos {Ala, Tir, His, Tre, Ser, Pro e Gli) , aminoácidos parcialmente hidrofóbicos (Arg e Lis), aminoácidos contendo enxofre {Cis), aminoácidos carregados positivamente{Arg, His e Lis), aminoácidos carregados negativamente {Asp e Glu) , etc.

Alternativamente, podem ser seleccionados para evitar um aminoácido particular, tal como Pro ou Cis.

Preferencialmente, utiliza-se pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 codões diferentes de aleatorização em cada ciclo de adição de codões de aleatorização.

Nem todos os codões são usados eficazmente em qualquer organismo particular. Assim, de preferência, os codões são seleccionados especificamente para permitir que a biblioteca de ADN aleatórios seja eficientemente utilizada em qualquer célula hospedeira utilizada para expressar a biblioteca de ADN e produzir péptidos a partir dela. Os problemas associados à não utilização de bibliotecas aleatórias, de forma eficaz, estão resumidos no artigo de Hughes M.D., et al. (J. Mol. Biol. (2003), vol. 331, páginas 973-979) .

De preferência, os codões são seleccionados entre codões privilegiados para a expressão de cada aminoácido num organismo seleccionado. Por exemplo, para a E. coli, os codões são preferencialmente GCG (A), TGC (C), GAT (D), GAA (E), TTT (F), GGC (G) , CAT (H) , ATT (I), AAA (K) , CTG (L) , 9 ATG (M), AAC (N) , CCG (P), CAG (Q) , CGC (R) , AGC (S) , ACC (T), GTG (V), TGG (W) e TAT (Y). As letras entre parênteses indicam o aminoácido codificado pelo codão.

De preferência, a extremidade 3' da hélice de codificação compreende um grupo de bloqueio para evitar a ligação não produtiva, por exemplo, várias cópias dos oligonucleótidos de aleatorização. 0 grupo de bloqueio pode ser seleccionado a partir de um aminoácido, um grupo fosfato, uma parte de glicerilo, um grupo tiol ou, por exemplo, uma parte de polietileno-glicol.

Além disso ou, alternativamente, a hélice não codificante pode incluir, na sua extremidade 5', um ou mais nucleótidos que se estendem para além da extremidade 3' da hélice complementar de codificação. Isto reduz novamente o número de ligações não produtivas que ocorrem.

De preferência, os processos da presente invenção compreendem, adicionalmente, as etapas de: (g) Providenciar um oligonucleótido iniciador, de hélice dupla, aleatório produzido por um processo de acordo com uma qualquer das reivindicações; (h) Providenciar um oligonucleótido pré-definido que compreende: (i) uma hélice de codificação, compreendendo a hélice de codificação um codão pré-definido que codifica para um aminoácido pré-definido; e (ii) uma hélice praticamente complementar não codificante, em que o oligonucleótido pré-definido compreende uma sequência de nucleótidos codificando para um sitio de 10 reconhecimento de endonuclease de restrição capaz de ser reconhecido por uma endonuclease de restrição, sendo a endonuclease de restrição capaz de clivar o oligonucleótido pré-definido, a montante ou a jusante do reconhecimento da endonuclease, num sitio de clivagem pré-determinado para criar um corte da extremidade cega; (i) Ligar do oligonucleótido inicial, de hélice dupla, aleatório com o oligonucleótido pré-definido para formar um oligonucleótido ligado; (j) Amplificar o oligonucleótido ligado; e (k) A digestão do oligonucleótido ligado com a endonuclease de restrição para formar um oligonucleótido aleatório que compreende, numa extremidade, o codão pré-definido. 0 codão pré-definido está, de preferência, numa extremidade do oligonucleótido pré-definido.

Isto permite a inserção de um aminoácido conhecido numa posição pré-determinada do péptido produzido pelas bibliotecas de oligonucleótidos. A vantagem desta técnica é que permite estudar o efeito de qualquer aminoácido especifico nessa biblioteca pré-definida. Exemplos dessas bibliotecas de rastreio posicionai são discutidos, por exemplo, no artigo de Pinilla (Nature Medicine (2003), vol. 9, páginas 118-122). O processo da presente invenção permite a produção dessas bibliotecas de rastreio posicionai que se conseguem de forma relativamente rápida e com relativa facilidade. 11

Um ou mais codões adicionais aleatórios podem ser adicionados a uma extremidade do codão pré-definido usando os processos da presente invenção. 0 sitio de reconhecimento da endonuclease de restrição, a endonuclease de restrição, o grupo de bloqueio e/ou os grupos opcionais de extensão na extremidade 3' da hélice não codificante podem ser definidos como antes. 0 oligonucleótido aleatório que compreende o codão pré-definido pode então ser usado como um oligonucleótido de iniciação para adicionar um ou mais codões adicionais aleatórios.

De preferência, a hélice codificante do oligonucleótido aleatório, utilizada no processo da presente invenção compreende a sequência: (i) 5’ΧΧΧΛ (N) aR’ (N) b-B3’ ou (ii) 5'- (N) bR(N)aAXXX-3' em que: XXX é o codão de aleatorização, N representa qualquer nucleótido, a representa um número inteiro de 0 a O \—1 preferencialmente 5, b representa um número inteiro de 0 a 40, preferencialmente de 1 a 20 ou, preferencialmente, de 1 a 10, Λ representa o sitio de clivagem da endonuclease de restrição, R' representa o complemento inverso da sequência do sítio de reconhecimento da endonuclease de restrição, 12 R representa a sequência do sítio de reconhecimento da endonuclease de restrição, B pode ou não estar presente e pode ser seleccionado entre -OH, -NH2, fosfato, uma parte de glicerilo, um tiol e um aparte de polietileno-glicol. 0 segundo oligonucleótido aleatório (ii) pode ser usado para ligar, à extremidade 5', o oligonucleótido de iniciação.

De preferência, os oligonucleótidos obtidos pelos processos da presente invenção são inseridos num vector de expressão adequado. Os vectores de expressão, por exemplo, para expressar os péptidos codificados pelos oligonucleótidos, são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, as bibliotecas de expressão de fagos em que os oligonucleótidos são inseridos na sequência de nucleótidos que codifica para as proteínas que revestem os fagos, de modo que os péptidos codificados por eles são expressos na superfície das partículas de fagos, são bem conhecidas na técnica. Além disso, os vectores de expressão da superfície bacteriana, os vectores de expressão de levedura e outros vectores de expressão em células eucarióticas são bem conhecidos na técnica.

De preferência, o oligonucleótido aleatório utilizado em cada ciclo de adição de codões difere por ter uma sequência diferente, (N)b. Isto é, num primeiro ciclo de aleatorização os oligonucleótidos têm uma primeira sequência (N)b com diferentes codões de aleatorização. Num segundo ciclo subsequente, os oligonucleótidos de aleatorização têm uma segunda sequência (N)b ligada aos codões de aleatorização. Isto permite que os oligonucleótidos aleatórios obtidos após cada ciclo de 13 adição de codões de aleatorização sejam amplificados com um iniciador especifico para a sequência (N)b' ou (N)b.

De preferência, o vector de expressão é inserido numa célula hospedeira de expressão adequada, como uma célula bacteriana (por exemplo E. coli), levedura, etc. A célula hospedeira expressa o péptido codificado pela biblioteca de ADN que é então utilizado para estudo posterior.

Também se providenciam os processos para produzir uma biblioteca de péptidos aleatórios que compreende a expressão da biblioteca de oligonucleótidos obtida por um processo de acordo com a presente invenção.

Também de providenciam bibliotecas de proteínas que se podem obter pelos processos da presente invenção.

Também tem por objecto uma biblioteca de oligonucleótidos aleatórios compreendendo uma pluralidade de oligonucleótidos, tendo cada oligonucleótido 3 ou mais codões MAX contíguos aleatórios que representam o uso ideal de um codão de um organismo pré-determinado e em que os codões MAX são diferentes entre os diferentes elementos da biblioteca.

Preferencialmente, a biblioteca aleatorizada compreende 1 ou 2, mais preferencialmente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 codões MAX. Descrevem-se kits para a produção de um oligonucleótido por um processo de acordo com as reivindicações.

De preferência, o kit compreende uma pluralidade de oligonucleótidos de aleatorização diferentes compreendendo: 14 (i) uma hélice de codificação, compreendendo essa hélice codificante um codão de aleatorização; e (ii) uma hélice complementar praticamente não codificante, em que cada oligonucleótido de hélice dupla, aleatorio compreende uma sequência de nucleótidos codificando para um sitio de reconhecimento de endonuclease de restrição capaz de ser reconhecido por uma endonuclease de restrição, sendo a endonuclease de restrição nucleótido de aleatorização a reconhecimento da endonuclease determinado para criar um corte De preferência, o sitio de 5'-GAGTCNNNNNA-3' (SEQ. ID. 3’-CTCAGNNNNNA-5’ (SEQ. ID. capaz de clivar o oligo-montante ou a jusante do num sitio de clivagem pré-da extremidade cega. reconhecimento é:No. 1) No. 2) em que: N = qualquer nucleótido, Λ = o sitio de clivagem da endonuclease de restrição. 0 kit pode ainda incluir uma enzima de restrição capaz de clivar o oligonucleótido aleatório e o sitio de clivagem pré-determinado. De preferência, a endonuclease de restrição selecciona-se entre Schl e Mlyl.

De preferência, os codões de aleatorização consistem em codões MAX, que representam o uso ideal do codão de um organismo pré-determinado de interesse ou uma selecção pré-determinada dos referidos codões MAX. 15 A hélice de codificação é, de preferência, a do oligonucleótido de aleatorização de hélice dupla compreendendo uma extremidade 5' e uma extremidade 3', da hélice de codificação compreendendo um grupo de bloqueio.

De preferência, o grupo de bloqueio é seleccionado entre um grupo amino, um grupo fosfato, uma parte de glicerilo, um grupo tiol e uma parte de polietileno-glicol.

De preferência, a hélice não codificante compreende uma extremidade 3' e uma extremidade 5', estendendo-se a extremidade 5' da hélice não codificante um ou mais nucleótidos para além da extremidade 3' da hélice complementar de codificação.

De preferência, a hélice de codificação compreende a sequência: (i) 5’ΧΧΧΛ (N) aR(N)b-B3' ou (ii) 5'- (N) bR(N)aAXXX-3' em que: XXX é o codão de aleatorização, N representa qualquer nucleótido, a representa um número inteiro de 0 a 10, preferencialmente 5, b representa um número inteiro de 0 a 40, preferencialmente de 1 a 20 ou, preferencialmente, de 1 a 10, Λ representa o sitio de clivagem da endonuclease de restrição, R' representa o complemento inverso da sequência do sitio de reconhecimento da endonuclease de restrição, 16 R representa a sequência do sitio de reconhecimento da endonuclease de restrição, B pode ou não estar presente e, quando presente, pode ser seleccionado entre -OH, -NH2, fosfato, uma parte de glicerilo, um tiol e uma parte de polietileno-glicol. 0 kit pode adicionalmente compreender um oligonucleótido pré-definido compreendendo: (i) uma hélice de codificação compreendendo um codão pré-definido que codifica para um aminoácido pré-definido; e (ii) uma hélice praticamente complementar não codificante, em que o oligonucleótido pré-definido compreende uma sequência de nucleótidos codificando para um sitio de reconhecimento de endonuclease de restrição capaz de ser reconhecido por uma endonuclease de restrição, sendo a endonuclease de restrição capaz de clivar o oligonucleótido pré-definido a montante ou a jusante do reconhecimento da endonuclease num sitio de clivagem pré-determinado para criar um corte da extremidade cega. A presente invenção também tem por objecto células hospedeiras compreendendo uma biblioteca de ADN que se podem obter por um processo de acordo com as reivindicações.

Os kits podem ser usados para produzir bibliotecas de péptidos para a selecção do efeito de diferentes sequências, por exemplo, na ligação de ligandos ou para o efeito na actividade biológica do péptido. 17 A presente invenção será agora descrita apenas a titulo de exemplo, com referência às figuras a seguir.

Fig. 1 mostra esquematicamente um processo de produzir sequências de ADN contendo codões MAX em posições pré-determinadas de acordo com a presente invenção.

Fig. 2 mostra a distribuição dos codões MAX e codões não MAX nas posições pré-determinadas dentro das sequências de ADN produzidas pelo processo da presente invenção.

Fig. 3 mostra um diagrama esquemático indicando um processo alternativo da presente invenção no qual se adicionam codões MAX à extremidade oposta do oligonucleótido iniciador ilustrado na figura 1.

EXEMPLO A figura 1 mostra um diagrama esquemático do processo utilizado para gerar a biblioteca de ADN aleatório contendo codões MAX em sete posições pré-determinadas. MAX indica um codão que representa um dos 20 codões favorecidos em E. coli. NH2 representa um grupo amina presente na extremidade 3' deste oligonucleótido, a fim de minimizar ligações não produtivas. A caixa cinzenta representa o sitio Mly I da endonuclease de restrição.

As principais etapas envolvidas na produção da biblioteca são: 1. A hibridação dos pares complementares dos oligonucleótidos 18

2. A ligação do oligonucleótido iniciador A e do oligonucleótido de aleatorização B 3. A amplificação por RCP do produto de ligação 4. A digestão com MlyI e a purificação do produto por EGPA do produto C. 5. A repetição do processo anterior para atingir o número desejado de posições contíguas aleatórias. 6. A clonagem das estruturas de ADN num vector apropriado A hibridação, a ligação e a clonagem foram realizadas conforme descrito a seguir e as construções transformado em DH5a de E. coli (genótipo: células quimicamente competentes F' 80dlacZ(lacZYA-argF)U169 deoR recAl endAl hsdR17(rK-, mK+)phoA supE44 - thi-1 gyrA96 relAl/F' proAB+ lacIqZM15 TnlO(tetr)), que foram induzidas a assumir o ADN por choque térmico. Os clones foram isolados e o ADN do plasmido foi recuperado. 0 ADN da inserção foi sequenciado para estabelecer as sequências presentes nas posições pré-determinadas .

Qualquer célula hospedeira apropriada e na verdade os vectores de expressão alternativos pode ser usado em vez desta estirpe de E. coli. MATERIAIS E PROCESSOS. Síntese do ADN de iniciação

Um par de oligonucleótidos totalmente complementar do ADN inicial foram sintetizados pela MWG Biotech. 19 Síntese de oligonucleótidos de aleatorização

Pares totalmente complementares de oligonucleótidos de aleatorização foram sintetizados pela MWG Biotech. Os oligonucleótidos de aleatorização foram concebidos para codificar um codão único MAX na extremidade 5' e um grupo amino na extremidade 3' da hélice codificante. A hélice não codificante não foi modificada no amino.

Fosforilação

As reacções de fosforilação de 5' das hélices de codificação dos oligonucleótidos de aleatorização foram realizadas num volume final de 50 μΐ, salvo indicação em contrário. As reacções consistiram em 1 X de tampão de ligase (NEB - New England Biolabs), 10 unidades de PNK T4, 300 pmoles de ADN e água até a um volume final de 50 μΐ. A reacção foi incubada a 37 °C, durante 30 min e, em seguida, parou-se a reacção por elevação da temperatura até 65 °C durante 20 min.

Hibridação

As reacções de hibridação foram realizadas utilizando quantidades iguais de dois oligonucleótidos. O volume final da reacção foi de 50μ1. Esta reacção foi aquecida a 95 °C e manteve-se a essa temperatura durante 2 min. Deixou-se a temperatura diminuir a 1 °C/min até 4 ° C para permitir que as sequências complementares hibridem.

Ligações

As ligações das extremidades cegas foram realizadas entre o iniciador e o conjunto de 20 oligonucleótidos de 20 feitas utilizando aleatorização. As ligações foram quantidades iguais de oligonucleótidos directos e inversos (50 pmoles) , 1 X tampão de ligase (NEB) , 10 unidades de ligase (NEB) e água até a um volume final de 20 .

Reacção em cadeia da polimerase (RCP).

As misturas reaccionais das RCP continham 1 unidade de polimerase Pfu (Promega) , 50 pmoles de cada um dos iniciadores de RCP, 1 μΐ do iniciador, 200 μΜ de dNTP, 1 X tampão Pfu e água duplamente destilada para perfazer o volume de 100 μΐ. ADN foi amplificado usando as seguintes condições: 94 °C durante 30 segundos, 48 °C durante 30 segundos, 72 °C durante um minuto durante 35 ciclos. As reacções foram completadas a 72 °C durante 7 minutos e as amostras foram armazenadas a 4 °C.

Extracção de ADN com clorofórmio e fenol..

Adicionou-se um volume de 0,1 de acetato de sódio 3M (pH 5,2) ao ADN a ser purificado na reacção que foi então misturado em vórtice. Posteriormente adicionou-se um volume de fenol/clorofórmio/álcool iso-amilico (25:24:1), sendo a amostra agitadas em vórtice e centrifugada durante 2 min a 14.000 rpm. A camada aquosa contendo o ADN foi removido com cuidado para um tubo limpo de microcentrifugadora. Adicionou-se um volume de clorofórmio e a mistura resultante foi agitada em vórtice e centrifugou-se durante 2 min a 14.000 rpm. A camada aquosa removida para um tubo de microcentrifugadora limpo e adicionou-se 2 volumes de etanol gelado e a amostra foi agitada em vórtice. O tubo da microcentrifugadora foi colocado a - 20 °C durante a noite ou a -70 °C durante 1 hora, deixando-se depois descongelar antes da centrifugação durante 20 minutos a 14.000 rpm. O 21 sobrenadante foi removido e lavaram-se os peletes de ADN com 200 μΐ de etanol a 70 %. O sobrenadante foi removido e deixou-se os peletes secar ao ar antes de uma nova suspensão em água destilada. As amostras foram armazenadas a -20 °C até ser necessário.

Dissoluções de restrição do ADN.

As dissoluções de restrição foram feitas em 1 X tampão apropriado (de acordo com as instruções dos fabricantes) com 0.1 pg/μΐ de ADN, 10 unidades da enzima de restrição e preencheu-se até 20 μΐ com água duplamente destilada. As dissoluções de restrição foram incubadas a 37°C ou 55°C durante duas horas, conforme recomendado pelo fabricante. Fez-se então subir a temperatura para 65 °C durante 20 minutos para desnaturar a enzima. As duplas dissoluções foram feitas da mesma forma usando o tampão mais apropriado para a combinação de enzimas.

Electroforese em gel de poliacrilamida.

Os géis de desnaturação da EGPA foram preparados dissolvendo 21 g de ureia, 12,5 ml de acrilamida a 40 % (relação de 19:1 de acrilamida: bisacrilamida), 5 ml de TBE (10 x) (base Tris 0,9 M, ácido bórico 0,9 M e EDTA 20 mM ) e completando com água para um volume final de 50ml. Agitou-se vigorosamente até a ureia estar dissolvida, adicionou-se 600 μΐ de persulfato de amónio a 10 % e, posteriormente, 80 μΐ de TEMED (N,N,N',N'-tetraetilmetil-etileno-diamina). O aparelho da electroforese foi montado de acordo com as instruções do fabricante e verteu-se o gel e ajustou-se. As amostras foram então carregadas no gel e aplicou-se uma tensão de 20 V/cm durante aproximadamente 3 horas. O gel foi então removido das placas de vidro e 22 colocado em 1 X tampão de TBE com brometo de etídio, a uma concentração de 2 pg/ml. Foi então colocado num agitador, a 150 rpm e para a esquerda durante cinco minutos. 0 gel foi então removido do tampão e foi fotografado sob luz U. V. Quando foi necessária uma EGPA não desnaturante, o gel foi preparado da mesma maneira mas a ureia foi omitida.

Eluição de ADN a partir da EGPA. A banda de interesse foi excisada do gel e colocada numa coluna de eluição de ADN/proteina. Adicionou-se 1 x tampão de TAE (base de Tris lOOmM, ácido acético 19 mM e EDTA 0,2 mM) à coluna e aplicou-se firmemente a tampa para impedir qualquer fuga. A coluna foi então imersa num tanque de electrof orese em gel cheio de 1 x tampão de TAE. Aplicou-se uma tensão de 15 V/cm durante 20 minutos para permitir que o ADN fosse eluido do gel. Passados 20 min, inverteu-se a corrente durante 30s para libertar o ADN da membrana da coluna de eluição para o tampão e retirou-se a coluna da prateleira. O tampão foi cuidadosamente removido da coluna de eluição e o ADN precipitou.

Adicionou-se ao tampão extraído um volume de 0, 1 de acetato de sódio 3M (pH 5,2) e 2 μΐ de corante em peletes. Adicionou-se dois volumes de etanol a 100 % e a amostra foi agitada em vórtice e incubada à temperatura ambiente durante 1 min. A amostra foi então centrifugada a 14.000 rpm durante cinco min, o sobrenadante foi removido e lavaram-se os peletes com 20 μΐ de etanol a 70 %. O sobrenadante foi removido e secaram-se os peletes antes da nova suspensão numa quantidade apropriada de água duplamente destilada. 23

Preparação de E. coli (DH5cQ quimicamente competente

Inoculou-se uma única colónia de E. coli (DH5a) em 10 ml de SOB e incubou-se, durante a noite, a 37 °C num agitador a 250 rpm. Transferiu-se 8 ml da cultura da noite para 800 ml de LB. Incubou-se a 37 °C num agitador, a 250 rpm, até a cultura estar a meio da fase logarítmica (DO a 550 de ~0, 45) . As células foram então arrefecidas em gelo durante 30 minutos e depois foram transformadas em peletes por centrifugação a 4 °C. 0 sobrenadante foi então removido e as células foram novamente suspensas por pipetagem ligeira em 264 ml de RF1 (RbCl 100 mM, MnCl2 50 mM, acetato de potássio 30 mM, CaCl2 10 mM, glicerol a 15 %, ajustada para pH 5,8, com ácido acético 0,2 M) . As células foram então novamente suspensas e depois incubadas em gelo durante uma hora. As células foram peletizadas novamente e o sobrenadante removido. As células foram novamente suspensas em 64 ml de RF2 (MOPS (ácido 4-morfolinopropano-sulfónico) 10 mM, RbCl 100 mM, CaCl2 75mM, glicerol a 15%, pH ajustado para 6, 8 com NaOH) e foram incubadas em gelo durante 15 minutos. Foram distribuídas em alíquotas de 200 μΐ em tubos de microcentrifugadora que foram então congelados rapidamente em azoto líquido e armazenadas a 70 °C conforme necessário.

Transformação

Descongelou-se em gelo E. coli (DHSa) e adicionou-se 100 μΐ à mistura de ligação (20μ1) rodou-se para misturar e deixou-se a incubar em gelo durante 30 minutos. As células 24 foram submetidas a um choque térmico a 37 °C durante 45 segundos e voltou a colocar-se em gelo durante mais dois minutos. Adicionou-se 100 μΐ de 2 X LB às células e isso permitiu a incubação a 37 °C num agitador a 250 rpm durante 1 hora. Adicionou-se 10 μΐ of IPTG e 50 μΐ de X-gal a 2 % às células antes de se semearem em placas em meios selectivos.

Preparação do ADN do plasmido.

Preparou-se o ADN do plasmido para a sequenciação usando o kit Wizard miniprep da Promega, de acordo com as instruções dos fabricantes.

Sequenciação do ADN A sequenciação automática do ADN foi feita pelo Genomics laboratory da Birmingham University num sequenciador ABI 3700.

RESULTADOS A figura 2 mostra a distribuição dos diferentes codões MAX obtidos nas posições pré-determinadas nos clones isolados. Sequenciou-se um total de 156 clones, dando um total de 1.092 posições de codificação MAX. Todas as 20 sequências codificadas estavam representadas nos clones analisados. A coluna marcada 'não MAX' refere-se a codões que apareceram, mas que não foram especificados na mistura de aleatorização. A coluna marcada com 'Ν' refere-se aos codões nos quais a sequência não pode ser determinada devido à falta de clareza na sequenciação. A coluna marcada 'Del.' refere-se aos codões que não estavam presentes ou continha uma eliminação. 25 A técnica tem sido usada nesta fase para produzir pelo menos 7 codões contíguos aleatórios.

Numa modalidade alternativa, pode-se adicionar o codão MAX na extremidade oposta ao oligonucleótido de iniciação.

CONCLUSÃO

Esta técnica providencia um processo de produção de oligonucleótidos aleatórios com codões aleatórios.

PROCESSO ALTERNATIVO A figura 3 mostra um processo alternativo de adição de codões MAX. Adicionam-se os codões MAX na extremidade oposta do oligonucleótido de iniciação mostrado na figura 1. As anotações são as mesmas das da figura 1. Isto demonstra que esta técnica pode ser usada para introduzir codões MAX em cada uma das extremidades de uma hélice de codificação. A purificação por EGPA está enquadrada nisto e, de facto, no sistema ilustrado na figura 1, a necessidade de EGPA pode ser reduzida utilizando diferentes oligonucleótidos de aleatorização com diferentes sequências a montante ou a jusante do codão MAX em cada ciclo de adição do codões MAX. Isto permite que os oligonucleótidos de hélice dupla, aleatórios, obtidos após cada ciclo de adição de codões sejam selectivamente amplificados por RCP com um iniciador complementar do da sequência diferente.

LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> Astro University 26 que codificam

<120> Biblioteca de oligonucleótidos péptidos aleatórios <130> P713229PCT <150> GB0515131.1 <151> 2005-07-22 <160> 2 <170> Patente na versão 3.3 <210> 1 <211> 10 <212> ADN <213> Artificial <22 0> endonuclease de <223> sitio de reconhecimento da restrição <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (6)..(10) <223> n representa a, c, g, t ou u <4 0 0> 1 gagtcnnnnn 10 <210> 2 <211> 10 <212> ADN <213> Artificial 27

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Processo para produzir uma biblioteca de oligonucleótidos, caracterizado pelo facto de compreender uma pluralidade de oligonucleótidos, tendo cada oligonucleótido na biblioteca pelo menos duas posições pré-determinadas, um codão seleccionado aleatoriamente num grupo definido de codões, em que os codões dentro do referido grupo definido codificam para diferentes aminoácidos, compreendendo o referido processo as etapas de: (a) providenciar um ou mais oligonucleótidos de iniciação, de hélice dupla, em que os oligonucleótidos de iniciação têm uma ou mais extremidades cegas; (b) providenciar uma variedade de diferentes oligonucleótidos de aleatorização, de hélice dupla, compreendendo: (i) uma hélice de codificação, compreendendo essa hélice de codificação um codão de aleatorização; e (ii) uma hélice não codificante praticamente complementar, em que cada oligonucleótido de aleatorização, de hélice dupla, compreende uma sequência de nucleótidos que codifica para um sitio de reconhecimento de endonuclease de restrição capaz de ser reconhecido por uma endonuclease de restrição, sendo a endonuclease de restrição capaz de clivar o oligonucleótido de aleatorização a montante ou a jusante do sitio de reconhecimento da 1 endonuclease, ao nivel de um sitio de clivagem pré-determinado, para criar um corte de uma extremidade cega e em que a endonuclease cliva o oligo-nucleótido de aleatorização adjacente ao codão de aleatorização providenciado pelo oligonucleótido de aleatorização, (c) ligar cada oligonucleótido de iniciação, de hélice dupla, a um oligonucleótido de aleatorização, de hélice dupla, para formar oligonucleótidos ligados; (d) ampliar os oligonucleótidos ligados; (e) digerir os oligonucleótidos ligados com a endonuclease de restrição para formar vários oligonucleótidos de hélice dupla e aleatórios, cada um dos quais compreende, numa extremidade, um codão de aleatorização; e (f) usar os oligonucleótidos de hélice dupla, aleatórios, como oligonucleótidos iniciais e repetir as etapas do processo (a) a (e) para produzir uma pluralidade de oligonucleótidos de hélice dupla, aleatórios, cada um composto por um codão de aleatorização adicional; em que a etapa (f) é seguida uma ou opcionalmente mais vezes, para produzir uma biblioteca de oligonucleótidos compreendendo vários oligonucleótidos, possuindo cada oligonlceótido da biblioteca pelos menos dois codões aleatórios contíguos.
2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o sítio de reconhecimento da endonuclease de restrição e o sítio de clivagem serem: 5'-GAGTCNNNNNΛ-3' (SEQ. ID. No. 1 3'-CTCAGNNNNNΛ-5' (SEQ. ID. No. 2 2 em que N = um qualquer nucleótido Λ = sitio de clivagem da endonuclease de restrição.
3. Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de a endonuclease de restrição ser seleccionada entre SchI e Mlyl.
4. Processo, de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de o grupo aleatório de codões estar focalizado.
5. Processo, de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de os oligo-nucleótidos aleatórios utilizados em cada etapa (f), tal como definido na reivindicação 1, compreenderem uma sequência diferente de nucleótidos ligada ao codão de aleatorização, por comparação com as utilizadas em ciclos anteriores de adição de codões aleatórios (etapas (a) a (e)).
6. Processo, de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de compreender, adicionalmente, a ligação de um oligonucleótido de finalização, com uma sequência pré-definida, ao oligonucleótido aleatório, depois de se ter adicionado um número pré-determinado de codões de aleatorização.
7. Processo, de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de os codões de aleatorização consistirem em codões MAX, que representam o uso ideal do codão de um organismo de 3 interesse, pré-determinado ou uma selecção pré-determinada dos referidos codões MAX.
8. Processo, de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de a hélice de codificação do oligonucleótido de aleatorização, de hélice dupla t compreender uma extremidade 5' e uma extremidade 3’ , compreendendo, a extremidade 3' da hélice codificante, um grupo de bloqueio.
9. Processo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de o grupo de bloqueio ser seleccionado entre um grupo amino, um grupo fosfato, uma parte de glicerilo, um grupo tiol e um fragmento de polietileno-glicol.
10. Processo, de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de a hélice não codificante compreender uma extremidade 3' e uma extremidade 5', estendendo-se a extremidade 5' da hélice não codificante a um ou mais nucleótidos para além da extremidade 3' da hélice de codificação complementar.
11. Processo, de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de o oligo-nucleótido iniciador, de hélice dupla, aleatório, obtido na etapa (e), estar purificado.
12. Processo, de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de compreender, adicionalmente, as etapas que consistem em: 4 (g) providenciar um oligonicleótido iniciador de hélice dupla, aleatório, produzido por um processo de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores; (h) providenciar um oligonucleótido pré-definido que compreende: (i) uma hélice de codificação, compreendendo essa hélice de codificação um codão pré-definido codificando para um aminoácido pré-definido; e (ii) uma hélice não codificante praticamente complementar, em que o oligonucleótido pré-definido compreende uma sequência de nucleótidos codificando para um sitio de reconhecimento de endonuclease de restrição capaz de ser reconhecido por uma endonuclease de restrição, sendo a endonuclease de restrição capaz de clivar o oligonucleótido pré-definido a montante ou a jusante do sitio de reconhecimento da endonuclease ao nivel de um sítio de clivagem pré-determinado para criar um corte na extremidade cega; (i) ligar o oligonucleótido iniciador, de hélice dupla, aleatório, a um oligonucleótido pré-definido para formar um oligonucleótido ligado; (j) amplificar o oligonucleótido ligado; e (k) digerir o oligonucleótido ligado com a endonuclease de restrição para formar um oligonucleótido aleatório compreendendo, numa das extremidades, um codão pré-definido. 5
13. Processo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo facto de compreender ainda as etapas que consistem na utilização do oligonucleótido aleatório compreendendo o codão pré-definido, como um oligonucleótido de iniciação e repetindo as etapas do processo (a) a (e) e, eventualmente, a etapa (f) tal como definido na reivindicação 1, para adicionar um ou vários codões aleatórios suplementares aos oligo-nucleótidos.
14. Processo, de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de compreender, adicionalmente, a etapa que consiste em inserir, num vector de expressão, um oligonucleótido, obtido por um processo realizado tal como definido em uma qualquer das reivindicações anteriores.
15. Processo, de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de o vector de expressão ser inserido numa célula hospedeira de expressão.
16. Processo de produção de uma biblioteca de péptidos aleatórios, caracterizado pelo facto de consistir em expressar uma biblioteca de oligonucleótidos obtida por um processo de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores. Lisboa, 13 de Janeiro de 2012. 6 <22 0> <223> sitio de reconhecimento da endonuclease de restrição <22 0> <221> várias caracteristicas <222> (1)..(5) <223> n representa a, c, g, t ou u <400> 2 nnnnngactc 10 Lisboa, 13 de Janeiro de 2012. 28